1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28575
(51) C12N 1/20 (2006.01)
A61K 39/112 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1187.1
(22) 10.09.2013
(45) 16.06.2014, бюл. №6
(72) Егорова Наталья Николаевна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А. Ветеринарные
препараты. М., 1981, с.233
(54) ШТАММ БАКТЕРИИ SALMONELLA
CHOLERAESUIS B - 0204, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ
ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ПРИ
ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЕЗА СВИНЕЙ В
РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
(57) Изобретение относится к области ветеринарии,
в частности ветеринарной микробиологии и
представляет собой штамм Salmonella choleraesuis В
- 0204, используемый для приготовления антигена
при диагностике сальмонеллеза свиней в реакции
агглютинации.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании
вирулентного штамма Salmonella choleraesuis.
Штамм бактерий штамм Salmonella choleraesuis В
- 0204 Бекон 3 КазНИВИ депонирован в
Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО
«Казахский научно - исследовательский
ветеринарный институт», используемый для
приготовления антигена при диагностике
сальмонеллеза свиней в реакции агглютинации.
(19)KZ(13)A4(11)28575

2. 28575
2
Изобретение относится к области ветеринарии, в
частности ветеринарной микробиологии и
представляет собой штамм Salmonella choleraesuis,
используемый для приготовления антигена для
серологической диагностики сальмонеллеза телят в
реакции агглютинации.
Известен штамм бактерий Salmonella choleraesuis
(ВГНКИ), используемый для изготовления
биофабричного серогруппового антигена группы Д1
для диагностики сальмонеллеза в пробирочной
реакции агглютинации производства Щелковского
биокомбината [Шустер Б. Ю., Малахов Ю. А.
Ветеринарные препараты. М., 1981, с.233].
Недостатком известного штамма является
возможность утраты вирулентности вследствие
длительных пересевов и отсутствие пассажей на
восприимчивых животных (свиньях).
Задачей данного изобретения является получение
высоковирулентного штамма Salmonella choleraesuis
с типичными культурально-морфологическими,
биохимическими, антигенными свойствами.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании
вирулентного штамма Salmonella choleraesuis.
Штамм бактерий Salmonella choleraesuis В - 0204
Бекон 3 КазНИВИ, депонирован в Лаборатории
генофонда микроорганизмов ТОО «Казахский
научно - исследовательский ветеринарный
институт», используемый для приготовления
антигена при серологической диагностике
сальмонеллеза свиней в реакции агглютинации.
Идентификацию штамма бактерий проводят по
основным культурально - морфологическим,
биохимическим и антигенным свойствам, согласно
определителю Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology /Department of Microbiology and
Molecular Genetics: Michigan State University: USA,
2005, Volum 2, Part B, p.764-799. Справочное
издание; URL:http://www.springer.com/series/4157
Manual of Systematic Bacteriology /Department of
Microbiology and Molecular Genetics/Department of
Microbiology and Molecular Genetics: Michigan State
University: USA, 2005, Volum 2, Part B, p.764 - 799.
Селекция штамма. Штамм Salmonella choleraesuis
В - 0204. Штамм Salmonella choleraesuis В - 0204
выделен из желчного пузыря 3 месячного поросенка
(после отъемного возраста), принадлежащего ТОО
ПСЗ «Бекон» Талгарского района Алматинской
области.
Содержимое желчного пузыря засевали
пастеровской пипеткой в мясопептонный бульон
(МПБ). Культивировали в термостате при 37 °С в
течение 18 20 часов. Отмечалось равномерное
помутнение МПБ. Затем с МПБ делали посевы на
висмут - сульфитный агар, среду Эндо и на
мясопептонный агар (МПА). При посеве отдельных
колоний сальмонелл, выделенных с МПА на чашках
Петри, отмечалось, что при пересеве их в МПБ при
20 часах инкубации и дальнейшем пересеве в
одинаковой дозировке 1,0 см3
на 10,0 см3
МПБ
отмечалось неодинаковое накопление бакмассы.
Значительная временная разница в интенсивности
роста, выделенной от теленка культуры, указывала
на неоднородность популяции Salmonella dublin 2 по
репродуктивной активности, накоплению бакмассы
и скорости роста. Исходя из результатов
исследований, в целях получения однородного
популяционного свойства сальмонеллезных
бактерий, обладающих сравнительно короткой
лагфазой, сопровождающейся накоплением более
высоким количеством бактериальной массы, были
проведены исследования по селекции отдельных
колоний сальмонелл с активными ростовыми
свойствами.
С этой целью методом разведений выделяли
клоны сальмонелл, выросших на чашках Петри с
МПА, которые при последующем посеве в пробирки
с МПБ давали наиболее обильный рост. Накопление
бактериальной массы определяли по
сальмонеллезному одномиллиардному
бактериальному стандарту мутности ГИСК им.
Тарасевича. Селекционное выделение клонов,
отличающихся по скорости репродукции, проводили
последовательно трехкратно, затем клоны
размножали и после этого изучали их активность по
наибольшему накоплению бактериальной массы.
В результате проведенного клонирования был
выделен изолят №3 из популяции штамма
Salmonella choleraesuis В - 0204, который был
отобран для дальнейшей работы, так как за 18 часов
культивирования в термостате на МПБ накопление
бактериальной массы составляло более 4,5
миллиардов микробных клеток в 1,0 см3
МПБ. У
остальных клонов этот показатель был несколько
ниже (около 1-1,5 млрд. м. к. / см3
и ниже).
При повторной проверке выбранного штамма
(изолят №3) через 3 месяца после хранения на
полужидком агаре (ПЖА) под вазелиновым маслом
под резиновыми парафинированными пробками
была установлена стабильность клона в быстроте
роста, что указывало на целесообразность его
использования при проведении дальнейших
исследований по отбору штамма для изготовления
диагностического препарата. Изолят №3 был
условно обозначен штаммом Salmonella choleraesuis
В - 0204.
Морфологические признаки. Salmonella
choleraesuis - палочки с закругленными концами,
реже овоидной формы, 2-4 мкм в длину и
0,2 - 0,4 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижные, с
перитрихиально расположенными жгутиками,
капсул не образуют.
Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы
или факультативные анаэробы. Хорошо
развиваются на обычных питательных средах,
оптимальная температура роста 37°С, при рН среды
7,2 - 7,4. На МПБ Salmonella choleraesuis В - 0204
образует равномерное помутнение жидкой среды со
слизистым осадком, на МПА - серовато -
голубоватые опалесцирующие круглые, блестящие,
выпуклые, влажные прозрачные чётко очерченные
колонии, вокруг которых иногда образуются
периферические валики. При хранении культуры
довольно быстро диссоциируют в шероховатые R -
формы. На среде Эндо колонии белого цвета (не
ферментируют лактозу), слегка розоватые,

3. 28575
3
прозрачные, блестящие с ровными краями; на
висмут - сульфитном агаре мелкие черные колонии
с металлическим блеском с окрашиванием участка
среды под колониями в чёрный цвет, на среде
Плоскирева - бесцветные колонии, на среде Левина -
малинового цвета. Для культивирования сальмонелл
используют также среды накопления - селенитовую,
Мюллер - Кауфмана, Киллиана. Учет характера
роста необходимо проводить через 24 - 48 часов.
Биохимические свойства. Отличительной
особенностью сальмонелл, в том числе и штамма
Salmonella choleraesuis В - 0204, является то, что они
не ферментируют лактозу, адонит и сахарозу, не
разлагают мочевину, не образуют на пептонной воде
индол, имеют отрицательную реакцию по Фогес-
Проскауэру, т.е. не образуют ацетил мети л
карбинол. Характерным свойством для Salmonella
choleraesuis В - 0204 является способность в течение
первых суток при вегетации на пептонных средах
(37°С) ферментировать глюкозу, как правило, с
образованием газа. Выделенную чистую культуру
для установления родовой принадлежности
засевают в набор дифференциально-
диагностических сред для определения
биохимической характеристики. Дифференциация
Salmonella choleraesuis В - 0204 проводится при
помощи ряда специальных питательных сред (сред
накопления и дифференциально-диагностических).
На средах с углеводами и многоатомными спиртами
с индикатором Андредэ учитывается
газообразование (путем поплавка) и
кислотообразование по изменению цвета среды при
наличии кислоты, от розового до красного. Бульон
Штерна при положительном результате (разложение
глицерина) принимает интенсивно пурпурную
окраску с чернильным оттенком. Штамм Salmonella
choleraesuis В - 0204 дает положительную реакцию с
метиленовым красным (среда окрашивается в
розово-красный цвет), отрицательную реакцию
Фогес -Проскауэра (желтое окрашивание среды).
Salmonella choleraesuis В - 0204 не ферментирует
мочевину, лактозу, сахарозу, адонит и салицин,
большинство видов не разлагает желатин и не
образует индола. Образование сероводорода и
отсутствие продукции индола, как и аэрогенность,
являются основными характерными признаками
сальмонелл.. Salmonella choleraesuis В - 0204
ферментирует глюкозу, галактозу, маннозу,
фруктозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, манит,
мальтозу, глицерин, дульцит, сорбит, образуют
сероводород, разлагают d- и 1-тартрат.
Сальмонеллы растут на агаре Симмонса (усваивают
цитратно-аммонийные соли). Штамм Salmonella
choleraesuis В - 0204 не изменяет инозит,
раффинозу, салицин; не образует сероводорода. Не
ферментирует мочевину, лактозу, сахарозу, не
разлагает желатин. Ферментирует с образованием
кислоты и газа глюкозу, галактозу, маннозу,
арабинозу, рамнозу, маннит, мальтозу, дульцит,
сорбит, умеренно восстанавливает нитраты в
нитриты, не образовывает индола. Штамм
Salmonella choleraesuis В - 0204 не продуцирует
сероводород, что является его отличительным
признаком от других серотипов сальмонелл.
Антигенная структура. У Salmonella choleraesuis
В - 0204 два основных антигенных комплекса: О-
антиген (соматический) термостабильный 6, 7; Н -
антиген, белковой природы 1-я фаза - с; 2- я фаза
1,5. О- и Н- антигены сальмонелл вызывают
образование различных антител, отличающихся по
характеру агглютината. О - агглютинация
мелкозернистая, клетки соединяются полярными
поверхностями, образуя мелкие агрегаты, для О-
агглютинации культура берется с верхней части
пробирки, для Н - агглютинации - со дна. Н -
агглютинация характеризуется образованием
крупного хлопьевидного рыхлого агглютината,
клетки соединяются своими жгутиками, происходит
их полное обездвиживание.
На основании общности соматических антигенов
сальмонеллы объединены в серологические группы,
которые обозначены прописными буквами
латинского алфавита: А. В, С, D, Е. Всего
насчитывается более 2000 видов сальмонелл.
Современная классификация сальмонелл
основывается на их биохимических свойствах и
антигенной структуре. Род сальмонелла
подразделен на 4 подрода, обозначающихся
римскими цифрами I-IV и отличающихся между
собой по биохимическим признакам, которые
варьируют в зависимости от вида и типа, а иногда
даже от штамма сальмонелл. Salmonella dublin
относится к серологической группе С1. Внутри
группы сальмонеллы дифференцируются на
основании особенностей Н -антигенов, при этом 1-я
фаза обозначается строчными буквами латинского
алфавита, у Salmonella choleraesuis 1-я фаза с; 2-я
фаза 1,5. Штамм Salmonella choleraesuis В - 0204
является эпизоотическим, обладает вирулентными
свойствами для поросят и высокой вирулентностью
для белых мышей (1000 м. к. при подкожном
введении); морских свинок (6×109
м.к. в объеме
2,0 см3
при внутрибрюшинном введении).
За время хранения и при пересевах в
лабораторных условиях штамм Salmonella
choleraesuis не изменил культурально -
морфологических, биохимических свойств, также
патогенность, вирулентность и антигенную
структуру.
Маркерные признаки штамма Salmonella
choleraesuis.
Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,
обладает дыхательным и бродильным типом
метаболизма. Аэроб. Не образовывает сероводорода
и индола, не ферментирует лактозу и сахарозу. При
длительном хранении возможна диссоциация из S- в
R- форму, приобретение лекарственной
устойчивости. Диссоциация в R- форму происходит
вследствие генетической изменчивости. Штамм
имеет плазмиду вирулентности молекулярной
массой 90 kb.
Серологические - при типизации с
диагностическими сальмонеллезным
агглютинирующими сыворотками имеет
постоянную реакцию с поливалентной (А, В, С, Д,

4. 28575
4
Е), О - сывороткой 6, 7 и Н -сывороткой 1 -я фаза -с;
2 -я фаза -1,5.
Патогенные свойства. Штамм Salmonella
choleraesuis В - 0204 обладает патогенными
свойствами для белых мышей массой 16-18
граммов, при внутрибрюшинном введении 0,2 см3
суточной бульонной культуры, вызывая гибель всех
10 мышей. Штамм обладает патогенными
свойствами для морских свинок весом 300-350 г,
вызывает их гибель при внутрибрюшинном
введении 0,5 см3
суточной бульонной культуры
Вирулентность для белых мышей. Штамм
Salmonella choleraesuis В - 0204 обладает
выраженной вирулентностью для белых мышей
массой 16-18 граммов, вызывая гибель 100%
животных при подкожном введении 1000 м. к. в
дозе 0,2 см3
на 2 - 3 сутки. После гибели белых
мышей чистая культура Salmonella choleraesuis В -
0204, не контаминированная посторонней
микрофлорой, высевалась из печени и сердца на
МПБ, МПА.
Пример. Питательной средой для получения
бакмассы при изготовлении антигена для
серологической диагностики сальмонеллезного
телят служит бульон Хоттингера (200 -250 мг%
аминного азота), содержащий 10% печеночного
экстракта, 0,4% пептона. Для приготовления
питательной среды используют основной перевар
Хоттингера. На 1,0 кг мясного фарша добавляют
15 дм дистиллированной воды, подогретой до 40°С,
и подщелачивают 20% раствором едкого натра, так
чтобы концентрация водородных ионов была 7,8 -
8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют
150,0 -170,0 г измельченной поджелудочной железы
свиньи или 18,0 - 20,0 г панкреатина и на каждый дм
смеси -10 см3
хлороформа.
Ферментативное расщепление должно
продолжаться 5 -6 сут при 40 -45°С. Химические
показатели качественного перевара: общий азот -
800,0 -1200,0 мг%; аминный азот -500,0 -750,0 мг%;
триптофан - 100,0 - 150,0 мг%. Содержание (мг%)
общего азота определяют методом перегонки
Къельдаля; аминного азота (мг%) - формольным
титрованием; триптофана (мг%) -методом Пешкова.
Приготовление печеночного экстракта. На
400,0 г свежей или свежезамороженной печени к. р.
с. или свиней, освобожденной от жира и пленок,
измельченной на кусочки по 30,0 - 50,0 г добавляют
5,0 см3
дистиллированной воды и кипятят в течение
часа, после чего фильтруют через ватно - марлевый
фильтр.
Приготовление питательной среды. Для
приготовления питательной среды к надосадочной
жидкости основного перевара Хоттингера
добавляют дистиллированную воду с таким
расчетом, чтобы содержание аминного азота было
не менее 200 -250 мг%. Затем добавляют 10%
печеночного экстракта, 0,4% пептона, 3- 4% агара.
Смесь кипятят в течение 30 минут, затем
устанавливают рН среды до 7,7 -7,8 путем
добавления 20% едкого натра, добавляют 15%
дистиллированной воды на выкипание, после чего
добавляют 0,3% химически чистого хлорида натрия.
После растворения указанных ингредиентов
добавлением 20%> едкого натра устанавливают рН
7,8 - 9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1 -1,5
часа, фильтруют через ватно -марлевый фильтр.
Для контроля стерильности приготовленную
питательную среду засевают на питательные среды:
МПА, МПБ, МППБ.
Готовая питательная среда должна быть
стерильной, прозрачной или слегка
опалесцирующей, рН 7,4 -7,6 и содержать аминный
азот 200, 0 -250,0 мг%.
Приготовление посевного материала. Для
изготовления антигена для серологической
диагностики сальмонеллеза телят каждый раз
используют отдельную ампулу с
лиофилизированной сальмонеллезной культурой.
Каждый раз проверяют морфологические,
культуральные и биохимические свойства и
антигенные свойства штамма Salmonella choleraesuis
В - 0204 с монорецепторными сыворотками О - VI,
VII и Н - с (1я фаза); Н - 1,5 (1я фаза). Бактерии
штамма Salmonella choleraesuis В - 0204
агглютинируются сыворотками О - VI/++++/, VII
/++++/, Н - с /+++/, Н -1,5/+++/. Ампулу с лиофильно
высушенной культурой штамма вскрывают и
добавляют в нее 2,0 см3
стерильного
физиологического раствора. Полученную взвесь
заливают по 1,0 см3
в два флакона с бульоном
Хоттингера (вместимость флакона 100,0 см3
, объем
среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате 14 -
15 часов при температуре (37+1,0)°С (культура
первой генерации).
Культуру первой генерации проверяют на
чистоту микроскопией мазков, окрашенных по
Граму, типичность роста, стерильность и засевают
50,0 см3
в бутыль, содержащую 100,0 см3 бульона
Хоттингера (культура второй генерации).
Культивирование проводят при (37+1,0)°С
18-20 часов. Культура второй генерации служит
посевным материалом для получения в
последующем биомассы.
Выращенную и проверенную на чистоту
суточную матриксную культуру второй генерации с
соблюдением условий стерильности засевают в
бутыли со стерильной питательной средой,
охлажденной до 37 - 30°С из расчета 5-10%
матриксной расплодки к общему объему
питательной среды, одновременно добавляют 0,1%
(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40%
раствора глюкозы 5-10%.
Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 18-
20 часов при (37+1,0)°С с постоянным
перемешиванием и непрерывной аэрации при
(37+1,0)°С. В процессе выращивания культуры
через 5-6 часов после засева берут пробу для
определения рН, чистоты роста и концентрации
микробных тел.
Добавляют 40% раствор глюкозы и продолжают
выращивать еще в течение 4 -6 часов.
Использование штамма Salmonella choleraesuis В
- 0204 позволит диагностики сальмонеллезного
аборта овец в реакции агглютинации.

5. 28575
5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм бактерий штамм Salmonella choleraesuis
В-0204 Бекон 3 КазНИВИ, депонирован в
Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО
«Казахский научно - исследовательский
ветеринарный институт», используемый для
приготовления антигена при диагностике
сальмонеллеза свиней в реакции агглютинации.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч