Nghiên Cứu Khả Năng Phân Hủy NAPHTHALENE Của Một Số Chủng Vi Khuẩn Phân Lập Từ Mẫu Đất Nhiễm Dầu

1. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA MÔI TRƯỜNG
--------------------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NAPHTHALENE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP
TỪ CÁC MẪU ĐẤT NHIỄM DẦU
Người thực hiện : NGUYỄN THỊ THU HỒNG
Lớp : MTC
Khóa : 57
Chuyên ngành : Môi trường
Giáo viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ NHI CÔNG
ThS. LÝ THỊ THU HÀ

2. Hà Nội – 2016
2

3. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA MÔI TRƯỜNG
--------------------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NAPHTHALENE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP
TỪ CÁC MẪU ĐẤT NHIỄM DẦU
Người thực hiện : NGUYỄN THỊ THU HỒNG
Lớp : MTC
Khóa : 57
Chuyên ngành : Môi trường
Giáo viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ NHI CÔNG
ThS. LÝ THỊ THU HÀ
Địa điểm thực tập : Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

4. Hà Nội – 2016
4

5. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong bài khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đều
đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều được chỉ rõ
nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng 1 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hồng
i

6. LỜI CẢM ƠN
Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng
tới TS. Lê Thị Nhi Công- Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công
nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tố Uyên – Phó Trưởng phòng
Công nghệ sinh học Môi trường và toàn thể các cán bộ nhân viên của phòng
đã giúp đỡ chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới
ThS. Lý Thị Thu Hà và ban chủ nhiệm khoa, cùng các thầy cô khoa Môi
trường - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng với ban lãnh đạo Viện Công
nghệ Sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình,
bạn bè và người thân của tôi đã luôn động viện, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực
hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày tháng 1 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hồng
ii

7. MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG........................................................................................ix
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................x
Phần 1................................................................................................................1
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài.........................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu............................................................2
1.2.1.Mục đích nghiên cứu........................................................................2
1.2.2.Yêu cầu nghiên cứu..........................................................................2
PHẦN2: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................3
2.1. Đặc điểm chung của naphthalene...........................................................3
2.1.1. Tính chất vật lý................................................................................3
2.1.2. Tính chất hóa học............................................................................3
2.2. Nguồn gốc phát sinh naphthalene..........................................................5
2.2.1. Nguồn tự nhiên................................................................................5
2.2.2. Nguồn nhân tạo...............................................................................5
2.3. Tình hình ô nhiễm và ảnh hưởng của naphthalene đến môi trường sinh
thái.................................................................................................................7
2.3.1. Tình hình ô nhiễm naphthalene.......................................................7
2.3.2. Tính độc và ảnh hưởng của naphthalene đến môi trường sinh thái
.................................................................................................................10
2.4. Các biện pháp xử lý naphthalene..........................................................13
2.4.1. Phương pháp vật lý........................................................................13
2.4.2. Phương pháp hóa học....................................................................14
2.4.3. Phương pháp phân hủy sinh học....................................................14
2.5. Phân hủy sinh học naphthalene bởi vi sinh vật....................................16
2.5.1. Vi sinh vật phân hủy naphthalene.................................................16
iii

8. 2.5.2. Cơ chế phân hủy naphthalene bởi vi sinh vật................................17
2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy naphthalene của vi sinh
vật................................................................................................................19
2.6.1. Nhiệt độ.........................................................................................19
2.6.2. pH..................................................................................................19
2.6.3. Độ mặn (nồng độ NaCl)................................................................20
2.6.4.Nguồn dinh dưỡng..........................................................................20
2.6.5.Oxy.................................................................................................20
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................................22
3.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................22
3.2. Phạm vi nghiên cứu..............................................................................22
3.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................22
3.4.Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu.....................................22
3.4.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy..................................................22
3.4.2. Máy móc và thiết bị nghiên cứu....................................................23
3.5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................27
3.5.1. Hoạt hóa chủng giống....................................................................27
3.5.2. Khảo sát khả năng sử dụng naphthalene của các chủng vi khuẩn ở
các nồng độ khác nhau............................................................................27
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ NaCl lên sự
phát triển của các chủng vi khuẩn đã chọn..............................................27
3.5.4. Đánh giá khả năng phân hủy naphthalene.....................................29
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................29
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................29
4.1. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở các nồng
độ naphthalene khác nhau...........................................................................30
4.1.1. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở nồng
độ naphthalene 50 ppm............................................................................30
4.1.2. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở nồng
độ naphthalene 100 ppm..........................................................................32
4.1.3. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở nồng
độ naphthalene 150 ppm..........................................................................33
iv

9. 4.1.4. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở nồng
độ naphthalene 200 ppm..........................................................................34
4.1.5. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ở nồng
độ naphthalene 250 ppm..........................................................................36
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ NaCl lên sự phát triển của các
chủng vi khuẩn đã chọn...............................................................................37
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................37
4.2.2. Ảnh hưởng của pH........................................................................40
4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl.......................................................44
4.3. Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi khuẩn ở điều kiện tối
ưu.................................................................................................................47
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................52
5.1. Kết luận................................................................................................52
5.2. Kiến nghị..............................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................53
PHỤ LỤC........................................................................................................60
v

10. DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của naphthalene.................................4
Hình 2.1: Con đường oxy hóa của naphthalene bởi vi khuẩn
(Goyal et al., 1997; Auger et al., 1995; Baboshin et al., 2008;
Denome et al., 1993; Kiyohara et al.,1994).................................18
Hình 4.1: Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm
naphthalene (K mẫu đối chứng không có vi sinh vật).................30
Hình 4.2: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm
naphthalene..................................................................................31
Hình 4.3: Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 100 ppm
naphthalene (K mẫu đối chứng không có vi sinh vật).................32
Hình 4.4: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 100 ppm
naphthalene..................................................................................32
Hình 4.5: Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 150 ppm
naphthalene (K mẫu đối chứng không có vi sinh vật).................33
Hình 4.6: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 150 ppm
naphthalene..................................................................................34
Hình 4.7: Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 200 ppm
naphthalene (K mẫu đối chứng không có vi sinh vật).................35
Hình 4.8: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn...........................................................................................35
trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 200 ppm
naphthalene..................................................................................35
Hình 4.9: Khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi
khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 250 ppm
naphthalene (K mẫu đối chứng không có vi sinh vật).................36
Hình 4.10: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn...........................................................................................36
vi

11. trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 250 ppm
naphthalene..................................................................................36
Hình 4.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng
vi khuẩn Paracoccus sp. ĐG2.5...................................................37
Hình 4.12 : Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Paracoccus
sp. ĐG2.5.....................................................................................38
trên các nhiệt độ khác nhau.........................................................38
Hình 4.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng
vi khuẩn Rhodococcus sp. B17...................................................38
Hình 4.14: Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Rhodococcus
sp. B17 trên các nhiệt độ khác nhau............................................39
Hình 4.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của chủng vi
khuẩn Alcaligenes sp. BQN23....................................................39
Hình 4.16: Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Alcaligenes
sp. BQN23 trên các nhiệt độ khác nhau......................................40
Hình 4.17: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của chủng vi
khuẩn...........................................................................................41
Paracoccus sp. ĐG2.5..................................................................41
Hình 4.18: Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Paracoccus
sp. ĐG2.5.....................................................................................41
ở các giá trị pH khác nhau...........................................................41
Hình 4.19: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của chủng vi
khuẩn...........................................................................................42
Rhodococcus sp. B17..................................................................42
Hình 4.20: Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Rhodococcus
sp. B17.........................................................................................42
ở các giá trị pH khác nhau...........................................................42
Hình 4.21: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của chủng vi
khuẩn...........................................................................................43
Alcaligenes sp. BQN23...............................................................43
Hình 4.22: Khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Alcaligenes
sp. BQN23...................................................................................43
ở các giá trị pH khác nhau...........................................................43
Hình 4.23: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự phát triển của vi
khuẩn Paracoccus sp. ĐG2.5.......................................................44
vii

12. Hình 4.24: Khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn
Paracoccus sp. ĐG2.5..................................................................44
ở các nồng độ muối NaCl khác nhau...........................................44
Hình 4.25: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự phát triển của
chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. B17.........................................45
Hình 4.26: Khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn
Rhodococcus sp. B17..................................................................45
ở các nồng độ muối NaCl khác nhau...........................................45
Hình 4.27: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự phát triển của
chủng vi khuẩn Alcaligenes sp. BQN23.....................................46
Hình 4.28: Khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn
Alcaligenes sp. BQN23 ở các nồng độ muối NaCl khác nhau....46
Hình 4.29: Sắc ký đồ hàm lượng naphthalene có trong mẫu thí
nghiệm.........................................................................................48
chứa chủng vi khuẩn Paracoccus sp. ĐG2.5...............................48
Hình 4.30: Sắc ký đồ hàm lượng naphthalene có trong mẫu thí
nghiệm chứa chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. B17...................48
Hình 4.31: Sắc ký đồ hàm lượng naphthalene có trong mẫu thí
nghiệm chứa chủng vi khuẩn Alcaligenes sp. BQN23................49
Hình 4.32: Biểu đồ thể hiện hiệu suất phân hủy naphthalene của
các chủng vi khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy.....................................49
viii

13. DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm một số chủng vi khuẩn để thử khả năng phân hủy Naphthalene.....24
Bảng 4.1: Ảnh hưởng các điều kiện lên khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng
vi khuẩn...........................................................................................................................47
ix

14. BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
PAHs : Polycyclic aromatic hydrocacbons( hydrocacbon thơm đa nhân)
OD : Optical Density (mật độ quang học)
ppm : parts per million (đơn vị một phần triệu, mg/l)
ng, mg, g, kg : nanogram, miligram, gram, kilogram
nm, µm : nanometer, micrometer
ml, l : mililiter, liter
x 4217425

15. Phần 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay Việt Nam là quốc gia có trữ lượng dầu mỏ cao thứ hai khu
vực Đông Á. Hàng ngày có tới hơn 300 nghìn thùng dầu được khai thác dẫn
đến môi trường ngày càng bị ô nhiễm nặng nề. Nguyên nhân gây ô nhiễm môi
trường bao gồm hiện tượng tràn dầu trong quá trình vận chuyển, khai thác và
sử dụng dầu mỏ, ngoài ra còn có một lượng không nhỏ cặn xăng dầu tồn đọng
trong các kho chứa và các nhà máy lọc dầu. Lượng dầu bị thất thoát này có
chứa các hydrocacbon thơm đa vòng (PAHs - Polycyclic aromatic
hydrocarbons) gây ô nhiễm nước, đất qua đó hủy hoại môi trường sống của
các loài động thực vật, ảnh hưởng tới sức khỏe của con người. Trong số các
hợp chất PAH này, naphthalene được xem là một trong những chất gây ô
nhiễm độc hại hàng đầu. Naphthalene xâm nhập vào cơ thể con người thông
qua đường hô hấp, ăn uống, tiếp xúc qua da, do đó có thể gây ung thư, thiếu
máu tán huyết, tiếp xúc cấp tính gây ra tiệu chứng như buồn nôn, tiêu chảy,
tổn thương thận, vàng da (da có màu vàng hoặc mắt) và tổn thương gan. Vì
vậy việc xử lý naphthalene trong mẫu đất nhiễm dầu càng được quan tâm
hơn.
Trên thế giới đã có nhiều phương pháp xử lý naphthalene như phương
pháp vật lý, phương pháp hóa học…. Các phương pháp này có thể xử lý
nhanh và có hiệu quả cao nhưng không triệt để gây vẫn phát sinh chất ô
nhiễm, chi phí xử lý cao. Từ đó thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu tìm ra
phương pháp phân hủy sinh học vừa tiết kiệm chi phí, hiệu quả xử lý cao và
đặc biệt phục hồi được môi trường ban đầu. Ở Việt Nam cũng đã và đang có
các nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong xử lý các hydrocacbon thơm do dầu
mỏ gây ra, để góp phần làm phong phú số lượng vi sinh vật phân hủy
1

16. hydrocacbon trong đất ô nhiễm dầu chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
khả năng phân hủy naphthalene của một số chủng vi khuẩn phân lập từ
các mẫu đất nhiễm dầu”.
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1.Mục đích nghiên cứu
Đánh giá được khả năng phân hủy naphthalene của một số chủng vi
khuẩn phân lập từ các mẫu đất nhiễm dầu tạo tiền đề để ứng dụng xử lý
naphthalene và một số hợp chất hydrocarbon thơm có trong dầu mỏ.
1.2.2.Yêu cầu nghiên cứu
 Khảo sát để chon lọc được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
trưởng và phát triển tốt trên môi trường chứa naphthalene ở các nồng độ khác
nhau.
 Đánh giá các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl ảnh hưởng đến
khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn được chọn.
 Đánh giá khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi khuẩn khi
nuôi cấy ở điều kiện tối ưu.
2

17. PHẦN2: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Đặc điểm chung của naphthalene
2.1.1. Tính chất vật lý
Naphthalene hay còn gọi là nhựa long não, nhựa trắng, băng phiến, là
một hydrocacbon thơm đa vòng đơn giản nhất, có 2 vòng benzene trong phân
tử. Naphthalene tồn tại ở thể rắn, có màu trắng, với mùi đặc trưng là băng phiến,
ngưỡng mùi phát hiện ở nồng độ thấp 0,08 ppm. Naphathalene có độ hòa tan
trong nước thấp (31.6mg/l ở 25o
C) nhưng tan nhiều trong methanol/ ethanol
(11,3 g/100g ở 25o
C), tan trong các dung môi hữu cơ, rất dễ tan trong ether,
acetone, tan trong butyric acid, axetic acid, trong chloroform, hexan (ATSDR,
2005). Naphthalene khi hòa tan trong sulfur dioxide lỏng có màu xanh lục, màu
vàng khi tan trong phenol. Ngoài ra naphthalene là một dung môi tốt cho nhiều
hợp chất bao gồm các chất vô cơ như phốt pho, iốt, lưu huỳnh và một số các
sunfua kim loại.
Trong số các hợp chất PAH, naphthalene là hydrocarbon đa vòng thơm
dễ bay hơi nhất do cấu tạo bởi 2 vòng benzene và được phân loại vào nhóm
các hợp chất hữu cơ bán bay hơi (VOCs - Volatile organic compounds) do áp
suất hơi trong không khí chỉ có 0,087 mmHg ở 25o
C và nhiệt độ bay hơi
218o
C, đặc biệt thăng hoa ngay ở nhiệt độ thường, nóng chảy 80,2o
C nhiệt độ
bắt cháy là 525o
C. Kiểm tra các hệ số phân vùng octanol - nước (log Kow =
3,01-3,45) cho thấy naphthalene là hợp chất kỵ nước và do đó có thể có xu
hướng hấp thụ các hạt vật chất (ví dụ như các hạt đất và trầm tích) và tích tụ
trong sinh vật (Bates et al., 1997).
2.1.2. Tính chất hóa học
Naphthalene có công thức phân tử là C10H8 và có khối lượng phân tử
bằng 128 g/mol.
3

18. Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của naphthalene
Naphthalene có thể được coi như gồm hai vòng benzene giáp nhau nên
có tính thơm tương tự như benzene.
 Phản ứng thế
Naphthalene tham gia các phản ứng thế dễ hơn so với benzene. Sản
phẩm thế vào vị trí số 1 (vị trí α) là sản phẩm chính.
 Phản ứng cộng hydro (hydro hóa)
 Phản ứng oxi hóa
Naphthalene không bị oxi hóa bởi dung dịch KMnO4. Khi có xúc tác
V2O5 ở nhiệt độ cao nó bị oxi hóa bởi oxi không khí tạo thành anhiđrit phtalic.
Ứng dụng trong sản xuất anhydrit phthalic.
4

19. 2.2. Nguồn gốc phát sinh naphthalene
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh naphthalene tuy nhiên
naphthalene được phát thải vào môi trường từ 2 nguồn chính: nguồn tự nhiên
và nguồn nhân tạo.
2.2.1. Nguồn tự nhiên
Naphthalen được phát hiện năm 1819 bởi A. Garden (BUA,1989), có
trong tự nhiên trong nhiên liệu hóa thạch chiếm 11% trong hắc ín than đá và
1,3% trong dầu thô (BUA, 1989; O'Neil et al., 2001). Cháy rừng cũng góp
phần vào sự có mặt của naphthalene trong môi trường, nó là một sản phẩm tự
nhiên của việc đốt gỗ. Ngoài ra, trong tự nhiên naphthalene được phát sinh từ
hiện tượng núi lửa phun trào, quá trình hình thành đất đá, cháy đồng cỏ, tạo
trầm tích…Tuy nhiên, nguồn naphthalene chính trong khí quyển lại bắt nguồn
từ các hoạt động sản xuất và sinh hoạt của con người.
2.2.2. Nguồn nhân tạo
Trong quá trình sản xuất và sinh hoạt của con người naphthalene phát
thải vào môi trường qua các nguồn khác nhau. Các nguồn phát thải chính bao
gồm:
- Quá trình chưng cất nhựa than đá và dầu mỏ
Naphthalene là thành phần phong phú nhất của nhựa than đá, là sản
phẩm phụ của quá trình chưng cất từ than đá sang than cốc, nhựa than đá điển
hình chứa khoảng 10% naphthalene theo trọng lượng. Naphthalene cũng được
5

20. sản xuất thương mại từ hắc ín than đá hoặc dầu mỏ. Năm 2000, ước tính sản
xuất thương mại naphthalene tại Nhật Bản, Tây Âu, và Hoa Kỳ là 179, 205,
và 107 nghìn tấn.(ATSDR, 2005)
- Quá trình sản xuất công nghiệp
Naphthalene được sản xuất vì mục đích thương mại chủ yếu được sử
dụng trong việc sản xuất các anhydrit phthalic. Naphthalene cũng được sử
dụng trong sản xuất các chất trung gian cho các ngành công nghiệp thuốc
nhuộm; trong sản xuất nhựa tổng hợp, nhựa, khói đèn và khói bột và trong sản
xuất của hydronaphthalene: Tetralin (tetrahydronaphthalene), Decalin
(decahydronaphthalene)) được sử dụng như dung môi, dầu nhờn và nhiên liệu
động cơ (Mason, 1995; Lacson, 2000; O'Neil et al., 2001).
Naphthalene được sử dụng trong chế tạo bê tông, plasterboards, cao su,
sơn và là một chất thuộc da trong ngành da. Naphthalene cũng được sử dụng
cho việc sản xuất của thuốc trừ sâu carbaryl (1-naphthyl-N-methylcarbamat).
Naphthalene là thành phần chính của creosote, của băng phiến - một
hợp chất được sử dụng để bảo vệ gỗ từ côn trùng và nấm, chống gián, mối
mọt trong tủ quần áo. Naphthalene có thể được sử dụng như một chất xông
hơi để xua đuổi bướm đêm trong năm 2000 khoảng 6500 tấn naphthalene đã
được sử dụng: ở Nhật Bản (1100 tấn), Mỹ (450 tấn) và Châu Âu (5000 tấn).
- Quá trình sản xuất nông nghiệp
Trong quá trình sản xuất nông nghiệp do con người sử dụng các loại
thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ naphthalene chúng phát thải vào môi trường
bằng quá trình bay hơi. Nguồn phát thải trong nông nghiệp còn do quá trình
đốt rơm rạ và thân cây đậu, ví dụ ở Trung Quốc lượng naphthalene phát sinh
ra từ đốt rơm rạ ước tính 110-126 tấn/ năm và từ đốt thân cây đậu là 13-26
tấn/ năm (Lu et al., 2009)
Ngoài ra naphthalene còn phát thải vào môi trường không khí từ khí
thải xe cộ, từ khói thuốc lá, quá trình nấu thực phẩm, từ lò đốt rác thải, đốt
6

21. nhang trong nhà và đền thờ ở khu vực châu Á.(Jia và Batterman, 2010)
2.3. Tình hình ô nhiễm và ảnh hưởng của naphthalene đến môi trường
sinh thái
2.3.1. Tình hình ô nhiễm naphthalene
 Trên thế giới
Nhiều loại PAH được tìm thấy trong môi trường không khí, nước và đất
chúng hấp phụ vào các hạt bụi hoặc chất rắn trong đất hoặc trầm tích. Trong
đó naphthalene là hợp chất thường xuyên có mặt trong khí thải công nghiệp,
khói thải của phương tiện giao thông và nước thải của các nhà máy sản xuất
các chất làm dẻo, nhựa, và thuốc trừ sâu và đặc biệt là các nhà máy sản xuất
sản phẩm có chứa dầu mỏ, than đá. Năm 2002, theo báo cáo của EPA trong
chương trình Toxics Release Inventory (TRI) lượng naphthalene phát thải vào
môi trường: 940,2 tấn trong khí thải; 21,5 tấn trong môi trường nước và 166,7
tấn trong môi trường đất. Nồng độ không khí ngoài trời cao nhất đã được tìm
thấy trong vùng lân cận của các nguồn công nghiệp và các khu chứa chất thải
nguy hại. Ví dụ: nồng độ trung bình của naphthalene trong không khí xung
quanh tại năm khu chứa chất thải nguy hại và một bãi rác ở New Jersey trong
khoảng 0,42-4,6 mg/m3
(LaRegina et al.,1986).
Ô nhiễm môi trường nước do naphthalene thường có trong nước thải từ
các ngành công nghiệp hóa chất và dầu khí và do hiện tượng tràn dầu hoặc sự
cố rò rỉ các sản phẩm dầu khí. Naphthalene phát thải vào khí quyển có thể
được vận chuyển vào nước mặt hoặc đất bằng cách lắng đọng ướt hoặc khô.
Khoảng 5% naphthalene phát thải vào môi trường nước chủ yếu phát sinh từ
quá trình sản xuất nhựa than đá và chưng cất dầu mỏ (EPA, 1982).
Naphthalene đã được phát hiện trong mẫu nước ngầm từ ba giếng ở nồng độ
tương ứng: 380, 740 và 1800 mg/l gần địa điểm có khí hóa than ở Tây bắc
Wyoming (Stuermer et al., 1982). Naphthalene đã được phát hiện trong trầm
tích bị ô nhiễm từ một dàn khoan dầu ở Texas nước Mỹ từ năm 1982 đến năm
7

22. 1985 với nồng độ trung bình 54,7 và 61,9 mg/kg ở 10 m và 25 m gấp khoảng
26 và 29,5 lần so với trầm tích ở gần cửa sông không bị ô nhiễm ở mức 2,1
mg/kg (Brooks et al., 1990). Nó đã được tìm thấy ở nồng độ 200 mg/kg trong
một trầm tích ô nhiễm của sông Warnow tại Schwaan gần Rostock nước Đức,
vào tháng 8 năm 1989 (Randow et al., 1996). Naphthalene đã được tìm thấy
trong tất cả bốn trầm tích biển Canada (đại diện cho nồng độ khác nhau và các
nguồn ô nhiễm PAHs) ở nồng độ khác nhau: 0,1-115 mg/kg bùn khô
(Simpson et al., 1995). Nồng độ naphthalene dao động từ 2-20,2 mg/kg trọng
lượng khô đã được báo cáo trong ba trong số bốn trầm tích từ các hồ nước
trong lãnh thổ Tây Bắc của Canada (Lockhart et al., 1992). Nó đã được tìm
thấy ở nồng độ 0,2 mg/kg trong đất nhiễm than (Yu et al., 1990) ở mức 16,7
mg/kg trong đất từ một nhà máy lọc dầu (Weissenfels et al., 1992) và lên đến
66 mg/kg trong đất bùn đã được xử lý (Wild et al., 1990).Trong một nghiên
cứu được thực hiện ở Thiên Tân, Trung Quốc phát hiện thấy 0,15-0,34 μg/l
naphthalene trong nước thải sử dụng để tưới cho cây trồng trong vòng 3 năm
thì thấy lượng naphthalene tích lũy trong gạo, lúa mạch và rau diếp lần lượt là
0,80-1,32;1,04-1,16 và 0,80-1,09 μg/kg (Chung et al.,2008)
 Tại Việt Nam
Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về sự tồn lưu và tình trạng ô
nhiễm của các hợp chất thơm đa vòng PAHs trong môi trường tuy nhiên chưa
có nghiên cứu cụ thể về tình trạng ô nhiễm naphthalene trong môi trường.
Trong môi trường không khí: Theo Vũ Đức Toàn (2003) cho thấy khi
phân tích 17 loại PAHs điển hình trong khí quyển tại thành phố Hà Nội năm
2003 nồng độ của ∑17 PAHs tại Thượng Đình, Bách Khoa, Chương Dương
lần lượt là 168,88 ng/m3
; 144,93 ng/m3
và 295,63 ng/m3
so sánh với nồng độ
∑17 PAHs trong bụi tại Băng Cốc năm 2003 (21,74 ng/m3
) có thể thấy sự ô
nhiễm PAH tại Hà Nội ở mức độ cao. Nguồn phát sinh PAHs là từ các
phương tiện giao thông sử dụng xăng mà không có bộ xử lý khí thải. Trong
8
4217425

23. đó nồng độ của naphthalene trong bụi tại Thượng Đình, Bách Khoa, Chương
Dương lần lượt là 0,98 ng/m3
, 0,85 ng/m3
, 0.58 ng/m3
.
Trong môi trường nước: Tại Việt Nam, ô nhiễm nước thải từ các khu
công nghiệp đã trở nên phổ biến. Các khu công nghiệp với nhiều loại hình sản
xuất đa dạng của các nhà máy (sản xuất sơn, cơ khí, nhôm, thép, thực phẩm,
in…) có thể thải ra PAHs trong quá trình hoạt động sản xuất. Tuy hiện nay
vẫn chưa có công bố chính thức về sự có mặt của PAH trong nước thải khu
công nghiệp ở Việt Nam nhưng khả năng ô nhiễm nghiêm trọng khá rõ ràng.
Đề tài nghiên cứu khoa học của Bùi Sỹ Bách – Viện Công nghệ môi trường
“Đánh giá mức độ ô nhiễm chất hữu cơ độc hại trong nước sông Hồng đoạn
chảy qua lãnh thổ Việt Nam” sử dụng sử dụng phần mềm AIQS-DB tích hợp
trên thiết bị GC-MS để phân tích các mẫu nước tại 14 điểm dọc sông Hồng từ
cầu Cốc Lếu (Lào Cai) chảy qua các tỉnh thành của Việt Nam và kết thúc ở
cửa Ba Lạt (Nam Định) nồng độ PAHs phát hiện thấy tại 13/14 điểm nghiên
cứu, nồng độ PAHs cao nhất tại tại cầu Yên Lệnh (Hưng Yên) là 0,08 µg/l và
cũng tại điểm này thì nồng độ naphthalene là cao nhất đạt 0,018 µg/l. Sở dĩ
nồng độ ở điểm này tăng cao là do các hoạt động giao thông, sửa chữa xe, các
phương tiện cơ giới làm phát thải xăng dầu, nguồn thải trực tiếp trên bờ
sông,tập trung nhiều khu công nghiệp, hơn thế nữa do Yên Lệnh là điểm ngay
sau các điểm của thủ đô Hà Nội (khu tập trung đông dân cư, hoạt động giao
thông cao, có các khu công nghiệp ngoại thành) nên nước thải của các hoạt
động trên sẽ làm tăng nồng độ PAHs và naphthalene ở khu vực này. Nồng độ
naphthalene chỉ xuất hiện từ Chương Dương (hạ lưu khi đi qua Tp. Hà Nội)
trở đi do sự xả thải trực tiếp nước thải của ngành dệt nhuộm chưa qua xử lý,
do quá trình rửa trôi, chảy tràn xăng dầu, rò rỉ nhiên liệu động cơ do quá trình
rửa xe tại các xưởng, gara sửa xe…, đây là nguyên nhân trên dẫn đến sự xuất
hiện với hàm lượng lớn naphthalene ở những điểm về hạ lưu. Nhìn chung
nồng độ PAHs phát hiện tương đối thấp nhưng bước đầu đã cho thấy ảnh
9

24. hưởng của các hoạt động công nghiệp và sinh hoạt của con người đến chất
lượng sông Hồng. Nồng độ PAHs tồn tại nhiều trong các cảng biển, các cửa
sông ven biển bởi đây là nơi tiếp nhận nguồn thải và diễn ra việc khai thác,
sản xuất chưng cất than đá, dầu mỏ. Kết quả phân tích mẫu nước tại vịnh Hạ
Long cho thấy nhóm chất ô nhiễm PAHs xuất hiện trong cả mùa mưa và mùa
khô. Nồng độ PAHs dao động trong khoảng từ 0,56 µg/l đến 23,06 µg/l, giá
trị trung bình cho toàn vùng là 7,17 μg/l. So sánh với tiêu chuẩn chất lượng
môi trường Canada, tổng PAHs trong nước là 5,8 μg/l, thì nồng độ tổng PAHs
trong nước Hạ Long đã vượt 0,81 lần (Dương Thanh Nghị và cộng sự, 2009)
Trong trầm tích: Cũng theo kết quả nghiên cứu của Dương Thanh
Nghị cho thấy hàm lượng PAHs trong trầm tích mặt vùng biển ven bờ Hạ
Long có giá trị thấp nhất là 43,29 g/kg mẫu khô và cao nhất là 185,8 g/kg
mẫu khô. So sánh với nồng độ PAHs với môi trường nước, PAHs trong
trầm tích cao hơn rất nhiều chứng tỏ có sự vận chuyển qua lại của PAHs
giữa hai hợp phần môi trường và nồng độ trong trầm tích mặt cao hơn
chứng tỏ mức tích tụ cao hơn mức hòa tan của PAHs trong vùng này
(Dương Thanh Nghị và cộng sự, 2009).
2.3.2. Tính độc và ảnh hưởng của naphthalene đến môi trường sinh thái
Theo Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về Ung thư (IARC) phân loại
naphthalene có thể gây ung thư như đối với con người và động vật được xếp
vào nhóm 2B. Nhưng theo hướng dẫn của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa
Kỳ (EPA) thì naphthalene được xếp vào nhóm C chất có thể gây ung thư. Có
2 nghiên cứu duy nhất về ung thư ở người do tiếp xúc với naphthalene đó là:
một báo cáo của Wolf (1976, 1978) 4 công nhân được chuẩn đoán mắc bệnh
ung thư thanh quản trong một nhà máy lọc naphthalene ở Đông Đức và một
báo cáo của Ajao và cộng sự (1988) báo cáo về 23 trường hợp ung thư đại
trực tràng tại một bệnh viện ở Nigeria. Qua 2 báo cáo trên thì EPA và IARC
đồng tình rằng những nghiên cứu này cung cấp bằng chứng đầy đủ về khả
10

25. năng gây ung thư ở người của naphthalene. Có rất nhiều nghiên cứu về ung
thư trên động vật thí nghiệm: các nghiên cứu của chương trình độc học quốc
gia (NTP, 1992) khi cho cả chuột đực và chuột cái F344 tiếp xúc với
naphthalene ở nồng độ 10, 30, hoặc 60 ppm trong 6 giờ/ngày, 5 ngày/tuần
trong 104 tuần phát hiện thấy tổn thương mũi và phổi, tăng sản biểu mô
đường hô hấp và chuyển sản biểu mô khứu giác (Abdo KM et al., 2001).
Một nghiên cứu ở chuột B6C3F1cùng thời gian tiếp xúc với naphthalene ở
nồng độ 10 hoặc 30 ppm, ở chuột cái phát hiện thấy khối u ác tính: u tuyến
bronchiolar và u phế nang nhưng không thấy dấu hiệu gây ung thư ở chuột
đực. Knake (1956) khi nghiên cứu 38 con chuột A/J tiếp xúc với 500 mg
naphthalene/kg trong dầu mè trong khoảng 3,5 tháng cho thấy tỷ lệ mắc các
khối u phổi ác tính là 15% tỷ lệ tử vong, viêm phổi và viêm bàng quang
tăng đáng kể.
Tính độc của naphthalene phụ thuộc vào nồng độ, mức độ tiếp xúc, thời
gian tiếp xúc và con đường tiếp xúc xảy ra qua đường hô hấp, tiêu hóa hay
tiếp xúc qua da. Naphthalene thăng hoa ngay ở nhiệt độ thường nên có thể dễ
dàng xâm nhập qua đường hô hấp, dấu hiệu và triệu chứng phổ biến gây ra
với con người như buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy, nhức đầu, rối
loạn, ra mồ hôi. Ảnh hưởng nghiêm trọng nhất của ngộ độc naphthalene là
phá hủy tế bào hồng cầu gây tan máu, đặc biệt ở những người bị thiếu glucose
dehydrogenase 6-phosphate (G6-PD). Ở người, tiếp xúc với naphthalene
trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ dẫn tới các bệnh kinh niên,
gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng thụ thai ở phụ nữ và có thể
làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi (Hamann et al.,1990). Ở chuột
khi hít phải 10ppm naphthalene trong 4 giờ gây ra hoại tử tế bào trong đường
hô hấp của phổi. Trong một số trường hợp nuốt phải naphthalene cũng có thể
gây loạn nhịp, co giật và hôn mê và có thể có thể gây tử vong. Tiếp xúc với
lượng lớn naphthalene gây ra bệnh vàng da và bệnh thận và rối loạn chức
11

26. năng gan mà có thể có thể gây tử vong, tổn thương giác mạc, gây đục thủy
tinh thể ở cả người, chuột và thỏ. Khi cho chuột và thỏ uống nước có chứa
naphthalene với liều lượng lớn hơn 500 mg/kg/ngày đã phát triển đục thủy
tinh thể. Các nhà nghiên cứu tiến hành thí nghiệm bằng cách cho chuột ăn
thức ăn có chứa naphthalene lần lượt là 27; 53 và 267 mg/kg mỗi ngày trong
14 ngày. Với liều lượng 267 mg/kg cho thấy khối lượng cơ thể giảm đáng kể
so với các nhóm khác cụ thể ở chuột trung bình giảm 30% trọng lượng tuyến
ức và ở chuột cái khối lượng lách giảm đáng kể nhưng khối lượng phổi lại
tăng (Sinkkonen và Paasivirta, 2000). Ngoài những nghiên cứu trong phòng
thí nghiệm thì các nhà khoa học đã tiến hành điều tra những công nhân làm
việc trong môi trường bị nhiễm naphthalene. Kết quả điều tra đối với công
nhân làm việc trong nhà máy chưng cất dầu naphthalene cho thấy 75 công
nhân có nguy cơ tiếp xúc với naphthalene bài tiết 1-naphthol (chất chuyển hóa
của naphthalene trong nước tiểu) với nồng độ trung bình là 7,48 mg/l cao gấp
57,5 lần so với 24 công nhân không tiếp xúc với naphthalene(khoảng 0,13
mg/l) (Bieniek, 1994).
Naphthalene không những gây ảnh hưởng trực tiếp đến con người mà
còn gây ảnh hưởng tới môi trường sinh thái tác động đến các loài thực vật
động vật từ đó gián tiếp ảnh hưởng tới con người. Nồng độ naphthalene từ rau
quả được trồng trong một khu vực công nghiệp của Thessaloniki, Hy Lạp đã
đo được 0,37-15 mg/kg trọng lượng khô trong bắp cải; 8,9-30 mg/kg trọng
lượng khô trong cà rốt; 6,3-35 mg/kg trọng lượng khô trong tỏi tây; 4,9-53
mg/kg trọng lượng khô trong rau diếp; và 27-63 mg/kg trọng lượng khô trong
rau diếp quăn (Kipopoulou et al., 1999). Ô nhiễm naphthalene từ sự cố tràn
dầu trên biển đã gây tác động đến các sinh vật biển nồng độ naphthalene đã
được phát hiện ở động vật có vỏ ở Hoa Kỳ: dao động 5-176 ng/g trong hàu; 4-
10 ng/g trong trai (Bender và Huggett 1989); 7,4 ng/g trong cua (Miles và
Roster, 1999). Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược,
12

27. người ta đã xác định LC50 là 240 μg/l (LC50 - lethal concentration: liều gây
chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm).
Qua những bằng chứng về tính độc hại do naphthalene gây ra đối với
con người và môi trường, các cơ quan chính phủ Hoa Kỳ đã thiết lập giới
hạn phơi nhiễm nghề nghiệp khi tiếp xúc với naphthalene. Cơ quan này
cũng đã đưa ra mức nồng độ an toàn cho con người trong quá trình tiếp
xúc với naphthalene ở cấp độ mãn tính là 0,1 mg/kg/ngày và tiếp xúc cấp
tính ở mức 0,4 mg/kg/ngày (EPA, 2008). Viện quản lý an toàn và sức
khỏe nghề nghiệp đã thiết lập một giới hạn tiếp xúc cho phép ở mức 10
ppm (50 mg/m3
) trong một thời gian trung bình trong tám giờ. Các Viện
Quốc gia về An toàn lao động và sức khỏe đã thiết lập một giới hạn đề
nghị tiếp xúc ở mức 10 ppm (50 mg/m3
) trong một thời gian trung bình
trong tám giờ, cũng như một giới hạn tiếp xúc ngắn hạn ở mức 15 ppm
(75 mg/m3
).Ở châu Âu và Trung Quốc kể từ năm 2008 băng phiến và các
sản phẩm có chứa naphthalene đã bị cấm sử dụng (Gray và Kerrina, 2013)
2.4. Các biện pháp xử lý naphthalene
Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của
naphthalene đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý. Do đó con
người đã nghiên cứu và tìm ra nhiều biện để xử lý naphthalenen như biện
pháp vật lý, hóa học, sinh học. Mỗi biện pháp đều có ưu điểm riêng và đem
lại hiệu quả xử lý nhất định.
2.4.1. Phương pháp vật lý
Sử dụng các chùm tia electron bức xạ năng lượng cao hay sử dụng than
hoạt tính trong việc xử lý naphthalene từ môi trường nước cũng đã có kết quả
nhất định đặc biệt sử dụng than hoạt tính. Than hoạt tính là chất hấp phụ phổ
biến đã được áp dụng từ lâu trong xử lý các chất vô cơ cũng như các hợp chất
hữu cơ khó phân hủy. Ngoài ra còn có các phương pháp được sử dụng trước
đây như thiêu đốt, đào chôn lấp đất ô nhiễm…
13

28. 2.4.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp phân hủy nhiệt, chiết dung môi, oxy hóa trong dung
dịch nước bằng oxy không khí hoặc các tác nhân oxy hóa mạnh như H2O2,
ozone, feton…
Phương pháp oxy hóa tiên tiến là oxy hóa thủy nhiệt là công nghệ mới
trong xử lý các PAH trong đó có naphthalene (Onwudili et al., 2007). Một
nghiên cứu mới của Da Silvaa (2015) cho thấy methyl methacrylate-
divinylbenzene (MMA-DVB) và poly divinylbenzene (DVB) là 2 loại nhựa
có khả năng loại bỏ naphthalene trong nước thải có chứa dầu.
Mặc dù có rất nhiều phương pháp vật lý, hóa học được áp dụng để xử
lý naphthalene song các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như gây ra ô
nhiễm thứ cấp, hiệu quả không triệt để do khi đi qua các vật liệu lọc vẫn còn
tồn dư naphthalene mất nhiều thời gian xử lý các vật liệu xử lý. Đặc biệt liên
quan đến lợi ích kinh tế đó là chi phí xử lý quá cao làm cho xu hướng sử dụng
ngày càng giảm.
2.4.3. Phương pháp phân hủy sinh học
Hiện nay, xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học
(bioremediation) là một hướng đi mới mẻ và đầy triển vọng trong giải quyết
các vấn đề ô nhiễm môi trường. Phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đạt
được khá nhiều thành tựu. Cơ sở của phương pháp này là dùng các vi sinh vật
có khả năng sử dụng các chất ô nhiễm như nguồn dinh dưỡng của nó. Nhờ hệ
enzyme mà vi sinh vật tiết ra sẽ phân hủy các chất ô nhiễm, loại bỏ tính độc
của chúng. Phương pháp phân hủy sinh học được ứng dụng hiện nay như: bổ
sung các vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất độc vào vùng ô nhiễm
(bioaugmentation), kích thích phát triển của vi sinh vật bản địa
(biostimulation). Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện
phức tạp (nhiệt độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm
14

29. thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều
kiện ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ
chậm, thời gian xử lý kéo dài.
Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành
theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học.
- Tăng cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa
đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí
vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô
nhiễm. Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật
vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao
do nhiều nguyên nhân như: sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi
trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần
thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật (Komárková et al., 2003)
- Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao
đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại
thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ
O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác… Kích thích sinh học
hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo
phương pháp phân hủy sinh học. Trong hoạt động sống, vi sinh vật cần
nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều kiện sống thích
hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những chủng vi sinh vật
có khả năng sử dụng naphthalene, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa
của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng dụng
cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa trong
việc phân sinh học naphthalene tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình
phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon,
nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định. Ngoài ra, các yếu tố môi
trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm bảo cho tốc độ phân hủy ở mức
ổn định và đạt hiệu quả cao nhất.
15

30. 2.5. Phân hủy sinh học naphthalene bởi vi sinh vật
2.5.1. Vi sinh vật phân hủy naphthalene
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng
sử dụng các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene. Số lượng các
vi sinh vật có khả năng phân hủy naphthalene tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn
so với các vùng không ô nhiễm. Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu
hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc
phân hủy naphthalene. Đa số các vi sinh vật phân lập có nguồn gốc từ các địa
điểm ô nhiễm. Tuy nhiên mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì có khả năng phân
hủy naphthalene ở các vùng ô nhiễm là khác nhau. Trong số các vi sinh vật thì
vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh học trong nước
và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân
hủy naphthalene và các chất ô nhiễm trong môi trường đất (Giraud et al.,
2001). Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAHs phần lớn thuộc vi
khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo.
Khả năng phân hủy naphthalene được nghiên cứu nhiều nhất trong các
PAHs vì nó cấu trúc đơn giản nhất, hòa tan dễ nhất và vi sinh vật có khả năng
phân hủy naphthalene dễ dàng được phân lập (Goyal và Zylstra, 1990). Các
chủng vi khuẩn chủ yếu được phân lâp từ đất, chúng sử dụng naphthalene như
một nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Đây là những vi khuẩn thường
gram âm, trong đó chi vi khuẩn Pseudomonas chiếm phần lớn ngoài ra còn có
một số loài thuộc các chi vi khuẩn khác như: Alcaligenes, Burkholderia,
Mycobacterium, Polaromonas, Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas,
Streptomyces… Ngoài ra còn một số vi khuẩn phân hủy hợp chất
hydrocacbon được phân lập từ môi trường biển như 2 chi vi khuẩn
Staphylococcus và Micrococcus có khả năng phân hủy naphthalene (Melcher
et al., 2002)
16

31. 2.5.2. Cơ chế phân hủy naphthalene bởi vi sinh vật
Con đường phân hủy sinh học PAHs bởi vi sinh vật diễn ra theo 2 con
đường là trao đổi chất và đồng trao đổi chất. Quá trình chuyển hóa PAH bởi
vi sinh vật có thể phân hủy thành các dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn
toàn thành CO2. Cerniglia (1993) cho rằng quá trình phân hủy PAH có thể
theo ba chiều hướng: phân hủy hoàn toàn, đồng phân hủy và oxi hóa không
đặc hiệu. Con đường phân hủy naphthalene được bắt đầu nhờ xúc tác của một
số enzyme. Đầu tiên naphthalene dioxygenase tấn công vào các vòng thơm để
tạo thành cis - (1R, 2S) -dihydroxy-1,2-dihydronaphthalene (cis -naphthalene
dihydrodiol). Các cis -naphthalene dihydrodiol được tạo thành sau đó loại
hydro tạo 1,2-dihydroxynaphthalene bởi enzyme cis-dihydrssodiol
dehydrogenase. Sau đó, 1,2-dihydroxynaphthalene được chuyển hóa thành
salicylate thông qua 2-hydroxy-2 H -chromene-2-carboxylic acid, cis - o
-hydroxybenzalpyruvate và 2-hydroxy-benzaldehyde. Bước tiếp theo, 1,2-
dihydroxynaphthalene bị oxy hóa thành 1,2-naphthaquinone. Salicylate
thường bị loại bớt cacbon để tạo thành catechol và tiếp tục chuyển hóa cắt
vòng ở vị trí meta - và ortho -. Fuenmayor và cộng sự đã chỉ ra rằng salicylate
bị chuyển hóa thành gentisate bởi enzyme salicylate- 5- hydroxylase (Seo,
2009)
17
4217425

32. Hình 2.1: Con đường oxy hóa của naphthalene bởi vi khuẩn (Goyal et al.,
1997; Auger et al., 1995; Baboshin et al., 2008; Denome et al., 1993;
Kiyohara et al.,1994).
18
- Tải bản FULL (FILE WORD 74 trang): https://bit.ly/3iV6Umu
- Dự phòng: https://bit.ly/3l68gwc

33. 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy naphthalene của vi
sinh vật
2.6.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất rõ tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật
nói chung và vi khuẩn phân hủy naphthalene nói riêng. Khi nhiệt độ tăng lên,
tốc độ phản ứng của các enzyme trong tế bào vi sinh vật cũng tăng lên làm
cho các hoạt động trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật diễn ra nhanh hơn.
Tuy nhiên, khi nhiệt độ quá cao sẽ làm biến tính màng sinh chất trong tế bào
vi khuẩn làm ức chế quá trình sinh trưởng (Leahy và Colwell, 1990). Khi
nhiệt độ thấp thì màng sinh chất của tế bào vi khuẩn bị kết đông lại và
enzyme cũng ngừng hoạt động. Vì vậy, nếu nhiệt độ môi trường nuôi cấy của
vi khuẩn vượt ra khỏi ngưỡng nhiệt độ cho phép của vi khuẩn thì quá trình
sinh trưởng của chúng sẽ bị ức chế và thậm chí ngừng hẳn. Do đó mỗi vi
khuẩn sẽ có nhiệt độ tối thiểu, tối ưu, tối đa cho sự sinh trưởng. Nhiệt độ tối
ưu sẽ thích hợp cho sự trao đổi chất của vi khuẩn để phân hủy naphthalene.
Phân hủy sinh học naphthalene trong khoảng nhiệt độ 20o
C-37o
C là hiệu quả
nhất, nhưng quá trình phân hủy vẫn có thể tiếp tục trong môi trường lạnh hơn
(<5o
C ) (Erickson et al., 2001). Vì vậy các quần thể vi sinh vật phân hủy
hydrocacbon sẽ thích nghi với môi trường xung quanh nhiệt độ được lựa chọn
và dự kiến trong vùng khí hậu và các mùa khác nhau.
2.6.2. pH
Bên cạnh nhiệt độ, pH cũng là yếu tố quan trong ảnh hưởng tới sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật .Hầu hết các môi trường tự nhiên có giá trị
pH trong khoảng từ 5 đến 9 vì thế mà pH thích hợp cho sự phát triển của vi
sinh vậtcũng phù hợp trong khoảng pH này thường từ 5,5-8,5 .Vi khuẩn và
nấm phân hủy tốt nhất ở pH trung tính. Tuy nhiên, nấm thực hiện phân hủy
tốt hơn ở điều kiện có tính acid .Vì vậy quá trình phân hủy sinh học vẫn có
thể xảy ra tại những khu vực có giá trị pH đặc biệt như môi trường rất acid
hoặc rất kiềm nhưng tốc độ phân hủy chậm hơn.
19

34. 2.6.3. Độ mặn (nồng độ NaCl)
NaCl là một thành phần trong hệ thống vậnchuyển của tế bào, duy trì
áp suất thẩm thấu củatế bào nên có ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào. Có
rất ít nghiên cứu được công bố về ảnh hưởng của độ mặn lên các vi khuẩn
phân hủy hydrocarbon. Theo báo cáo của Leahy và Colwell (1990) có mối
tương quan giữa độ mặn và tỷ lệ khoáng hóa của PAHs. Trong một nghiên
cứu của Ward và Brock (1978) cho thấy tỷ lệ trao đổi chất hydrocarbon giảm
khi tăng độ mặn trong khoảng 3,3-28,4%. Vì vậy trong môi trường có độ mặn
thấp thì tỷ lệ phân hủy PAHs đạt hiệu quả cao hơn so với môi trường có độ
mặn cao.
2.6.4.Nguồn dinh dưỡng
Các chất dinh dưỡng như carbon (C), nitor (N), phosphore (P) là các
chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp tế bào của vi sinh vật.Trong đó
carbon chiếm tới 50 % trọng lượng khô của một tế bào vi sinh vật vì vậy
carbon có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của
vi sinh vật. Tùy từng loại vi sinh vật mà khả năng đồng hóa nguồn C là khác
nhau và chúng sử dụng nguồn C một cách khá chọn lọc, do đó khi sống trong
môi trường bị ô nhiễm (môi trường nghèo dinh dưỡng) thì các vi sinh vật sẽ
sử dụng nguồn C có trong thành phần của chất ô nhiễm.Các muối phosphate
và muối nitor có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein của vi sinh
vật. Tại các vùng ô nhiễm do tính chất của các chất ô nhiễm mà nồng độ
carbon hữu cơ cao vì thế mà các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt vì thế cần bổ
sung nguồn dinh dưỡng để đẩy nhanh quá trình phân hủy các chất ô nhiễm
(Brandli et al, 2008)
2.6.5.Oxy
Phân hủy sinh học hiếu khí là con đường hiệu quả nhất để xử lý sinh
học bởi vì quá trình phân hủy naphthalene nói riêng và PAHs nói chung liên
quan đến việc sử dụng oxy mà oxy phân tử là thành phần bắt buộc. Ward và
20

35. cộng sự (2003) nghiên cứu cho thấy khi có oxy thì sự phân hủy sinh học
hydrocacbon trong tự nhiên đạt hiệu quả cao hơn. Mặc dù phân hủy kỵ khí
PAHs bởi các vi sinh vật cũng đã được chứng minh nhưng tỷ lệ có phần
không đáng kể.
Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập như: nhiệt
độ, pH, độ mặn, nguồn dinh dưỡng... có ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển
của chúng, làm thay đổi đa dạng loài của hệ vi sinh vật và tỷ lệ trao đổi chất
của chúng. Vì thế việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy
naphthalene của vi sinh vật là rất quan trọng, đảm bảo các điều kiện thuận lợi
nhất cho vi sinh vật phát triển từ đó tăng tốc độ phân hủy naphthalene có thể
đạt ở mức tối đa.
21
- Tải bản FULL (FILE WORD 74 trang): https://bit.ly/3iV6Umu
- Dự phòng: https://bit.ly/3l68gwc

36. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mười chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất nhiễm dầu có khả năng
phân hủy PAHs được lưu trữ tại phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đặc
điểm của các chủng này được trình bày trong Bảng 3.1
3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Đơn vị thực hiện: Phòng thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ sinh học
Môi trường - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
- Thời gian thực hiện: 8/9/2015 - 8/1/2016.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Thử nghiệm khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn đã hoạt hóa trên các nồng độ naphthalene khác nhau.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ NaCl lên sự phát
triển của các chủng vi khuẩn đã chọn.
- Đánh giá khả năng phân hủy naphthalene của các chủng vi khuẩn ở
điều kiện tối ưu.
3.4.Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu
3.4.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
 Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết cao
của các hãng trên thế giới như: Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic …
22

37. - Chuẩn bị cơ chất naphthalene: Naphthalene tinh khiết tồn tại ở thể rắn,
do chúng ít tan trong nước nên được pha loãng bằng acetone (nồng độ
0,5g/10ml). Mặt khác naphthalene có thể bị quang phân khi tiếp xúc với ánh
sáng mặt trời nên chú ý đựng dung dịch trong lọ tối màu và bảo quản trong
tối, tránh ánh sáng mặt trời.
 Môi trường nuôi cấy
Môi trường MPA dịch (g/l) Môi trường khoáng Gost dịch (g/l)
Cao thịt : 3
Peptone : 10
NaCl : 5
pH : 7 – 7,2
Nước cất vừa đủ 1 lít
KNO3 : 3
KH2PO4 : 0,3
MgSO4 : 0,4
NaH2PO4 : 0,4
NaCl : 1
pH : 7- 7,2
Nước cất vừa đủ 1 lítMôi trường MPA thạch (g/l)
Các thành phần giống môi
trường MPA dịch nhưng có bổ
sung thêm 18- 20 g agar
Môi trường khoáng Gost biển dịch (g/l)
Các thành phần môi trường giống môi
trường khoáng Gost dịch chỉ thay đổi
NaCl tăng lên 5g
Các thành phần môi trường được cân cẩn thận và khử trùng ở 121o
C,
1atm trong 30 phút.
3.4.2. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có
độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và
phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ
sinh học bao gồm: cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar
của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ
nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm , máy đo mật độ quang học , máy chụp ảnh Gel-
Doc, tủ lạnh các loại 4o
C, -20o
C, -80o
C, lò vi sóng, pipet man của hãng
Eppendorf, bình tam giác, que cấy, đầu côn, ống ly tâm…
23
4217425