1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29373
(51) A61K 39/112 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0237.1
(22) 28.02.2014
(45) 25.12.2014, бюл. №12
(72) Егорова Наталья Николаевна; Мусаева Асия
Кыблашевна; Даугалиева Аида Тлековна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) Егорова Н.Н., Мусаева А.К., Канатов Б.К.
Диагностика и профилактика сальмонеллезного
аборта овец // Вестник сельскохозяйственной науки.
Бишкек, 2012, №6, с.238-243
(54) ШТАММ БАКТЕРИИ SALMONELLA
ABORTUS - OVIS B - 0272, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ
ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ЖИВОЙ
ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО
АБОРТА ОВЕЦ
(57) Изобретение относится к области ветеринарии,
в частности ветеринарной микробиологии и
представляет собой штамм Salmonella abortus - ovis
В-0272, используемый для приготовления сухой
живой вакцины против сальмонеллезного аборта
овец.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании
аттенуированного безвредного и иммуногенного
штамма Salmonella abortus - ovis.
Штамм бактерии Salmonella abortus - ovis B-0272
NS-5, используемый для приготовления сухой
живой вакцины против сальмонеллезного аборта
овец, депонирован в Лаборатории генофонда
микроорганизмов ТОО «Казахский научно -
исследовательский ветеринарный институт.
(КазНИВИ).
(19)KZ(13)A4(11)29373

2. 29373
2
Изобретение относится к области ветеринарии, в
частности ветеринарной микробиологии и
представляет собой аттенуированный штамм
Salmonella abortus-equi Е-841, используемый для
приготовления сухой живой вакцины
сальмонеллезного аборта кобыл.
Известен штамм бактерии В-0066 Salmonella
abortus-ovis АН 9/2, используемый для получения
инактивированной вакцины против
сальмонеллезного аборта овец [Егорова Н. Н.,
Мусаева А. К., Канатов Б. К. Диагностика и
профилактика сальмонеллезного аборта овец//
Вестник сельскохозяйственной науки. - Бишкек.-
2012. - №6.- с.238-243].
Известный штамм бактерии В-0066 Salmonella
abortus-ovis АН 9/2 не обладает высокой
иммуногенной активностью.
Задачей данного изобретения является получение
аттенуированного со слабой остаточной
вирулентностью и высокой иммуногенной
активностью штамма.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в изыскании
аттенуированного безвредного и иммуногенного
штамма Salmonella abortus - ovis.
Штамм бактерии Salmonella abortus - ovis В -
0272 NS-5 депонирован в ТОО «Казахский научно -
исследовательский ветеринарный институт»
(КазНИВИ), используемый для приготовления
сухой живой вакцины против сальмонеллезного
аборта овец.
Идентификацию штамма бактерии проводят по
основным культурально - морфологическим,
биохимическим и антигенным свойствам, согласно
определителю Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology /Department of Microbiology and
Molecular Genetics: Michigan State University: USA,
2005, Volum 2, Part B, p. 764 - 799.
Селекция штамма. Штамм Salmonella abortus -
ovis В - 0272 NS-5 выделен из костного мозга
абортированного плода овцематки, принадлежащей
СХПК ПЗ «Алматы» Талгарского района
Алматинской области.
Костный мозг из бедренной кости засевали
пастеровской пипеткой в мясопептонный бульон
(МПБ). Посевы культивировали в термостате при
37°С 18-20 часов. Отмечалось равномерное
помутнение МПБ. Затем с МПБ делали посевы на
висмут - сульфитный агар, среду Эндо и на
(мясопептонный агар) МПА. При посеве отдельных
колоний сальмонелл, выделенных с МПА на чашках
Петри, отмечалось, что при пересеве в МПБ при 20
часах инкубации и дальнейшем пересеве в
одинаковой дозировке 1 см3
на 10,0 см3
МПБ
отмечалось неодинаковое накопление бакмассы.
Значительная временная разница в интенсивности
роста культур указывала на неоднородность
популяции Salmonella abortus - ovis по своей
репродуктивной активности. Исходя из результатов
исследований, в целях получения однородного
популяционного свойства бактерий, обладающих
сравнительно короткой лагфазой,
сопровождающейся накоплением более высокой
бактериальной массы, были проведены
исследования по селекции отдельных колоний
штамма сальмонелл с активными ростовыми
репродуктивными свойствами.
После отбора активных клонов Salmonella abortus
- ovis культуру высевали на МПА с добавлением
возрастающих концентраций стрептомицина в
разведениях 1:25, 1: 50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:
300 мкг/см3
. Культуру выращивали на МПА с
постепенно возрастающими концентрациями
стрептомицина. Путем селекции штамма Salmonella
abortus - ovis на МПА при максимальной
концентрации антибиотика (1:250 мкг/см3
) путем
ступенчатого отбора колоний получен
аттенуированный (ослабленный) штамм,
выращенный при максимальной концентрации
стрептомицина. Методом разведений выделяли
аттенуированные клоны сальмонелл, выросших на
чашках Петри с МПА со стрептомицином, которые
при последующем посеве в пробирки с МПБ давали
наиболее обильный рост. Накопление
бактериальной массы сальмонелл определяли по 1
миллиардному оптическому сальмонеллезному
бактериальному стандарту мутности ГИСК им.
Тарасевича. Селекционное выделение клонов
сальмонелл, отличающихся по скорости
репродукции и выросших на МПА с концентрацией
стрептомицина 1:300 мкг/см3
, проводили
последовательно двукратно, затем клоны
размножали и после этого изучали их активность по
наибольшему накоплению бактериальной массы и
активности роста на средах с добавлением
стрептомицина. Стрептомицин ослабил
вирулентные свойства эпизоотического штамма в 30
раз.
В результате проведенного клонирования был
выделен изолят 5 из популяции штамма Salmonella
abortus - ovis, который был выбран для дальнейшей
работы, так как за 18 часов культивирования в
термостате на МПБ с добавлением 1:300 мкг/см3
стрептомицина накопление бактериальной массы
составляло более 3 миллиардов микробных клеток в
1 см3
МПБ. У остальных клонов этот показатель был
несколько ниже (около 1 млрд м. к. /см3
).
При повторной проверке выбранного штамма
(изолят №5) через 3 месяца после хранения на
полужидком агаре под вазелиновым маслом под
резиновыми парафинированными пробками была
установлена стабильность клона в быстроте роста на
средах, что указывало на целесообразность его
использования при проведении дальнейших
исследований по отбору штамма для изготовления
вакцинного препарата. Изолят №5 был условно
обозначен штаммом Salmonella abortus - ovis В-0272
NS-5, который депонирован в коллекции культур
микроорганизмов ТОО «Научно-исследовательский
ветеринарный институт».
Морфологические признаки. Salmonella abortus -
ovis В-0272 NS-5 - палочки с закругленными
краями, реже овоидной формы, 2-3 мкм в длину и
0,2 - 0,4 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижные, с
перитрихиально расположенными жгутиками, легко
окрашиваются анилиновыми красками,

3. 29373
3
грамотрицательные. Спор и капсул не образуют.
Salmonella abortus - ovis являются самыми мелкими
по размеру по сравнению с другими видами
сальмонелл.
Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы
или факультативные аэробы. Хорошо развиваются
на обычных питательных средах, оптимальная
температура роста 37°С, при pH среды 7,2 - 7,4. На
МПБ Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5 образует
равномерное помутнение со слизистым осадком, на
МПА - серовато - голубоватые мелкие
опалесцирующие колонии, вокруг которых иногда
образуются периферические валики. При хранении
культуры довольно быстро диссоциируют в R -
форму. На среде Эндо сальмонеллы образуют слегка
розоватые прозрачные колонии; на висмут -
сульфитном агаре мелкие черные колонии с
металлическим блеском, участки среды под
колонией также окрашиваются в черный цвет; на
среде Плоскирева - бесцветные колонии. На среде
Клиглера сальмонеллы растут в виде мелких
колоний ярко желтого цвета. Для культивирования
сальмонелл используют также среды накопления -
селинитовую, Мюллера, Кауфмана, Киллиана. Учет
характера роста необходимо проводить через 24 - 48
часов.
Биохимические свойства. Штамм Salmonella
abortus-equi В - 0147 Е- 841 не изменяет инозит,
глицерино - фуксиновый бульон, раффинозу,
салицин; не образует сероводорода и индола. Не
ферментирует мочевину, лактозу, сахарозу, не
разлагает желатин. Ферментирует с образованием
кислоты и газа глюкозу, галактозу, маннозу,
арабинозу, рамнозу, маннит, мальтозу, дульцит,
сорбит, восстанавливает нитраты в нитриты.
Сальмонеллы растут на агаре Симмонса (усваивают
цитратно-амонийные соли). Реакция Фогес-
Проскауэра отрицательная (желтое окрашивание
среды).
Антигенная структура. У Salmonella abortus - ovis
В-0272 NS-5 имеется два основных антигенных
комплекса: О - антиген (соматический)
термостабильный, Н - антиген (термолабильный),
белковой природы. О антиген- 4, 12, Н-с (1-я фаза),
1,6 (2-я фаза). О- и Н- антигены вызывают
образование различных антител, отличающихся по
характеру агглютината. О - агглютинация
мелкозернистая, клетки соединяются полярными
поверхностями, образуя мелкие агрегаты. Н -
агглютинация характеризуется образованием
хлопьевидного рыхлого агглютината, клетки
соединяются своими жгутиками, происходит полное
обездвиживание сальмонелл. Salmonella abortus -
ovis В-0272 NS-5 относится к серологической
группе В.
Для идентификации сальмонелл путем
иммунизации кроликов готовят монорецепторные
сыворотки к каждому антигену (например, к О -
антигенам 4, 12 и т. д. и Н - антигенам с, 1, 6, с и
др).Сначала определяют по О - антигену групповую
принадлежность сальмонелл (реакция агглютинации
на стекле), затем при помощи Н - монорецепторных
сывороток устанавливают типовую
принадлежность. Знание антигенной структуры
сальмонелл необходимо при отборе штаммов в
процессе конструирования вакцинных препаратов.
Штамм Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5
является аттенуированным (ослабленным)
вакцинным, не реактогенным, не обладает
абортогенными свойствами для суягных овцематок.
Штамм обладает слабой остаточной
вирулентностью. За время хранения в лабораторных
условиях штамм не изменил культурально -
морфологические, биохимические свойства, также
антигенную структуру.
Маркерные признаки штамма Salmonella abortus -
ovis В-0272 NS-5.
Штамм Salmonella abortus - ovis B-0272 NS-5,
полученный из вирулентной эпизоотической
культуры под влиянием химического мутагена
стрептомицина с последующей селекцией мутантов,
отличается слабой остаточной вирулентностью,
безвредностью, выраженной иммуногенной
активностью, отсутствием абортогенных свойств.
Образовывает сероводород, не продуцирует и
индол, не ферментирует лактозу и сахарозу.
Маркерным признаком является отсутствие
продукции сероводорода. Является прототрофом.
Существенным отличием от штамма Salmonella
abortus - ovis В-0272 NS-5 от вирулентного
прототипа является ауксотрофность в отношении
тиамина и никотиновой кислоты; штамм образует
аргинин - декарбоксилазу и слабо-лизин-
декарбоксилазу. Вакцинный штамм не реверсирует
при пассировании на восприимчивых животных
(белые мыши). Штамм растет на средах с
добавлением высоких концентраций стрептомицина,
природные эпизоотические изоляты не растут,
стрептомицин подавляет их рост. Титр сыворотки в
РА 1:800 - 1: 1600.
Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,
обладает дыхательным и бродильным типом
метаболима. Аэроб.
Серологические - при типизации с
диагностическими сальмонелезными сыворотками
имеет постоянную реакцию с О - сывороткой 4, 12 и
Н сыворотками - с (1-я фаза), 1,6 (2-я фаза).
Патогенные свойства. Штамм Salmonella abortus
- ovis В-0272 NS-5 безвреден для белых мышей. При
внутрибрюшинном введении белым мышам массой
16-18 г в дозе 100 млн микробных клеток (0,2 см3
500 млн взвеси суточной агаровой культуры
сальмонелл) по стандартному образцу ГИСК им.
Тарасевича в объеме 0,2 см3
вызывает гибель более
2 белых мышей в течение 10 сут наблюдения.
Иммуногенность для белых мышей. Штамм
Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5 обладает
выраженной иммуногенностью для белых мышей
массой 16 - 18 граммов, защищая 100% животных
при однократной подкожной иммунизации их живой
вакциной из штамма Salmonella abortus - ovis В-0272
NS-5 в дозе 10 млн микробных клеток в объеме
0,2 см3
и последующим подкожным заражением
через 21 сутки 2,5 LD50 смывом суточной агаровой
культуры вирулентного (контрольного) штамма
Salmonella abortus - ovis 372. Выживаемость

4. 29373
4
опытных животных составила 100% - 10 голов. Из
10 контрольных мышей аналогичной массы,
зараженных одновременно с вакцинированными,
погибли 8 животных. Срок наблюдения 10 суток.
Пример. Питательной средой для изготовления
сухой живой вакцины против сальмонеллезного
аборта овец служит бульон Хоттингера
(200-250 мг% аминного азота), содержащий 10%
печеночного экстракта, 0,4% пептона. Для
приготовления питательной среды используют
основной перевар Хоттингера. На 1 кг мясного
фарша добавляют 1,5 дм3
дистиллированной воды,
подогретой до 40°С, и подщелачивают 20%
раствором едкого натра, так чтобы концентрация
водородных ионов была 7,8-8,0. Затем на каждый
килограмм фарша добавляют 150-170 г
измельченной поджелудочной железы или 18-20 г
панкреатина и на каждый дм3
смеси - 10 см3
хлороформа.
Ферментативное расщепление должно
продолжаться 5 -6 сут при 40 - 45°С. Химические
показатели качественного перевара: общий азот -800
- 1200 мг%; аминный азот -500 -750 мг%; триптофан
- 100 150 мг%. Содержание (мг%) общего азота
определяют методом перегонки Къельдаля;
аминного азота (мг%) - формольным титрованием;
триптофана (мг%) - методом Пешкова.
Приготовление печеночного экстракта. На 400,0
г свежей или свежезамороженной печени крс или
свиней, освобожденной от жира и пленок,
измельченной на кусочки по 30,0-50,0 г, добавляют
0,5 дм3
дистиллированной воды и кипятят в течение
часа, после чего фильтруют через ватно-марлевый
фильтр.
Приготовление питательной среды. Для
приготовления питательной среды к надосадочной
жидкости основного перевара Хоттингера
добавляют дистиллированную воду с таким
расчетом, чтобы содержание аминного азота было
не менее 200 -250 мг%. Затем добавляют 10%
печеночного экстракта, 0,4% пептона, 3-4% агара.
Смесь кипятят в течение 30 минут, затем
устанавливают pH среды до 7,7 - 7,8 путем
добавления 20% едкого натра, добавляют 15%
дистиллированной воды на выкипание, после чего
добавляют 0,3% химически чистого хлорида натрия.
После растворения указанных ингредиентов
добавлением 20% едкого натра устанавливают pH
7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1-1,5
часа, фильтруют через ватно - марлевый фильтр.
Для контроля стерильности приготовленную
питательную среду выдерживают термостате 72
часа при 37°С (отсутствие крнтаминации). Готовая
питательная среда должна быть стерильной,
прозрачной или слегка опалесцирующей, pH 7,4-7,6
и содержать аминный азот 200-250 мг%.
Приготовление посевного материала. Для
изготовления сухой живой вакцины против
сальмонеллезного аборта кобыл каждый раз
используют отдельную ампулу с
лиофилизированной культурой штамма Salmonella
abortus - ovis В-0272 NS-5. Каждый раз проверяют
морфологические, культуральные, биохимические
свойства и агглютинабельность штамма, с
монорецепторными сыворотками О - IV, XII и Н - с;
1,6 производства Краснодарской биофабрики и
Санкт- Петербургского научно-исследовательского
института вакцин и сывороток и предприятия по
производству бактерийных препаратов. Бактерии
штамма Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5
агглютинируются сыворотками О - IV/++++/,
ХII/+++/, Н - с/+++/, 1,6/+++/. Ампулу с сухим
штаммом вскрывают и добавляют в нее 2 см3
стерильного физиологического раствора..
Полученную взвесь заливают по 1 см3
в два флакона
с бульоном Хоттингера (вместимость флакона
100 см3
, объем среды - 1/3 флакона). Выращивают в
термостате 14 -15 часов при температуре (37±1,0)°С
(культура первой генерации).
Культуру первой генерации проверяют на
чистоту микроскопией мазков, окрашенных по
Граму, типичность роста, стерильность и засевают
50 см3
в бутыль, содержащую 10 дм3
бульона
Хоттингера (культура второй генерации).
Культивирование проводят при (37±1,0)°С
18-20 часов. Культура второй генерации служит
посевным материалом для получения в
последующем биомассы.
Выращенную и проверенную на чистоту
суточную матриксную культуру второй генерации с
соблюдением условий стерильности засевают в
бутыли со стерильной питательной средой,
охлажденной до 37 - 30°С из расчета 5-10%
матриксной расплодки к общему объему
питательной среды, одновременно добавляют ОД %
(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40%
раствора глюкозы 5-10%.
Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 18-
20 часов при (37±1,0)°С с постоянным
перемешиванием и непрерывной аэрации при
(37±1,0)°С. В процессе выращивания культуры
через 5-6 часов после засева берут пробу для
определения pH, чистоты роста и концентрации
микробных тел. Добавляют 40% раствор глюкозы и
продолжают выращивать еще в течение 4-6 часов.
Выращенную культуру проверяют на чистоту
популяции путем микроскопии и высева в пробирки
с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, агар
Сабуро, на чашки Петри с МПА. Культура должна
агглютинироваться монорецепторными
сыворотками О - IV, XII и Н - с; 1,6. После
получения результатов, подтверждающих
отсутствие загрязнения посторонней микрофлорой
выращенной культуры (просмотр посевов,
микроскопия мазков, окрашенных по Граму),
производят определение концентрации микробных
клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК
им. Тарасевича. Бактериальную м массу хранят при
температуре от 2 до 4°С 1-1,5 суток. Культура
сальмонелл должна иметь концентрацию 30 млрд
микробных клеток в 1 см3
и pH 7,2 - 7,4.
Бактериальную суспензию, разведенную средой
для лиофилизации (сахарозо-желатиновой средой)
до концентрации 30 млрд ±1 млрд микробных
клеток в 1 см3
по оптическому стандарту мутности
ГИСК им. Тарасевича, расфасовывают по 4 см3
в

5. 29373
5
стерильные ампулы. Погрешность расфасовки ±1%.
После этого ампулы с вакциной подвергают
лиофильной сушке и запаивают под вакуумом.
Штамм Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5
получен из вирулентного штамма Salmonella
abortus- ovis, являющегося основным возбудителем
сальмонеллезного аборта овец на территории
республики, под влиянием стрептомицина. Штамм
Salmonella abortus - ovis В-0272 NS-5 обладает
типичными культурально-морфологическими,
биохимическими и антигенными свойствами.
Вирулентность вакцинного штамма по сравнению с
природным прототипом снижена в 30 раз.
Предложенный штамм Salmonella abortus - ovis
В-0272 NS-5 эпизоотически актуален для
овцеводческих хозяйств Республики Казахстан,
изготовленная сухая живая вакцина является
эффективной в профилактике сальмонеллезного
аборта овец. Вакцина безвредна для суягных
овцематок, обладает высокой иммуногенной
активностью, защищает овцематок от абортов
сальмонеллезной этиологии.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм бактерии штамм Salmonella abortus - ovis
В-0272, депонирован в ТОО «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»,
используемый для приготовления сухой живой
вакцины против сальмонеллезного аборта овец.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова