1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29971
(51) C21N 7/00 (2006.01)
A61K 39/145 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0421.1
(22) 03.04.2014
(45) 15.06.2015, бюл. №6
(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич; Даулбаева
Клара Дакишевна; Карамендин Кобей Омертаевич;
Асанова Сауле Естаевна; Саятов Марат Хусаинович;
Касымбеков Ермухаммет Торебекович; Жуматов
Кайнар Хамзаевич; Хан Елизавета Яковлевна
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Институт
микробиологии и вирусологии" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Кадырманов А.И., Саятов М.Х.,
Карамендин К.О. И др. Филогенетическая
характеристика казахстанских изолятов вируса
гриппа диких птиц H1N2. Материалы
международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы вирусологии,
микробиологии, гигиены и эпидемиологии,
иммунобиологии. Алматы, с.56-61, 2012.
(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ
А/ОЗЕРНАЯ ЧАЙКА/АТЫРАУ/4378/10(Н1N2),
ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
(57) Изобретение относится к области вирусологии
и может быть использовано при создании тест-
систем для диагностики гриппозной инфекции птиц,
а также проведения фундаментальных
молекулярно - биологических исследований.
Задачей изобретения является получение нового
штамма А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (H1N2) с
целью приготовления на его основе тест-систем для
диагностики вируса гриппа с подтипом НА Н1 и
выявления к нему специфических антител в
сыворотках крови птиц.
Штамм вируса гриппа А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2) по структуре
гемагглютинина близок к вирусу
A/duck/Zhejiang/0224-06/2011 (H1N2), отличается от
А/красноносый нырок/Балхаш/4523/201(H1N2)
аминокислотной заменой Lys39→Arg и от
референсного штамма А/утка/Альберта/35/1976
(H1N1) заменами Аlа15→Ilе, Thr44→Ser и
Thr99→Asn. По М-гену вирус А/озерная
чайка/Атырау/4378/2010 (H1N2) входит в кластер
чайковой линии, сформированной в основном
вирусами с подтипом НА Н13. Штамм
А/красноносый нырок/Балхаш/4523/201(H1N2)
относится к кластеру вирусов с НА Н1, Н8, H11
европейской птичьей линии, выделенных в Корее и
на юге Китая в 2003-2007 гг.
Штамм репродуцируется в системе куриного
эмбриона при оптимальной (37°С) температуре до
инфекционного титра 5,75 lg ЭИД 50/0,2 мл,
обладает высокой гемагглютинирующей (1:512) и
иммуногенной активностью (титр иммунной
сыворотки в РТГА -1:1280, термостабильным
гемагглютинином, хорошо агглютинирует
эритроциты различных видов животных и человека
«0» группы, характеризуется высокой скоростью
элюции с эритроцитов кур, проявляет
ингибиторорезистентность к нативным и прогретым
сывороткам крови курицы, морской свинки, крысы,
кролика, барана и лошади.
Штамм депонирован в коллекции
микроорганизмов РГП на ПХВ «НИИ проблем
биологической безопасности» КН МОН РК за
номером депозита М-2-13/Д. Предлагаемый штамм
рекомендуется для приготовления диагностических
препаратов (антигена, иммунной сыворотки, тест-
системы), которые могут быть использованы в
вирусологических лабораториях при расшифровке
этиологии эпизоотических вспышек гриппа и
оценки напряженности популяционного иммунитета
у диких и домашних птиц.
(19)KZ(13)A4(11)29971

2. 29971
2
Изобретение относится к области вирусологии и
может быть использовано при создании тест-систем
для диагностики гриппозной инфекции птиц, а
также проведения фундаментальных молекулярно -
биологических исследований.
Наличие природного резервуара вирусов гриппа А
(семейства Orthomyxoviridae рода А),
поддерживаемого птицами водного и околоводного
комплексов, а также некоторыми видами
млекопитающих, определяет риск формирования
новых антигенных вариантов, в том числе с
высоким эпидемическим потенциалом, что было
подтверждено развитием пандемий прошлого
столетия. Вирусы гриппа А гемагглютинином (НА)
Н1 явились причиной возникновения трех
пандемий: «испанского гриппа» 1918-1919 гг.,
«русского гриппа» 1978-1979 гг., а также новой
пандемией 2009 г., вызванной реассортантом двух
свиных вирусов американского и евразийского
кластеров: 6 сегментов он пробрел (РВ2, РВ1, РА,
НА, NP и NS) от американского, а два NA и М от
евразийского. Как и у всех вирусов гриппа А, в нем
присутствует генетический материал от птичьих
вирусов [Dawood F.S., Jain S., Finelli L. et al.
Emergence of a novel swine-origin influenza A (H1N1)
virus in humans // New Engl. J. Med. 2009.Vol. 361.
P. 1-10. Zimmer S.M., Burke D.S. Historical
perspective - emergence of influenza A(H1N1)
viruses//N.Engl.J.Med. 2009. Vol. 361. P. 279-285.
Львов Д.К. Новые и возвращающиеся инфекции
северной Евразии - глобальные последствия //
Вестник РАМН.- М.-Медицина. 2011. №5. c.5-12.
Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Меркулова Л.Н.
и др. Этиотропная терапия гриппа: Уроки последней
пандемии // Вестник РАМН. М. Медицина. 2011.
№5. c.35-40.]. В связи с этим прогностическое
значение может иметь надзор за циркуляцией
вирусов, включающий изоляцию и идентификацию
эпидемических штаммов, изучение их
биологических и молекулярно-генетических
свойств, а также оперативное выявление новых
антигенных серовариантов.
Задачей изобретения является получение нового
штамма А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (H1N2) с
целью приготовления на его основе тест-систем для
диагностики вируса гриппа с подтипом НА Н1 и
выявлении к нему специфических антител в
сыворотках крови птиц.
В 2010 г. на атырауском побережье Каспия
(Западный Казахстан) из помета озерной чайки
выделен штамм вируса гриппа А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 [Кыдырманов А.И.,
Саятов М.Х., Карамендин К.О. и др.
Филогенетическая характеристика казахстанских
изолятов вируса гриппа диких птиц H1N2 // Мат-лы
межд. науч.-практич. конф. «Актуальные пробл.
вирусол., микробиол гигиены, эпидемиол. и
иммунобиол.» К 100-летию акад. АН КАЗ ССР,
д.м.н., проф. X Ж. Жуматова. Алматы, 19 окт. 2012 г.
c.56-61.], антигенно близкий к эталонам
A/duck/Alberta/35/76 (H1N1) и А/swine/Guandong/
1/2009 (H1N2), с иммунными сыворотками к
которым в РТГА он взаимодействовал до 1/2-1/4
гомологичных титров (1:640,1:1280. Со
специфическими сыворотками к вирусам с
подтипами HA Н2-Н16 получены отрицательные
результаты (табл. 1).
Ферментативная активность изолята А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 подавлялась
моноспецифической сывороткой к NA N2, с
диагностическими сыворотками, содержащими
антитела к нейраминидазе (NA) N1, N3-N9
получены отрицательные результаты (табл.2).
Таким образом, результаты представленные в
таблицах 1 и 2, показывают, что штамм А/озерная
чайка/Атырау/4378/2010 имеет антигенную формулу
H1N2.
Циркуляции вируса гриппа с подобным
подтипом НА среди диких пернатых на территории
Казахстана не отмечалось в последние 10 лет и его
появление в популяциях водоплавающих птиц в
регионе совпало с пандемией «свиного гриппа
H1N1» 2009 г.
Штамм депонирован и хранится в коллекциях
микроорганизмов РГП на ПХВ «НИИ проблем
биологической безопасности» КН МОН РК
(№ депонента М-2-13/Д) и лаборатории экологии
вирусов РГП на ПХВ «Институт микробиологии и
вирусологии» КН МОН РК.
Генетический анализ. Выделение вирусной РНК
осуществляли с использованием набора QIAamp
Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hidden)
[QIAampR
Viral RNA Mini Handbook 12.-2005.].
Обратную транскрипцию проводили с
ревертазой AMV reverse transcriptase (Promega,
Madison) при помощи npaftMepaUni 12.
Амплификацию кДНК выполняли с
использованием праймеров, рекомендованных для
секвенирования сегментов генома вирусов гриппа А
[Кыдырманов А.И., Саятов М.Х., Карамендин К.О. и
др. Филогенетическая характеристика казахстанских
изолятов вируса гриппа диких птиц H1N2 // Мат-лы
межд. науч.-практич. конф. «Актуальные пробл.
вирусол., микробиол гигиены, эпидемиол. и
иммунобиол.» К 100-летию акад. АН КАЗ ССР,
д.м.н., проф. X Ж. Жуматова. Алматы, 19 окт.
2012 г. c.56-61.] и набора the Expand High Fidelity
PCR System (Roche Diagnostics, Manheim,
Германия).
Для секвенирования кДНК использовали метод
дидеоксисеквенирования по Сенгеру [QIAamp R
Viral RNA Mini Handbook 12. 2005.].
Секвенирование ДНК проводили на автоматическом
96-капиллярном секвенаторе Genetic Analyser 3730
xl, Applied Biosystems.
Выравнивание секвенированных
последовательностей генов казахстанского изолята
вируса гриппа А с полными нуклеотидными
последовательностями таковых вирусов
американской и евразийской линий проводили по
компьютерной программе BioEdit.
Филогенетический анализ и построение древ
выполнены с помощью программы и MEGA версии
4 методом «присоединения соседей» со значениями
Bootstrap на основе 1000 повторов.

3. 29971
3
Результаты сравнительного филогенетического
анализа последовательностей генов показали, что
казахстанский вирус А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2), также как изолят
А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 (H1N2)
входят в кластер Н1.1.2.
В составе штамма А/озерная чайка
Атырау/4378/10 (H1N2) отсутствуют гены вирусов
гриппа пандемического (А/Алматы/347/2009 -
H1N1) и свиного (A/swine/Guandong/l/2009-H1N2)
происхождений, которые представляют отдельную
линию генетического кластера Н1.3. В
филогенетическом отношении казахстанский изолят
вируса гриппа H1N2 относился к евразийской
птичьей линии (филограмма 1). Наиболее близким
из этой группы к вирусу А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 оказался изолят
A/duck/Zhejiang/0224-06/2011 (H1N2).
циркулировавший в 2009-11 гг. в Китае и Корее,
возможно, вариант подобный этому вирусу явился
донором НА и NA генов казахстанского изолята
H1N2.
По гену НА изолят А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2) отличался от утиного
вируса гриппа А/красноносый
нырок/Балхаш/4523/201(Н1N2) на один нуклеотид,
что привело к замене кодируемой аминокислоты в
положении 39 с Lys на Arg. В отличие от
референсного штамма А/утка/Альберта/35/1976
(H1N1) исследуемый изолят обладает уникальными
аминокислотными заменами: Аlаl5- »Ile, Thr44-»Ser
и Thr99-»Asn.
Штамм А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (H1N2)
значительно отличался от вируса А/красноносый
нырок/Балхаш/4523/2010. Если М-ген первого
относился к чайковой линии, сформированной из
вирусов преимущественно с подтипом НА Н13, то
второй принадлежал к европейской птичьей линии и
к кластеру вирусов с НА HI, Н8, H11,
изолированных от диких уток в Корее и Южном
Китае в 2003-2007 гг. (филограмма 2).
Предлагаемый штамм имеет следующие свойства.
Адаптационные свойства. Вирус А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2) активно
репродуцируются в системе куриных эмбрионов при
оптимальной температуре (37°С) до инфекционного
титра 5,75 lg ЭИД 50/0,2мл, обладает высокой
гемагглютинирующей (1:512- 1-1024) и
иммуногенной активностью (титр иммунной
сыворотки в РТГА 1:1280).
Доступная длительность хранения при -20°С-
2 года.
Свойства агглютинации. Вирус обладает
широким спектром агглютинации эритроцитов
различных видов животных. Он одинаково активно
агглютинирует эритроциты курицы, морской
свинки, лошади, барана, кошки, крупного рогатого
скота и человека «0» группы.
Терморезистентностъ. Штамм обладает
терморезистентным НА, более устойчивым к
прогреванию при +560
С в течение 4 ч, чем
прототипный вирус А/утка/Альберта /35/76 (H1N1).
Ингибиторочувствительностъ. Вирус проявляет
ингибиторорезистентность к нативным и прогретым
сывороткам крови курицы, морской свинки, крысы,
кролика, барана и лошади.
Адсорбционно-элюирующая активность. Штамм
обладает хорошей адсорбирующей способностью по
отношению к эритроцитам кур (90-95%) полностью
элюирует с них через 2 часа инкубации при 370
С.
К штамму А/озерная чайка/Атырау/4378/10
(H1N2) получена кроличья иммунная сыворотка.
Схема иммунизации. Для иммунизации
использовали кроликов породы Шиншилла массой
2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводили
подкожно в область шейных и подключичных
лимфатических узлов путем 15-20 точечных
инъекций концентрированного антиген (100 мкг) в
смеси с полным адъювантом Фрейнда (Sigma).
Через 3 недели кроликов иммунизировали с
адъювантом подкожно и без адъюванта внутривенно
равным количеством антигена. Через 10 дней после
второй иммунизации у животных брали кровь из
краевой вены уха.
Титр иммунной сыворотки к предлагаемому
штамму в РТГА составляет 1:1280.
Приготовленные на основе оригинального
казахстанского штамма А/озерная
чайка/Атырау/4378/2010 (H1N2) диагностические
препараты (антигены, иммунные сыворотки, тест-
системы) могут быть использованы в
вирусологических лабораториях при расшифровке
этиологии эпидемических и эпизоотических
вспышек гриппа, а также для оценки напряженности
популяционного иммунитета у диких и домашних
птиц.
Таблица 1
Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 в РТГА
Иммунная сыворотка к референсному
штамму
Гомологичный
титр
Титр антигемагглютининов к изоляту
А/озерная чайка/Атырау/4378/10
А/duck/Alberta/35/76 (H1N1) 2560 1280
А/swine/Guandong/1/2009 (H1N2) 2560 640
Примечания: - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов.
С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютининов Н2-Н16 получены
отрицательные результаты

4. 29971
4
Таблица 2
Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 в РИНА
Титр антител к подтипу нейраминидазы:Изолят
N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9
А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2)
# >100* # # # # # # #
Примечания - реакция отрицательная;
* - представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности вируса иммунной
сывороткой
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм вируса гриппа А/озерная
чайка/Атырау/4378/10 (H1N2), семейства
Orthomyxoviridae рода А, депонирован в коллекции
микроорганизмов РГП на ПХВ «Научно-
исследовательский институт проблем
биологической безопасности» КН МОН РК под
номером М-2-13/Д, используемый для
приготовления диагностических препаратов.

5. 29971
5
Верстка Н.Киселева
Корректор К.Нгметжанова