This document is a graduation thesis that investigates the antimicrobial activity of extracts from some traditional medicinal plants found in Bidoup National Park in Lam Dong Province, Vietnam. The thesis was completed by Pham Thi Thao under the supervision of lecturer Pham Minh Nhut from the University of Technology in Ho Chi Minh City. The thesis includes chapters on background information about the selected medicinal plants and antimicrobial compounds, methodology of the extract preparation and antimicrobial testing, results of the extraction yield, antimicrobial activity and chemical characterization of the extracts, and conclusions and recommendations.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia bidoup núi bà, tỉnh lâm đồng
1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
TP. Hồ Chí Minh, 2015
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Thảo
MSSV: 1151110516 Lớp: 11DSH01
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO
CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN
GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ,
TỈNH LÂM ĐỒNG
2. Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên
cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm
Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về
lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Phạm Thị Thảo
3. Đồ án tốt nghiệp
ii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức thật quý báu cho tôi trong suốt
quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tận tình
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Thầy đã luôn ở bên,
quan tâm, và giúp đỡ tôi trong việc gợi ra các ý tưởng trong quá trình làm luận văn
cũng như cung cấp các tài liệu và sách vở liên quan trong suốt quá trình nghiên cứu.
Ngoài ra tôi cũng xin cám ơn các bạn sinh viên trong nhóm của thầy như
Tâm, Hằng, Hồng Vân, Nhân, Vân Anh, Tuấn, Trí, Hiền và tất cả các bạn trong
phòng thí nghiệm của trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con
những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như
trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Phạm Thị Thảo
4. Đồ án tốt nghiệp
iii
MỤC LỤC
TRANG
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................ii
MỤC LỤC................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..........................................................................1
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................1
4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU.............................................................................2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………..……………………..............3
1.1. Sơ lược về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại
vườn quốc gia Bidoup..............................................................................................3
1.1.1. Cây Podocarpus sp. ................................................................................3
1.1.2. Cây Polygala sp......................................................................................4
1.1.3. Cây Medinilla sp.....................................................................................5
1.1.4. Cây Elephantopus sp. .............................................................................6
1.1.5. Cây Eupatorium sp. ................................................................................7
1.2. Đại cương về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nước .................8
1.2.1. Carbohydrate..........................................................................................8
1.2.2. Flavonoid................................................................................................9
1.2.3. Tannin ...................................................................................................10
1.2.4. Alkaloid.................................................................................................11
1.2.5. Saponin .................................................................................................12
5. Đồ án tốt nghiệp
iv
1.2.6. Anthraglycoside ....................................................................................13
1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật .........................15
1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật ....................................15
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật....................16
1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.............................................................17
1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột..................................................17
1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy......................................................18
1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da ..........................................................23
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................25
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................25
2.2. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................25
2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ........................................................................25
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ..................................................................................25
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.......................................................................26
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ................................................................................26
2.3.2. Hóa chất................................................................................................26
2.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................27
2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc.................................27
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị ........................27
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực
vật ...............................................................................................................29
2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu.....................................................................29
2.5. Bố trí thí nghiệm..........................................................................................29
2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây
thuốc ...............................................................................................................30
2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một
số loại cây thuốc.................................................................................................32
2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nước một số
loại cây thuốc dân gian.......................................................................................33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................38
3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân
gian.........................................................................................................................38
6. Đồ án tốt nghiệp
v
3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước một số loại cây
thuốc dân gian ....................................................................................................39
3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây
thuốc .....................................................................................................................50
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................54
4.1. Kết luận...........................................................................................................54
4.2. Đề nghị............................................................................................................54
7. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TSB: Trypton Soya Broth
TSA: Trypticase Soya Agar
DMSO: Dimethyl sulfoxide
pABA: p – aminobenzoic acid
mRNA: RNA thông tin
tRNA: RNA vận chuyển
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
8. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao nước của một số loại cây
thuốc đối với một số chủng vi sinh vật ....................................................................48
Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây
thuốc..........................................................................................................................51
9. Đồ án tốt nghiệp
viii
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricartus ......................................................................3
Hình 1.2. Cây Polygala paniculata.............................................................................4
Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis.....................................................................5
Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis ............................................................................6
Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum..........................................................................7
Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và
nấm............................................................................................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm..............................................................30
Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc
dân gian .....................................................................................................................31
Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây
thuốc dân gian ...........................................................................................................32
Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc.
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian...............38
Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao chiết nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm
mẫu............................................................................................................................38
Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp. ..............39
Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp. .....41
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp. ..................43
Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp................45
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp. ..................47
Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD
(A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium
10. Đồ án tốt nghiệp
ix
sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và
cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2). ........................................................49
11. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngay từ những ngày đầu khi xã hội loài người còn chưa phát triển, con người
đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngày
như làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một
trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Gần 150000
loài cây thuốc trong số 250000 – 300000 loài thực vật có hoa ở vùng nhiệt đới được
sử dụng làm cây thuốc, gần 5 % trong số cây thuốc đó được nghiên cứu thành phần
hóa học.
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên
cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bài
thuốc dân gian. Từ đó chiết suất tạo ra các dược phẩm có giá trị chữa bệnh có hiệu
quả. Do đó, việc điều tra các loại cây cỏ có tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm
dân gian là rất cần thiết.
Trong dân gian người ta thường sử dụng các loại cây cỏ để chữa bệnh bằng
cách sử dụng trực tiếp hoặc nấu nước uống để chữa các bệnh thông thường như tiêu
chảy, cảm mạo... Đối với các mẫu cây này người ta thường rửa sạch, sau đó cắt nhỏ
hoặc xay nhuyễn rồi đem đi nấu với nước trong nồi kín cho đến khi gần cạn rồi chắt
dịch cạn thu được để dùng . Do đó, người dân chủ yếu tách chiết các hợp chất trong
cây thuốc bằng dung môi là nước. Tuy nhiên, hiệu quả mang lại thật sự của phương
pháp này chưa thể chứng minh được hoạt tính thật sự của cây thuốc vì trong cây
thuốc có khá nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao không hòa tan được trong
nước. Vì thế, việc đánh giá hoạt tính của cao chiết nước của một số cây thuốc dân
gian đóng vai trò rất quan trọng.
Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài "Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc của một số loại cây
thuốc dân gian tại Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng". Đề tài
12. Đồ án tốt nghiệp
2
này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm –
Môi trường, Trường ĐH Công nghệ Tp.HCM.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của các loại cây thuốc đối
với một số chủng vi sinh vật gây bệnh và bước đầu định tính thành phần hóa học
cao chiết nước của một số loại cây thuốc.
3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của một số loại cây thuốc
dân gian
Bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước một số loại cây thuốc
dân gian.
4. Phạm vi nghiên cứu
Chỉ khảo sát một số cây thuốc dân gian như Podocarpus sp., Polygala sp.,
Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. thu được ở vườn quốc gia Bidoup
núi Bà – tỉnh Lâm Đồng.
Chỉ sử dụng một loại dung môi là nước
13. Đồ án tốt nghiệp
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại
vƣờn quốc gia Bidoup
1.1.1. Cây Podocarpus sp.
1.1.1.1. Phân loại khoa học
Giới: Plantae
Ngành: Pinophyta
Lớp: Pinopsida
Bộ: Pinaes
Họ: Podocarpaceae
Chi: Podocarpus
1.1.1.2. Đặc điểm
Chi Podocarpus trong tiếng việt được gọi là chi thông tre. Có khoảng 105
loài thuộc chi này, thân của các loài trong chi có chiều cao từ 1 – 25 m, có thể lên
tới 40 m. Trong thân thường có nhựa mủ, lá của các loài thường là lá kim thon dài
như hình liềm hoặc tre trúc, dài từ 0,5 – 15 cm ( Farjon, 1998).
Podocarpus imbricatus là dạng cây gỗ lớn thuộc họ Kim giao
(Podocarpaceae), chi podocarpus. Cây cao tới 35 m, đường kính 50 – 70 cm có khi
tới 200 cm, thân thẳng, tròn, có nhiều cành xòe rộng, quả hơi vuông cạnh. Vỏ cây
có màu nâu đỏ, ghồ ghề, khi chặt chảy nhựa màu nâu nhạt, thịt vỏ màu da cam. Hoa
đực mọc ở nách lá dài 1 cm, hoa cái màu đỏ mọc trên đế nạc (Laub D, 1969).
Cây mọc rải rác trong rừng thường xanh ở các tỉnh Quảng Bình, Nghệ An,
Hà tĩnh, Gia Lai,.. Phân bố ở độ cao từ 300 – 1000 m, có khi xuống dưới 200 m.
Cây ưa sáng, nhưng lúc non cần che bóng, ưa ẩm ướt, tốt nhất là đất cát pha.
1.1.1.3. Công dụng
Cây có vị nhạt chát, có tác dụng tán nhiệt, sát trùng, chỉ dương. Có thể dùng
để trị cảm mạo và bệnh ngoài da… Ngoài ra lá thông còn có tác dụng trừ phong
Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricatus
14. Đồ án tốt nghiệp
4
thấp, sát trùng, kích thích mọc tóc nhanh, chữa bệnh cước khí (phù do thiếu vitamin
B1).
Gỗ nhẹ, không bền thường dùng để đóng đồ trong nhà, làm bột giấy…
1.1.2. Cây Polygala sp.
1.1.2.1. Phân loại khoa học
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Fabales
Họ: Polygalaceae
Chi: Polygala
1.1.2.2. Đặc điểm
Polygalaceae là một họ thực vật có hoa, chúng gần như phân bố khắp thế
giới, có khoảng từ 17 – 20 chi, 900 – 1000 loài cây thân thảo, cây bụi và cây gỗ.
Khoảng một phần ba tổng số loài của họ này thuộc về chi Viễn chí (Polygala)
(Lüdtke và ctv, 2013).
Polygala paniculata L là một loài thuộc họ viễn chí Polygalaceae. Cây còn
được gọi là cây dầu nóng, cây thảo nhỏ hay bụi mảnh cao 30 – 40 cm. Đặc điểm dễ
nhận của cây là khi nhổ cây lên ngửi phần gốc rễ cây sẽ thơm mùi tinh dầu salicylat
methyl, thân cây mảnh không lông. Lá có phiến nhỏ hẹp 1,5 x 0,15 cm, đầu nhọn
mỏng không lông. Hoa có màu trắng nhỏ, cao 2 mm, không lông (Đỗ Tất Lợi,
2004).
Trên thế giới, Viễn chí lá nhỏ phân bố ở Nam Mỹ, châu Đại Dương, châu
Á… Ở nước ta thường gặp ven đường đi, đất hoang và có số lượng lớn ở Lâm Đồng
Thành phần hóa học: Rễ chứa nhiều tinh dầu có salicylat methyl nên có mùi
rất thơm, saponin…
Hình 1.2. Cây Polygala paniculata
15. Đồ án tốt nghiệp
5
1.1.2.3. Công dụng
Cây có vị đắng the, có tác dụng an thần, ích trí, khan đàm, hoạt huyết, trị sổ
mũi. Ngoài ra saponin có trong dược liệu sẽ kích thích sự bài tiết niêm dịch ở khí
quản, có tác dụng chữa ho, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da…
1.1.3. Cây Medinilla sp.
1.1.3.1. Phân loại khoa học
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Myrtales
Họ: Melastomataceae
Chi: Medinilla
1.1.3.2. Đặc điểm
Medinilla là chi có khoảng 150 loài thực vật nở hoa trong họ
Melastomataceae, chủ yếu nằm trong các vùng nhiệt đới. Chúng là cây thường
xanh, cây bụi hoặc dây leo.
Medinilla thường mọc thành bụi nhỏ, cao khoảng từ 1 – 2 m, với những lá
đơn mọc đối với cụm hoa dạng chùm lớn với những hoa nhỏ li ti. Chùm hoa mọc từ
nách lá, cành hoa kéo dài khoảng 25 cm, hoa có màu tím hồng (Renner, 2004).
Medinilla septentrionalis thuộc loại cây bụi cây cao khoảng 1 – 7 m, cây có
nhiều nhánh. Cuống lá có bề dày từ 0,4 – 0,9 mm, có dạng hình trứng bản rộng rất
mỏng, kích thước lá 7 – 8,5 x 2 – 2,5 cm. Hoa của cây mọc theo từng chùm, dạng
hình chuông, cuống hoa mọc từ lá nách kéo dài khoảng 1 – 2,5 cm, hoa có màu
hồng hoặc đỏ tía (Chen Cheih và ctv, 1984).
Phân bố: Cây được phân bố chủ yếu ở các rừng rậm, lề rừng, các khu vực ẩm
ướt trong độ cao từ 200 – 1800 m. Cây mọc chủ yếu tại các vùng Quảng Đông,
Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis
16. Đồ án tốt nghiệp
6
Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc, ngoài ra còn có ở các nước như Thái lan,
Việt Nam...
1.1.4. Cây Elephantopus sp.
1.1.4.1. Phân loại khoa học
Giới: Plantae
Ngành: Spermatophyta
Lớp: Dicotyledonae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Chi: Elephantopus
1.1.4.2. Đặc điểm
Elephantopus mollis có tên thường gọi là cúc chỉ thiên hoa trắng hay cúc
chân voi mềm. Là loại cây thân thảo lâu năm cao từ 0,5 – 1 m, cây phủ đầy lông. Lá
mọc dài theo thân, không cuống dài từ 10 – 15 cm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh
mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung (Mercadante, 2013)
Phân bố: Loài này có nguồn gốc ở Trung và Nam Mĩ, thường gặp ở các vùng
nhiệt đới. Ở nước ta, cây Elephantopus mollis mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc
đường đi ở các tỉnh Tây Nguyên.
1.1.4.3. Một số nghiên cứu dược liệu về cây E. mollis
Tại Brazil lá cây được sử dụng như một chất làm mềm, làm lành vết thương,
ra mồ hôi và để điều trị viêm phế quản, ho, cảm cúm trong y học dân gian
(Empinotti và Duarte, 2008)
Chiết xuất E. mollis chứng minh tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do
β – D –galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết thanh
glutamate – oxalate – transaminase và huyết thanh glutamate – pyruvate –
transaminase. Các biến đổi chất béo ở gan và hoại tử của lobule trung tâm rõ ràng
đã được cải thiện bằng cách xử lí với E. mollis (Lin và ctv, 1995)
Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis
17. Đồ án tốt nghiệp
7
Tabopda và ctv, (2008) đã xác định được một sesquiterpene lactone mới
trong E. mollis. Nó thể hiện tác động gây độc tế bào quan trọng chống lại tế bào
B104 chuột neuroblastoma.
1.1.4.4. Công dụng
Có vị đắng, se, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, trị cảm mạo…
1.1.5. Cây Eupatorium sp.
1.1.5.1. Phân loại khoa học
Giới: Plantae
Ngành: Angiospermae
Lớp: Eudicots
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Chi: Eupatorium
1.1.5.2. Đặc điểm
Cây Eupatorium odoratum có tên thường gọi là cây cỏ hôi, cây cỏ lào… Là
một loại cây nhỏ, mọc thành bụi, thân hình trụ thẳng cao tới hơn 2 m, có nhiều
cành. Khi cây trưởng thành lá có hình dạng quả trám lệch, mép có răng cưa thưa, có
lông thưa và ngắn ở cả hai mặt lá. Nếu vò lá và cành non có mùi thơm hắc. Cụm
hoa đầu, hình trụ dài 9 – 11 mm, đường kính 5 – 6 mm. Lúc nở hoa có màu tím
nhạt, sau trắng (King, R. M. and H. Robinson, 1987).
Phân bố: Cây mọc ở khắp nơi và trên mọi địa hình
Thành phần hóa học: Tinh dầu 0,7 – 2,0 % màu vàng nhạt, ageratochromen,
demethoxy, cadinen, caryophyllen. Ngoài ra còn có saponin, alkaloid…
1.1.5.3. Công dụng
Có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, chữa rong huyết sau đẻ…
Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum
18. Đồ án tốt nghiệp
8
1.2. Đại cƣơng về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nƣớc
1.2.1. Carbohydrate
1.2.1.1. Khái niệm
Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh
vật, là hợp chất có chứa nhiều nhóm chức OH và một nhóm CHO (aldehyde) hoặc
một nhóm CO (ketone).
Cây xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp
carbohydrate từ CO2 và H2O. Carbohydrate thực vật là nguồn dinh dưỡng quan
trọng của người và động vật. Là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố C,
H, O
Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n.
1.2.1.2. Phân loại
Carbohydrate được chia làm 3 nhóm chính:
Monosaccharide: Hay còn gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản
nhất của carbohydrate và không bị thủy phân như glucose, fructose,
galactose. Monosaccharide đầu tiên được tìm thấy là glucose với cấu trúc 5
nhóm hydroxyl, (Alexander Kolli, 1869).
Oligosaccharide: Khi thủy phân cho từ 2 – 8 đường đơn như sucrose,
maltose, lactose
Polysaccharide: Do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau, có khối
lượng phân tử lớn, do đó polysaccharide không có tính khử như tinh bột,
glycogen…
1.2.1.3. Vai trò
Cung cấp năng lượng cho cơ thể, carbohydrate đảm bảo khoảng 60% năng
lượng cho các quá trình sống.
Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglycan...)
Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide)
19. Đồ án tốt nghiệp
9
Góp phần bảo đảm tương tác đặc hiệu của tế bào (polysaccharide trên màng
tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật).
1.2.1.4. Tính chất
Các monosaccharide là những chất không màu, phần lớn có vị ngọt. Chúng
hoà tan tốt trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực,
tan trong dung dịch ethanol 80%.
Momosaccharide có tính khử
Các oligosaccharide bị thủy phân trong môi trường acid, tuy nhiên chúng khá
bền với môi trường kiềm…
1.2.2. Flavonoid
1.2.2.1. Khái niệm
Là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa,
giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa
Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3
carbon
1.2.2.2. Phân loại
Dựa theo gốc aryl, flavonoid được chia như sau:
1.2.2.3. Tính chất
Ðộ tan không giống nhau
Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi
hữu cơ, tan được trong nước, cồn
Aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước
20. Đồ án tốt nghiệp
10
1.2.2.4. Vai trò
Là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản
1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…)
Tham gia lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa
1.2.3. Tannin
1.2.3.1. Khái niệm
Là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền
vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và
alkaloid).
1.2.3.2. Phân loại
Tannin thủy phân được(Tannin pyrogalic)
o Thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo ra phần đường (glucose) và
phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este.
o Tủa xanh đen với muối sắt III
o Dễ tan trong nước
o Ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn…
Tannin không thủy phân được(Tannin pyrocatechic)
o Dễ tạo thành chất phlobaphen không tan
o Thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là
những chất đồng trùng hợp của hai loại)
o Tủa xanh với muối sắt III
o Ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng…
1.2.3.3. Tính chất
Có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và acetone
Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ
Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)
21. Đồ án tốt nghiệp
11
1.2.3.4. Vai trò
Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu
Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng
Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy
1.2.4. Alkaloid
1.2.4.1. Khái niệm
Là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số
có nhân dị vòng, thường gặp chủ yếu ở thực vật.
1.2.4.2. Phân loại
Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của
chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử.
Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:
o Nhóm pyridine: piperin, coniin, cytisin,…
o Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin
o Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine
o Nhóm quinolin: quinine, quinidin, brucin…
o Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein…
o Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, serotonin
o Nhóm indol: serotonin, ergin, reserpin…
o Nhóm purin: caffeine, theobromin, theophyllin
o Nhóm terpenoid: cholin, aconitin,…
1.2.4.3. Tính chất
Đa số các Alkaloid đều có tính base yếu
Alkaloid trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng thể rắn như morphine
(C17H17NO3), quinine (C20H24N2O2)… Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở
dạng lỏng như coniin (C8H17N)…
22. Đồ án tốt nghiệp
12
Đa số alkaloid không có mùi, không có màu, có vị đắng và một số ít có vị
cay như piperin…
Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi,…) tạo ra muối phức.
1.2.4.4. Vai trò
Diệt khuẩn
Tác động lên hệ thần kinh
Hạ huyết áp
Chống ung thư
1.2.5. Saponin
1.2.5.1. Khái niệm
Thuộc nhóm glycoside, gặp rộng rãi trong thực vật. Dưới tác dụng của các
enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là
sapogenin) và phần glucid
1.2.5.2. Phân loại
Dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia làm 2 loại: saponin triterpenoid và
saponin steroid.
Saponin triterpenoid được chia làm hai nhánh lớn là saponin triterpenoid
pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic.
o Saponin triterpenoid pentacyclic gồm có các nhóm olean, ursan, lupan,
hopan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon thường có 5 vòng.
o Ví dụ: Asiaticosid có trong rau má là saponin của nhóm ursan…
o Saponin triterpenoid tetracyclic gồm có các nhóm drammaran, lanostan,
cucurbitan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon có 4 vòng.
o Ví dụ: Đại diện cho nhóm drammaran là saponin của nhân sâm, lanostan có
trong các loài hải sâm…
Saponin steroid gồm có các nhóm spirostan, furostan, aminofurostan,
spirosolan. Đặc điểm chung của nhóm này là gồm có 27 carbon như
cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20 – 27 tạo thành hai vòng có oxy. Một
23. Đồ án tốt nghiệp
13
là hydrofutan (vòng E), và vòng còn lại là hydropyran (vòng F). Các nhóm
trên chỉ khác nhau ở sự biến đổi ở vòng F
1.2.5.3. Tính chất
Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ
hoá và tẩy sạch.
Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm
mất các chất điện giải cần thiết…
Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu…
Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với một số các chất khác…
Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,
abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị
ngọt.
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ete, hexan.
1.2.5.4. Vai trò
Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng)
Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt
Một số saponin có tác dụng chống viêm
Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus
1.2.6. Anthraglycoside
1.2.6.1. Khái niệm
Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Những hợp
chất quinon được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao
và cả trong động vật.
Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người ta sắp xếp
thành benzoquinon, naphthoquinon, anthraquinon và naphthacenequinon hay
còn gọi là anthracyclinon (4 vòng).
24. Đồ án tốt nghiệp
14
Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là
anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác
Anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và
phần aglycon (genin).
Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon. Gắn vào nhân thường
có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH... Tuỳ theo vị trí các nhóm
chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau.
1.2.6.2. Phân loại
Dẫn chất antraquinon có thể chia làm ba nhóm là nhóm phẩm nhuộm, nhóm
nhuận tẩy và nhóm dimer.
Nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinon). Các dẫn chất
của nhóm này thường có màu đỏ cam đến đỏ tía, trong cấu trúc có hai nhóm
OH kế cận nhau
o Ví dụ: Alizarin, purpurin…
Nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon). Nhóm này
thường có nhóm CH3, CH2OH, CHO, COOH ở vị trí C3, các dẫn chất này có
thể ở dạng tự do hoặc kết hợp với phần đường ở dạng glycoside
o Ví dụ: Rein, cryzophanol…
Nhóm dimer được hình thành do hai phân tử ở dạng anthron bị oxy hóa rồi
trùng hợp với nhau tạo thành
o Ví dụ: Hypericin, ararobinol…
1.2.6.3. Tính chất
Những dẫn chất anthraquinon đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ.
Dễ thăng hoa
Ở thể glycosid dễ tan trong nước, có thể tan trong ether, chloroform và một
số dung môi hữu cơ khác.
OH ở vị trí α thì có tính acid yếu hơn ở vị trí β do tạo dây nối hydro với
nhóm carbonyl
25. Đồ án tốt nghiệp
15
Dẫn chất có 1,4-dihydroxy sẽ có huỳnh quang trong dung dịch acid acetic.
Ngoài ra các dẫn chất này còn cho màu xanh dương với H2SO4.
Các dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy khi ở trong dung dịch kiềm tạo phenolat
có màu đỏ và dưới ánh sáng UV (365 nm) cho huỳnh quang tím hoặc đỏ nâu.
Các dẫn chất anthranol có phản ứng với p-nitroso dimethylanilin để tạo thành
azomethin có màu.
1.2.6.4. Vai trò
Các dẫn chất anthraglycoside, chủ yếu là các β-glucoside dễ hoà tan trong
nước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non. Khi đến ruột già,
dưới tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột thì các glycoside bị
thủy phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và
anthranol là dạng có tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lí do tác dụng
đến chậm sau khi uống thuốc. Dạng genin thì bị hấp thu ở ruột non nên
không có tác dụng.
Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất 1,8-
dihydroxyanthraquinon dưới dạng heteroside giúp cho sự tiêu hoá được dễ
dàng, liều vừa nhuận, liều cao xổ.
Các dẫn chất anthraglycoside có tác dụng thông mật.
Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây Rubra tinctoria L. có tác
dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận.
Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben.
Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất
anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư.
1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật
1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật
Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực
vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triên của vi sinh vật. Các chất kháng
26. Đồ án tốt nghiệp
16
Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm
khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ
thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010)
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật
Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật bao gồm việc phá vỡ
màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng
chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây
đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của
tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant
secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi
tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt
động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013).
Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. Do tác động lên quá
trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do
thay đổi áp suất thẩm thấu.
27. Đồ án tốt nghiệp
17
Ức chế chức năng của màng tế bào: Cơ chế làm mất chức năng của màng
làm cho các phân tử có kích thước lớn và các ion bị thoát ra ngoài
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:
o Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác
o Nhóm chlorarnphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các aid amin mới vào chuỗi
polypeptide
o Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome ngăn
cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide
Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid:
o Nhóm rifampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA
o Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch
đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA
o Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng
cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid
o Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.
1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy
1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột
1.4.1.1. Khái niệm
Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn gram
âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có lên men oxidase, lên men đường
glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động
hoặc không và không sinh nha bào.
28. Đồ án tốt nghiệp
18
1.4.1.2. Đặc điểm hình thể và tính chất nuôi cấy
Tất cả vi khuẩn họ này đều là trực khuẩn gram âm, kích thước trung bình 2 – 4
µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi.
Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở xung quanh tế bào.
Họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường, trên
môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường
Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:
o Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng
o Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì
o Dạng M: Khuẩn lạc nhầy, các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau
1.4.1.3. Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, đầu tiên là khả năng nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa. Chúng đứng đầu trong các căn nguyên gây bệnh vi khuẩn
gây bệnh tiêu chảy. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác
như tiết niệu, thần kinh… Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm
khuẩn huyết.
1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy
1.4.2.1. Nhóm Salmonella
a, Đặc điểm hình thái
Hình thái khuẩn lạc: Trên môi trường XLD khuẩn lạc có màu hồng trong
suốt, có hoặc không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc
Hình thái tế bào:
o Salmonella do Daniel E. Salmon phát hiện ra năm 1885. Năm 1880 Grafhy
đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên
phân lập được S.typhi vào năm 1884.
29. Đồ án tốt nghiệp
19
o Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.
Salmonella là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước khoảng 0,6 – 2,0 μm,
kị khí tùy nghi, có tiên mao, có thể di động (trừ S. gallinarum và S.
pullorum) không tạo bào tử, có khả năng sinh hơi, lên men dextrose và sinh
khí H2S.
b, Khả năng gây bệnh
Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện trong thực phẩm,
đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella
gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ tiêu thụ thực
phẩm bị nhiễm khuẩn đến khi có các triệu chứng biểu hiện là 12 – 36 giờ. Không
phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm salmonella đều bị ngộ độc.
Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt,
trứng…
Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải
thức ăn bị nhiễm khuẩn như thực phẩm, sữa, nước uống… Sau khi qua hàng rào
acid dạ dày, vi khuẩn di chuyển về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục đi qua
màng nhày và vào thành ruột.
c, Một số chủng salmonella gây bệnh cho người
S. typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trọng nhất
trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn
S. paratyphi A: Chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn
S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động
vật
S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây
viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết
S. typhimurium và S. enteritidis: Có khả năng gây bệnh cho người và động
vật
30. Đồ án tốt nghiệp
20
S. choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do
Salmonella
1.4.2.2. Nhóm Escherichia coli
a, Đặc điểm của E. coli
Escheriachia coli do Escherich phân lập 1885 từ phân trẻ em. E. coli là trực
khuẩn hình que ngắn kích thước 2 – 3 x 6µm, hai đầu tròn, tế bào đứng riêng lẻ, đôi
khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không
tạo bào tử, gram âm, thỉnh thoảng có hiện tượng bắt màu ở hai đầu.
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ
từ 15 – 44o
C (tối ưu ở 37o
C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Trên môi trường EMB
E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, thường có ánh kim, bờ tròn đều.
Có phản ứng lên men đường với các loại đường như Lactose, Glucose,… Ngoài
ra còn có phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứn H2S, VP, Urea âm tính.
b, Khả năng gây bệnh của vi khuẩn
E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở
đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E. coli có thể gây bệnh
cơ hội. Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục… Nhưng nguy
hiểm nhất là gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em
Trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng
kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành
ruột. ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá vỡ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột,
đồng thời sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin, gây ra hiện tượng tiêu chảy.
1.4.2.3. Nhóm Shigella
a, Đặc điểm chung
Là trực khuẩn gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi,
tăng trưởng ở nhiệt độ 10 40o
C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng
nguyên K, không có kháng nguyên H
31. Đồ án tốt nghiệp
21
Shigella lên men glucose, không sử dụng nitrat, không sinh hơi
Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có cấu trúc
kháng nguyên phức tạp. Shigella có kháng nguyên O, không có kháng nguyên H,
một số có kháng nguyên K
b, Khả năng gây bệnh trên người
Các loài shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chúng chỉ xâm nhiễm và
tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng. Trong môi trường nước các loài
này có thể tồn tại hơn 6 tháng. Ngộ độc thực phẩm do shigella chủ yếu là do ăn phải
thực phẩm kém vệ sinh. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua
người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ trong 1 – 7 ngày sau khi sử dụng
thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ tiêu chảy nhẹ đến
đi tiêu ra máu, mất nước, sốt cao… Các triệu chứng trên có thể kéo dài trong nhiều
ngày
Một số chủng shigella: Shigella dysenteriae, shigella flexneri, shigella sonnei,
shigella boydii
1.4.2.4. Nhóm Vibrio
a, Đặc điểm hình thái
Là phẩy khuẩn, Gram âm, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm. Chúng không
sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi
khuẩn (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).
Là vi khuẩn gram âm, sống kỵ khí tùy nghi, có phản ứng catalase và oxidase
dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S và vi khuẩn
không phát triển trên môi trường không muối (NaCl). (Trần Linh Phước, 2008)
b, Khả năng gây bệnh
Các loài vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+
để
phát triển. Nhóm vibrio là tác nhân gây ra bệnh tả, được lan truyền rất nhanh qua
đường nước, gây nhiễm thực phẩm, và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ
32. Đồ án tốt nghiệp
22
sinh kém. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống,
rau quả… Ngoài khả năng gây nhiễm các bệnh về đường ruột, một số chủng của
nhóm này còn có khả năng gây nhiễm trùng máu cho người.
Một số chủng gây bệnh của nhóm vibrio: V. alginolyticus, V. harveyi, V.
parahaemolyticus…
1.4.2.5. Nhóm Listeria
a, Đặc điểm chung
Đại diện của nhóm Listeria là L. monocytogenes, là trực khuẩn gram dương,
kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1 – 45o
C, không tạo bào tử nhưng có di
động.
Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 1
- 2µm. Cho phản ứng Catalase dương tính
Giống Listeria bao gồm 6 loài: L. monocytogens, L. innocua, L. ivanovii, L.
seeligeri, L. welshimeri, L. grayi
b, Khả năng gây bệnh
Bệnh do nhóm Listeria gây ra ít gặp ở người tuy nhiên các triệu chứng của
bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cao. Việc tiêu thụ các thực phẩm nhiễm
khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh viêm dạ dày – ruột với triệu chứng sốt. L.
monocytogenes là nguyên nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tuổi, phụ nữ
mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch
kém.
Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do Listeria gây ra tác động đến các bệnh
nhân mang bệnh về miễn dịch. Ngoài ra nhóm này cũng là nguyên nhân gây ra các
bệnh như viêm màng kết, bệnh về hạch bạch huyết… Phần lớn người bị nhiễm bệnh
đều có các dấu hiệu lâm sàng nhẹ, và triệu chứng không rõ ràng.
33. Đồ án tốt nghiệp
23
1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da
1.4.3.1. Staphylococcus
a, Đặc điểm chung của staphylococcus
Là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính từ 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng
riêng lẻ, từng đôi hoặc từng chùm. Vi khuẩn không di động và không sinh bào tử
thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng (Koch, 1878;
Pasteur, 1880)
Là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có cả sự trao đổi chất, hô
hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều
loại carbohydrate khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi. Staphylococcus
có thể mọc ở nhiều điều kiện và môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ từ
30 – 37o
C và pH gần trung tính. Chúng kháng được với các chất diệt trùng, độ khô
nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 1,5% NaCl (Scott E
Martin và John J Iandolo, 2000).
b, Khả năng gây bệnh cho người
Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dưới
da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh…
Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: Thường xảy ra ở những người có sức đề kháng
yếu hoặc trẻ em.
Trong tự nhiên staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc
hay móng của các động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh một số loại
độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị thủy phân ở 100o
C trong 30 phút.
Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này thì sau 4 – 6 giờ người bệnh có những
triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các loại thực phẩm như
jambon, nước súp… thường nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm
chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trính chế biến.
34. Đồ án tốt nghiệp
24
1.4.3.2. Streptococcus
a, Đặc điểm
Là liên cầu khuẩn, có hình cầu hoặc oval kéo dài, thuộc vi khuẩn Gram dương,
không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày.
Là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng vẫn có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí.
Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm khi nuôi cây trong môi trường azide
tetrazolium chứa TTC
b, Khả năng gây bệnh
Mặc dù streptococcus có khả năng gây nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh
viện. Nhưng phải đến sau những năm 1970 mới được biết đến như tác nhân gây
bệnh nhiễm trùng bệnh viện. Nhóm vi khuẩn này trở thành tác nhân phổ biến đứng
thứ hai nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương.
Một số nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêm
màng trong tim. Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần kinh trung ương cũng như viêm
khớp, hạch, viêm xoang cũng có thể do nhóm này gây ra nhưng rất hiếm gặp.
35. Đồ án tốt nghiệp
25
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ Sinh học –
Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh.
Thời gian nghiên cứu: 2/2015 – 8/2015
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Các loại cây thuốc dân gian bao gồm: Podocarpus sp., Medinilla sp.,
Elephantopus sp., Eupatorium sp., Polygala sp.
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị
Các chủng vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp
tại Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh bao gồm:
Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli (EC), E. coli O157 : H7 (EC.O157:
H7), E. coli 0208 (EC.0208), E. coli – ETEC (Enterotoxigenic).
Nhóm vi khuẩn Listeria: L. innocua (LI), L. monocytogenes (LM).
Nhóm vi khuẩn Samonella: S. dublin (SD), S. enteritidis (SE), S. typhi (ST),
S. typhimurium (STy).
Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. boydii (ShB), Shi. flexneri (ShF), Shi. sonnei
ShS).
Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. alginolyticus (VA), V. cholera (VC), V. harveyi
(VH), V. parahaemolyticus (VP)
Và một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da khác: Pseudomonas aeruginosa
(PA), Staphylococcus aureus (SA), Enterococcus feacalis (EF)
36. Đồ án tốt nghiệp
26
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy, bình hút ẩm
Đĩa petri, que trang, đèn cồn, dây cấy vòng
Máy say mẫu
Máy lọc, giấy lọc
Bình tam giác, cốc thủy tinh
Máy lắc
Máy nước cất (Branstead USA)
Máy đo quang phổ
Tủ ấm 30o
C, 37o
C (Memmert mermany)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
Micropipette loại 100 – 1000 𝜇l, đầu tipe
Cân phân tích (Orbital Germany)
Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn
Ống eppendorf, parafirm
Nồi hấp autoclave (Huxky Đài Loan)
Bông không thấm, dây cấy vòng
2.3.2. Hóa chất
Cồn, nước cất, muối NaCl
Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).
Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
Thuốc thử Fehling A, Fehling B, Ninhydrin, Gelatin 1%, NaOH 10%,
Ferric chloride 10%, thuốc thử Hager, Wagner, chì acetate 10%, thuốc
thử Molisch, Barfoed, Dragendroff, Benzene, bột Magnesium.
37. Đồ án tốt nghiệp
27
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc
Khái niệm: Chiết xuất là tách các chất hòa tan trong dược liệu nhưng vẫn giữ đủ
thành phần và bản chất của của các hợp chất có trong cây.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau.
Phương pháp chiết bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kĩ thuật chiết,
mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi.
Phương pháp tiến hành: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn,
sau đó đem phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để
trích ly các hợp chất có trong mẫu cây, tiến hành ngâm trong 24 giờ rồi đem lọc,
quá trình lặp lại từ 3 – 5 lần cho đến khi dịch lọc trong thì thôi. Tiến hành cô quay
dịch lọc ở nhiệt độ thấp hơn 50o
C. Cao chiết thu được sẽ bảo quản lạnh ở - 4o
C
(Atta và Mouneir, 2004)
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị
2.4.2.1. Phương pháp tăng sinh
Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường
vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh
dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không chỉ cần thiết đối với hoạt động
sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý
thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường.
Phương pháp tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các
giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành
tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường
TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang,
2013).
38. Đồ án tốt nghiệp
28
2.4.2.2. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
Nguyên tắc: Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng
và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được
chuyển vào tủ mát (3 – 5o
C) để bảo quản.
Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi
sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng
nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên
giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần.
Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy
chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo
quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4o
C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.7.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có
thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu.
Mục đích:
o Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn hay bị mất hoạt tính. Vì
vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng trong thí nghiệm
cũng như sản xuất.
o Làm cho các giống vi sinh vật có tỉ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn
định và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật khác.
Phương pháp bảo quản lạnh sâu (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
o Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt
độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
o Pha dịch tế bào với glycerol 40% đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối
cùng 10% và mật độ tế bào 106
.
o Dịch huyền phù tế bào được đưa vào eppendoff và đóng.
39. Đồ án tốt nghiệp
29
o Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất
thẩm thấu trong và ngoài tế bào.
o Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Và được tiến hành giữ
giống ở - 15o
C
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật
Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào các giếng thạch đã cấy vi sinh vật kiểm
định. Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào môi trường
agar và tác động lên vi sinh vật chỉ, khi đó nó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật
chỉ thị tạo thành vòng vô khuẩn.
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dựa trên phương
pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Murray và ctv, 1995; Olurinola, 1996)
Phương pháp được thực hiện trên môi trường TSA, vi khuẩn sau khi được
trang đều trên mặt đĩa, khi đó sẽ tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm. Chuẩn
bị các các loại dịch chiết khác nhau với nồng độ thích hợp. Hút 100 µl các loại dịch
chiết khác nhau vào trong từng giếng thạch, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng
2 giờ. Tất cả các đĩa petri sau đó sẽ được đem ủ ở nhiệt độ 37o
C trong 18 – 24 giờ
rồi đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn thu được.
2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm
Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey.
2.5. Bố trí thí nghiệm
40. Đồ án tốt nghiệp
30
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm
2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc
2.5.1.1. Quy trình xử lí mẫu và đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số
cây thuốc dân gian
Khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn
Định tính thành
phần hóa học
Đọc kết quả
Mẫu cây thuốc
Xử lí mẫu
Cao chiết nước
Vi sinh vật
chỉ thị
Tăng sinh
Đo OD (600nm)
Pha loãng thành 106
cfu/ml
Cấy trang
41. Đồ án tốt nghiệp
31
Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc
dân gian
2.5.1.2. Thuyết minh quy trình
Các mẫu cây thuốc sau khi được thu mua sẽ được rửa sạch bằng nước máy,
sau đó đem đi phơi phô tự nhiên ở nơi có bóng mát, tránh cường độ ánh sáng quá
mạnh. Mẫu cây sau khi phơi khô đến khối lượng không đổi sẽ được đem đi xay
thành bột, Cân và xác định khối lượng bột thu được.
Để xác định được hiệu suất thu hồi cao nước của mỗi loại cây thuốc, ta tiến
hành cân một lượng mẫu bột cây thuốc nhất định, sau đó đem mẫu đi ngâm với
nước cất ở tỉ lệ mẫu: nước là 1/20 (w/v) trong vòng 4 giờ rồi tiến hành lọc mẫu.
Dịch lọc thu được sẽ được đem đi đun cách thủy ở 70o
C cho đến khi cô cạn, còn bã
cây thuốc sau khi lọc sẽ tiếp tục được ngâm với nước cất, quá trình trên được tiến
hành cho đến khi dịch lọc trong thì ngừng. Mẫu cao nước thu được sẽ được bảo
quản lạnh ở 4o
C để tiến hành các thử nghiệm liên quan. Mỗi nghiệm thức được tiến
hành lăp lại 3 lần.
Mẫu cây
thuốc xay
mịn
Ngâm trong 4 giờ
(tỉ lệ 1 : 20; w/v)
Cô cách thủy
70o
C
Bảo quản
lạnh ở 4o
C
Lọc tinh
Cao nước
Các mẫu cây
thuốc
Rửa sạch
Phơi khô
Cân, xác định khối
lượng ban đầu
Xay mẫu thành bột
mịn
42. Đồ án tốt nghiệp
32
Hiệu suất thu hồi cao: H (%) =
𝑚′−𝑚
mo
x100
Trong đó
o m’: Khối lượng cốc và cao thu được (g)
o m: Khối lượng cốc ban đầu (g)
o mo: Khối lượng bột mẫu ban đầu (g)
2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một
số loại cây thuốc
2.5.2.1. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại
cây thuốc bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây
thuốc dân gian
Lắc, 18 – 24 giờ
ở nhiệt độ phòng
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh trong
TSB/TSB +NaCl
1,5%
Đo OD (600nm)
Pha loãng đến 106
cfu/ml
Hút 100𝜇l vào đĩa
petri chứa TSA/TSA
+ NaCl 1,5%
Dịch cao
[100] mg/ml
Pha cao
bằng
DMSO 1%
Cấy trang
Đục lỗ (d= 6 mm)
ủ 37o
C/24 giờ
Đọc kết quả
43. Đồ án tốt nghiệp
33
2.5.2.2. Thuyết minh quy trình
Tiến hành tăng sinh cho 20 chủng vi sinh vật chỉ thị thuộc các nhóm vi khuẩn
như Escherichia coli spp., Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp.,
Staphylococcus spp., Enterococcus spp., và môi trường tăng sinh TSB có bổ sung
1,5 % muối cho các chủng Vibrio spp. rồi đem đi hấp khử trùng ở 121o
C trong 15
phút. Sau đó tiến hành tăng sinh bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của
vi khuẩn cấy vào môi trường TSB và đem lắc 120 vòng/phút, trong 18 – 24 giờ.
Lưu ý là tiến hành tăng sinh trong tủ cây vô trùng.
Vi khuẩn sau khi tăng sinh được đem đi đo OD ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa
vào công thức McFahrland để pha loãng thành nồng độ 106
CFU/ml bằng nước
muối. Sử dụng micropipette hút 100 µl dịch vi khuẩn sau khi đã pha loãng cho vào
đĩa petri có chứa môi trường TSA hay môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl đối
với các chủng Vibrio spp., thực hiện trang đĩa để vi khuẩn được trải đều trên mặt đĩa
sau đó để yên 15 phút để cho đĩa khô hoàn toàn.
Tiến hành pha cao các mẫu cây thuốc ở nồng độ 100 mg/ml bằng DMSO 1%.
Đĩa thạch sau khi khô được đem đi đục lỗ với đường kính mỗi lỗ là 6 mm. Hút 100
µl dịch cao của mỗi cây thuốc rồi nhỏ vào các giếng thạch và để yên trong 2 giờ,
sau đó các đĩa được đem đi ủ ở 37o
C trong 24 giờ và đọc kết quả. Đối chứng được
sử dụng là kháng sinh Ciprofloxacin pha theo dãy nồng độ ở cấp số 2 từ nồng độ
1000 µg/ml đến 8 µg/ml, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc một số
loại cây thuốc dân gian
2.5.3.1. Quy trình định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số cây
thuốc
44. Đồ án tốt nghiệp
34
Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc
2.5.3.2. Thuyết minh quy trình
Mẫu cao nước các loại cây thuốc được tiến hành thử nghiệm định tính thành
phần hóa học theo hai phần. Đối với các chỉ tiêu alkaloid, mẫu cao nước được ngâm
trong H2SO4 10% trong khoảng thời gian từ 30 – 60 phút sau đó tiến hành lọc qua
giấy lọc. Thu phần dịch để tiến hành thử nghiệm. Riêng đối với các thử nghiệm còn
lại thì lại tiến hành ngâm mẫu cao trong dung dịch DMSO 1%, sau đó tiến hành lọc,
thu dịch và tiến hành làm các thử nghiệm còn lại.
a, Thử nghiệm carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào từ 5
– 6 giọt thuốc thử Molisch. Sau đó nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 trên thành ống nghiệm.
Kết quả dương tính nếu hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách hai chất
lỏng.
Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1
ml thuốc thử Fehling A và 1 ml thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa sẵn dịch
Cao chiết nước
Pha loãng bằng
H2SO4 10%
Định tính alkaloid Định tính carbohydrate, flavonoid,
tanins, anthraquinon glycosides,
amino acid, saponin, phenolic,
steroids
Lọc Lọc
Pha loãng bằng dung
dịch DMSO 1%
45. Đồ án tốt nghiệp
35
mẫu cây thuốc. Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết tủa dương tính nếu
có kết tủa màu đỏ của CuO ở dưới đáy ống nghiệm
Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc
thử Barfoed. Sau đó đun cách thủy hỗn hợp trên trong 5 phút , làm lạnh nhanh và
quan sát kết quả. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
b, Thử nghiệm alkaloid
Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vào vài
giọt thuốc thử Mayer và quan sát kết quả. Kết tủa dương tính nếu kết tủa màu đục
được tạo thành.
Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài
giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát kết quả. Nếu dương tính sẽ hình
Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử
Hager và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu vàng
Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc
thử Wagner và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu nâu đỏ.
c, Thử nghiệm saponin
Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh rồi quan
sát. Nếu trong ống nghiệm hình thành một lớp bọt ổn định thì cho kết quả dương
tính.
d, Thử nghiệm anthraquinon glycosides
Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml
H2SO4 loãng và đun sôi, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Rồi thêm 3 ml
benzene, lắc đều rồi để yên sẽ thấy dung dịch trong ống nghiệm tách làm 2 lớp.
Tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dương
tính nếu lớp ammonia xuất hiện màu đỏ
46. Đồ án tốt nghiệp
36
e, Thử nghiệm flavonoid
Thử nghiệm alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, rồi cho vào
vài giọt NaOH 10 %, thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với mẫu đối chứng là
mẫu cây thuốc và nước cất để so sánh. Sau đó thêm HCl loãng nếu mất màu thì
chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.
Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho ít bột
Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung thêm 5 ml cồn
95%, rồi quan sát kết quả. Nếu dương tính thì dung dịch có cam, hồng hoặc đỏ tím
Thử nghiệm Ferric Chloride: Lấy 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài
giọt thuốc thử Ferric Chloride 10%. Dung dịch cho kết quả dương tính nếu xuất
hiện màu xanh hoặc tím.
f, Thử nghiệm phenolic
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml chì
acetate 10%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng.
Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin
1%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm.
g, Thử nghiệm tannin
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml
NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Ferric chloride 10%. Kết quả dương tính nếu dung dịch
xuất hiện màu xanh.
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết mẫu cho vào ống nghiệm,
thêm 2 ml NaCl 10%, rồi thêm 4 giọt chì acetate. Kết quả dương tính nếu dung dịch
xuất hiện kết tủa màu vàng
h, Thử nghiệm steroid
Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml
chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào. Lắc mạnh rồi để yên cho dung
dịch tách thành 2 lớp. Quan sát kết quả ở mặt phân cách hai chất lỏng. Nếu xuất
47. Đồ án tốt nghiệp
37
hiện màu đỏ ở lớp dưới thì là steroid, còn nếu là màu vàng ở lớp dưới là
triterpenoid.
Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm
2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Tiếp đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm
đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ
ở mặt phân cách thì là steroid, còn nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm là
triterpenoid
i, Thử nghiệm amino acid
Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử
Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút rồi quan sát hiện tượng. Kết quả là dương
tính nếu xuất hiện màu tím.
48. Đồ án tốt nghiệp
38
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nƣớc của một số loại cây thuốc dân
gian
Các mẫu cây thuốc được tiến hành xử lí cao nước trong 4 giờ và sau đó tiến
hành đánh giá hiệu suất thu hồi cao.
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian
Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm mẫu
Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao được thể hiện trong Hình 3.1. Dựa
vào Hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng đối với các loại cây khác nhau thì dung môi
nước có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết cao khác nhau. Trong 5 mẫu cây khảo
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
Cây thuốc
a
b b
a
c
Hiệu
suất
thu
hồi
(%)
(%
49. Đồ án tốt nghiệp
39
sát thì hiệu suất thu hồi cao nước của cây Eupatorium sp. là cho kết quả cao nhất
với 25,5 % và cao hơn một cách có ý nghĩa so với các mẫu cây còn lại (P < 0,05).
Kế đến là hiệu suất thu hồi cao của cây Medinilla sp., Polygala sp., Elephantopus
sp., và cuối cùng là cây Podocarpus sp. cho kết quả thu hồi cao nước thấp nhất với
11,6 %.
Khi tiến hành so sánh hiệu suất thu hồi của từng mẫu cây với nhau, chúng tôi
thấy rằng hiệu suất thu hồi của cây Podocarpus sp. và cây Elephantopus sp. không
có sự sai khác về mặt thống kê với nhau nhưng lại khác biệt có ý nghĩa so với các
cây còn lại. Tương tự đối với hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. và
cây Polygala sp. cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê với nhau với giá trị
lần lượt là 20,2 % và 20,6 % nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 mẫu còn
lại.
Sở dĩ kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các mẫu cây thuốc có
sự khác biệt như vậy có thể là do mức độ hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cây
thuốc đối với dung môi nước là khác nhau
3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc một số loại cây
thuốc dân gian
3.1.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây
Podocarpus sp.
50. Đồ án tốt nghiệp
40
Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp.
(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn
đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là
200 mg/ml)
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước từ cây Podocarpus
sp. được trình bày trong Hình 3.3. Dựa vào kết quả này chúng tôi nhận thấy rằng
phổ kháng khuẩn của cao chiết nước từ cây Podocarpus sp. khá hẹp. Chúng chỉ ức
chế được 4/20 chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm các chủng như S. typhii, Shi.
sonnei, V. harveyi, S. aureus. Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cây thuốc
thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn cũng khá thấp (từ 7,7 mm đến
13,5 mm).
Khi so sánh kết quả kháng khuẩn của mẫu cây thuốc với kháng sinh
Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với nhóm vi khuẩn Virio spp.)
thì cao chiết nước của cây Podocarpus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn
một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
ST ShS VH SA
Đƣờng
kính
vòng
kháng
(mm)
Vi sinh vật
Podocarpus
Ciprofloxacin
a
b
a
b
a
b
a
b
51. Đồ án tốt nghiệp
41
Kết quả này chứng tỏ rằng đối với cây Podocarpus sp. thì sự hòa tan các hợp
chất hữu cơ có trong cây với dung môi nước là khá yếu và kết quả này phù hợp với
kết quả thu được trong Hình 3.1 (với hiệu suất thu hồi của mẫu cây là 12,0 %).
3.1.1.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Polygala
sp.
Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp.
(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn
đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là
200 mg/ml)
Sau khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao chiết nước của cây
Polygala sp. thì kết quả được thể hiện trong Hình 3.4
Dựa theo kết quả trên Hình 3.4 cho thấy mẫu cao nước Polygala sp. ở nồng độ
200 mg/ml có phổ kháng khuẩn hẹp, chỉ kháng được 6/20 chủng vi sinh vật chỉ thị.
Hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu do vòng đường kính vòng kháng khuẩn là từ
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
EC VA VC VH PA EF
Đƣờng
kính
vòng
kháng
(mm)
Vi sinh vật
Polygala
Ciprofloxacin
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b a
a
52. Đồ án tốt nghiệp
42
8,0 mm đến 11,5 mm. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn của mẫu cây đối
với các chủng vi sinh vật khảo sát là chưa cao.
Mẫu cao nước Polygala sp. kháng được các chủng gây bệnh trên da và gây bệnh
đường ruột. Trong đó có chủng Enterococcus feacalis có đường kính vòng kháng
cao nhất với 11,5 mm và cho kết quả kháng thấp nhất đối với chủng V. harveyi với
đường kính vòng kháng là 8,0 mm.
Dựa vào kết quả đã xử lí thống kê trên Hình 3.4 cho thấy rằng khả năng kháng
khuẩn của cao nước Polygala sp. đối với mỗi chủng vi sinh vật gây bệnh là khác
nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Theo đó khi so
sánh với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với các
chủng Vibrio spp.) cũng cho thấy rằng đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cây
còn rất nhỏ và hầu hết là thấp hơn một cách có ý nghĩa về mặt thống kê so với vòng
kháng của mẫu đối chứng. Tuy vậy vẫn có trường hợp khả năng kháng khuẩn của
mẫu cây và kháng sinh Ciprofloxacin được cho là không có sự sai khác với nhau về
mặt thống kê. Cụ thể ở đây là trường hợp của chủng E. feacalis, đường kính vòng
kháng trung bình của cả mẫu cây và đối chứng được xem là tương đương về mặt
thống kê với số liệu lần lượt là 11,5 mm và 12,0 mm.
Điểm đáng chú ý ở đây là khi tiến hành đối chiếu kết quả thu được với kết quả
nghiên cứu của (Uthiraselvam và ctv, 2012) về hoạt tính kháng khuẩn đối với các
chủng như E. coli, Pseudomonas aeruginosa và E. feacalis thì kết quả cho thấy mẫu
Polygala sp. có đường kính vòng kháng khuẩn tốt hơn hẳn với đường kính vòng
kháng lần lượt là 8,2 mm; 9,3 mm và 11,5 mm, trong khi đường kính vòng kháng
của mẫu cây Polygala javana lần lượt chỉ là 7,0 mm; 7,0 mm và 9,0 mm.
Kết quả này chứng tỏ rằng sự hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cao nước
của cây Polygala sp. tuy nhiều (hiệu suất thu hồi cao nước là 20,5 %) nhưng với
dung môi nước thì chỉ lôi kéo được phần lớn các hợp chất không có hoạt tính sinh
học như carbohydrate và amino acid. Trong khi đó phần lớn các thành phần hóa học
có hoạt tính sinh học lại không hòa tan được trong nước. Do đó, việc sử dụng nước
53. Đồ án tốt nghiệp
43
để tách chiết các hợp chất từ cây Polygala sp.sẽ không thu được tất cả các thành
phần hóa học có hoạt tính sinh học cao.
3.1.1.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây
Medinilla sp.
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp.
(Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml)
Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với
một số chủng vi sinh vật chỉ thị được thể hiện trong Hình 3.5
Theo Hình 3.5 mẫu cao chiết nước Medinilla sp. kháng được 12/20 chủng vi
sinh vật chỉ thị. Trong đó kháng mạnh nhất là đối với chủng shigella flexneri với
đường kính vòng kháng là 13,3 mm, sau đó vòng kháng giảm dần và cuối cùng cho
kết quả kháng yếu nhất là đối với chủng Shi. sonnei với đường kính vòng kháng là
7.5 mm
Mẫu cao chiết nước kháng được cả những chủng gây bệnh đường ruột và gây
bệnh trên da. Trong đó kháng chủ yếu vẫn là các chủng gây bệnh tiêu chảy thuộc
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
Đƣờng
kính
vòng
kháng
(mm)
Vi sinh vật
Medinilla
Ciprofloxacin
a
b
a
b a
b
a
b a a a
a
a a
a
b
a
b
a b ab
54. Đồ án tốt nghiệp
44
các nhóm như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. và Listeria spp.
Ngoài ra còn kháng các chủng vi sinh vật khác như P. aeruginosa, S.aureus, và E.
feacalis. Mặc dù đường kính vòng kháng còn chưa cao nhưng nhìn chung phổ
kháng của mẫu cao chiết nước Medinilla sp. là khá rộng. Điều này chứng tỏ mẫu
cây Medinilla sp. cho khả năng kháng khuẩn khá tốt.
Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.5 cho thấy rằng
mức độ kháng khuẩn của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với các chủng vi sinh vật
chỉ thị so với mẫu đối chứng Ciprofloxacin là khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê
với (P < 0,05). Ngoài ra dựa vào Hình 3.5 cũng cho thấy rằng khả năng kháng của
cao nước và mẫu kháng sinh đối với một số chủng vi sinh vật là tương đương nhau
về mặt thống kê, như đối với trường hợp của chủng S. dublin, S. typhi, và Shi.
flexneri. Đặc biệt đối với chủng Shi. boydii thì đường kính vòng kháng của mẫu cao
nước đối với chủng này là 11,3 mm trong khi mẫu đối chứng Ciprofloxacin lại
không có khả năng kháng được chủng này.
Nhìn chung đối với mẫu cao nước Medinilla sp. cho kết quả hoạt tính kháng
khuẩn khá tốt. Mặc dù mới khảo sát ở nồng độ là 100 mg/ml nhưng kết quả thu
được là rất khả quan với 12 chủng trên cho 20 chủng khảo sát và sự sai khác giữa
những lần lặp lại của các nghiệm thức là khá nhỏ và số liệu được chấp nhận về mặt
thống kê.
Kết quả này là phù hợp với kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước trong
Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. là 20,2 %). Mặc dù phổ
kháng của mẫu cao nước là khá rộng song kết quả thu được khi đo vòng kháng
khuẩn là khá yếu. Sở dĩ có sự khác biệt này là do dung môi nước hòa tan được
nhiều hợp chất có trong mẫu cây thuốc nhưng hàm lượng của các thành phần hóa
học có hoạt tính sinh học trong mẫu cây còn ít dẫn đến kết quả là vòng kháng khuẩn
thu được yếu.
55. Đồ án tốt nghiệp
45
3.1.1.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây
Eupatorium sp.
Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp.
(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn
đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là
100 mg/ml)
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của mẫu cây Eupatorium
sp. được thể hiện trong Hình 3.6
Dựa vào kết quả được biểu hiện trên Hình 3.6 cho thấy rằng mẫu cao chiết nước
Eupatorium sp. kháng được 5 trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Nhìn chung thì mẫu
cao chiết nước kháng được một vài chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy như
Listeria monocytogens, Shigella flexneri, Vibrio harveyi. Ngoài ra còn kháng được
các chủng gây bệnh ngoài da như Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis.
Mặc dù phổ kháng của mẫu cao chiết nước còn hẹp, nhưng xét một cách tổng
quát thì khả năng kháng khuẩn của mẫu cây thuốc đối với các chủng vi sinh là rất
tích cực tại nồng độ là 100 mg/ml. Và nhìn chung là mẫu Eupatorium sp. có thể
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
LM ShF VH PA EF
Đƣờng
kính
vòng
kháng
(mm)
Vi sinh vật
Eupatorium
Ciprofloxacin
a
b
a
b a
b
a
b
a
b
56. Đồ án tốt nghiệp
46
kháng rải rác ở cả 2 nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da và đường ruột. Với kết quả
trên sẽ là cơ sở quan trọng để tiếp tục làm thêm thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
của mẫu cao nước Eupatorium sp. ở các chủng vi sinh vật khác.
Theo như kết quả trên Hình 3.6 thì cho thấy cao nước Eupatorium sp. cho khả
năng kháng tốt nhất đối với chủng V. harveyi với đường kính vòng kháng là 12,8
mm, sau đó đường kính vòng kháng giảm dần với các chủng lần lượt là E. feacalis,
P. aeruginosa, Shi. flexneri và cuối cùng là cho kết quả kháng yếu nhất là chủng
Lis. monocytogenes với đường kính vòng kháng khuẩn là 7,0 mm
Dựa theo kết quả xử lí số liệu được thể hiện trên Hình 3.6 cho biết rằng khả
năng kháng khuẩn của mẫu cao nước Eupatorium sp. so với kháng sinh
Ciprofloxacin là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Và cụ thể ở đây
là hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao nước yếu hơn nhiều so với hoạt tính kháng
khuẩn của mẫu đối chứng Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với
các chủng Vibrio spp.)
Kết quả này cho thấy rằng đối với mẫu cây Eupatorium sp. thì sự hòa tan của
các hợp chất tuy nhiều (Hiệu suất thu hồi cao là 25,46 %) nhưng khả năng hòa tan
của các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như alkaloid và tannin trong dung môi
nước là rất yếu. Khi đó việc sử dụng dung môi nước sẽ không thể tách chiết được
các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học cao.
3.1.1.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây
Elephantopus sp.
57. Đồ án tốt nghiệp
47
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp.
(Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml)
Kết quả kháng khuẩn cao nước của mẫu câu Elephantopus sp. được trình bày
trong Hình 3.7
Theo kết quả trên Hình 3.7 ta thấy rằng với nồng độ 100 mg/ml mẫu cao
nước Elephantopus sp. chỉ kháng được 1/20 chủng vi sinh vật khảo sát đó là chủng
Shi. flexneri với đường kính vòng kháng là 12,2 mm
Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.7 ta thấy rằng khi
so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao nước cây Elephantopus sp. so với mẫu
kháng sinh Ciprofloxacin tại nồng độ là 500 µg/ml thì cho kết quả thấp hơn một
cách có ý nghĩa về mặt thống kê. Cụ thể ở đây là đường kính vòng kháng khuẩn của
mẫu kháng sinh là 13,2 mm và đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cao nước là
12,2 mm.
Mặc dù mẫu cao nước chỉ kháng được một chủng vi sinh vật nhưng đây sẽ là
cơ sở để có thể tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng khác nữa.
11.5
12
12.5
13
13.5
14
Elephantopus sp. Ciprofloxacin
Đƣờng
kính
vòng
kháng
(mm)
Mẫu thử nghiệm
ShF
a
b
58. Đồ án tốt nghiệp
48
Và kết quả này phù hợp với kết quả hiệu thu hồi ở Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi là
15,2 %).
Điều này chứng tỏ rằng đối với mẫu cây Elephantous sp. thì hàm lượng
thành phần hóa học có trong mẫu là rất ít và khi sử dụng dung môi nước để tách
chiết các hợp chất sinh học có trong mẫu cây thì kết quả thu được sẽ không khả
quan.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao nước các loại cây thuốc
đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị
Chủng VSV
Podocarpus
sp.
[200]
mg/ml
Polygala
sp.
[200]mg/ml
Medinilla
sp.
[100]mg/ml
Eupatorium
sp.
[100]mg/ml
Elephantopus
sp.
[100]
mg/ml
E.coli O157:H7 - - 13,2 ± 0,3 - -
E.coli 0208 - - 12,3 ± 0,3 - -
E.coli 7,8 ± 0,3 8,2 ± 0,3 13,2 ± 0,3 - -
Lis.monocytogenes - - - 7,0 ± 0,5 -
Lis. innocua - - 8,7 ± 0,3 - -
S.dublin - - 10,8 ± 0,8 - -
S.typhii - - 12,0 ± 0,5 - -
Shi.boydii - - 11,3 ± 0,3 - -
Shi.flexneri - 13,3 ± 0,6 9,5 ± 0,5 12,2 ± 0,3
Shi.sonnei - - 7,5 ± 0,9 - -
V.alginolyticus 9,3 ± 0,3 9,2 ± 0,3 - - -
V.cholerae 13,5 ± 0,5 9,5 ± 0,9 - - -
V.harveyi 7,7 ± 0,6 8,0 - 12,8 ± 0,3 -
P. aeruginosa - 9,3 ± 1,0 9,2 ± 0,8 10,0 -
59. Đồ án tốt nghiệp
49
S.aureus - - 11,0 - -
E.feacalis - 11,5 ± 1,5 10,8 ± 0,3 10,8 ± 0,3 -
Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD
(A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium
sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và
cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2).
(A1)
(A2
)
(B1) (B2)
(C1) (C2)
(D1)
(D2)
60. Đồ án tốt nghiệp
50
Từ kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao nước trên Bảng
3.1 cho thấy rằng khả năng kháng khuẩn của mỗi loại cao nước là khác nhau. Trong
đó mẫu cây Podocarpus sp. và Elephantopus sp. cho kết quả kháng yếu nhất với
mẫu Podocarpus sp. thì kháng được 4 chủng vi sinh vật chỉ thị ở nồng độ là 200
mg/ml và mẫu Elephantopus sp. thì chỉ kháng được 1 chủng vi sinh vật ở nồng độ
100 mg/ml. Trong khi đó với nồng độ khảo sát là 100 mg/ml thì các mẫu cây khác
cho khả năng kháng khuẩn tốt hơn như mẫu cây Eupatorium sp. kháng được 6/20
chủng vi sinh vật khảo sát. Và cho kết quả kháng tốt nhất là mẫu cây Medinilla sp,
với phổ kháng khá rộng là 12/20 chủng vi khuẩn khảo sát.
Dựa vào kết quả ở Bảng 3.1 cũng cho thấy rằng các mẫu cao nước chủ yếu
kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy. Cụ thể như đối với chủng Shi.
flexneri thì cả ba mẫu cây Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. đều cho
kết quả kháng với vòng kháng khuẩn lần lượt là 13,3 mm, 9,5 mm, 12,2 mm.
Kết hợp với kết quả thu hồi hiệu suất cao nước của các mẫu cây thuốc trong
Hình 3.1 cho thấy kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên là phù hợp với kết
quả thu được
Nhìn chung với dung môi nước thì khả năng kháng khuẩn của các mẫu cây
thuốc đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh còn khá yếu. Nguyên nhân có thể là do
các hợp chất kháng khuẩn có trong các mẫu cây hòa tan kém trong dung môi nước.
Và hàm lượng thành phần hóa học có hoạt tính sinh học trong các mẫu cây còn khá
thấp.
3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nƣớc của một số loại cây
thuốc
Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây
thuốc
62. Đồ án tốt nghiệp
52
noid noid
Elephantopus + - + + - + + Sterol Sterol -
Eupatorium
+ - + + - + +
Triterpe
noid
Triterpe
noid
-
Podocarpus - - + + + + + Sterol Sterol -
Dựa vào kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy đối với mỗi loại cao nước khác nhau sẽ
cho kết quả định tính thành phần hóa học không giống nhau, ngoài ra chúng còn
khác nhau trong từng thử nghiệm. Cụ thể ở đây là đối với thử nghiệm carbohydrate
thì đối với mẫu cao nước Medinilla sp., Elephantopus sp., Podocarpus sp. thì cho
kết quả dương tính với tất cả các thử nghiệm trong khi các mẫu cao nước khác như
Polygala sp., Eupatorium sp., lại cho kết quả dương tính với thử nghiệm Molisch và
Barfoed nhưng lại cho kết quả âm tính với thử nghiệm Fehling. Hoặc nếu xét ở thử
nghiệm alkaloid thì chỉ có cây Polygala sp. là cho kết quả dương tính với các thử
nghiệm như Wagner, Hager, Mayer, Dragendorff trong khi tất cả các mẫu cao nước
còn lại đều cho kết quả âm tính hết.
Sở dĩ có sự khác biệt như vậy là do đối với mỗi hợp chất có trong mỗi loại
cây thuốc có độ hòa tan trong dung môi nước khác nhau và đối với mỗi thử nghiệm
sẽ dùng để kiểm tra một loại thành phần khác nhau. Do đó mà có thể trong cùng
một thử nghiệm mà khi dùng thuốc thử này thì cho kết quả âm tính nhưng khi sử
dụng loại thuốc thử khác thì lại cho kết quả dương tính. Cụ thể như đối với trường
hợp của thử nghiệm carbohydrate của cây Polygala sp., đối với thử này chúng tôi sử
dụng ba loại thuốc thử là Molisch, Fehling và Barfoed. Kết quả của mẫu cây cho
thấy rằng đối với thử nghiệm Molisch và Barfoed thì mẫu cây cho kết quả dương
tính trong khi thử nghiệm Fehling lại cho kết quả âm tính. Nguyên nhân là do đối
với thử nghiệm Molisch thì cho kết quả dương tính với tất cả các loại carbohydrate,
còn Barfoed thì cho kết quả dương tính với các loại đường không khử như