Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
DƯƠNG THỊ THU HOÀI
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG
(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : CNSH-CNTP
Khoá học : 2015-2019
Thái Nguyên, năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
DƯƠNG THỊ THU HOÀI
Tên đề tài
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG
(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Lớp : K47 - CNSH
Khoa : CNSH-CNTP
Khoá học : 2015-2019
Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình
Thái Nguyên, năm 2019

i
LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng
(Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”.
Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu
nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề
tài nghiên cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian
thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cám ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện
tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ
dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời
gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,
thành công trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 03 tháng 6 năm 2019
Sinh viên thực hiện
Dương Thị Thu Hoài

ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn
Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] ...............................................................8
Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................25
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung
dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ....35
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái
sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy)........................37
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................39
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài
P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)....................................................41
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả
năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )........44
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân
nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................47
Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ).......................49
Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy).......................51

iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa
CNSH-CNTP ...........................................................................................11
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài
P.micranthum...........................................................................................28
Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2
đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .......................36
Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. ......................................................37
Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum......38
Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh
chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ..............................39
Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)...........40
Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ......................................41
Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P.
micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ........................................................42
Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh
chồi lan hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ). .............................43
Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng
nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)............45
Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân
nhanh chồi lan Hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )...................46
Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) .......................................47

iv
Hình 4.12. Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) .......................................48
Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .......................................50
Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................51
Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) .......................................52
Hình 4.16. Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của
lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ......................................53

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
B5 : Gamborg cs, 1976
BAP : 6-Benzyl amino purine
CS : Cộng sự
CT : Công thức
CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động
Đ/C : Đối chứng
LSD : Least Singnificant DifferenceTest
MS : Murashighe và Skoog, 1962
MT : Môi trường
GA3 : Gibberellic acid
NAA : α-Napthalene acetic acid
IAA : Indole-3-acetic acid
IBA : Indole-3-butyric acid
IUCN : International Union for Conservation of Nature and
Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên
Quốc tế
P. micranthum : Paphiopedilum micranthum
P. malipoens : Paphiopedilum malipones
WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

vi
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v
MỤC LỤC..................................................................................................................vi
Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu............................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................3
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn...............................................................................................3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum)................................................................4
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc .....................................................................................4
2.1.2. Đặc điểm hình thái ...........................................................................................5
2.1.3. Sinh thái ............................................................................................................6
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam......................................................................7
2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum ................................................................10
2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam ......................10
2.2.2. Hình thái..........................................................................................................10
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum..................11
2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng ..............................12
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật..........Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật...........Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.............. Error!
Bookmark not defined.
2.3.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật...................................13

vii
2.3.4. Môi trường dinh dưỡng...................................................................................14
2.3.5. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào...........................................................18
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước .......19
2.4.1. Trên thế giới....................................................................................................19
2.4.2. Trong nước......................................................................................................21
Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......25
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu............................................................25
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu........................................................................25
3.1.2. Hoá chất sử dụng.............................................................................................25
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu...........................................................................25
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................26
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu.........................................................................................26
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................26
3.2.3. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................26
3.3. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................26
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử
trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng........................................................26
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum..................................................................26
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và
hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân
mang mầm ngủ..........................................................................................................26
3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P.
micranthum. ..............................................................................................................27
3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................27
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro............................................................27
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống..............................................28
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................28
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................33

viii
3.5.1. Thu thập số liệu...............................................................................................33
3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu...............................................................................34
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................35
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng
HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng .................................................................35
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái
sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum............................................37
4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ
tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang
mầm ngủ....................................................................................................................39
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan
Hài P. micranthum ....................................................................................................39
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài
P. micranthum...........................................................................................................41
4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng
nhân nhanh chồi lan P. micranthum..........................................................................43
4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh
chồi lan P. micranthum .............................................................................................46
4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.
micranthum từ mầm ngủ ...........................................................................................48
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P. micranthum..............................................................................49
4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh của lan Hài P.micranthum...............................................................................51
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................54
5.1. Kết luận ..............................................................................................................54
5.2. Kiến nghị............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế
giới, được công nhận là một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái
của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc
đáo không có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy
nhiên tập trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và
Châu Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một
trong nhiều loài phong lan đẹp. Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có
158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê và phát
hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên
thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á. Trong các
loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong
phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam. Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào
mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam.. Có thể thấy 22 loài lan hài
thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự
đa dạng cho các loài lan hài Việt Nam. Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc
và kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan trong nước mà còn hấp dẫn khách chơi
lan ngoại quốc do vậy những người đi săn lan hài sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở
những vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác. Việc thu hái như vậy đã gây nên những tác
động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng. Điều này đã đẩy các loài lan hài của Việt Nam
rơi vào nguy cơ tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18].
Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ (Paphiopedilum micranthum) là một trông số
loài lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa giữa
hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa và môi là
điều hấp dẫn nhất đối với những người trồng và lai tạo Lan Hài. Hoa thường nở vào
dịp tết. Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam (tập trung
tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây,

2
Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc). Là loài Hài rất quý mới được phát hiện và được
ưa chuộng ở thị trường trong và ngoài nước [30].
Giống như thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P.micranthum cũng bị
khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiến chngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài
Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự
nhiên của chúng. Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng như vậy việc bảo tồn, phát
triển loài lan này hết sức cần thiết.
Đặc thù riêng của lan Hài P. micranthum là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy
mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan Hài Mốc Hồng có
nguy cơ rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Vì vậy việc nghiên cứu
nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn
gen thực vật quý hiếm. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các
loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những
phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất
lượng cây thấp và số lượng cây ít…Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân
giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số
lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp
truyền thống không thực hiện được. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định
về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng của thị
trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt
chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả
năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương
pháp in vitro ”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nhân giống thành công chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ bằng kĩ thuật
nuôi cấy in vitro.

3
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu
quả tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ
lan Hài P. micranthum.
- Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm
ngủ.
- Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào
kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế
cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân
giống cây lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp
phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan Hài P. micranthum bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng lớn cây lan Hài P. micranthum góp phần bảo
tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho
nghiên cứu khoa học.

4
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum)
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
2.1.1.1. Phân loại
Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan
(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành
hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng
dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi
sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ
ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác.
Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở
các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.
- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25
loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ
Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.
Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông,
Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales),
phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín
(Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1].
2.1.1.2. Nguồn gốc
Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt
Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và
miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế.
Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu
mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi

5
là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong).
Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực
hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự
giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một
nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là
dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1], [19].
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất
đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:
- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá
mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều
có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1].
- Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và
mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên
thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc
khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá
có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển
hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1].
- Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm
ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống
hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có
cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có
lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy
từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá
hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có
lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.
- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh
hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với
các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp

6
hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu
tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở
mặt ngoài [1].
Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè
xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn.
Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ
ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi
sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.
Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực
hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn
cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài
lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1].
- Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả
mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ
phấn từ sáu đến mười tháng [1].
- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và
thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội
nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1].
2.1.3. Sinh thái
Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân
bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m,
nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-
2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay
rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.
Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài
sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc,
các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc
trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá
và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ

7
cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m.
Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao.
Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải
qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi
tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng
phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của
các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự
hình thành và phát triển của quần thể lan Hài.
Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi.
Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các
sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan
Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay
đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính
gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1].
2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam
Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng
như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành
kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam
Á.
Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm,
tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 22 loài thuộc chi Paphiopedilum,
Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không
những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm
mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [5]. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu
lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự
nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan
Hài càng biến mất nhanh chóng [6].
Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài
trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức

8
bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1]
Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt)
Đã bị tuyệt chủng
ngoài thiên nhiên
P. vietnamense Hài Việt
Đang bị tuyệt
chủng trầm trọng
p. delenatii Hài Đỏ
Đang bị tuyệt
chủng
P.  aspersum
P. barbigerum var. lokianum
P. callosum
P. dianthum
P. emersonii
P. gratrixianum
P. hangiannum
P. helenae
P. henryanum
P.  herrmannii
P. malipoense var. jackii
P. malipoense
P. micranthum
P. purpuratum
P. tralienianum
Chưa rõ tên gọi
Hài Lộc
Hài Vân
Hài Xoắn
Hài Hương Lan
Hài Đuôi công
Hài Hằng
Hài hê len
Hài Henry
Hài Herman
Hài Jack
Hài Giáp
Hài Mốc Hồng
Hài Tía
Hài Trần liên
Sắp bị tuyệt chủng
P. appletonianum
P. concolor
P. hirsutissimum var. chiwuawnum
P. hirsutissimum var. esquirolai
P. villosun var. annamense
Hài Cánh Sen
Hài Gia Định
Hài Tiên biến dị
Hài Tiên
Hài Lông
Thiếu dẫn liệu
P.  affine
P.  datalanse
P. villosum var. boxalli
Hài Hoà
Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt
Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự
suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều
tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu
rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19].
Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số
lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng

9
các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến
tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy
cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến
mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái.
Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong
những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và
xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không
có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu
có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài
lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1].
Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu
quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai
gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc
hữu.
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia
về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên
cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình
hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác
giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004
[1].
Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc
biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:
- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà
(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.
- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn
loài P. callosum.
- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà
Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P. dalatensis.
- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò
(Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P. micranthum.

10
- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.
hangianum, P. malipoense varijackii.
- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum.
- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.
- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha
đang bảo tồn loài P. malipoense.
Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải
kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng
năm 2005 [27, 28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành
công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi
cấy mô khác nhau.
2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum
2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam
2.2.1.1. Nguồn gốc
Paphiopedilum micranthum được tìm thấy từ miền bắc Việt Nam đến phía tây
và bắc Quảng Tây, đông nam Vân Nam và phía tây Quý Châu (Trung Quốc), ở độ cao
360 - 1600 m. Cây được tìm thấy trên các vách đá, kẽ nứt bao gồm xác lá mục, đá vôi
và đất sét. Khu vực này chịu sương mù vào mùa đông và mưa lớn từ cuối mùa xuân
đến mùa hè.
2.2.1.2 Phân bố
Lan Hài P.micranthum chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh
Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn) và vùng Quảng Tây, Quý Châu, Vân
Nam (Trung Quốc)[20].
2.2.2. Hình thái
- Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường
kính 2-3 mm.
- Dạng lá: Có 3 - 5 lá xếp thành 2 dãy; thân rễ có đường kính 2 - 3 mm, dài đến
25 cm. Lá thường hình thuôn - bầu dục, dài 5 – 12, rộng 1,5 - 2 cm, mặt trên màu lục
với các đốm to màu lục thẫm, mặt dưới có nhiều chấm màu tím - tía.

11
- Dạng hoa: Cụm hoa có cuống dài 9 - 25 cm, mang 1 hoa. Hoa không có mùi,
thường màu hồng hay vàng nhạt, thẫm hơn về chóp, rộng 3 cm, dò hoa dài 9 - 25 cm,
hoa như một chiếc muôi lớn dài 10 cm, rộng 5 - 6 cm có mạng gân màu đỏ tía thẫm.
Lá đài hình trứng dài 1,5 - 3,6 cm, rộng 1,7 - 3 cm, hơi uốn ngược lại ở mép
bên, từ hình bầu dục tới hình trứng ngược, nhọn và có rãnh tới chóp.
Cánh hoa hình trứng ngược rộng, chóp tròn dài 1,9 - 4,3cm, rộng 2,3 - 4,4 cm,
có lông mép và nhiều lông dài màu trắng ở mặt trong.
Môi hình trứng rộng, lõm sâu, mép cuốn vào trong dài 5 – 10, rộng 3,4 - 5,6 cm.
Nhị lép lồi, hình thuôn rộng hay hình bầu dục, dài 5 - 10 mm.
- Dạng quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt.
Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.
- Dạng rễ: Rễ chùm, màu nâu.
Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum
tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP
2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum
2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng
- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung,
những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình,
ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với
điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C.
- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài ưa

12
ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000 lux [25].
Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lá màu xanh
đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng
- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong
mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá
nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ
với 50% độ ẩm là lý tưởng.
2.2.3.2. Nhu cầu bón phân
Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung
khoáng Ca2+
40mg/l và Mg2+
20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân,
nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể
trồng có dấu hiệu mục nát [6].
2.2.3.3. Giá thể trồng
P. micranthum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than
củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt
mùa sinh trưởng của cây lan [8].
2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng
- Phương pháp tách chiết thông thường: Lan Hài Mốc Hồng là loài đơn thân
nên chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cột
chặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và
vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm
chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợp cho sự phát
triển lâu dài của cây [6].
- Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống
lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một
cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát triển 1cây/năm
thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triệu cây/năm. Các loài lan Hài
thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went
có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin...trong điều

13
kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ
phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng
hay chồi bên, cọng hoa, lá, đốt thân hoặc rễ [6].
2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân
hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử phát
triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm
nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn chế, đặc
biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa được khám phá.
Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
2.3.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay
bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá...), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá
mầm...), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ..) [16].
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau,
trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy
việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất
lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và
khả năng nuôi cấy [16].
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ
biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi
sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả
năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu 1quả vô trùng tuỳ
thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá
chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-
hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất
kháng sinh(gentamicin, ampixilin...) [16].

14
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với
mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ
cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi
sinh vật. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in
vitro. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phút
sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử
trùng ở 121°C trong 25-30 phút có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [6].
- Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu
tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian
chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự
phát sinh hình thái mô nuôi cấy [13].
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của
mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường
độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000(lux), ngoài ra chất lượng ánh
sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ
làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong
ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng
của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh
sáng có cường độ 2000 - 2500(lux) người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách
bình nuôi cấy từ 35 – 40(cm).
- Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20
C [13].
2.3.3. Môi trường dinh dưỡng
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận,
các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như
duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [11].

15
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các
thành phần chính sau:
2.3.3.1. Nguồn Cacbon
Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do
không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường
nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-
30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose,
sorbitol, glucose, maltose, lactose,....những loại đường này chỉ dùng trong những
trường hợp cá biệt [13].
2.3.3.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có
trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản
để tổng hợp chất hữu cơ [11]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng
trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng
[15].
- Nguyên tố đa lượng:
Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [14]
+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật
sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữu cơ.
+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác
dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường.
+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O
+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O
+ Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4
+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4
- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên tố vi
lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá
trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy.

16
2.3.3.3. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa số
tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp,
có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin thường được sử dụng nhiều
nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin
B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy
và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy
[8].
- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường
nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [16].
- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng
trao đổi chất [16].
- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [16].
- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham
gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [16].
2.3.3.4. Các chất hữu cơ tự nhiên
- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,
các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [16].
- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [16].
- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [16].
- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh… [16]
2.3.3.5. Các thành phần khác
- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ
như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn... Ngoài tác
dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào,
mô nuôi cấy [8].
- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế
sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá
khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [16].

17
2.3.3.6. pH của môi trường
Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của
mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng
từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy
sản sinh ra các acid hữu cơ.
2.3.3.7. Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường
nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả
của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà
sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [16].
Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm:
Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế
bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [16].
- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là
Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà
khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ
thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có
nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể
như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng
sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh
sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích
thích sự phân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài
ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm
sự rụng lá [16].
Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA
(các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếu đến
mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ
trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi,
NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây

18
độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [6].
- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu
tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của
hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim.
Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thực vật,
cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc
ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự
phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ,
ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu
thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin.
Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [10].
Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ
biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng
kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng
TDZ, Diphenylurea... [10].
- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà
khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô
đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính
trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích
thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin
được sử dụng nhiều nhất [10].
2.3.4. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào
Một qui trình nhân giống in vitro cơ bản gồm các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn
tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới cho hiệu quả cao.
Giai đoạn 2: Khử trùng mẩu cấy, ở giai đoạn này một phần thích hợp của thực
vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng.
Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3.
Giai đoạn 3: Tăng sinh. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá

19
thể bằng sự tự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồi tăng
trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn 4.
Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro. Ở giai đoạn này những chồi đạt chiều cao thích hợp
sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ. Trong môi trường này cần phải bổ sung
auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh.
Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vitro, với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ
được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước
2.4.1. Trên thế giới
Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay
tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho
hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường. Vì vậy, phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời
gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏi nguy cơ
tuyệt chủng.
Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck
năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều
phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên cứu đã
thành công:
Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi
có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất
khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu
hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu
từ hạt [24].
Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [26] và phương
pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983 [21].
Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng
tạo chồi từ chồi nách của cây in vitro được nuôi cấy kéo dài [22].
Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt

20
một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm [25].
Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P.
philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM [23].
Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo
chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM [20].
Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân nhanh
giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro. Từ cây con
in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấy trên
môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái
sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái
sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong
3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh [26]. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên
cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là
phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc sau khi
nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo
và một số ít xuất hiện protocorm [27].
Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành công
lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được nuôi cấy kéo dài
in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l, BA 2 mg/l, NAA
0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l [22]. Khi nuôi cấy trong bóng tối
sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ
thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thân cây.
Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con
giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65mM [21]
Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con
hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian
để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp
khác [24].

21
Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng
mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác của
Paphiopedilum.
2.4.2. Trong nước
* Về các nghiên cứu điều tra, sưu tập, lưu giữ, bảo tồn lan.
- Đề tài “Điều tra tài nguyên di truyền các loài lan rừng Vườn quốc gia Cát Tiên
(VQGCT) và nghiên cứu các biện pháp nhân nhanh để bảo tồn” của Tiến sỹ Nguyễn
Văn Kết.
- Khoa Nông Lâm thuộc trường Đại học Đà Lạt. VQGCT là nơi có sự tập trung
với mật độ khá dày các loại lan rừng quý hiếm tại Việt Nam (ở đây có tới 100 chi và
gần 400 loài trên tổng số 152 chi và 897 loài lan của cả nước). Được biết, tình trạng
khai thác bừa bãi diễn ra liên tục trong thời gian dài và không có kế hoạch gây trồng
đã làm cho nhiều loài lan đứng trước nguy cơ tuyệt chủng ngay tại VQGCT. Sau hơn
01 năm nghiên cứu, đã nhân giống thành công bằng biện pháp nuôi cấy mô gần 30
giống lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT). Trong số các giống lan đã
được nhân giống thành công tại Khoa Nông lâm Đại học Đà Lạt có nhiều loài rất quý
được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như kim hài, vân hài, lan P. concolor,...
(trong đó có một số loài còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh như Ludisia discolor,
Kim tuyến...). Việc nhân giống thành công các loài lan đặc hữu không chỉ cho phép
bảo tồn các nguồn gen quý hiếm bằng cách di thực các giống lan này trở lại trồng tại
VQGCT mà còn tạo điều kiện để nhân rộng các giống phong lan quý ở các địa bàn
khác (nhất là trồng tại vùng trồng hoa nổi tiếng Đà Lạt).
- Đề tài “Nghiên cứu chọn lọc và phát triển một số loài lan rừng có triển vọng
phục vụ cho công tác nhân giống, lai tạo và bảo tồn nguồn gien đặc hữu, quý hiếm của
Lâm Đồng” của Viện Sinh học Tây Nguyên công bố tháng 10/2008. Kết quả đã xác
định được 73 loài lan rừng có hoa to, lâu tàn, màu sắc đẹp, có giá trị kinh tế và được
nhiều người ưa chuộng có thể đưa vào nhân giống phục vụ sản xuất kinh doanh. Ngoài
ra đã xác định được tên khoa học của 189/209 loài lan rừng phân bố trên địa bàn Lâm
Đồng mà đơn vị đã thu thập, khảo sát. Trong đó có 3 loài mới và 37 loài đặc hữu thuộc

22
loại quý hiếm của Việt Nam như lan Hài hồng, Huyết nhung trơn, Hài vân, Hài Đà
Lạt... Hiện các loài lan thu thập được ngoài tự nhiên đều đang phát triển tốt, có khả
năng ra hoa ở điều kiện của khí hậu Đà Lạt.
- Đề tài: “Điều tra, thu thập đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây hoa cảnh khu vực
miền Bắc Việt nam do Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp chủ trì.
Kết quả của đề tài đã chỉ ra khu vực Tây bắc có trên 18 chi lan khác nhau, trong đó
phải kể đến các chi Hoàng thảo (Dendrobium), Dáng Hương (Aerides), Ngọc điểm
(Rhynchostylis), Kiếm (Cymbidium), Hài (Paphiopedilum), v.v,...
- Đề tài: “Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam và lưu giữ chúng ở 2
vùng: miền núi phía Bắc và đồng bằng Bắc bộ” do GS. TSKH. Trần Duy Quý – Viện
Khoa học nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm, từ năm 2007 – 2009. Kết quả đã điều
tra, thu thập, định danh và lưu giữ nguồn gen cho nhiều loài lan rừng thuộc 10 chi
khác nhau (Hài vệ nữ, Hồ điệp, lan Kiếm, Hoàng thảo, Quế lan hương, Vanđa, Catlan,
Phượng vĩ, Hạc đính và Đai châu) và lưu giữ chúng ở 2 nơi: Vùng núi Tam đảo và
vùng đồng bằng Hà nội với quy mô 2.000 dò (chậu)/ 1.500m2
vườn nuôi trồng
* Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài
Lan Hài đỏ (Hài hồng - P. delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được nhân
giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều
lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học
Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài đỏ. Các cây sau khi
được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng
đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi
môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc
1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo
chồi rất nhanh, ,mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua
đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính [9].
Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan Hài đỏ-
một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng kỹ thuật gây vết

23
thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc
sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp
với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu
ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau
khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và
ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có
bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao
nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung
1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất [7], [27].
Năm 2006, tác giả Đặng Xuyến Như và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
các cây con của hai loài lan Hài Hằng (P. hangianum) và Hài Tam Đảo (P.
gratrixianum) bằng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm và kỹ thuật gây vết thương trên
cây con trong ống nghiệm. Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1
– 2mm, rộng chừng 1mm, chứa rất ít và hầu như không có chất dinh dưỡng để tạo điều
kiện cho hạt nảy mầm. Do đó nếu gieo hạt trong môi trường đất hạt rất dễ bị mất mát
và khó nảy mầm. Từ những kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu do PGS-TS Đặng
Xuyến Như phụ trách đã xây dựng được quy trình nhân giống hai loài lan Hài quý trên
bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm. Đồng thời họ cũng tìm ra phương pháp
tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng và Hài Tam Đảo.
Không dừng tại đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những
cây con nói trên trong vườn ươm [12].
Hoàng thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro giống lan
hài Hằng (P.hangganumperner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt lấy từ quả
6-10 tháng tuổi. Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58-67%).
Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung 150ml/l nước dừa và 100mg/l
chuối cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung
0,4 – 0,6 mg/l NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất [5].
Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cộng sự (2014) về lan Hài Hồng cho
thấy các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5

24
mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và
được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân,
sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các
năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình
10.5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu
được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện
chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên không nhận
thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt
với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các
đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt
thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [7; 9].
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan
Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l và
TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần.
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp P.
malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân
chồi 3,28 lần.
Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân
Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 2mg/l
+ Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.

25
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Loài lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum)
được thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Thái Nguyên và được lưu giữ tại
nhà lưới khoa CNSH&CNTP.
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Một số chất kích thích sinh trưởng .
+ Một số thành phần dinh dưỡng hữu cơ (nước dừa, dịch chiết chuối ).
+ Đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Mốc Hồng.
3.1.2. Hoá chất sử dụng
- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, thuỷ ngân clorua (HgCl2).
- Môi trường MS, B5, WPM đường sacharose, agar, ...
- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin (IAA ,IBA,
NAA,...), nhóm cytokinin (BA,...), nhóm gibberellin (GA3)
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Thiết bị Dụng cụ
Cân phân tích Pank
Máy khuấy từ Dao kéo
Máy đo PH Đèn cồn
Lò vi sóng Cốc đong, ống đong
Nồi hấp vô trùng Bình tam giác
Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri)
Hệ thống giàn đèn Chun nịt
Máy cất nước Túi nilon
Box cấy vô trùng Giấy thấm

26
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí
nghiệm Khoa CNSH&CNTP.
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2
đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm
ngủ lan Hài P. micranthum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất
hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi và ra rễ từ mầm ngủ lan Hài P. micranthum.
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa
CNSH&CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.3. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 1/2019 – tháng 5/2019
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử
trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2
đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân mang mầm ngủ, lan Hài P. micranthum.
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái
sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum.
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và
hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân
mang mầm ngủ.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P.
micranthum từ mầm ngủ.

27
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh
chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi
lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.
3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P.
micranthum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan
Hài P. micranthum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan
Hài P. micranthum.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro
- Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước
dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6 - 5,8.
- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có
hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.
- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210
C, áp suất 1,0 atm trong 15 phút.
- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ
phòng từ 220
C – 25o
C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang
chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.

28
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P.micranthum
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công
nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC
± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 –
2500 lux.
- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên
hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 30 bình, mỗi bình 1
mẫu.
3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch
HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau:
- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là các đoạn thân của cây lan Hài
P.micranthum có mang chồi ngủ, chồi nách đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết
phần đất bẩn, cắt bỏ phần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lại bằng
nước cất.
Đoạn thân mang chồi ngủ
Khử trùng (cồn 70º, HgCl2)
Tái sinh chồi
Nhân nhanh chồi
Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

29
- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn
70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp
bằng dung dịch HgCl2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu
lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần
mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy.
- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ
phòng từ 220
C – 25o
C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang
chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian khử trùng mẫu trong
dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.
Các công thức được bố trí như sau:
Hóa chất Công thức Thời gian (phút)
CT1 (Đ/C) 0
HgCl2 0.1%
CT2 5
CT3 10
CT4 15
HgCl2 0.15%
CT5 5
CT6 10
CT7 15
HgCl2 0.2 %
CT8 5
CT9 10
CT10 15
3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả
năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum.
- Mẫu vô trùng, được cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các
thành phần khoáng khác nhau với chất bổ sung Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước
dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến
khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum
Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

30
CT Môi trường Chất bổ sung
1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L
+ Nước dừa 150 ml/L +
Inositol, pH 5,6 – 5,8.
2 Gamborg’s (B5)
3 Woody Plant Medium (WPM)
- Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường tái
sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi,
quan sát chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh.
3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và
hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ
đoạn thân mang mầm ngủ.
- Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi
trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là
thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar
5,5 g/l + Inositol 100mg/l , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng
(NAA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan
P.micranthum từ mầm ngủ.
Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển
sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + NAA ở các nồng độ khác nhau
để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan
P.micranthum từ mầm ngủ.

31
Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển
sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để
theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân
nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ.
Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi
trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi ở thí nghiệm 3) +
GA3 ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
CT 1(Đ/c): MT nền + A + GA3 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + A + GA3 0,1 mg/l
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh
chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.
Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi
trường nền + nồng độ dịch chiết chuối để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.
CT 1 (Đ/c): MT nền + dịch chiết chuối 0 g/l
CT 2: MT nền + dịch chiết chuối 100 g/l

32
3.4.3.4.Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
của lan Hài P. micranthum.
- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT
nền có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.
- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.
CT 1 (Đ/c): MT nền + IAA 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + IAA 0,3 mg/l
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
của lan Hài P. micranthum.
- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm : MT
nền có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.
- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.
CT 1 (Đ/c): MT nền + IBA 0,0 mg/l
CT 2: MT nền + IBA 0,3 mg/l

33
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu
3.5.1. Thu thập số liệu
- Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết.
- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.
- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.
3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi
- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu
+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:
Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
+ Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:
Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100%
+Tỷ lệ mẫu chết:
Tổng số mẫu chết (mẫu)
Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100%
- Chỉ tiêu theo dõi chồi:
Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu)
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100%
Tổng chồi thu được
Hệ số nhân chồi (lần) = × 100%
Tổng chồi nuôi cấy

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (17)

Similar to Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

Similar to Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro