Khoa luan tot nghiep-2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
NHÂN GIỐNG IN VITRO THÔNG BA LÁ
(Pinus kesiya Royle ex Gordon)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG
CBHD: TS. HỒ BẢO THÙY QUYÊN
SVTH: MAI NGUYỄN NGUYỆT HẠNH
MSSV: 1553010047
Khóa: 2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
NHÂN GIỐNG IN VITRO THÔNG BA LÁ
(Pinus kesiya Royle ex Gordon)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG
Chữ ký CBHD CBHD: TS. HỒ BẢO THÙY QUYÊN
SVTH: MAI NGUYỄN NGUYỆT HẠNH
MSSV: 1553010047
Khóa: 2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

3
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt những năm học tập tại trường em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,
giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Hồ Bảo Thùy Quyên đã tận tình giúp đỡ,
quan tâm, trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài.
Em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cùng
quý Thầy Cô ở Khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã
truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt khoảng thời gian học tập tại
trường.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và các Thầy
Cô phụ trách các phòng thí nghiệm sinh hóa, tế bào, công nghệ vi sinh đã giúp đỡ, tạo điều
kiện cho em thực hiện đề tài.
Cuối cùng với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình đã
nuôi dạy, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ con trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019
Sinh viên thực hiện đề tài
Mai Nguyễn Nguyệt Hạnh

4
MỤC LỤC
Lời cảm ơn.................................................................................................3
Mục lục......................................................................................................4
Danh mục bảng...........................................................................................7
Danh mục hình............................................................................................8
Danh mục những từ viết tắt..........................................................................9
Đặt vấn đề ................................................................................................ 10
Phần I: Tổng quan tài liệu .......................................................................... 11
1. Tổng quan về thông ba lá (Pinus kesiya) ............................................. 11
1.1 Vị trí phân loại................................................................................. 11
1.2 Phân bố........................................................................................... 11
1.3 Đặc điểm thực vật học ...................................................................... 11
1.3.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................... 11
1.3.2 Đặc điểm sinh thái ..................................................................... 12
1.4 Thành phần hóa học ......................................................................... 12
1.5 Giá trị kinh tế................................................................................... 13
1.6 Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ...................................... 13
1.6.1 Định nghĩa ................................................................................ 13
1.6.2 Lịch sử hình thành...................................................................... 13
1.6.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô ......................................................... 16
1.6.4 Các yếu tố và điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy mô ..................... 16
1.6.4.1 Sự lựa chọn mẫu cấy............................................................ 16
1.6.4.2 Khử trùng mẫu cấy .............................................................. 17

5
1.6.4.3 Môi trường nuôi cấy ............................................................ 17
1.6.4.3.1 Đường ............................................................................. 18
1.6.4.3.2 Các khoáng đa lượng......................................................... 19
1.6.4.3.3 Các khoáng vi lượng ......................................................... 19
1.6.4.3.4 Các vitamin...................................................................... 19
1.6.4.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng ............................................ 20
1.6.4.3.6 Nhóm chất tự nhiên........................................................... 21
1.6.4.3.7 Ánh sáng.......................................................................... 21
1.6.4.3.8 Nhiệt độ........................................................................... 21
1.6.4.3.9 pH................................................................................... 22
1.6.4.3.10 Sự thoáng khí.................................................................. 22
1.6.4.3.11 Agar............................................................................... 22
1.7 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về quy trình nhân giống các
loài thông ........................................................................................ 22
1.7.1 Nghiên cứu trong nước ............................................................... 22
1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước............................................................... 24
Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................... 26
1. Vật liệu............................................................................................ 26
2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 26
2.1 Vô trùng mẫu nuôi cấy...................................................................... 26
2.2 Nuôi cấy hạt thông ba lá in vitro........................................................ 26
2.3 Nhân chồi thông ba lá in vitro............................................................ 27
2.4 Tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro ................................................. 27

6
2.5 Tạo rễ - hình thành cây in vitro.......................................................... 28
3. Phân tích và xử lý số liệu................................................................... 28
Phần III: Kết quả và thảo luận .................................................................... 29
1. Kết quả khử trùng hạt thông ba lá....................................................... 29
1.1 Sơ đồ quy trình khử trùng hạt ............................................................ 29
1.2 Kết quả khử trùng hạt ....................................................................... 30
2. Kết quả nuôi cấy hạt thông ba lá in vitro ............................................. 31
3. Kết quả nhân chồi thông ba lá in vitro................................................. 33
4. Kết quả tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro....................................... 37
5. Kết quả tạo rễ - hình thành cây in vitro................................................ 40
Phần IV: Kết luận và kiến nghị ................................................................... 45
1. Kết luận........................................................................................... 45
2. Kiến nghị ......................................................................................... 45
Tài liệu tham khảo..................................................................................... 46
PHỤ LỤC................................................................................................. 49

7
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Tỷ lệ hạt vô trùng sau khi được khử trùng bằng Oxy già với thời gian khác nhau.
Bảng 3.2: Tỷ lệ tách vỏ và ra rễ của hạt thông ba lá khi được nuôi cấy trên môi trường dinh
dưỡng.
Bảng 3.3: Sự hình thành cụm chồi mới của chồi thông ba lá khi được nuôi cấy trên các môi
trường dinh dưỡng.
Bảng 3.4: Sự tăng trưởng của chồi thông ba lá trong các môi trường dinh dưỡng.
Bảng 3.5: Tỷ lệ cảm ứng ra rễ của chồi thông ba lá sau khi được tiền xử lý với IBA, NAA
ở các nồng độ và các khoảng thời gian khác nhau (Varjinia Kalita 1998).

8
DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Hạt thông ba lá vô trùng khi mới cấy vào môi trường.
Hình 3.2: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường WA + 0,5% glucose.
Hình 3.3: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường MS½.
Hình 3.4: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (phải) trong môi
trường M0.
trường M1.
Hình 3.6: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (giữa, phải) trong
môi trương M2.
Hình 3.7: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (giữa, phải) trong
môi trường M3.
Hình 3.8: Chồi thông ba lá ban đầu (trái) và sau 2 tuần (phải) trong môi trường M0.

9
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
2,4D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
ABA: Abscisis acid.
B: Bo.
B1: Thiamine.
B2: Riboflavin.
B3: Niacin.
B4: Choline.
B5: Pantothenic acid.
B5: Môi trường Gramborg.
B6: Pyridoxine.
BAP: Benzylaminopurine.
Ca: Canxi.
Cl: Clo.
Co: Coban.
Cu: Đồng.
DCR: Môi trường Gupta & Durzan.
Fe: Sắt.
GA: Gibberelin
GD: Môi trường Gresshoff và Doy.
IAA: 3-Indoleaxetic acid.
IBA: 3-Indolebutyric acid.
K: Kali.
LVM: Môi trường dinh dưỡng Litvary và
cộng sự.
LP: Môi trường Quoirin và Lepoivre.
Mg: Magie.
Mn: Mangan.
Mo: Molypden.
MS: Môi trường Murashige & Skoog.
N: Nito.
NAA: α-Naphthaleneacetic acid.
P: Photpho.
PEG: Polyethylene glycol.
PP: Niconitic acid.
S: Lưu huỳnh.
SH: Môi trường Schenk & Hildebrandt.
WA: Water Agar.

10
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông là loài cây lá kim trong chi Pinus thuộc họ Pinaceae và là cây chủ của
nhiều loài nấm cộng sinh. Chúng đượctìm thấy phần lớn ở Bắc bán cầu với phần lớn các
loài trong khu vực ôn đới nhưng cũng được thấy ở khu vực nhiệt đới và hàn đới, giữ vai
trò quan trọng về mặt sinh thái, kinh tế, thương mại … Ngoài ra còn được trồng để lấy
gỗ, làm cây cảnh trong vườn hay trong các khu công viên, dọc các tuyến đường quốc lộ
… Không những thế còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp sơn, công nghiệp chất béo … một số loài còn được dùng như là vị thuôc dân tộc.
Các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ nhất
như chống oxy hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV
… (Nguyễn Hoàng Sa 2017)
Thông ba lá (Pinus kesiya)là loài có sự phân bố khá rộng rãi ở Việt Nam, Ấn Độ,
Philipines, Myanmar, Thái Lan. Thông ba lá Pinus kesiya là loài cây lâm nghiệp được
trồng phổ biến ở Lâm Đồng với nhiều giá trị kinh tế cao. Nó cung cấp một lượng lớn gỗ
phục vụ cho các ngành xây dựng và công nghiệp giấy, phần nhựa thông là nguồn nguyên
liệu cho các ngành công nghiệp chế biến cao su, vật liệu cách điện, keo dán … và tinh
dầu thông được ứng dụng trong các ngành công nghệ dược để làm thuốc … Ngoài ra,
rừng thông ba lá còn là nguồn cung cấp các loại nấm rễ cộng sinh với nhiều lợi ích khác
nhau như làm thuốc chữa bệnh, hoặc sử dụng làm thức ăn thường ngày … (Trần Văn
Mão 2004)
Bên cạnh đó việc trồng một cây mới từ hạt đến lúc trưởng thành theo phương
pháp truyền thống lại mất khá nhiều thời gian. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro
là phương pháp tiềm năng nhất cho quá trình sản xuất cây con với hệ số nhân giống cao
. Vì những lý do đó, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu đề tài “Nhân giống in
vitro thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)” nhằm xây dựng quy trình gieo hạt và
nhân giống in vitro của thông ba lá (P. kesiya).

11
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN VỀ THÔNG BA LÁ (PINUS KESIYA)
1.1 Vị trí phân loại
Thông ba lá P. kesiya có tên đồng nghĩa: P. langbianensis A. Chev, P. insularis
var. khasyana (Griff.) Silba, P. yunnanensis Franch. (Nguyễn Hoàng Sa 2017).
Tên khác: Xà nu, xà núi (Tây Nguyên), ngo (Đà Lạt), tòng thú (Mèo – Lai Châu).
Thông ba lá thuộc:
Giới Plantae.
Ngành Pinophyta.
Lớp Pinopsida.
Bộ Panales.
Họ Pinaceae.
Chi Pinus.
Loài P. kesiya.
1.2 Phân bố
Ở Việt Nam, thông ba lá có vùng phân bố rộng, sinh trưởng ở các khu vực có độ
cao từ 300 m đến 2700 m, song thích hợp nhất là ở các độ cao từ 1000 – 1500 m. Thông
ba lá có ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang (YênMinh, Hòng Xu Phì, Xí Mần), Kon Tum,
Gia Lai, Dak Lak, Dak Nông, Lâm Đồng … (Farjon 2013).
Trên thế giới, thông ba lá phân bố ở niềm Nam Trung Quốc, Lào, Bắc Thái Lan,
Philippine, Myanmar và miền Đông Ấn Độ (Farjon 2013).
1.3 Đặc điểm thực vật học
1.3.1 Đặc điểm hình thái
Thông ba lá là cây gỗ lớn, thân thẳng đứng, cao 20 – 30 m, đường kính thân có
thể tới 50 – 70 cm, vỏ dày, nứt thành những mảng sâu, màu nâu đen. Cành nhỏ thường
có màu vàng nhạt, màu phấn trắng. Lá hình kim, họp thành từng túm ba lá (ít khi có hai
hoặc bốn lá), mảnh, mềm, màu xanh sáng, mỗi lá thường dài 20 – 25 cm. Đầu cành ngắn

12
đính lá thường có độ dài 1,5 cm, đính các vòng xoắn ốc trên cành lớn. (Nguyen và cộng
sự 2004)
1.3.2 Đặc điểm sinh thái
Thông ba lá thích hợp với các khu vực có nhiệt độ trung bình năm khoảng 15 –
20°C, tổng lượng mưa khoảng 2000 – 2500 mm và mùa khô ngắn. Chúng ưa đất nhiều
mùn, tương đối ẩm, chua (pH 4,8 – 5,5), phong hoá trên đá mẹ hoa cương, phiến thạch,
phiến thạch mica, sa thạch … thoát nước tốt, quang đãng và được chiếu sáng đầy đủ, tuy
nhiên lại không thích ứng với đất kiềm (Farjon 2013).
Thông ba lá bắt đầu ra nón vào tháng 2 – 3, chín từ tháng 12 đến tháng 1 năm sau.
Hạt giống thu hái từ các cây trội hoặc các lâm phần giống từ tháng 11 đến tháng 1 năm
sau khi quả chuyển từ xanh sẫmsang vàng mơ hay cánh gián (Viện khoa học lâm nghiệp
Việt Nam 2009).
1.4 Thành phần hóa học
Nhựa thông ba lá là một hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ, trong đó
chủ yếu là tùng hương (còn được gọi là colophan, resin) với hàm lượng thay đổi từ 65 –
75% và tinh dầu (turpentine oil) với hàm lượng thay đổi trong khoảng 18 – 20%. Tùng
hương là hợp chất rắn, trong suốt, ròn, dễ gãy, màu vàng, vàng nâu hay vàng sáng, vị
đắng, không tan trong nước, nhưng lại hoà tan trong cồn, ether, chloroform, tinh dầu,
chất béo và một phần trong benzen. Tùng hương là một hỗn hợp hữu cơ gồm chủ yếu là
các acid abietic, acid pimaric và một lượng nhỏ các chất trung tính. Chất lượng của tùng
hương được đánh giá chủ yếu dựa trên cơ sở các chỉ số acid và xà phòng hoá. Chỉ số
acid và chỉ số xà phòng hoá càng cao thì sản phẩm được coi là có chất lượng càng tốt.
Tùng hương đạt chất lượng cao khi chỉ số acid đạt 160 – 170 và sản phẩm có màu vàng
nâu nhạt, bóng. Tinh dầu thông ba lá từ Tây Nguyên là hỗn hợp không màu, trong suốt,
nhẹ hơn nước, có mùi thơm hắc, với thành phần hoá học chính gồm α-pinen (chiếm
khoảng trên dưới 60%) và β-pinen; các thành phần khác như ∆-3-caren, limonen,
myrcen, longifolen … thường có hàm lượng nhỏ (Lã Đình Mỡi 2002).

13
1.5 Giá trị kinh tế
Thông ba lá là nguồn cung cấp nhựa và gỗ với năng suất khá cao, hầu hết ở khu
vực Đông Nam Á và được trồng làm cây lâm nghiệp ở nhiều quốc gia như Châu Phi,
Nam Mỹ, Châu Đại Dương … Chúng được sử dụng phổ biến nhất là làm nguyên liệu
sản xuất bột giấy trong ngành sản xuất giấy.
Nhu cầu về nhựa thông ba lá và các sản phẩm từ nhựa thông (tùng hương và dầu
thông) trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và cung không kịp cầu.
Rễ được sử dụng để nghiên cứu và trong y học cổ truyền để chữa lo âu, mất ngủ,
an thần …
1.6 Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.6.1 Định nghĩa
Theo Ngô Xuân Bình (2010), nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ
thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong
điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã
xác định, có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh.
1.6.2 Lịch sử hình thành
Theo Ngô Xuân Bình (2010), lịch sử hình thành của nuôi cấy mô tế bào thực vật
trải qua các giai đoạn sau:
- Năm 1838 – 1839 học thuyết hiện đại về tế bào học được công bố do hai
nhà khoa M.J. Scleiden (nhà nghiên cứu thực vật) và T.Schwann (nhà nghiên cứu
động vật) đề xuất. Học thuyết này khẳng định: “mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều
gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang
các thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây
dựng lại toàn bộ cơ thể”.
- Năm 1902, nhà khoa học Hebarlandt cho rằng: cóthể tạo cá thể hoàn chỉnh
từ việc nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên ông đã không thành công trong việc nuôi

14
cấy tế bào thực vật. Những hạn chế về khoa học kĩ thuật, kiến thức khoa học thời
bấy giờ đã không đưa ông đến thành công như mong đợi.
- Năm 1922, Kotte – nhà khoa học người Mỹ lặp lại thí nghiệm của
Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ loài cây họ hòa thảo. Trong môi
trường lỏng có chứa dinh dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất
mạnh tạo thành một hệ rễ bao gồm cả rễ phụ. Tuy vậy, sinh trưởng của mẫu tồn
tại một thời gian, sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển sang
môi trường mới.
- Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô thực vật, White đã nuôi
cấy thành công trên cây cà chua với môi trường lỏng chứa dinh dưỡng khoáng,
đường và dịch chiết nấm men. Sau đó, White đã chứng minh có thể thay thế dịch
chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamine (B1), pyridoxine
(B6) và niconitic acid (PP). Từ đây, việc nuôi cấy đã được tiến hành ở nhiều loài
cây khác nhau. Đồng thời, Gautheret tiến hành các nghiên cứu và thành công nuôi
cấy mô phân sinh (thượng tầng) một số cây thân gỗ. Went và Thimann phát hiện
chất điều hòa sinh trưởng hormone đầu tiên là IAA. Gautheret xác định tác động
của chất kích thích củaIAA và nhóm 3 vitamin trên mô sẹodo White khởi xướng.
Cùng với Nobercourt, Gautheret thành công trong việc duy trì sinh trưởng của
mô sẹo cà rốt trên môi trường rắn có chứa thạch agar.
- Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng của chất kích
thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ Cà.
- Năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt.
Sau đó kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và
tổng hợp thành công. Hợp chất NAA và chất 2,4-D được bắt đầu sử dụng ở nồng
độ cao để trừ cỏ trong sản xuất nông nghiệp.
- Năm 1955, nhà khoa học Hoch Skoog phát hiện vai trò của một hợp chất
có tác dụng kích thích sự phân bào, và đặt tên là kinetin. Sau này các nhà khoa
học nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vai trò của kinetin và xếp vào nhóm cytokinin.

15
- Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng
của tỉ lệ cytokinin/auxin đối với sự hình thành mô sẹocây thuốc lá. Khi giảm thấp
tỉ lệ cytokinin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo rễ, ngược lại nếu tăng tỉ lệ này lên,
mô sẽ phát sinh chồi. Hiện tượng này cho kết quả giống nhau trên nhiều loại cây
trồng. Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng vào việc sử dụng chất điều hòa
sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro.
- Năm 1958, Kerint và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào
tượng tầng cây cà rốt.
- Năm 1960, Morelddax thành công trong nhân giống in vitro loài lan
Cymbidium từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng. Nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng
hình thành dạng cụm chồi gọi là cái protocorm. Khi tách các protocorm tiếp tục
nuôi cấy trên môi trường phù hợp, mẫu nuôi cấy có thể phát triển thành cây hoàn
chỉnh.
- Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế
bào thực vật MS.
- Năm 1966, Guha và cộng sự đã thành công trong nuôi cấy tạo cây đơn bội
ở cà độc dược từ bao phấn.
- Năm 1967 – 1968, lần lượt Nichko Nakaro và cộng sự tạo được cây đơn
bội từ bao phấn cây thuốc lá.
- Năm 1971, Takebe tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần.
- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma hai
loài khác nhau, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của hai loài thuốc lá
Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii.
- Năm 1977, MLchers dung hợp thành công hai loại tế bào soma của cây cà
chua và cây khoai tây đanh dấu bước ngoặc trong lịch sử chọn tạo giống cây
trồng.
- Năm 1980 đến 1992 nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen
thực vật.

16
- Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô
được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo đột
biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học … Các
ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng và công nghệ tế bào nói chung
đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản phẩm đặc thù phục vụ
con người.
1.6.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô
Theo Ngô Xuân Bình (2010) nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được ứng dụng
vào:
- Nhân nhanh giống các loại cây trồng.
- Tạo giống cây sạch bệnh virus bằng nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng.
- Chọn giống nhờ công nghệ tế bào.
- Khắc phục hiện tượng bất hợp trong lai xa.
- Sản xuất các chất thứ cấp qua nuôi cấy tế bào.
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đẫ được cũng cố vững
chắc ở nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp đã đượcphát triển
để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo dòng tế bào, nhân
nhanh các kiểu di truyền tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và túi phấn, đa dạng
hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma, tạo mô sẹo cô lập và
nuôi cấy tế bào để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin và các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Nhiều kỹ thuật nuôi cấy mô đã
được nghiên cứu và ứng dụng. Trong tương lai, các mô được nuôi cấy sẽ được sử dụng
như công cụ cơ bản và người ta đã sử dụng nhiều thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các
kiểu nuôi cấy khác nhau: cấy cây, cấy phôi, cấy cơ quan, cấy mô, cấy tế bào, cấy tế bào
trần, cấy túi phấn, hạt phấn (Dương Công Kiên 2006).
1.6.4 Các yếu tố và điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy mô
1.6.4.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

17
Theo Dương Công Kiên (2006); Vũ Quang Sáng và cộng sự (2007), khi lựa chọn
đưa mẫu vào nuôi cấy cần đảm bảo các yêu cầu sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ tăng trưởng nhanh.
Việc lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả
nuôi cấy mô. Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh
tốt hơn mô già của cùng một cây. Chồi hoa non hay cụm hoa cũng thường có kết quả tái
sinh rất tốt. Mẫu cấy thích hợp phải có khả năng biểu hiện tính toàn thể (Dương Công
Kiên 2006).
1.6.4.2 Khử trùng mẫu cấy
Cần thiết khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hóa chất khử trùng để
loại bỏ các vi sinh vật (nấm, khuẩn …) bám trên bề mặt mẫu cấy. Vi khuẩn và vi nấm là
hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy. Bào tử nấm có trọng lượng nhẹ và hiện diện khắp
nơi trong môi trường sống của chúng ta. Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi
cấy thì đây là điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và từ đó phát triển nguồn
lây bệnh (Dương Công Kiên 2006).
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường
sinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất:
HgCl2 0,1% xử lý trong 5 – 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5 – 7% xử lý trong 15 – 20
phút hoặc H2O2, dung dịch Br … (Vũ Quang Sáng và cộng sự 2007).
1.6.4.3 Môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tang trưởng và phát triển hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần nuôi cấy thay đổi tùy vào loài và bộ phận nuôi cấy. Ngoài ra, thành phần
môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa của mẫu và mục đích
nuôi cấy như: nuôi cấy mô sẹo phôi hóa hoặc phôi vô tính, tạo rễ, vi nhân giống, tái tạo
cây hoàn chỉnh…

18
Một số môi trường cơ bản dùng để nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Môi trường Murashige – Skoog (MS): Là một trong những loại môi trường
được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô. MS thích hợp cho cả cây 1 lá mầm và
cây 2 lá mầm. Đến nay có rất nhiều công thức cải tiến tuy nhiên môi trường MS
trên cơ sở gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962 (Ngô Xuân Bình 2010).
- Môi trường Gramborg (B5): Là một loại môi trường được thử nghiệm đầu
tiên cho cây đậu tương, nhưng cũng được dùng nhiều trong nhân giống vô tính
đặc biệt là tách và nuôi tế bào trần (Ngô Xuân Bình 2010).
Môi trường nuôi cấy mô thường gồm những thành phần cơ bản sau:
- Đường làm nguồn cung cấp cacbon.
- Khoáng đa lượng.
- Khoáng vi lượng.
- Các vitamin.
- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
- Các chất hữu cơ bổ sung như nước dừa, dịch khoai tây, dịch nấm men …
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường (rắn, lỏng …): Agar.
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với các thành phân hóa học đặc trưng phụ
thuộc vào các yếu tố sau:
- Đối tượng nuôi cấy.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương pháp nuôi cấy.
- Trạng thái môi trường nuôi cấy.
1.6.4.3.1 Đường
Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbonđể mô tế bào
thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối khi tế bào có
khả năng quang hợp hoặc chưa đảm nhận hoàn toàn chức năng quang hợp. Hai dạng
đường hay sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng
phổ biến hơn trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô. Khi khử trùng, đường sucrose
sẽ bị phân hủy một phần vì vậy thuận lợi hơn cho cây hấp thụ. Tùy theo mục đích nuôi

19
cấy, nồng độ sucrosebiến đổi 1 – 6% thông dụng nhất là 2 – 3% (Ngô Xuân Bình 2010).
Trong một số trương hơp, ví dụ nuôi cấy mô cây một lá mầm, đường glucose sẽ tốt hơn
sucrose. Ngoài ra, mô thực vật còn có khả năng hấp thụ một số loại đường khác như là
lactose, maltose, galatose … tuy nhiên ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực
vật.
1.6.4.3.2 Cáckhoáng đa lượng
Nguyên tố khoáng đa lượng gồm 6 nguyên tố: N, P, K, S, Mg và Ca tồn tại ở muối
khoáng, sử dụng với nồng độ 30 mg/l môi trường nhằm cung cấp chất khoáng đến cấu
tạo tế bào, mô thực vật. Tất cả các nguyên tố này rất quan trọng cho sinh trưởng của mô
và tế bào thực vật (Ngô Xuân Bình 2010).
1.6.4.3.3 Cáckhoáng vi lượng
Các nguyên tố vô cơ cần một lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu đi trong quá
trình sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng gồm Fe,
B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Mn …
Cácyếu tố khoáng vi lượng đượcsử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 mg/l môi trường,
các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Ngô Xuân
Bình 2010).
1.6.4.3.4 Cácvitamin
Theo Ngô Xuân Bình (2010), các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng
tổng hợp được hầu hết các vitamin cơ bản nhưng thường dưới số lượng yêu cầu, do đó
phải bổ sung thêm một hay nhiều loại vitamin vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là
vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 ... Các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-
inositol … đóng vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào và thường được sử dụng với
hàm lượng lớn từ 50 – 100 mg/l.
Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần
dung dịch được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Dung dịch vitamin dễ hỏng do nấm,
khuẩn nhiễm tạp và bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì thế cần bảo quản trong điều kiện lạnh
dưới 0°C hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng.

20
1.6.4.3.5 Cácchất điều hòa sinh trưởng
Theo Ngô Xuân Bình (2010), trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thành phần quan
trọng trong việc quyết định kết quả nuôi cấy mô là chất điều hòa sinh trưởng. Chúng là
yếu tố quan trọng trong điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây hoàn chỉnh.
Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là:
- Auxin:
 Còn được gọi là hormone sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát
hiện.
 Có các tác dụng sinh lí sau: Tác dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào,
hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn,
tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt,
kìm hãm sự rụng lá, hoa quả.
 Các loại Auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô: IAA, NAA, 2,4-D, IBA.
- Cytokinin:
 Hiệu quả sinh lí đặc trưng nhất củaCytokinin đối với thực vật là kích thích
sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp
axit nucleic, protein và có mặt trong ARN vận chuyển.
 Ảnh hưởng đến sự phân hóa chồi, kìm hãm sự già hóa của cơ quan và của
cây nguyên vẹn, có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, làm yếu hiện
tượng ưu thế ngọn.
 Các loại Cytokinin thường dùng: Kinetin, Zeatin, BAP …
- Giberellin:
 Được phát hiện vào năm 1930.
 Kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn cao dài lóng
cây họ lúa. Kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, kích thích sự ra hóa, ức
chế phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực, tăng kích thước
quả , tạo quả không hạt.

21
 Một số Giberellin: AAB, GA.
1.6.4.3.6 Nhóm chất tự nhiên
Theo nghiên cứu của Vũ Quang Sáng và cộng sự (2007) các chất tự nhiên bổ
sung, thường bao gồm:
- Nước dừa: Theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và
cộng tác viên (1961) cho thấy, trong nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho
sự sinh trưởng của tế bào như axit amin, axit béo, axit hữu cơ, đường, ARN,
ADN, Myo-inositol, các chất có hoạt tính Auxin, các glucocid của Cytokinin.
- Dịch chiết nấm men: White (1934) lần đầu tiên đã nuôi cấy thành công rễ
cây cà chua trong môi trường có dịch nấm men. Thành phần của dịch chiết nấm
men gồm có đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, Auxin, khoáng. Dịch chiết
tốt cho sinh trưởng của rễ nhưng không tốt với mô sẹo.
- Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) chứa chủ yếu một số đường, vitamin
và một số chất có hoạt tính điều tiết sinh trưởng.
- Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt ...) với thành
phần có đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, khoáng ...
1.6.4.3.7 Ánh sáng
Đối với nuôi cấy mô, ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát
sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Mỗi loài thực vật khác nhau có những
đáp ứng khác nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau.
Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô
và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của
chúng.
Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây
vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp (Dương Công Kiên 2006).
1.6.4.3.8 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sựsinh trưởng vàphát triển củacây con in vitro. Nhiệt
độ phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ 22 – 25°C.

22
Một số loài cầncó nhiệt độ tối ưu để phát sinh hình thái (Dương Công Kiên 2006).
1.6.4.3.9 pH
Độ pH của môi nuôi câythích hợp đa số các loại cây trồng giao động từ 5,5 – 5,8.
Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng. Khi pH < 4 hoặc pH > 7 thì
sẽ kết tủa một số loại muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ làm chết cây. Cần phải
điểu chỉnh pH cho phù hợp từ 5,5 – 5,8 bằng NaOH hoặc HCL 1N (Vũ Quang Sáng và
cộng sự 2007).
1.6.4.3.10 Sự thoáng khí
Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cáchtự nhiên nhờ sựhiện diện của khí CO2
trong không khí như một nguồn cung cấp cacbon. Trong nuôi cấy in vitro truyền thống,
nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng
quang tự dưỡng, thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt
(Dương Tấn Nhật 2007; Bùi Trang Việt 2000).
1.6.4.3.11 Agar
Agar là một loại polysaccharide của tảo (chủ yếu tảo hồng – Rodophyta). Agar
khi ngậm nước ở 80°C sẽ chuyển sang dạng sol và 40°C thì sẽ trở về trạng thái gel. Khả
năng ngậm nước củaagar cao (6 – 12 g/l nước). Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫnđảm
bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng. Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây
trong nuôi cấy mô.
1.7 Những nghiên cứu trong nước và ngoài nước về quy trình nhân
giống các loài thông
1.7.1 Nghiên cứu trong nước
Năm 2009, quy trình nhân giống in vitro Pinus caribaea do Kiều Phương Nam
và cộng sự được thực hiện. Tiến hành tiền xử lý mẫu với axit benzoic, axit citric sẽ gia
tăng hiệu quả khử trùng (93,33%). Tạo các búp chồi ngủ là vật liệu phù hợp cho quá
trình khởi đầu quy trình nhân giống trên môi trường Schenk & Hildebrandt (SH) bổ sung
30 g/l glucose, 10% nước dừa, 2 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA.

23
Năm 2011, Vương Đình Tuấn và cộng sự ở phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm
nghiệp NamBộ thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii)
trong điều kiện in vitro”. Nghiên cứu tạo phát sinh phôi và phôi soma đã đạt được kết
quả tốt trên môi trường Litvary và cộng sự (LVM) có bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 3,0 mg/l
BA. Trọng lượng tươi của tế bào tiền phôi tăng hơn 3 lần ở tuần đầu trên môi trường có
bổ sung 500 mg/l glutamine. Đường maltose ở 90 g/l kết hợp 80 mg/l ABA và 10 g/l
phytagel tạo phôi soma tốt hơn sucrose ở cùng nồng độ.
Năm 2012, Phạm Chí Nhân đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de vries) trong
điều kiện in vitro”. Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi đạt được kết quả tốt trên
môi trường LVM bổ sung L-glutamin 500 mg/l, BA 1 mg/L. Đường maltose ở nồng độ
60 – 90 g/l phối hợp cùng 30 g/l polyethylene glycol (PEG) tốt hơn đường sucrose khi
sử dụng trong thành thục tế bào tiền phôi và tạo phôi soma.
Năm 2014, công trình “Nghiên cứu một số ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo phát sinh,
nhân nhanh khối tiền phôi và tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii)trong điều kiện
in vitro” được thực hiện bởi Phan Thị Mỵ Lan và Nguyễn Xuân Cường, viện Khoa học
Lâm nghiệp Nam Bộ. Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo phát sinh và nhân nhanh khối
tiền phôi soma thông nhựa đã được nghiên cứu. Tỷ lệ hình thành khối tiền phôi 25,3 –
40% của phôi soma đạt được khi chưa trưởng thành nuôi cấy trên môi trường LVM bổ
sung 2,4-D (2,0 mg/l) và BA (1,0 mg/l). Tỷlệ này đã đượccải thiện lênđến 37,6 – 58,3%
khi thay thế BA (1,0 mg/l) bằng 24 – epibrassinolide 1,0 mg/l. Môi trường tối ưu nhất
cho hệ số tăng sinh khối ở tất cả các dòng là LVM kết hợp với 2,4-D (2,0 mg/l + BA (1,0
mg/l). Trọng lượng tươi tăng từ 2,58 đến 3,89 lần ở tuần đầu tiên sau cấy. Số phôi soma
tạo thành dao động 40 đến 58,33 phôi/1g trọng lượng tươi tùy theo các dòng khi nuôi
cấy trên môi.
Đối với thông ba lá Pinus kesiya, phương pháp nhân giống phổ biến hiện nay là
gieo hạt hoặc giâm trong bầu giá thể (viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2009). Các
quy trình nhân giống in vitro vẫn chưa được công bố rộng rãi.

24
Năm 2006, “Nhân giống một số loài cây rừng bằng phương pháp giâm hom và
triển vọng trồng rừng của chúng” được viết bởi Trần Văn Tiến, viện Khoa học Lâm
nghiệp Việt Nam. Phương pháp giâm hom chủ yếu từ cành hoặc chồi được cắt thành
đoạn từ 10 – 15 cm, sau đó được nhúng vào thuốc bột rồi cắm vào giá thể cát hay túi
bầu. Giâm hom là phương pháp dễ dàng thực hiện, ít tốn kém, thời gian ngắn, tỷ lệ ra rễ
cao. Giâm hom thông ba lá tốt nhất ở giai đoạn 2 – 7 tuổi, bằng chồi đã qua giai đoạn
tạo chồi. Khi được xử lý bằng IBA 0,5 – 1% tỷ lệ ra rễ từ 80 – 90%.
Theo “Kỹ thuật trồng thông ba lá” (viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2009,
2014) phương pháp gieo và trồng thông ba lá từ hạt cho thấy khả năng tái sinh bằng hạt
của cây mạnh, cây thích hợp với đất có pH 4 – 5,0, có thể trồng ở nơi đất nghèo dinh
dưỡng trừ những nơi đất kiềm hoặc mặn. Hạt giống được thu trên các cây trội từ tháng
11 đến tháng 2 năm sau. Hạt phải đạt tiêuchuẩn 04-TCN-41-2001vàtỷlệ 14 – 17 g/1000
hạt hoặc 60000 – 70000 hạt/kg.
1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước
Năm 1977, Kathryn và Jenny đã nghiên cứu quá trình nhân giống Pinus radiata
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Cây con được hình thành từ mô chưa phát triển. Thí nghiệm
được thực hiện trên môi trường SH bổ sung 200 mg/l glutamine, 5 mg/l BAP không cần
bổ sung Auxin và môi trường Gresshoff và Doy (GD) bổ sung 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l
IBA.
Năm 1993, McKellar đã thực hiện nghiên cứu vi nhân giống Pinus patula trong
điều kiện in vitro. Nghiên cứu này khảo sát các khả năng và khó khăn của ba hệ thống
in vitrokhác nhau để nhân rộng P. patula là nguồn vật liệu hiếm và quan trọng. Kỹ thuật
nảy mầm và khử trùng hạt đã được phát triển cho thí nghiệm tạo phôi soma và chồi bất
định. Chồi bất định được lấy từ phôi trưởng thành P. patula và được nuôi cấy trên môi
trường LVM chứa 5 mg/l BA. Nghiên cứu này cung cấp một số kiến thức cơ bản và các
công việc nền tảng cho những người gây giống cây muốn thực hiện các kỹ thuật công
nghệ sinh học trong việc lựa chọn và cải tiến các kiểu gen P. patula.

25
Năm 1993, quy trình nhân giống in vitro thông ba lá P. kesiya đã được nghiên
cứu bởi Nadgauda và cộng sự. Các cụm chồi được nhân lên từ các chồi đỉnh và chồi bên
của cây thông mẹ 20 tuổi. Môi trường nuôi cấy là môi trường DCR ½ bổ sung 0,5 mg/l
BA và 3% sucrose. Các chồi sau đó được cấy trên môi trường bổ sung 0,25 mg/l Kinetin
để tăng trưởng chồi và ra rễ sau 40 – 50 ngày nuôi cấy.
Năm 2001, Nandwani và cộng sự đã thu mẫu chồi của cây thông ba lá nảy mầm
từ hạt vô trùng và tăng sinh cụm chồi khi nuôi cấy các mẫu này trên môi trường MS bổ
sung 23 µM Kinetin trong 4 tuần. Để tăng trưởng chồi, các chồi con được chuyển sang
môi trường MS trong 4 tuần. Môi trường thích hợp cho việc ra rễ của chồi là môi trường
GD bổ sung NAA hoặc IBA.
Năm 2006, nghiên cứu về tái tạo cây Pinus massoniana L trong ống nghiệm được
thực hiện bởi Zhang và cộng sự ở Trung Quốc. Hệ thống tái sinh thực vật hiệu quả từ
phôi trưởng thành và nảy mầm của Pinus massoniana đã được thành lập trong nghiên
cứu này trên môi trường DCR, GD bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA. Các
chồi ngẫu nhiên được nuôi cấy trên môi trường DCR bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,05 mg/l
IBA hoặc NAA. Tỷ lệ cảm ứng cao nhất của chồi là 99,3%. Sau khi nuôi cấy trên môi
trường kéo dài, các chồi cao hơn 2 cm được chuyển vào môi trường GD ½ bổ sung 2
mg/l IBA và 0,05 mg/l BA. Tỷ lệ ra rễ trung bình trên 70%. Sau khi rễ đã xuất hiện, các
chồi đượcchuyển đến môi trường GD ½ bổ sung 0,2 mg/l IBA cho rễ phát triển hơn nữa.
Năm 2010, Zhu và cộng sự thực hiện nghiên cứu vi nhân giống Pinus massoniana
và sự hình thành nấm rễ cộng sinh trong điều kiện in vitro. Cây ươm giống được nuôi
cấy trên môi trường GD bổ sung BA, NAA để kích thích sự hình thành chồi nách. Tỷ lệ
mọc của các chồi trên môi trường GD bổ sung 4,0 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA là 97%.

26
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. VẬT LIỆU
Hạt thông ba lá (P. kesiya) được lấy giống từ thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp thực nghiệm, mô tả, thống kê và
phân tích dữ liệu.
Phương pháp luận dựa trên:
- Các kiến thức về sinh lý thực vật của đối tượng nghiên cứu.
- Các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài.
2.1 Vô trùng mẫu nuôi cấy
Hạt thông được rửa kỹ bằng nước máy. Sau đó khử trùng sơ bộ bằng cồn 70°
trong 2 phút, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch Oxy già (3%, 5%) được pha loãng từ
dung dịch Oxy già 30% ban đầu (Xilong Scientific Co., Ltd.), sau đó rửa lại bằng nước
cất vô trùng khoảng 4 – 5 lần.
Thời gian khử trùng khác nhau được khảo sát (3 phút, 5 phút). Hạt thông sau khi
khử trùng được cấy vào môi trường Water Agar (WA), che tối trong điều kiện nhiệt độ
25o
C ± 2o
C. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần 10
mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt vô trùng (%) sau khi được khử trùng với dung dịch
Oxy già với thời gian khác nhau sau 1 tuần nuôi cấy.
2.2 Nuôi cấy hạt thông ba lá in vitro
Để khảo sátkhả năng nảy mầm của hạt thông, cấyhạt thông vô trùng trên cácmôi
trường dinh dưỡng MS½ và WA bổ sung 0,5% glucose.
Mẫu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25o
C ± 2o
C, che tối. Thí
nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 4 lần lặp lại, mỗi lần 15 mẫu.
Chi tiêu theo dõi: Tỷ lệ tách vỏ và ra rễ (%) của hạt thông ba lá.

27
2.3 Nhân chồi thông ba lá in vitro
Chồi được tách từ cây con vô trùng và cấy trên môi trường MS đối chứng và MS
bổ sung 10% nước dừa, 30% glucose với 0,5 mg/l IBA và các nồng độ BAP khác nhau
để khảo sát khả năng hình thành chồi của cây thông ba lá. Thí nghiệm được tiến hành
theo 4 nghiệm thức sau:
Nghiệm thức Nước dừa (%) Glucose (%) IBA (mg/l) BAP (mg/l)
M0 0 0 0 0
M1 10 30 0 0
M2 10 30 0,5 1
M3 10 30 0,5 1,5
C ± 2o
C, cường độ chiếu
sáng 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. Thí nghiệm được bố trí hoàn
toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần 10 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi được tạo thành từ mỗi mẫu sau 4 tuần nuôi cấy.
Khả năng hình thành chồi (BFC – The bud-forming capacity) được tính dựa trên
số lượng chồi trung bình và tỷ lệ phần trăm hình thành chồi của các mẫu (Tandon và
cộng sự 2007).
BFC = (số lượng chồi trung bình trên một mẫu) x (tỷ lệ phần trăm hình thành chồi
của các mẫu) ÷ 100
2.4 Tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro
Các chồi in vitro được cấy trên môi trường MS đối chứng và MS có bổ sung 10%
nước dừa, 30% glucose và BAP với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng tăng
trưởng chồi in vitro của cây thông ba lá. Thí nghiệm được tiến hành theo 4 nghiệm thức
sau:
Nghiệm thức Nước dừa (%) Glucose (%) BAP (mg/l)
M0 0 0 0
M1 10 30 0
M6 10 30 0,1
M7 10 30 0,2

28
C ± 2o
C, cường độ chiếu
Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi ban đầu và sau khi cấy (cm) sau 2 tuần.
2.5 Tạo rễ - hình thành cây in vitro
Các chồi in vitro có chiều cao 1,0 – 1,5 cm (chiều cao thân giả) được cấy vào môi
trường MS½ đối chứng và có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả
năng tạo rễ in vitro của cây thông ba lá. Thí nghiệm được tiến hành theo 4 nghiệm thức
sau:
Nghiệm thức IBA (mg/l)
M9 0
M10 0,5
M11 1,0
M12 1,5
Mẫu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25°C ± 2°C, cường độ chiếu
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng rễ của mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy.
3. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu thực nghiệm qua thống kê bằng các phần mềm thống kê Microsoft
Excel 2010 và Statgraphics plus 3.0.

29
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHỬ TRÙNG HẠT THÔNG BA LÁ
1.1 Sơ đồ quy trình khử trùng hạt
Rửa hạt bằng nước
máy từ 3 – 5 tiếng
Rửa hạt bằng cồn 70°
cất vô trùng 3 – 4 lần
Khử trùng hạt bằng
Oxy già
cất vô trùng 3 – 4 lần
Cấy hạt lên môi
trường Water agar

30
1.2 Kết quả khảo sát khử trùng hạt
Hạt thông ba lá sau khi được khử trùng với dung dịch Oxy già 3%, 5% với các thời
gian khác nhau được cấy vào môi trường WA. Các mẫu được theo dõi trong 1 tuần để ghi
nhận tỷ lệ các hạt đã vô trùng, không bị nhiễm vi sinh vật (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Tỷ lệ hạt vô trùng sau khi được khử trùng bằng Oxy già với thời gian khác
nhau.
Nghiệm thức Nồng độ Oxy già Thời gian khử trùng Tỷ lệ hạt được vô
trùng (%)
1 3% 3 phút 96,67 ± 5,77 ns
2 3% 5 phút 100 ± 0,0 ns
3 5% 3 phút 100 ± 0,0 ns
4 5% 5 phút 93,33 ± 5,77 ns
cv (%) 4,19
ns: Không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 qua phép thử Duncan.
Số hiệu được biểu diễn: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn.
Các ký tự theo sau các trung bình nghiệm thức dùng để so sánh sự khác biệt qua phép kiểm định Duncan.
Các trung bình có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức α = 0,05 qua phép thử Duncan.
Qua kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong
thí nghiệm qua thống kê. Như vậycó thể thấy rằng thời gian khử trùng thích hợp đối với hạt
thông ba lá là 5 phút với chất khử trùng là dung dịch oxy già 3% hoặc với thời gian khử
trùng là 3 phút, nồng độ dung dịch chất khử trùng là 5%

31
Hình 3.1: Hạt thông ba lá vô trùng khi mới cấy vào môi trường.
2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NUÔI CẤY HẠT THÔNG BA LÁ IN
VITRO
Những hạt thông vô trùng sau một tuần cấy trên môi trường WA được cấy chuyển
vào môi trường dinh dưỡng WA bổ sung 0,5% glucose và MS½ để khảo sát môi trường
thích hợp cho sự nảy mầm của hạt.
Sau khoảng 1 tuần nuôi cấy, các hạt thông bắt đầu tách vỏ. Sau 2 tuần tiếp theo rễ
của cây mầm nhú ra khỏi vỏ hạt. Và sau khoảng 5 tuần nuôi cấy, các chồi lá của cây mầm
mới xuất hiện. Kết quả quan sát được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ tách vỏ và ra rễ của hạt thông ba lá khi được nuôi cấy trên môi trường
dinh dưỡng.
Nghiệm thức Tỷ lệ tách vỏ (%) Tỷ lệ ra rễ (%)
MS½ 15 ± 6,38 ns 23,33 ± 20,72 ns
Water agar + 0,5% glucose 20 ± 5,44 ns 8,33 ± 3,33 ns
cv (%) 2,27 0,84
ns: Không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 qua phép thử Duncan.

32
Qua kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong
thí nghiệm qua thống kê. Nghiệm thức sử dụng môi trường MS½ và WA bổ sung 0,5%
glucose có tỷ lệ tách vỏ tương đương nhau và tỷ lệ ra rễ giữa hai nghiệm thức cũng không
có sự khác biệt có ý nghĩa. Tuy nhiên, trên thực tế quan sát thì trong môi trường MS½ cho
kết quả tỷ lệ hạt ra rễ cao hơn (23,33%) so với môi trường WA có bổ sung 0,5% glucose
(8,33%).
Hình 3.2: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường WA + 0,5% glucose.
Hình 3.3: Hạt thông ba lá nảy mầm trên môi trường MS½.

33
Kết quả khảo sát cho thấy môi trường MS½ có thể sử dụng cho việc nuôi cấy nảy
mầm hạt thông ba lá với tỷ lệ hạt nảy mầm là 23,33 % (dựa trên tỷ lệ hạt phát triển rễ). Tuy
nhiên, hạt thông ba lá gieo hạt ở ngoài vườn ươm, trong bầu giá thể có thể đạt tỷ lệ nảy
mầm từ 60 – 85% với loại hạt đạt tiêu chuẩn 04-TCN-41-2001, tỷ lệ 14 – 17 g/1000 hạt và
hạt phải được gieo ngay sau khi thu hái (viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2014). Tỷ
lệ hạt thông ba lá nảy mầm của đề tài thấp hơn so với quy trình gieo hạt truyền thống.
Nhưng tỷ lệ này phụ thuộc vào chất lượng hạt, thời gian lưu giữ hạt. Do đó, để tăng tỷ lệ
nảy mầm của hạt trong điều kiện in vitro thì cầnchọn hạt vừa được thu hái và có chất lượng
tốt theo tiêu chuẩn 04-TCN-41-2001, đồng thời cần tiếp tục khảo sát môi trường tốt nhất
cho sự nảy mầm của hạt thông ba lá.
3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHÂN CHỒI THÔNG BA LÁ IN
VITRO
Hạt sau khi nảy mầm, ra rễ, sẽ phát triển thành cây con. Cây con cao được 2 – 3 cm
sẽ được cắt lấy phần chồi với kích thước từ 0,5 – 1,5 cm. Mẫu chồi được chuyển sang môi
trường nhân chồi MS có bổ sung 10% nước dừa, 30% glucose, 0,5 mg/l IBA với các nồng
độ BA khác nhau.
Các mẫu chồi được nuôi cấy trên các môi trường M0 đối chứng với pH 5,8 và môi
trường M1, M2, M3 với pH 4,8 – 4,9. Kết quả quan sát được trình bày ở Bảng 3.3 sau 4
tuần nuôi cấy.

34
Bảng 3.3: Sự hình thành chồi mới của chồi thông ba lá khi được nuôi cấy trên các môi
trường dinh dưỡng.
Nghiệm thức Số chồi/mẫu Tỷ lệ cảm ứng tạo chồi BFC
(%)
M0 0,00 ± 0,00 c 0,00 ± 0,00 c 0
M1 0,47 ± 0,42 bc 33,33 ± 35,11 bc 0,16
M2 2,43 ± 0,78 a 90,00 ± 10,00 a 2,19
M3 1,13 ± 0,32 b 66,67 ± 20,82 ab 0,75
cv (%) 46,5 44,24
Qua kết quả cho thấy thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí
nghiệm qua thống kê đối với sự hình thành chồi của thông ba lá. Nghiệm thức M2 có số
chồi được tạo thành cao nhất (2,43 cụm chồi/mẫu) và có sự khác biệt có ý nghĩa so với các
nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức M0, M1, M3 có số chồi được tạo thành thấp hơn (0,00
chồi/mẫu; 0,47 cụm chồi/mẫu; 1,13 chồi/mẫu) so với các nghiệm thức M2. Đối với tỷ lệ
cảm ứng tạo chồi, nghiệm thức M2 có sự khác biệt không quá ý nghĩa so với các nghiệm
thức M1 và M3 qua thống kê, các nghiệm thức có tỷ lệ tạo chồi tương đương. Tuy nhiên,
nghiệm thức M2 có sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức M0 đối chứng.
Trên thực tế quan sát, mẫu cấy trên môi trường MS đối chứng, không có sự hình
thành chồi mới, có hiện tượng héo úa, chồi mất dần màu xanh và chết dần sau 4 tuần nuôi
cấy. Tỷ lệ tạo chồi trên môi trường MS bổ sung 10% nước dừa, 30 g/l glucose, 0,5 mg/l
IBA và 1,5 mg/l BAP cao hơn (66,67%) so với môi trường MS chỉ bổ sung 10% nước dừa,
30 g/l glucose (33,33%), tuy nhiên lại thấp hơn so với môi trường MS bổ sung 10% nước
dừa, 30 g/l glucose, 0,5 mg/l IBA, 1 mg/l BAP (90%).

35
trường M0.
Hình 3.5: Chồi thông ba lá Pinus kesiya ban đầu (trái) và sau 4 tuần (giữa, phải) trong môi
trường M1.

36
trường M2.
trường M3.
Kết quả khảo sát cho thấy, có sự phát triển và hình thành chồi mới trên môi trường
MS bổ sung 10% nước dừa, 30% glucose, 0,5 mg/l IBA và 1 mg/l BAP, khoảng 2 – 3
chồi/mẫu trong 4 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển khỏe mạnh, xanh tốt, tỷ lệ cảm ứng tạo
chồi 90%, BFC cao nhất 2,19, cao hơn 13,69 lần so với môi trường MS bổ sung 10% nước

37
dừa, 30% glucose (0.16) và 2,92 lần so với môi trường MS bổ sung 10% nước dừa, 30%
glucose, 0,5 mg/l IBA và 1,5 mg/l BAP (0,75).
Khi so sánh kết quả khảo sát với kết quả thí nghiệm tái sinh chồi từ một đoạn chồi
của thông ba lá được thực hiện bởi Nandwani và cộng sự (2001), mẫu được nuôi trên các
môi trường dinh dưỡng Quoirin & Lepoivre (LP), SH, MS bổ sung 1 mg/l BAP trong 4
tuần. Môi trường LP, số chồi trung bình được tạo thành là 4,2 chồi/mẫu, tỷ lệ cảm ứng
23,6%, BFC 0,99. Môi trường SH, số chồi trung bình tạo thành là 7,1 chồi/mẫu, tỷ lệ cảm
ứng 47,2%, BFC 3,35. Môi trường MS, số chồi trung bình tạo thành là 8,5 chồi/mẫu, tỷ lệ
cảm ứng 34,7%, BFC 2,95. Kết quả khảo sát cho thấy rằng môi trường MS bổ sung 10%
nước dừa, 30% glucose, 0,5 mg/l IBA và 1 mg/l BAP có thể sử dụng cho việc nuôi cấy và
nhân chồi thông ba lá với số chồi trung bình tạo thành 2,43 chồi/mẫu, tỷ lệ cảm ứng 90%,
BFC 2,19.
4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TĂNG TRƯỞNG CHỒI THÔNG BA LÁ
IN VITRO
Các chồi con hình thành từ thí nghiệm nhân chồi sẽ được tách ra và nuôi cấy trên
môi trường tăng trưởng chồi MS có bổ sung 10% nước dừa, 30% glucose với các nồng độ
BAP khác nhau.
Cácmẫu chồi đượcnuôi cấytrên môi trường M0 đối chứng với pH5,8 và môi trường
M1, M6, M7 với pH 4,8 – 4,9. Kết quả quan sát được trình bày ở Bảng 3.4 sau 2 tuần nuôi
cấy.

38
Bảng 3.4: Sự tăng trưởng của chồi thông ba lá trong các môi trường dinh dưỡng.
Nghiệm thức Tỷ lệ chồi cảm ứng Chiều dài chồi thay đổi
(%) (cm)
M0 0,00 ± 0,00 c 0,00 ± 0,00 c
M1 40,00 ± 40,00 bc 0,16 ± 0,14 bc
M6 86,67 ± 11,54 a 0,51 ± 0,11 a
M7 53,33 ± 15,27 ab 0,15 ± 0,06 b
cv (%) 49,27 38,1
Qua kết quả cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí
nghiệm qua thống kê đối với sự thay đổi chiều cao của chồi. Nghiệm thức M6 có sự thay
đổi chiều cao chồi lớn nhất (0,51 cm) và có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức
M1, M7 và nghiệm thức đối chứng (0,16 cm, 0,15 cm và 0 cm). Đối với tỷ lệ cảm ứng chồi,
nghiệm thức M6 có sự khác biệt không quá ý nghĩa so với các nghiệm thức M1 và M7 qua
thống kê, các nghiệm thức có tỷ lệ cảm ứng tương đương nhau. Nghiệm thức M6 có sự
khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức M0 đối chứng qua thống kê.
Trên thực tế quan sát các mẫu chồi được nuôi trên môi trường MS đối chứng sau 2
tuần, chồi thông ba lá không phát triển, nhợt nhạt, sức sống yếu. Trên môi trường MS bổ
sung 10% nướcdừa, 30 g/l glucose và 0,1 mg/l BAP cótỷ lệ cảmứng chồi caohơn (86,67%)
so với môi trường MS bổ sung 10% nước dừa, 30 g/l glucose (40%) và môi trường MS bổ
sung 10% nước dừa, 30 g/l glucose và 0,2 mg/l BAP (53,33%).
Qua kết quả khảo sát, môi trường MS bổ sung 10% nước dừa, 30 g/l glucose và 0,1
mg/l BAP có thể được sử dụng cho việc nuôi cấy và tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro
với tỷ lệ cảm ứng 86,67%, chiều cao chồi (0,51 cm) cao gấp 3,4 lần so với môi trường bổ
sung 0,2 mg/l BAP và gấp 3,18 lần so với môi trường không bổ sung BAP sau 2 tuần nuôi
cấy.

39

40
5. KẾT QUẢ TẠO RỄ - HÌNH THÀNH CÂY IN VITRO
Các chồi in vitro có chiều cao 1,0 – 1,5 cm (chiều cao thân giả) được cấy vào môi
trường MS½ có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng tạo rễ in

41
vitro. Các chồi được nuôi trên môi trường M9 đối chứng với pH 5.5 và môi trường M10,
M11, M12 với pH 5.0 – 5.1.
Sau 4 tuần nuôi cấy chồi thông ba lá trên cácmôi trường tạo rễ in vitro thì không ghi
nhận được tỷ lệ cảm ứng ra rễ và phát sinh rễ của chồi thông ba lá. Tuy nhiên, ghi nhận
được sự lớn lên của chồi thông ba lá trong các môi trường ra rễ.
Hình 3.13: Chồi thông ba lá ban đầu (trái) và sau 4 tuần (phải) trong môi trường M10

42
So sánh kết quả khảo sát với bảng ghi nhận kết quả thí nghiệm tỷ lệ ra rễ của các
chồi thông ba lá P. kesiya trong môi trường MS½ bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau
(0,1 mg/l; 0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4 mg/l; 0,5 mg/l) được thực hiện bởi Varjinia Kalita (1998),
chồi thông ba lá được nuôi cấy trên môi trường MS½ bổ sung 0,3 mg/l IBA cho kết quả
cảm ứng ra rễ tốt nhất (36,4 ± 2,5) với 1 đến 2 rễ con được hình thành sau 4 tuần nuôi cấy.

43
Tuy nhiên, môi trường MS½ bổ sung 0,1 mg/l IBA; 0,2 mg/l IBA và 0,5 mg/l IBA không
ghi nhận được tỷ lệ cảm ứng ra rễ và hình thành rễ từ chồi thông ba lá in vitro. Ngoài ra,
Varjinia Kalita (1998) cũng tiến hành khảo sát ảnh hưởng của NAA ở nồng độ và thời gian
tương ứng với IBA đến sự tạo rễ của chồi, ghi nhận được ở môi trường MS½ + 0,2 mg/l
NAA có tỷ lệ cảm ứng cao nhất là 68,1 ± 2,58 với 3 – 4 rễ tạo thành. Trên môi trường MS½
bổ sung NAA ở các nồng độ 0,3 mg/l; 0,4 mg/l; 0,5 mg/l cho kết quả cảm ứng lần lượt là
61,3 ± 1,92; 56,2 ± 2,53; 42,5 ± 1,82, riêng môi trường MS½ + 0,1 mg/l NAA không ghi
nhận đượckết quả. Cũng trong nghiên cứu tạo rễ từ chồi in vitro, một thí nghiệm khác cũng
đã được Varjinia Kalita (1998) thực hiện, các chồi thông được tiền xử lý với IBA và NAA
ở nồng độ (10 mg/l, 20 mgl/, 30 mg/l) với các khoảng thời gian khác nhau (12 giờ, 24 giờ,
48 giờ), sau đó được chuyển vào môi trường MS½ căn bản, không bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.5 sau 4 tuần nuôi cấy.
Bảng 3.5: Tỷ lệ cảm ứng ra rễ của chồi thông ba lá sau khi được tiền xử lý với IBA, NAA
ở các nồng độ và các khoảng thời gian khác nhau (Varjinia Kalita, 1998)
Chất điều
hòa sinh
trưởng
Thời gian
(giờ)
Nồng độ
(mg/l)
Tỷ lệ cảm
ứng (%)
Trạng thái
IBA
12 10 - -
24 10 25,3 ± 2,53 Có rễ nhỏ phát triển
48 10 22,1 ± 1,58 Có sự phát sinh rễ con
12 20 - -
24 20 - -
48 20 - -
12 30 - -
24 30 - -
48 30 - -
NAA
12 10 45,3 ± 2,83 1 rễ nhỏ phát triển
24 10 70,1 ± 1,56 3 - 4 rễ
48 10 58,2 ± 2,56 2 - 3 rễ
12 20 48,3 ± 2,81 2 - 3 rễ
24 20 46,4 ± 2,98 1 - 2 rễ
48 20 - -
12 30 35,1 ± 1,86 1 - 2 rễ
24 30 - -
48 30 - -

44
Sau khi so sánh các kết quả với nhau, có thể thấy rằng hàm lượng IBA (0,5 – 1,5
mg/l) và thời gian chồi tiếp xúc với IBA (4 tuần) là chưa phù hợp cho sự tạo rễ của chồi
thông ba lá.
Qua kết quả khảo sát và kết quả thí nghiệm tạo rễ của Varjinia Kalita (1998) cho
thấy môi trường MS½ và IBA thích hợp cho sự tăng trưởng chồi của thông ba lá. Tuynhiên
để tỷ lệ tạo rễ của chồi thông ba lá in vitro được tốt nhất cần thay đổi hàm lượng IBA bổ
sung vào môi trường và thời gian chồi được xử lý với IBA hoặc thay đổi chất điều hòa sinh
trưởng, ví dụ NAA, để tìm được môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ của chồi thông ba
lá in vitro.

45
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
- Xây dựng được quy trình khử trùng hạt thông ba lá Pinus kesiya, xác định được
thời gian khử trùng với nồng độ dung dịch Oxy già phù hợp với thông ba lá là 3%, 5 phút
hoặc 5%, 3 phút đạt tỷ lệ khử trùng cao (100%).
- Ghi nhận được sự nảy mầm của hạt thông ba lá P. kesiya khi nuôi cấy trên môi
trường MS½ và WA bổ sung 0,5% glucose.
- Ghi nhận được môi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l glucose + 0,5 mg/l IBA
+ 1 mg/l BAP thích hợp để nhân chồi thông ba lá in vitro với số chồi là 2,43 chồi/mẫu, tỷ
lệ cảm ứng 90%, BFC 2,19 trong vòng 4 tuần.
- Ghi nhận được môi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l glucose + 0,1 mg/l BAP
thích hợp để tăng trưởng chồi thông ba lá in vitro với chiều cao chồi thay đổi sau 2 tuần
được ghi nhận là 0,51 cm, tỷ lệ cảm ứng 86,67%.
- Chưa ghi nhận được thời gian và nồng độ IBA thích hợp cho sự tạo rễ của chồi
thông ba lá in vitro, tuy nhiên ghi nhận được sự tăng trưởng của chồi thông ba lá ở nồng độ
IBA từ 0,5 – 1,5 mg/l
2. KIẾN NGHỊ
- Khảo sátsự ảnh hưởng của nồng độ, thời gian tiền xử lý vớiIBA đối với khả năng
tạo rễ của chồi thông ba lá P. kesiya trong điều kiện in vitro.

46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển. Nhà
xuất bản Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh.
2. Dương Công Kiên, 2006. Nuôi cấy mô tập III. Nhà xuất bản Đại học Quốc
gia, Tp. Hồ Chí Minh.
3. Dương Tấn Nhựt, 2011. Công nghệ sinh học thực vật tập 1. Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh.
4. Kiều Phương Nam, Cao Quốc Liêm, Trần Trung Hiếu, Bùi Văn Lệ, Kiều
Thanh Tịnh, 2009. Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea (Pinus caribaea).
Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp 2009 (1): 854-859.
5. Lã Đình Mỡi, 2002. Chi Thông – Pinus L. Tài nguyên Thực vật có tinh dầu
ở Việt Nam. Tập II (Lã Đình Mỡi – Chủ biên). Nhà xuất bản Nông nghiệp – Hà Nội
6. Ngô Xuân Bình, 2010. Nuôi cấy mô tế bào thực vật- Cơ sở lý luận và ứng
dụng. Nhà xuất bản Khoa học- Kỹ thuật, Hà Nội.
7. Nguyễn Chí Nhân, 2012. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa học
đến tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii Jungh et de Vries) trong điều kiện in vitro.
Luận văn thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Hoàng Sa, 2017. Nghiên cứu thành phần hóa học của cácloài lá kim:
Pinus dalatesis, Pinus kesiya và Podocarpus neriifolius ở Việt Nam. Luận án Tiếnsĩ Hóa
học. Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
9. Phan Thị Mỵ Lan, Nguyễn Xuân Cường, 2014. Nghiên cứu một sốảnh hưởng
đến tỷ lệ tạo phát sinh, nhân nhanh khối tiền phôi và tạo phôi soma thông nhựa (Pinus
merkusii) trong điều kiện in vitro. Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp 2014 (4): 3491-3498.
10. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích tập II. Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội.
11. Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Kim Thanh,
2007. Giáo trình sinh lý tế bào thực vật. Trường Đai học Nông nghiệp I Hà Nội.

47
12. Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan, 2010. Nghiên
cứu tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii) trong điều kiện in vitro. Kỷ yếu Hội nghị
Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp với phát triển rừng bền vững và biến đổi khí hậu, Viện
Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, 23-24/9/2010 Thành phố Hồ Chính Minh: 38-44 .
Tài liệu Tiếng Anh
13. Farjon A., 2013. Pinus kesiya. The IUCN Red List of Threatened Species
2013: e.T42372A2975925.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2013-1.RLTS.T42372A2975925.en
14. Kathryn R., Jenny W., 1977. Vegetative propagationof radiatapine by tissue
culture: Plantlet formation from embryonic tissue. New Zealand Journal of Forestry
Science, 7: 199-206.
15. McKellar S.D., 1993. Micropropagation and in vitro studies of Pinus patula
Scheide et Deppe, Master Thesis of Science – Biology University of Natal, Durban.
16. Nadgauda R.S., Nagarwala N.N., Parasharami V.A. et al., 1993. Bud break
and multiple shoot formation from tissues of mature trees of Pinus caribaea and Pinus
kesiya. Invitro Cellular and Developmental Biology. Plant, 29 (3): 131-134.
17. Nandwani D., Kumaria S., Tandon P., 2001. Micropropagation of Pinus
kesiya Royle ex Gord (Khasi pine). Gartenbauwissenschaft, 66 (2) S: 68–71.
18. Nguyen T.H., Phan K. L., Nguyen D. T. L. et al., 2004. Vietnam Conifers:
Conservation Status Review 2004. ISBN 1 903703 16 6. 42–43.
19. Kalita V., 1998. Cryopreservation of germplasm of Pinus kesiya Royle ex.
Gord. – An important tree of North – East India. A Thesis submitted for the degree of
doctor of philosophy in Botany. Plant Biotechnology Laboratory Department of Botany
North – Eastern Hill University Shillong.
20. Zhang Y., Wei Z.M., Xi M.L., Shi J.S., 2006. Efficient plant regeneration in
vitro in Pinus massoniana L, 39(3), 271-276.
21. Zhu L.H., Wu X.Q., Qu H.Y. et al., 2010. Micropropagation of Pinus
massoniana and mycorrhiza formation in vitro. Plant Cell Tissue Organ Culture, 102:
121- 128.

48
Thông tin từ Internet
22. Kĩ thuật chăn nuôi, trồng trọt trong nông nghiệp, 2014. Giá trị kinh tế caocủa
cây thông lấy nhựa.
https://kythuatnuoitrong.edu.vn/nong-dan-lam-giau/gia-tri-kinh-te-cao-cua-cay-
thong-lay-nhua.html
23. Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam, 2006. Nhân giống một số loài cây rừng
bằng phương pháp giâm hom và triển vọng trồng rừng của chúng.
http://vafs.gov.vn/vn/nhan-giong-mot-so-loai-cay-rung-bang-phuong-phap-giam-
hom-va-trien-vong-trong-rung-cua-chung/
24. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, 2009. Kỹ thuật trồng thông ba lá.
http://vafs.gov.vn/vn/2009/03/ky-thuat-trong-thong-ba-la/
25. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, 2014. Kỹ thuật trồng thông ba lá.
http://vafs.gov.vn/vn/2014/08/ky-thuat-trong-thong-ba-la-2/

49
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Bảng thành phần các vi lượng, đa lượng và vitamins trong môi trường MS
Thành phần vi lượng mg/l
CoCl2.6H2O 0.025
CuSO4.5H2O 0.025
FeSO4.7H2O 27.80
H3BO3 6.20
KI 0.83
MnSO4.4H2O 22.30
Na2MoO4.2H2O 0.25
ZnSO4.7H2O 8.60
Na2EDTA.2H2O 37.20
Thành phần đa lượng mg/l
CaCl2.2H2O 440.00
KH2PO4 170.00
KNO3 1900.00
MgSO4.7H2O 370.00
NH4NO3 1650.00
NH4H2PO4 -
Vitamins mg/l
Glycine 2.00
Myo-inositol 100.00
Nicotinic acid 0.50
Pyridoxine HCl 0.50
Thiamine HCl 0.10

Khoa luan tot nghiep-2019

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khoa luan tot nghiep-2019

Similar to Khoa luan tot nghiep-2019 (20)

Khoa luan tot nghiep-2019