1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29719
(51) A61K 39/145 (2006.01)
A61P 31/12 (2006.01)
C12R 1/92 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0454.1
(22) 07.04.2014
(45) 15.04.2015, бюл. №4
(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич;
Кыдырбаев Жайлаубай Кыдырбаевич; Хайруллин
Берик Мухитович; Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич;
Табынов Кайсар Казыбаевич; Червякова Ольга
Викторовна; Рыскельдинова Шолпан
Жанбырбаевна; Асанжанова Нурика Нарынбековна;
Кожамкулов Еркен Муратханович; Инкарбеков
Дулат Амангельдиевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Научно-
исследовательский институт проблем
биологической безопасности" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Ninomiya A., Imai М., Tashiro М., Odagiri Т.
Inactivated influenza H5N1 whole- virus vaccine with
aluminium adjuvant induces homologous and
heterologous protective immunities against lethal
challenge with highly pathogenic H5N1 avian influenza
viruses in a mouse model, 2007, p.3554-3560
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ИНАКТИВИРОВАННОЙ
ЦЕЛЬНОВИРИОННОЙ
ГИДРООКИСЬАЛЮМИНИЕВОЙ ВАКЦИНЫ
ПРОТИВ ГРИППА A/H5N1
(57) Способ получения инактивированной
цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины
против гриппа A/H5N1.
Изобретение относится к медицинской
биотехнологии и представляет собой способ
получения инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 из рекомбинантного штамма
A/AstanaRG/6:2/2009, полученного методом
обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК для
разработки препандемической вакцины.
Предлагается способ получения
инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 на основе рекомбинантного штамма
A/AstanaRG/6:2/2009, где вирус культивируется в
10-11-суточных куриных эмбрионах,
инактивируется формалином по оптимальному
режиму, очищается и концентрируется при помощи
хроматографических и фильтрационных методов и
добавляется адъювант- гидроокись алюминия.
Полученная вакцина представляет собой
прозрачную жидкость с рыхлым осадком, легко
разбивающимся при встряхивании.
Вакцина инактивированная цельновирионная
гидроокисьалюминиевая против гриппа A/H5N1,
изготовленная по предложенному способу, не
обладает токсичностью для лабораторных
животных, высокоиммуногенна и протективна при
двукратном применении.
(19)KZ(13)A4(11)29719

2. 29719
2
Изобретение относится к медицинской
биотехнологии и представляет собой способ
получения инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 из рекомбинантного штамма
A/AstanaRG/6:2/2009, полученного методом
обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК для
разработки препандемической вакцины.
Известен способ получения инактивированной
цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины
против гриппа A/H5N1 из рекомбинантного штамма
NIBRG-14, полученного в Национальном институте
биологических стандартов и контроля (NIBSC,
Великобритания) методом обратной генетики из
эпидемического вируса А/Вьетнам/1194/2004
(H5N1) и высокорепродуктивного штамма
A/PR/8/34 (H1N1). Согласно указанному способу
вирусная суспензия нарабатывается в 10-11-
суточных куриных эмбрионах, очищается и
концентрируется посредством
ультрацентрифугирования через линейный градиент
сахарозы 10-50% и инактивируется формалином в
конечной концентрации 0,02%, температуре и pH
реакционной среды 4°С и 7,0-7,6, соответственно, в
течение 7 суток. После чего инактивированный
вирусный концентрат подвергается стерилизации
через фильтры диаметром пор 0,22 мкм, разводится
в зависимости от весового содержания
гемагглютинина (SDS- PAGE) буферным солевым
раствором (БСР, рН-7,2) до вакцинных параметров,
объединяется раствором гидроокиси алюминия,
таким образом, чтобы концентрация ионов
алюминия (Аl+3
) в препарате составляла 0,3 мг/0,5
мл и перемешивается для сорбции при 4-6°С в
течение часа.
Приготовленная по вышеизложенному способу
вакцина с содержанием гемагглютинина
2,5 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых
мышей, с интервалом в 21 день, формирует
иммунитет напряженностью титров антител в
реакции торможении гемагглютинации (РТГА) с
гомологичным антигеном 1:160 [Tada Y.
Characterization of a whole, inactivated influenza
(H5N1) vaccine // Influenza and Other Respiratory
Viruses. - 2008. - Vol. 2(6). -p.261-266].
Существенным недостатком способа является
низкая производительность использованного метода
очистки и концентрирования вируса и не
совершенность метода сорбции.
Существуют также способ получения
инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 из рекомбинантных штаммов rgHK213/03
(H5N1) и rgVNJP1203/04 (H5N1), полученных на
основе обратной генетики из полевых вирусов
A/Hong Kong/213/2003 (H5N1) и A/Vietnam/
JP 1203/2004 (H5N1) и высокорепродуктивного
штамма A/PR/8/34 (H1N1), где вирусная биомасса
нарабатывается в системе 10-11-суточных куриных
эмбрионов, далее инактивируется формалином в
конечной концентрации 0,05%, температуре и pH
реакционной среды 4°С и 7,0-7,6, соответственно, в
течение 14 суток. После чего инактивированная
вирусная суспензия подвергается очистке и
концентрированию через линейный градиент
сахарозы 10-50%, с последующей ее стерилизацией
через фильтры диаметром пор 0,22 мкм.
Полученный очищенный концентрат в зависимости
от весового содержания гемагглютинина (SDS-
PAGE) разводится буферным солевым раствором
(БСР, рН-7,2) до вакцинных параметров,
объединяется в равном соотношении с 2%-ным
раствором гидроокиси алюминия и перемешивается
для сорбции при 4-6°С в течение часа.
Приготовленная вышеизложенным способом
вакцина с содержанием гемагглютинина
2 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых
мышей, интервалом в 21 день, формирует
иммунитет напряженностью титров антител в РТГА
с гомологичным антигеном 1:52. При контрольном
заражении вакцинированных мышей
эпидемическим вирусом A/Vietnam/JP1203/2004
(H5N1) все мыши остались живыми и не проявляли
клинических признаков болезни в течение 14-
дневного срока наблюдения. Потеря массы тела у
зараженных мышей также не отмечалось
[Ninomiya A., Imai М., Tashiro М., Odagiri Т.
Inactivated influenza H5N1 whole-virus vaccine with
aluminium adjuvant induces homologous and
heterologous protective immunities against lethal
challenge with highly pathogenic H5N1 avian influenza
viruses in a mouse model // Vaccine. - 2007. - Vol. 25.
P.3554-3560].
Наиболее значимый недостаток представленного
метода заключается в длительности срока
инактивации, нежелательного при промышленном
производстве противогриппозных вакцин и низкой
производительности использованного метода
очистки и концентрирования вируса.
Предлагаемый способ получения
инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 основан на использовании
рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009,
полученного в НИИПББ КН МОН РК методом
обратной генетики из эпизоотического штамма
A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) вируса гриппа птиц и
высокорепродуктивного штамма A/PR/8/34 (H1N1).
Вакцинный штамм депонирован в коллекции
микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под № M-
12-09/D от 19.10.09 г. и имеет паспорт
международного образца, позволяющий его
использовать для приготовления препандемической
вакцины против гриппа A/H5N1.
Сущность способа заключается в том, что
рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009
культивируется в 10-11-суточных куриных
эмбрионах при 33-34°С в течение 72 часов,
наработанная вирусная суспензия осветляется через
8-слойные марлевые фильтры, инактивируется
формалином в конечной концентрации 0,05%
вначале при 37±1°С в течение 24 часов, далее при
5±1°С в течение 48 часов, соблюдая режим
постоянного перемешивания. Очистка и
концентрирование инактивированной вирусной
суспензии проводится поэтапно, вначале

3. 29719
3
осветляется через мембранные фильтры с
диаметром пор 0,45 мкм, далее концентрируется на
ультрафильтрационной установке Millipore®
Pellicon®
cassette system (Франция) и диализе против
10 объемов буфера [1,0 М натрий хлористый; 0,01 М
ФБР pH 7,4; 0,001 М ЭДТА] и 6 объемов буфера
[0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР pH 7,4; 0,001
М ЭДТА]. Полученный вирусный концентрат
дополнительно очищается с помощью
гельфильтрации на колонках с сефарозой CL-6B,
после чего стерилизуется через каскад мембранных
фильтров с диаметром пор АР 20-0,45 мкм -
0,22 мкм. Далее очищенный вирусный концентрат в
цельном или разведенном до вакцинных параметров
виде, объединяют в асептических условиях с
рабочим раствором гидроокиси алюминия
(содержание ионов Аl+3
2 мг/мл) в соотношении 1:1,
перемешивают лабораторным гомогенизатором Т25
basic ULTRA-TURRAX, IKA (Германия) в течение
3 мин при 3000 об/мин. Полученную смесь, после
гомогенизации переливают в специальные стаканы
и инкубируют при температуре 6±2°С в течение 24 ч
при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с
помощью спиннера «Techne» (Франция). После
окончания срока инкубации смесь фасуют во
флаконы нужного объема и контролируют качество
на соответствие нормативному документу.
Показатель полноты сорбции антигена на
гидроокиси алюминия при соблюдении
вышеуказанного режима составления превышает
90%.
Приготовленная по предлагаемому способу
вакцина с содержанием гемагглютинина
3 мкг/0,2 мл при двукратной внутрибрюшинной
вакцинации мышей с интервалом 7 суток,
формирует у них иммунитет напряженностью 1:238
в РТГА. При контрольном заражении
(интраназально под легким эфирным наркозом)
вакцинированных мышей эпизоотическим штаммом
A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) в дозе 15 LD50/0,03 все
животные оставались живыми и не проявляли
признаков какой-либо болезни в течение 14-
дневного срока наблюдения.
Предлагаемый способ отличается от аналогов
тем, что в технологии изготовления вакцины
используется новый рекомбинантный штамм
A/AstanaRG/6:2/2009, полученный методом
обратной генетики в НИИПББ НЦБ КН МОН РК,
применяются оптимальные режимы формалиновой
инактивации вируса, составления вакцины,
комбинированная схема очистки и
концентрирования вируса посредством
хроматографических и фильтрационных методов.
Изобретение выполнимо в условиях научно-
производственных объединений при наличии
рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009
вируса гриппа, соответствующего технологического
оборудования и соблюдении предлагаемого режима
приготовления вакцины.
Эффективность и воспроизводимость
предлагаемого способа получения
инактивированной цельновирионной
гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа
A/H5N1 из рекомбинантного штамма
A/AstanaRG/6:2/2009 (H5N1) вируса гриппа
подтверждена при приготовлении трех
производственно-экспериментальных серий этого
препарата в НИИПББ КН МОН РК, в последующем
прошедших с положительными результатами
доклинические испытания специфической
активности и безопасности в РГП «Национальный
центр экспертизы лекарственных средств»,
г.Алматы, Республика Казахстан и Научно-
исследовательском институте гриппа СЗО РАМН
РФ, г.Санкт- Петербург, Российская Федерация.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения инактивированной
цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины
против гриппа A/H5N1, включающий
культивирование вируса в куриных эмбрионах,
химическую инактивацию, комбинированную схему
очистки и концентрирования вируса и добавление
адъюванта-гидроокиси алюминия, отличающийся
тем, что используется новый рекомбинантный
штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа, который
инактивируется формалином по оптимальному
режиму, очищается и концентрируется в
соответствии схемы: осветление,
ультра/диафильтрация, гельфильтрация и
стерилизующая фильтрация.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова