1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28920
(51) C12N 1/20 (2006.01)
A61K 39/10 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1321.1
(22) 08.10.2013
(45) 15.09.2014, бюл. №9
(72) Барамова Шолпан Аузаровна; Султанов
Ахметжан Акиевич; Оспанов Ержан
Калиолдинович; Мырзалиев Ахан Жахангерович;
Даугалиева Аида Тлековна; Адамбаева Акмарал
Ауелхановна; Шманова Баламзия Тастановна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) Иванов Н.П. Бруцеллез животных, методы и
средства борьбы с ним. Алматы, 2002, с.300-301,
308-315
(54) ШТАММ БАКТЕРИИ BRUCELLA
MELITENSIS B-0122, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО
АНТИГЕНА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ
БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ
ЖИВОТНЫХ
(57) Изобретение относится к области ветеринарной
микробиологии, может быть использовано при
изготовлении препаратов для серологической
диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных
животных.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании штамма
бруцелл, для приготовления эффективного
бруцеллезного антигена для серологических
реакций.
Штамм бактерии Brucella melitensis В-0122,
депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов Товарищества с ограниченной
ответственностью «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»,
используемый для приготовления бруцеллезного
антигена при диагностике бруцеллеза
сельскохозяйственных животных.
(19)KZ(13)A4(11)28920

2. 28920
2
Изобретение относится к области ветеринарной
микробиологии, может быть использовано при
изготовлении препаратов для серологической
диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных
животных.
Известен вакцинный штамм Brucella abortus 19,
используемый для получения S-бруцеллезных
диагностикумов [Иванов Н.П. Бруцеллез животных
методы и средства борьбы с ним.- Алматы, 2002,
с.300-301; с.308-315].
Недостатком антигена, приготовленного из
штамма Brucella abortus 19 для серологических
реакций, является его относительно невысокая
чувствительность и специфичность, который
отличается по своей антигенной структуре от
штаммов бруцелл, циркулирующих в РК.
Задачей изобретения является получение
высокочувствительного штамма бруцелл с
типичными культурально-морфологическими,
биохимическими, антигенными свойствами для
серологической диагностики бруцеллеза,
вызываемого S- формами возбудителя.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании штамма
бруцелл, для приготовления эффективного
бруцеллезного антигена для серологических
реакций.
Штамм бактерии Brucella melitensis В-0122
депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов Товарищества с ограниченной
ответственностью «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»,
используемый для приготовления бруцеллезного
антигена при диагностике бруцеллеза
сельскохозяйственных животных.
Идентификацию штамма бактерии Brucella
melitensis В-0122 проводят по морфологическим,
культуральным и физиолого-биохимическим
свойствам.
Происхождение штамма бактерии. Штамм
бактерии выделен от больного бруцеллезом мелкого
рогатого скота из сельского округа Бауыржан,
Энбекшиказахского района Алматинской области.
Способ выделения - МПБ, МПА, эритрит агар с
добавками и отбор колоний в S-форме по Уайт-
Вильсону.
Идентифицирован согласно определителю
бактерии Bergey,s Manual of Systematic
Bacteriology/Department of Microbiology and
Molecular Genetics: Michigan State University: USA,
2005, Part C, P.370-386.
Сравнен с типовым коллекционным штаммом
Brucella melitensis 16 М (эталонный).
Назначение штамма бактерии. Штамм типовой
для приготовления диагностических препаратов
обладает S-антигенными детерминантами.
Повышает эффективность серологической
диагностики бруцеллеза животных.
Состав среды и условия культивирования:
панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид,
тиамин-бромид, глюкоза, глицерин, агар-агар,
дрожжевой экстракт, L-цистин.Т° + 37-38°С, рН 6,8-
7,0.
Морфолого-культуральные свойства.
Бруцеллы - грамотрицательные коккобациллы,
длиной 0,4-2,2 мкм, шириной 0,4 - 0,6 мкм,
неподвижны, очертания концов округлые,
клеточные стенки содержат липополисахарид,
консистенция S-формы.
Вегетативные клетки растут на эритрит-агаре с
добавками, Т + 37-38°С, в течение 48 часов в
термостате и обладают сравнительно короткой
лагфазой и более активными ростовыми свойствами,
сопровождающейся накоплением более высокого
количества бактериальной массы. Так за 48 часов
культивирования в термостате на эритрит агаре,
накопление бактериальной массы составляло более
800 миллиардов микробных клеток в 1,0 см3
.
При повторной проверке выбранного штамма
Brucella melitensis В-0122, через 3 месяца после
хранения на эритрит агаре под резиновыми
пробками, была установлена его стабильность в
быстроте роста, что указывало на целесообразность
его использования для изготовления
диагностических препаратов.
Физиолого-биохимические свойства.
Принадлежность к трофической группе:
хемоорганотроф. Типы катабализма: аэроб.
Симбиотрофные отношения: внутриклеточный
паразитизм. Источники углерода: глюкоза,
глицерин. Источники азота: гидролизат животных
белков. Источники серы: цистин.
Другие характерные физиологические
особенности обмена: дифференцирующие и
диагностические ферменты уреаза, оксидаза,
каталаза, не образует сероводород, не разжижает
желатин, не лизирует эритроциты, не образует
ацетилметилкарбинол.
Антигенная структура. Содержит типичный
набор антигенных детерминант, характерных для S-
форм бруцелл, то есть агглютинируются S-
антибруцеллезными сыворотками в титре 1:160
образуя крупные рыхлые хлопья агглютината и не
вступает в реакцию с R-антибруцеллезной
сывороткой.
Маркерные признаки штамма. Растет на средах с
пенициллином, обладает уреазной, оксидазной,
каталазной активностью.
Серологические свойства. Антиген из бруцелл
данного штамма, обладает высокой эффективностью
при исследовании сывороток крови животных их
хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу.
Выявляет дополнительно к биофабричному
бруцеллезному антигену до 5% инфицированных
животных.
Патогенные свойства. При определении
вирулентности по методу Коротича-Голота
установлено, что Brucella melitensis В-0122 имеет
высокую вирулентность.
Способ, условия и состав сред для хранения.
Основные биологические свойства штамма
стабильно сохраняются при многократных
пассажах.
В нативном состоянии не снижает активности 4
месяцев на твердых средах (эритрит-агар) при
температуре +4-+6°С.

3. 28920
3
Способ, условия и состав сред для размножения
штамма: эритрит агар с добавками (дрожжевой
экстракт, L-цистин, 1% глюкоза, 2% глицерин).
Проба на диссоциацию. По Уайт-Вильсону
колонии окрашиваются в желтый цвет (S-форма).
Проба с трипафлавином и реакция
термоагглютинации - отрицательные.
Молекулярно-биологические характеристики
гена 16S rDNA штамма В. melitensis 280.
Молекулярно-биологические характеристики
гена 16S rDNA штамма В. melitensis 280,
выражаются в нуклеотидных последовательностях,
электрофореграмме и дендрограмме.
Пример 1. Из штамма Brucella melitensis В-0122
ДНК выделяют методом Kate Wilsona.
Амплификацию гена 16S rDNA проводят
универсальными праймерами 8F-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG и 806R-
GGACTACCAGGGTATCTAAT в общем объеме
30 мкл. ПЦР смесь содержит 150 нг. ДНК, 1Ед.
Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (Fermentas),
0,2 mM каждого дНТФ, 1-х ПНР буфер (Fermentas),
2,5 mM MgCl2, 10 пмоль каждого праймера.
Программа ПЦР амплификации включает
денатурацию 95°С в течение 7 минут; 30 циклов:
95°С - 30 секунд, 55°С- 40 секунд, 72°С -1 минута;
заключительная элонгация 7 минут при 72°С.
ПЦР продукты очищают при помощи ферментов
Exonuclease 1 (Fermentas) и щелочной фосфатазы
(Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas). Реакцию
секвенирования проводят с применением BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) согласно инструкции производителя.
Продукт реакции секвенирования очищают
колоночным методом Centri-Sep. Очищенные
фрагменты разделяют на автоматическом
генетическом анализаторе 3500 (Applide
Biosystems). Нуклеотидные последовательности 16S
rDNA гена штамма анализируют и объединяют в
общую последовательность в программном
обеспечении SeqScape 2.6.0 (Applide Biosystems).
После чего удаляют концевые фрагменты
(нуклеотидные последовательности праймеров,
фрагменты, имеющие низкий показатель качества)
что позволяет получить нуклеотидную
последовательность протяженностью более 650 п.н.,
которую идентифицируют в GeneBank по алгоритму
BLAST. Нуклеотидные последовательности и
результаты идентификации представлены в таблице
1.
Из таблицы 1 видно, что нуклеотидная
последовательность гена 16S rDNA штамма В.
melitensis 280, имеет 100% совпадением с
известными последовательностями штаммов В.
melitensis, В. abortus и В. canis.
Проводят проверку чистоты штамма, которую
осуществляют на основе анализа
электрофореграммы нуклеотидной
последовательности 16S rDNA гена. В таблице 2
представлена электрофореграмма фрагментов
нуклеотидной последовательности анализируемого
гена В. melitensis 280.
Как показано в таблице 2, у анализируемого
штамма отсутствует смешение сигналов, что
свидетельствует об отсутствии в культуре
посторонних видов бактерий.
Проводят построение филогенетического древа с
нуклеотидными последовательностями 16S rDNA
гена, филогенетически наиболее связанных
микроорганизмов. Для построения
филогенетических деревьев используют
программное обеспечение - Mega 3.1. Используют
алгоритм ClustalW для выравнивания нуклеотидных
последовательностей, построение древ проводят с
использованием метода присоединения ближайших
соседей (Neiighbor-Joining NJ), который приведен в
таблице 3.
Как видно из таблицы 3, анализируемый штамм
находится на одной филогенетической ветви с
разновидностями рода Brucella.
Результаты идентификации штамма по гену 16S
rRNA приведены в таблице 4.
Как показано в таблице 4, учитывая высокую
степень однородности нуклеотидной
последовательности гена 16S rDNA у всех
разновидностей Brucella spp. (~100%), проведенный
анализ не позволяет проводить видовую
идентификацию бруцелл.
Пример 2. Культуры бактерии Brucella melitensis
В-0122 выращивают на твердой питательной среде в
течение 3 суток с последующим их смывом 0,5%
фенолизированным раствором, полученную
бактериальную суспензию фильтруют через
двойной марлевый фильтр, определяют количество
микробных клеток и прогревают в водяной бане при
температуре 80°С в течение 1 ч при постоянном
помешивании. Затем полученную взвесь бруцелл
проверяют на чистоту и стерильность путем высева
на питательные среды, центрифугируют при
6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную
жидкость удаляют, а осадок доводят 0,5%
формалинизированным физиологическим раствором
до 100 млрд. микробных клеток в 1,0 см3
и
расфасовывают по 50,100, 200 см3
в стерильные
флаконы, которые закрывают резиновыми пробками
и хранят в рефрижераторе при 4-8°С до
приготовления бруцеллезного антигена для ПРА,
РА, РСК/РДСК и КР с молоком.
Использование предложенного штамма, который
эпизоотически актуален для Республики Казахстан,
позволяет получать максимальный выход
бактериальной массы для изготовления антигенов
при серологической диагностики бруцеллеза
сельскохозяйственных животных. Изготавливаемые
из штамма бактерии Brucella melitensis В-0122 S-
антигены для серологических реакции ПРА, РА,
РСК/РДСК и КР с молоком при диагностике
бруцеллеза животных являются чувствительными и
специфичными и позволяют дополнительно
выявлять инфицированных животных к известным
антигенам.

4. 28920
4
Таблица 1
Результаты идентификации гена 16S rDNA
Наименование
штамма
Нуклеотидная последовательность гена 16S г DNA штамма В.
melitensis 280
Идентификация нуклеотидных
последовательностей в международной базе
данных BLAST
Инвентарныйномер
GeneBank(Accesion
number)
Наименованиештамма
%совпадения
JN571438. 1 Brucella melitensis
100
СР003177. 1 Brucella abortus
100
СР003174. 1 Brucella canis
100
СР003174. 1 Brucella canis
100
Штамм В. melitensis
В-0122
AGCGGCAGACGGGTGAGTAACG
CGTGGGAACGTACCATTTGCTAC
GGAATAACTCAGGGAAACTTGTG
CTAATACCGTATGTGCCTTCGGG
GGAAAGATTTATCGGCAAATGAT
CGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGT
TGGTGGGGTAAAGGCTCACCAA
GGCGACGATCCATAGCTGGTCTG
AGAGGATGATCAGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCC
TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA
TATTGGACAATGGGCGCAAGCCT
GATCCAGCCATGCCGCGTGAGTG
ATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAG
CTCTTTCACCGGTGAAGATAATG
ACGGTAACCGGAGAAGAAGCCC
CGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCC
GCGGTAATACGAAGGGGGCTAG
CGTTGTTCGGATTTACTGGGCGT
AAAGCGCACGTAGGCGGACTTTT
AAGTCAGGGGTGAAATCCCGGG
GCTCAACCCCGGAACTGCCTTTG
ATACTGGAAGTCTTGAGTATGGT
AGAGGTGAGTGGAATTCCGAGT
GTAGAGGTGAAATTCGTAGATAT
TCGGAGGAACACCAGTG
СР003174. 1 Brucella canis
100
Таблица 2
Электрофореграмма фрагмента нуклеотидной последовательности гена 16S rDNA штамма В280

5. 28920
5
Таблица 3
Дендрограмма, построенная на основании гена 16S rDNA
Таблица 4
Результат идентификации гена 16S г DNA штамма В. melitensis 280
Наименование Результат идентификации
Brucella melitensis 280 Brucella spp.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм бактерии Brucella melitensis 280 В-0122
депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов Товарищества с ограниченной
ответственностью «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»,
используемый для приготовления бруцеллезного
антигена при диагностике бруцеллеза
сельскохозяйственных животных.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч