SlideShare a Scribd company logo

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)

•
•
https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace

This document presents a graduation thesis that studies the antimicrobial capability and chemical composition of extracts from Plumeria rubra L. acutifolia (white plumeria) flowers. The study aims to evaluate the extraction yield and antimicrobial activity of extracts obtained using different solvents against several groups of pathogenic bacteria, and qualitatively determine some basic chemical components in the ethanol 70% extract. The methodology includes extraction of flowers using various solvents, assessment of extraction yield, evaluation of extracts' antimicrobial activity using the disc diffusion method, and identification of major chemical constituents in the most active extract.

Education
1 of 118
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT HOA SỨ TRẮNG (PLUMERIA RUBRA L. ACUTIFOLIA) Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trần Phương Thùy MSSV: 1311100744 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC.........................................................................................................................i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................3 4. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................................3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................4 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng .....................................................................................4 1.1.1. Phân loại..........................................................................................................4 1.1.2. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................4 1.1.3. Phân bố............................................................................................................5 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng ..........................................................................6 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng............................................................8 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới ........................8 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật ..................................9
Đồ án tốt nghiệp ii 1.2.1. Carbohydrate ...................................................................................................9 1.2.2. Alkaloid.........................................................................................................10 1.2.3. Flavonoid.......................................................................................................11 1.2.4. Saponin..........................................................................................................12 1.2.5. Tannin............................................................................................................13 1.2.6. Hợp chất glycoside........................................................................................14 1.2.7. Hợp chất phenolic..........................................................................................15 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật........................16 1.3.1. Khái niệm ......................................................................................................16 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn......................................................................................17 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột......................................................................17 1.4.1. Định nghĩa .....................................................................................................17 1.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................17 1.4.3. Tính chất nuôi cấy.........................................................................................17 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa .........................................................................................18 1.4.5. Sức đề kháng .................................................................................................18 1.4.6. Độc tố ............................................................................................................19 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên..................................................................................19 1.4.8. Khả năng gây bệnh........................................................................................20 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................22
Đồ án tốt nghiệp iii 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................................22 2.1.1. Địa điểm ........................................................................................................22 2.1.2. Thời gian .......................................................................................................22 2.2. Vật liệu.................................................................................................................22 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................22 2.2.2. Địa điểm thu mẫu ..........................................................................................22 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................22 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ........................................................................................24 2.2.5. Hóa chất, dung môi .......................................................................................24 2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................25 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu.....................................................................25 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật .........................................................25 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ...........................................26 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật ................................................................27 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu .........................................................................27 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ........................28 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết .....................28 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................31 2.4. Bố trí thí nghiệm..................................................................................................32
Đồ án tốt nghiệp iv 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng.....................................................................................32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng...............................................................................................34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................38 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng...........................................................................................................38 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng.....................................................................................39 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli........................................................................................39 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. ..............................................................................................42 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. .......................................................................................................44 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................................................................................48 3.2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại .......................................................................................................50 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ trắng từ dung môi ethanol 70%............................................................................................57
Đồ án tốt nghiệp v TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62 PHỤ LỤC.........................................................................................................................1 Phụ lục A. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các loại dung môi khác nhau...............................................................................................1 Phụ lục B. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với 20 chủng vi khuẩn thử nghiệm...............................1 Phụ lục C: Cách pha các loại thuốc thử......................................................................38 Phụ lục D. Kết quả hình ảnh định tính một số thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ........................................................................................40
Đồ án tốt nghiệp vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide NA: Non activity DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid PrAEE: Cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng
Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh..........................................54 Bảng 3.2. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh...........................................55 Bảng 3.3. Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ mẫu Hoa Sứ trắng ..........................................................................................................................58
Đồ án tốt nghiệp viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng.............................................................................................4 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát........................................................................32 Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng......................................33 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE............................34 Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng................................................................................................................................36 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau .38 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli...............................................................................................40 Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli (EtOH 70%) B. Vòng ức chế E0208 (EtOH 96%)....40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp.....................................................................................................42 Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%).......................................................................................42 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp................................................................................................................44 Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) ..................44 Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. ....................................................................................................46 Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B) ..........................................................................................................................47 Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp.......................................................................................................................49 Hình 3.11. A. Vòng ức chế V.cholerae của cao chiết EtOH 96% và B. Vòng ức chế V.harveyi của cao chiết EtOH 70%................................................................................49 Hình 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ..................................................................................................51 Hình 3.13. Vòng ức chế S.aureus (A) và P.aeruginosa ở cao chiết EtOH 70% (B) .....51
Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nước là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh giá là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhưng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước nhà. Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất…Trong điều trị các vết thương phần mềm,
Đồ án tốt nghiệp 2 nhiều tác giả trong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng khỏi. Hiện nay trên thế giới, phong trào quay về với thiên nhiên đang diễn ra mạnh mẽ và Việt Nam chúng ta cũng đang rất tích cực nghiên cứu về vấn đề này. Ở Việt Nam, các nghị định,các chương trình của nhà nước đã thúc đẩy việc phát hiện, nghiên cứu và sử dụng các nguồn cây thuốc trong kho tàng cây thuốc Việt Nam. Trong các cuốn sách nói về cây thuốc hầu hết đều có nhắc tới công dụng chữa bệnh của cây sứ trong đó có hoa sứ điển hình như trong cuốn sách Từ điển cây thuốc Việt Nam của tác Võ Văn Chi. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây sứ có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Thời xa xưa, dân gian thường dùng hoa đại phơi khô để làm thuốc chữa chứng ho, kiết lỵ và tiêu chảy. Với nghiên cứu khoa học và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng khi tách chiết bằng các dung môi khác nhau. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng.
Đồ án tốt nghiệp 3 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với các vi khuẩn chỉ thị. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ thực hiện tách chiết trên những loại dung môi là cồn và nước. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.
Đồ án tốt nghiệp 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng 1.1.1. Phân loại Giới: Plantae Bộ: Gentianales Lớp: Dicotyledons Họ: Apocynaceae (Trúc Đào) Chi: Plumeria Tên khoa học: Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại, bông Sứ, Chăm pa… Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cây cao khoảng 2 – 3 m, có khi cao đến 7 m.Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong queo, xù xì. Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại, cây có nhựa mủ. Lá cây Hoa Sứ trắng thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu. Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và
Đồ án tốt nghiệp 5 các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá. Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành. Hoa Sứ trắng ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30 – 50 cm, phân nhánh ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng. Các bông có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì khoe sắc trắng của cánh hoa và tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng. Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng. Cây Hoa Sứ trắng có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15 cm. Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Hoa Sứ trắng khó đậu trái. Cây Hoa Sứ trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh. Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ Trắng có khả năng chịu hạn cao. Cây được nhân giống từ giâm cành là chính. Vào mùa mưa, những cành Sứ trắng giâm rất nhanh ra rễ và mọc khỏe. 1.1.3. Phân bố Hoa Sứ trắng là một trong số nhiều loài thuộc chi Plumeria. Chi này có nguồn gốc ở vùng Trung Mỹ. Do có hoa đẹp và đặc biệt có hương thơm, dần dần đã được con người trồng nhiều nơi trên thế giới để làm cảnh và lấy hương từ hoa. Ở nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam, Sứ trắng thường được trồng ở các đền đài, và dùng hoa của nó để thờ cúng. Nicaragua và Lào là hai nước lấy cây Sứ Trắng làm quốc hoa, ở đó nó được gọi với cái tên là Sacuajoche (Nicaragua) và Champa (Lào). Sứ Trắng có tên tiếng Anh là frangipani, xuất phát từ tên dòng họ Frangipani của một gia đình hầu tước đã nghĩ ra cách tạo một loại nước hoa có mùi của hoa Sứ Trắng. Ở Việt Nam, Cây Sứ trắng được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn biệt thự… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều.
Đồ án tốt nghiệp 6 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng 1.1.4.1. Công dụng làm cảnh Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ những cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà,… đến những cây Sứ to được trồng trong sân vườn đem lại hương hoa và bóng mát cho ngôi nhà. 1.1.4.2. Công dụng dân gian của cây Sứ trắng Tính vị, tác dụng: Hoa Sứ trắng có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt lợi tiểu, hòa vị, nhuận tràng, bổ phổi, có tác dụng hạ huyết áp rất rõ. Vỏ cây có vị đắng tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm những tổ chức rắn chai chân. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây Sứ trắng có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng khác nhau: a) Công dụng của hoa Năm 1962, khoa Dược lý trường sĩ quan quân y Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng của Hoa Sứ và kết luận rằng “Hoa Sứ có tác dụng hạ huyết áp. Hoa khô có tác dụng mạnh hơn hoa tươi”. Hoa Sứ hạ huyết áp nhưng không làm giãn tĩnh mạch, không tác dụng đối với tuần hoàn ngoại biên mà tác dụng vào trung tâm. Tác dụng huyết áp xuất hiện nhanh và tương đối bền vững. Ngoài ra Hoa Sứ còn có một số công dụng sau: Dự phòng say nắng Viêm ruột, lỵ Khó tiêu, kém hấp thu và kém dinh dưỡng ở trẻ em Nhiễm khuẩn, viêm gan Viêm khí quản, ho
Đồ án tốt nghiệp 7 b) Công dụng của vỏ thân, vỏ rễ Trong vỏ thân có gluside là agoniadin và một chất đắng là plumierite. Vỏ thân và rễ có hơi độc, vị đắng, tính mát. Dân gian thường sử dụng để chữa thủy thủng, làm thuốc tẩy xổ (dùng 8 – 15 g), táo bón lâu ngày (thay thế cho đại hoàng), nhuận tràng (dùng 3 – 5 g), viêm chân răng. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị tiêu chảy và dùng vỏ rễ để trị bệnh lậu và loét đường sinh dục. c) Công dụng của nhựa mủ Nhựa mũ thành phần chủ yếu là acid plumeric. Cũng có thể dùng nhựa mủ để tẩy xổ, nhưng liều thấp hơn nhiều so với vỏ thân , 0.5 – 0.8g/ngày dưới dạng nhũ dịch. Nhựa mủ còn được dùng để chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt. Ở Ấn Độ, người ta dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng xổ. d) Công dụng của lá Lá tươi chứa plumier và một số chất khác đã được sử dụng để điều trị loét, viêm (Bobbarala và ctv, 2000, Zaheer và ctv, 2010). Chiết xuất lá đã cho thấy dấu hiệu của hoạt động kháng khuẩn. Kinh nghiệm dân gian dùng lá cây Sứ trắng chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt. Một số bài thuốc dân gian từ Hoa Sứ: Chữa cao huyết áp, bằng cách dùng như sau: Hằng ngày sử dụng 12 - 20g hoa sứ (loại khô), đem sắc (nấu) lấy nước, uống thay trà trong ngày. Bong gân: Dùng một lá tươi rửa sạch, giã nhuyễn, trộn với một ít muối ăn đắp lên chỗ sưng. Lại dùng một ít lá tươi khác, hơ lên lửa cho héo và đắp phía ngoài rồi cố định bằng băng hoặc vải sạch. Ngày đắp 1 – 3 lần liên tục như vậy 1 – 2 ngày. Đau nhức hay mụn nhọt: Cũng dùng lá tươi giã nhuyễn đắp vào. Chân răng sưng đau: Vỏ rễ ngâm rượu, dùng ngậm rất hiệu quả (chú ý không được nuốt). Ho: Sử dụng 4 – 12g hoa sứ khô, sắc lấy nước, uống thay trà trong ngày.
Đồ án tốt nghiệp 8 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng - Hoa chứa tinh dầu dễ bốc hơi (chừng 0,05 %) trong có citronellol, farnesol, geraniol, bornesitol, linalol, phenyl-ethyl alcohol, 2-methylbutan-1-ol. Các flavonoid như kaempferol, kaempferol-glycoside, quercetin, quercetin-glycoside.., quercitrin, rutin.. - Vỏ thân có beta-sitosterol, các iridoids như fulvoplumierin (0,25%), al lamcin và allamandin , plumieride (6%), p-benzoquinone, lignan loại liriodendrin.. - Rễ chứa beta-dihydroplumericic acid, beta-dihydroplumericine, isoplume ricine, plumericine. - Nhựa chứa acetyl-luoeol, alpha và beta-amyrin, cerotic acid, lupeol, lupe ol- acetate, oxymethyl-dioxycinnamic acid, plumieric acid.. - Lá chứa khoảng 5,6 % pectin. 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới 1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam chưa có bài viết cụ thể nào nghiên cứu về loài Hoa Sứ. 1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới Năm 2010, Ajay Singh Baghel và ctv đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước, ethanol, etyl acetate, chloroform. Năm 2015, Lawal và ctv đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria. Năm 2014, Muruganantham và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra. Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn của chiết xuất tinh dầu từ Plumeria rubra. Năm 2012, Ravi Kumar Goyal và ctv đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vỏ cây Plumeria alba.
Đồ án tốt nghiệp 9 Năm 2010, Subur Khan và ctv đã nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học của Plumeria rubra và Plumeria alba. 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành. Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,.. (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. 2.Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm ba nhóm chính sau: Monosaccharide còn được gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản nhất của carbohydrate và không bị thủy phân. Monosaccharide được xem là sản phẩm oxy hóa không hoàn toàn của các polyalcol, công thức có chứa chức aldehyde và cetone. Oligosaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide. Phân tử oligosaccharide và polysaccharide đều do các monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết O-glycoside do nhóm hydroxyl hemiacetal của một gốc với một hydroxyl bất kì của một gốc khác. Thông thường người ta gọi oligosaccharide là những gluside chứa từ 2 - 10 gốc monosaccharide. Tùy theo số lượng monosaccharide mà người ta gọi disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide…
Đồ án tốt nghiệp 10 Hầu hết các oligosaccharide dễ kết tinh, dễ hòa tan, có vị ngọt và có phân tử lượng xác định. Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside. Polysaccharide mang nhiều tính khác với mono và disaccharide như: không có phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình thành dung dịch keo. Phân tử polysaccharide có thể gồm một hoặc vài loại monome khác nhau, do đó người ta chia ra polysaccharide đồng thể và polysaccharide dị thể. 1.2.1.3. Vai trò Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng: Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglican...). Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phương Hà Linh Linh, 2011). 1.2.2. Alkaloid 1.2.2.1. Khái niệm Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất nhiều loài thực vật có alkaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất 0,05% alkaloid so với mẫu cây khô. 1.2.2.2 Phân loại Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia làm 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả - alkaloid (Pseudoalkaloid).
Đồ án tốt nghiệp 11 Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ colchicin, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin. Lysin, phenylalanin, tryptophan, histidin, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N - dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino aicd, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (thí dụ conessin) và purin (cafein). Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.2.3. Vai trò Nhiều alkaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alkaloid có tác dụng kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin… có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alkaloid có tác dụng ức chế thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẫu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối như: morphin, codeine, cocaine. Các alkaloid được bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanol. 1.2.3. Flavonoid 1.2.3.1. Khái niệm Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn có màu vàng ( do từ flavus là màu vàng ); tuy vậy, một sắc tố
Đồ án tốt nghiệp 12 có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn cơ bản. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhammose; L-Arabinose… Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glyside flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thường xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glycoside thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin… tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam – đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. 1.2.3.2. Vai trò Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng samonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon ( trích từ cây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu ) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất pyrethrin ( trích thừ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc ). 1.2.4. Saponin 1.2.4.1. Khái niệm Saponin còn gọi là saponosid do chữ la tinh Sapo = xà phòng (vì nó tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid phân bố khá rộng rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thường
Đồ án tốt nghiệp 13 ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200o C trở lên và có thể trên 300o C. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxit barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. 1.2.4.2. Vai trò Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormon steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. 1.2.5. Tannin 1.2.5.1. Khái niệm Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật. Người ta gặp tannin hằng ngày trong cuộc sống ( trà, rượu vang đỏ, trong nhiều loại trái cây, đặc biệt là trong vỏ trái măng cục…). Các tannin có trọng lượng phân tử khoảng 500 – 3000. Các tannin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.5.2. Phân loại Tannin được phân thành hai nhóm chính là “tannin thủy giải được” và “tannin hóa đặc” tùy theo việc tannin có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc dung dịch acid. Tannin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol thí dụ như catechol hoặc epicatechol. Loại này khác với tannin thủy giải được vì nó không được thủy giải dưới tác dụng của acid vô cơ loãng.
Đồ án tốt nghiệp 14 Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glcose với acid galic. Người ta cũng chia tannin loại này ra là tannin galic và tannin ellagic. 1.2.5.3. Vai trò Ở trong cây, tannin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. Là những chất đa phenol, tannin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây. Dung dịch tannin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da. Tannin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tannin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy. Tannin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá. Tannin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. 1.2.6. Hợp chất glycoside Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận của cây : lá, vỏ, hạt… Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng. Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần : phần đường và phần không đường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường. Phần đường của glycosid : phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L- arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác. Phần aglycon của glycosid : phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như : monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iriđoi, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol…
Đồ án tốt nghiệp 15 1.2.7. Hợp chất phenolic 1.2.7.1. Khái niệm Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên, Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy, chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu. 1.2.7.2. Phân loại Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2- C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2(lignan, neolignan), (C6- C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ). Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. 1.2.7.3. Vai trò Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này. Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng.
Đồ án tốt nghiệp 16 Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn. Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường. Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp, Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa. 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 1.3.1. Khái niệm Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).
Đồ án tốt nghiệp 17 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008). 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột 1.4.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không nhưng nếu di động thì sẽ có tiên mao, không sinh bào tử. 1.4.2. Đặc điểm hình thái Tất cả các vi khuẩn thuộc học này đều là vi khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 – 4 µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình dạng không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có tiên mao phân bố khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không sinh bào tử. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 1.4.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trong môi trường lỏng, vi khuẩn làm đục đều môi trường sau 12 - 18h nuôi cấy, một số có thể phát triển thành váng trên mặt và lắng cặn dưới đáy ống,
Đồ án tốt nghiệp 18 nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy. Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc: Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng. Dạng M: Hình thức này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau. 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: Di động hoặc không di động. Lên men hoặc không lên men một số loại đường. Hai loại đường thường được xác định nhất là glucose và lactose. Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. Có hay không có một số enzyme. Hai enzyme thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat như nguồn cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons. 1.4.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành bào tử nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100O C và bởi các hóa chất sát khuẩn kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị cho lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa thông thường. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều
Đồ án tốt nghiệp 19 ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 1.4.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có độc tố. bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị ly giải. Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100 đến 500 KDa. Nội độc tố có tính rất độc chỉ cần 0,005 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ. Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100O C trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố như Shigella, E.Coli loại enterotoxigenic e.coli (ETEC ). Ngoại độc tố của Shigella làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có ba nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên than của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong dó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc. Không bị phá hủy ở 100O C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi bị xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành type huyết thanh.
Đồ án tốt nghiệp 20 Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Có bản chất là protein, dễ bị phá hủy ở 100O C hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ưngsẽ xảy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá hủy, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn bào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhii). Kháng nguyên K nếu chi phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuối cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này. 1.4.8. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng
Đồ án tốt nghiệp 21 đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm trùng máu. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột.
Đồ án tốt nghiệp 22 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey) 2.2.2. Địa điểm thu mẫu Mẫu được thu tại nghĩa trang phường 8, quận Gò Vấp. 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi ThS. Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh bao gồm các chủng: Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli gồm: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. Coli O157:H7. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm: L. monocytogenes, L. innocua. Các vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: E. feacalis, S. aureus,P. aeruginosa.
Đồ án tốt nghiệp 23
Đồ án tốt nghiệp 24 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.2.4.1. Thiết bị Tủ sấy Máy lọc chân không Tủ ủ Bể đều nhiệt Tủ lạnh Bếp từ Tủ hấp autoclave Máy lắc 2.2.4.2. Dụng cụ Pipette pasteur Ống nghiệm Phễu lọc Giấy lọc Cân phân tích Kẹp ống nghiệm Micropipette loại 10 – 100 µl Micropipette loại 100 – 1000 µl Đầu tipe Bình môi trường 500 ml Chai môi trường 100 ml Cốc thủy tinh 1000ml Cốc thủy tinh 100ml Đĩa nhựa Eppendoff Que trang Dao cấy Ống trụ kim loại rỗng (d = 6 mm) Đèn cồn Bông không thấm Bông thấm Parafilm 2.2.5. Hóa chất, dung môi Môi trường nuôi cấy và tăng sinh Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Dung môi: ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 50%, Dimethylsulfoxid (DMSO), nước cất (Việt Nam).
Đồ án tốt nghiệp 25 Hóa chất Ciprofloxacin 500 mg (Thái Lan). H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform, NaCl. Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2) 10%. Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu Tiến hành thu những mẫu Hoa Sứ trắng nở hoàn toàn, không héo. Sau đó, rửa sạch, để ráo rồi sấy khô đến trọng lượng không đổi và xay mẫu. Mẫu sau khi được xay thành bột được bảo quản trong các túi nhựa ở nhiệt độ 4o C để tiến hành tách chiết cao. 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật Tách chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan các hợp chất trong cây bằng phương pháp chiết ngâm và lắc để phá vỡ mẫu ở nhiệt độ thường. Sau đó thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi theo thể tích nhất định để tách chiết các hợp chất có trong cây nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây. Cách tiến hành: Mẫu hoa Sứ được ngâm trong dung môi theo tỷ lệ 1:20 để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được lắc ở 150 vòng/phút trong khoảng 18 – 24 giờ. Sau đó đem đi lọc để thu dịch chiết. Tiếp tục lặp lại 3 lần cho đến khi dịch lọc trong suốt. Tiến hành cô cách thủy ở 70o C để loại bỏ dung môi và thu cao. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở - 4o C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Đồ án tốt nghiệp 26 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5o C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4o C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được bảo quản trong tủ lạnh ở 4o C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15o C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
Đồ án tốt nghiệp 27 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Cách tiến hành: Môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút ở 1 atm. Tiến hành hút 100µl dịch vi khuẩn khảo sát vào 20ml môi trường TSB trong đều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên sẽ làm đục môi trường. Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (cfu/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 . Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
Đồ án tốt nghiệp 28 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng ức chế (mm). Cách thực hiện: Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 10-6 vào đĩa chứa môi trường TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa cho đến khi khô hoàn toàn. Sau đó đục lỗ thạch để tạo giếng với đường kính 6 mm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)1% theo nồng độ khảo sát. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch và dùng paraflim quấn xung quanh đĩa. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 37o C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. (Ramakrishnan, 2011). 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Sứ trắng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.3.7.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào
Đồ án tốt nghiệp 29 và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O. Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.3.7.2. Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ 2.3.7.3. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.
Đồ án tốt nghiệp 30 Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 2.3.7.5. Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất. Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.3.7.6. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1.5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.7.7. Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen. Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng.
Đồ án tốt nghiệp 31 2.3.7.8. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành màu nâu đỏ đậm là triterpenoid. 2.3.7.9. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statistical Analysis System 9.4 (SAS). Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.
Đồ án tốt nghiệp 32 2.4. Bố trí thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng. Thuyết minh quy trình: Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi thu được rửa sạch và sấy khô ở 40o C. Sau đó, xay nhuyễn thành bột. Tiến hành cân 40 g bột Hoa Sứ trắng và ngâm trong 800 ml các loại dung môi khảo sát (tỉ lệ 1 : 20 (w/v)) ở nhiệt độ phòng. Đối với dung môi nước cất: mẫu được ngâm với nước cất (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) chứa trong erlen thủy tinh. Cứ mỗi 4 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm và lọc theo cách như trên. Thu tất cả dịch lọc và cô cách thủy ở 70o C để thu nhận cao. Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu với ethanol (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) ở các nồng độ 50%, 70%, 96% trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt Mẫu Hoa Sứ trắng Tách chiết cao bằng các dung môi khác nhau Xử lý mẫu Đánh giá hàm lượng thu hồi của các loại cao chiết Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Định tính một số thành phần hóa học Đánh giá kết quả
Đồ án tốt nghiệp 33 dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70o C để thu nhận cao chiết. Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Tiến hành đánh giá hàm lượng thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: H (%) = 𝑚1−𝑚0 m x 100 Trong đó: H: hàm lượng cao thu được (%) m1: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g) m0: khối lượng cốc ban đầu (g) m: khối lượng mẫu ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) Mẫu Hoa Sứ trắng Xử lý mẫu Ngâm dung môi (1:20) (w/v) trong 24 giờ Cô cách thủy 70o C Lọc tinh Cao chiết Đánh giá hàm lượng thu hồi Bã
Đồ án tốt nghiệp 34 Sau khi xác định hàm lượng thu hồi các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 4o C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng Sau khi thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau, tiến hành quy trình khảo sát hoạt tính. Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong môi trường TSB Lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ Đo OD600nm Pha loãng về 106 cfu/ml Cấy trang trên môi trường TSA Đục lỗ (d = 6 mm) PrAEE Nồng độ 200 mg/ml Ủ 37o C trong 24 giờ Đo đường kính vòng kháng Hút 100 µl DMSO Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE
Đồ án tốt nghiệp 35 Thuyết minh quy trình: Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ trắng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 20 ml môi trường TSB (riêng đối với các chủng Vibrio spp. thì bổ sung thêm 1,5% NaCl). Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha cho vào đĩa thạch TSA và trang đều. Dùng ống trụ kim loại có đường kính d = 6 mm, đục 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch. PrAEE được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 200 mg/ml. Hút 100 μl dịch cao chiết cho vào các giếng trong đĩa môi trường TSA. Các đĩa thạch được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó đem ủ ở 37o C trong vòng 24 giờ và đọc kết quả. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 2.4.3 Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Dựa vào quy trình Hình 2.8 có thể chia cao chiết Hoa Sứ trắng làm 2 phần Phần thứ nhất: Cao chiết Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành định tính alkaloid. Phần thứ hai: Cao Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho tan hoàn toàn, sau đó tiến hành pha loãng và lọc dung dịch qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch này đem phân tích, định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, steroid, phenolic, tannin, cardiac glycoside.
Đồ án tốt nghiệp 36 Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng a) Định tính thành phần carbohydrat - Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Barfoed b) Định tính thành phần saponin Cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% Hòa tan trong dung dịch DMSO 1% Lọc Lọc Dịch trong Định tính thành phần hóa học Dịch trong Định tính thành phần hóa học Alkaloid Carbohydrate Saponin nn Cardiac glycoside Flavonoid Hợp chất Phenolic Tannin Steroid Amino acid
Đồ án tốt nghiệp 37 - Thử nghiệm Foam (tạo bọt) c) Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer - Thử nghiệm Dragendorff - Thử nghiệm Hager - Thử nghiệm Wagner d) Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal - Thử nghiệm Keller Killiani e) Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline - Thử nghiệm Ferric chloride f) Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Lead acetate - Thử nghiệm Gelatin g) Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride - Thử nghiệm Lead acetate h) Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski - Thử nghiệm Libermann Burchard i) Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhydrin
Đồ án tốt nghiệp 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70o C. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng từ các dung môi được trình bày trong hình 3.1 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau Dựa vào Hình 3.1 nhận thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Tuy cùng quy trình tách chiết nhưng hàm lượng thu hồi cao của các loại dung môi từ Hoa Sứ trắng không giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,01). Mẫu Hoa Sứ trắng được tách chiết bằng dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng trung bình là 36,27%. Kế đến là dung môi ethanol 50% và 70% với hàm lượng trung bình lần lượt là 33,63% và 26,97%. Cuối cùng hàm lượng thu hồi cao thấp nhất là của dung môi ethanol 96% là 18,10%.
Đồ án tốt nghiệp 39 Trong nghiên cứu này, việc sử dụng các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như flavonoid, alkaloid, glycoside, saponin, tannin,... (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này có thể bốc hơi nhanh trong quá trình cô mẫu. Ngoài ra nó cũng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân cực. Theo các nghiên cứu liên quan đến việc khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi EtOH 70% để tiến hành tách chiết cao vì EtOH 70% có khả năng tách chiết rất nhiều chất có hoạt tính kháng khuẩn ra khỏi thực vật (Wendakoon và ctv, 2012). Với hàm lượng thu hồi của 4 loại dung môi khác nhau từ Hoa Sứ trắng thì nước là dung môi cho hàm lượng cao nhất nhưng chưa thể khẳng định rằng nước là dung môi có hoạt tính sinh học mạnh nhất đối với cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Do đó, cần phải đánh giá các hoạt tính sinh học mới có thể kết luận được dung môi tốt nhất cho quá trình tách chiết cao. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng Với mục tiêu nghiên cứu là chọn ra dung môi thích hợp để tách chiết cao có hoạt tính sinh học cao nhất từ mẫu Hoa Sứ trắng nên chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi tách chiết khác nhau đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày ở các Hình 3.2, Hình 3.4, Hình 3.6, Hình 3.8, Hình 3.10, Hình 3.12, Bảng 3.1 và Bảng 3.2. 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli
Đồ án tốt nghiệp 40 Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm 4 chủng: E. Coli, ETEC, E. coli 0208 và E. coli O157:H7. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn E. Coli thể hiện trên Hình 3.2. Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli của cao chiết EtOH 70%; B. Vòng ức chế E.0208 của cao chiết EtOH 96% A B Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli
Đồ án tốt nghiệp 41 Dựa vào kết quả thí nghiệm trên Hình 3.2 nhận thấy rằng các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đều thể hiện hoạt tính kháng nhóm Escherichia coli ngoại trừ cao chiết nước. Đối với cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng trong nhóm vi khuẩn Escherichia coli với đường kính trung bình từ 8,83 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% có hoạt lực mạnh nhất đối với chủng E.coli với đường kính vòng ức chế 11,17 mm nhưng thấp hơn hoạt tính của kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện khả năng ức chế chủng E.0208 với đường kính vòng ức chế trung bình cao nhất là 9,83 mm. Trong khi đó, ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng E.coli và E.O157:H7 với đường kính vòng ức chế trung bình 8,33 mm và 8,83 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng nhóm vi khuẩn Escherichia coli, cụ thể là trên chủng ETEC có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 12 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính ức chế 2/4 chủng đó là chủng ETEC và E.0208 và có đường kính vòng ức chế trung bình lần lượt là 9,67 mm và 9,33 mm. Cao chiết EtOH 70% (50 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. Cao chiết EtOH 50% chỉ thể hiện hoạt tính ức chế đối với chủng ETEC ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng chế lần lượt là 10,50 mm và 9,33 mm. Từ kết quả phân tích trên cho thấy rằng trong 4 loại cao chiết khảo sát thì cao chiết EtOH 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất nhưng lại có phổ kháng khuẩn hẹp hơn cao chiết EtOH 96%. Theo kết quả nghiên cứu của Baghel (2010) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ lá của Plumeria rubra thì cao chiết này kháng được chủng vi khuẩn E.coli với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 16 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết EtOH từ Hoa Sứ trắng nhưng lại sử dụng nồng độ khảo sát cao hơn (250 mg/ml). Mặt khác, khi so sánh với kết quả của Khalil (2012), hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Catharanthus roseus (dừa cạn) ở nồng độ 100 mg/ml ức chế được chủng
Đồ án tốt nghiệp 42 E.coli với đường kính vòng kháng 11 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 100 mg/ml. Từ kết quả nghiên cứu của Kalpana và ctv (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá cây Moringa oleifera trên chủng vi khuẩn E.coli cho thấy cao chiết Moringa oleifera ức chế chủng E.coli với đường kính trung bình là 8,3 mm thấp hơn cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở cùng nồng độ 200 mg/ml. 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng L. innocua và L. monocytogenes và kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3.4. Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%) Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. A B
Đồ án tốt nghiệp 43 Kết quả Hình 3.4 cho thấy cao chiết EtOH 70% và EtOH 96% ức chế được cả 2 chủng vi khuẩn nhóm Listeria spp. ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml. Và cùng nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml nhưng cao chiết nước chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở chủng L.monocytogenes. Đối với cao chiết EtOH 50% thì không có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Listeria spp.. Từ Hình 3.4 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng ức chế trung bình 9,67 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Nhưng ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện đường kính vòng ức chế cao nhất đối với chủng L.innocua là 9,00 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế tốt nhất trên chủng L.monocytogenes, L.innocua với đường kính vòng ức chế lần lượt là 13 mm và 10,83 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao EtOH 70% ức chế chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng kháng cao nhất là 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ có hoạt tính ức chế được chủng L.monocytogenes và không ức chế được chủng L.innocua. Ở nồng độ 200 mg/ml cao chiết nước có hoạt lực tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) và có đường kính vòng ức chế là 11,33 mm, theo như kết quả thống kê thì không có sự khác biệt (P > 0,01). Cao chiết nước ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế trên chủng L.monocytogenes với đường kính vòng kháng là 9,17 mm. Như vậy, khi so sánh với các loại cao chiết thì cao EtOH 70% có hoạt lực mạnh nhất khi khảo sát trên nhóm vi khuẩn Listeria spp.. Điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn Listeria spp. khá nhạy cảm với cao chiết EtOH 70%, đặc biệt là đối với chủng L.monocytogenes. So với nghiên cứu của Rozman (2009) ở cây Rosmarinus offcinalis L. với nồng độ160 mg/ml có khả năng kháng khuẩn trên chủng L. monocytogenes với đường kính vòng kháng là 8 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở nổng độ 100
Đồ án tốt nghiệp 44 mg/ml có đường kính vòng kháng khuẩn là 9,67 mm cao hơn so với cây Rosmarinus offcinalis L. ở nồng độ 160 mg/ml. 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm 4 chủng : S.dublin, S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium được trình bày ở Hình 3.6. A B Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp.
Đồ án tốt nghiệp 45 Qua kết quả Hình 3.6 cho thấy rằng các loại cao chiết khảo sát đều có hoạt tính ức chế đối với nhóm Salmonella spp., cụ thể là cao chiết EtOH 96% ức chế được 4/4 chủng ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng ức chế từ 8,50 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml, EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất ở chủng S.typhii, tiếp đến là S.dublin và S.enteritidis với đường kính vòng ức chế trung bình từ 11 mm đến 11,33 mm tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao EtOH 96% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với chủng S.typhii là 10,67 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% không có hoạt tính ức đối với nhóm vi khuẩn Salmonella. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml ức chế được 3/4 chủng, ở nồng độ 50 mg/ml chỉ ức chế được 2/4 chủng vi khuẩn nhóm Salmonella spp.. Ở nồng độ 200 mg/ml hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất thể hiện ở chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 11,83 mm không có sự khác biệt với ciprofloxacin về mặt thống kê (P > 0,01). Cao chiết EtOH 70% (100 mg/ml) có hoạt tính ức chế cao nhất đối với chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 9,83 mm và ở nồng độ 50 mg/ml có đường kính vòng ức chế là 8,17 mm. Điều này chứng tỏ, ở nồng độ càng cao thì hoạt lực của cao EtOH 70% càng mạnh. Đối với cao chiết EtOH 50% (200 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với chủng S.typhimurium nhưng lại ức chế được 3 chủng còn lại và đường kính vòng ức chế cao nhất là 12,33 mm đối với chủng S.dublin và tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được chủng S.dublin, có đường kính vòng ức là 10,83 mm và không có sự khác biệt với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Đối với cao nước chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với chủng S.enteritidis, ở nồng độ 200 mg/ml thì cho kết quả tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01), ở nồng độ 100 mg/ml có đường kính vòng ức chế trung bình 8,67 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01).
Đồ án tốt nghiệp 46 Dựa vào kết quả nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2015) cho thấy rằng hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ Plumeria rubra ở nồng độ 40 mg/ml có đường kính vòng ức chế đối với chủng S.typhii là 12 mm tương đương với kết quả thử nghiệm của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng với đường kính vòng ức chế là 11,33 mm. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Nirosha (2013) cho thấy cao chiết ethanol từ lá Carica papaya L. có khả năng ức chế chủng vi khuẩn S.typhii ở nồng độ 250 mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm thấp hơn hoạt tính của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 200 mg/ml. 3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm 3 chủng: Shi.boydii, Shi.flexneri, Shi. Sonnei được trình bày ở Hình 3.8. Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp.
Đồ án tốt nghiệp 47 Dựa vào kết quả trên hình 3.8 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% (200 mg/ml và 100 mg/ml) ức chế được 3/3 chủng vi khuẩn nhóm Shigella spp.. Ở nồng độ 200 mg/ml, cao chiết EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng ức chế trung bình 11 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính mạnh nhất đối với chủng Shi.flexneri và có đường kính vòng ức chế 10,17 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin về mặt thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 50 mg/ml chỉ ức chế được chủng Shi.flexneri với đường kính vòng ức chế là 8,83 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế được 3/3 chủng vi khuẩn nhóm Shigella spp., ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng cao nhất đối với chủng Shi.sonnei với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,50 mm thấp hơn kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Trong khi đó, cũng ở nồng độ 200 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được 2 chủng Shi.boydii và Shi.flexneri với đường kính vòng ức chế lần lượt là 12,17 mm và 11,67 mm tương đương với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được chủng Shi.boydii với đường kính vòng kháng cao nhất là 10,17 mm và ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế với đường kính vòng ức chế cao nhất là 9,00 mm tương đương với chủng Shi.sonnei. Đối với cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được ở Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)

Recommended

Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
nhuphung96
 
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAYĐề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đĐề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điềuKhảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímNghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
ljmonking
 

Recommended

Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả NhàuĐánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
Đánh giá hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong quả Nhàu
nhuphung96
 
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAYĐề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Đề tài: Hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền nam việt nam và thử h...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia c...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đĐề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Đề tài: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng, 9đ
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điềuKhảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
Khảo sát điều kiện lên men nhằm nâng cao chất lượng rượu trái điều
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímNghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
ljmonking
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chiNghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAYĐề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docxĐồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Zalo/Tele: 0973.287.149 Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaNghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quyNghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngNghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
Man_Ebook
 
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAYĐề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Huongdanvietbaocaothuctap
HuongdanvietbaocaothuctapHuongdanvietbaocaothuctap
Huongdanvietbaocaothuctap
tienkhongdien
 
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộpCông nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
ljmonking
 
Stress oxy hóa và các chất oxy hóa
Stress oxy hóa và các chất oxy hóaStress oxy hóa và các chất oxy hóa
Stress oxy hóa và các chất oxy hóa
Bệnh Hô Hấp Mãn Tính
 
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đĐề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiNghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuốiNghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

More Related Content

What's hot

Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docxĐồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Zalo/Tele: 0973.287.149 Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói
 

What's hot (20)

Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
 
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô...
 
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chiNghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi
 
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAYĐề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
Đề tài: Nghiên cứu bào chế viên nén chứa cao Hà thủ ô đỏ, HAY
 
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAYĐề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
Đề tài: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng, HAY
 
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docxĐồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
Đồ Án Phát Triển Sản Phẩm Thực Phẩm Sữa Chua Dẻo Hoa Đậu Biếc.docx
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaNghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
 
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quyNghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
Nghiên cứu khả năng thay thế bột mì bằng bột chuối xanh để chế biến bánh quy
 
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóngNghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
Nghiên cứu trích ly pectin từ vỏ thanh long bằng phương pháp vi sóng
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm​
 
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
Nghiên cứu quá trình tạo mầm hạt đậu xanh và ứng dụng sản xuất bột đậu xanh n...
 
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAYĐề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
Đề tài: Quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái Sơ ri, HAY
 
Huongdanvietbaocaothuctap
HuongdanvietbaocaothuctapHuongdanvietbaocaothuctap
Huongdanvietbaocaothuctap
 
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộpCông nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp
 
Stress oxy hóa và các chất oxy hóa
Stress oxy hóa và các chất oxy hóaStress oxy hóa và các chất oxy hóa
Stress oxy hóa và các chất oxy hóa
 
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đĐề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
Đề tài: Quá trình trích ly thu nhận Flavonoid từ củ cải trắng, 9đ
 
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gaiNghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một...
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuốiNghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu chuối
 
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tíaKhảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía
 

Similar to Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)

Similar to Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia) (20)

Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
 
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi s...
 
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân g...
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân g...Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân g...
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân g...
 
Nghiên cứu mô hình thu hồi dinh dưỡng từ nước thải thủy sản
Nghiên cứu mô hình thu hồi dinh dưỡng từ nước thải thủy sảnNghiên cứu mô hình thu hồi dinh dưỡng từ nước thải thủy sản
Nghiên cứu mô hình thu hồi dinh dưỡng từ nước thải thủy sản
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
 
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp. (cs1b) và ứng dụ...
 
ứNg dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long...
ứNg dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long...ứNg dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long...
ứNg dụng nấm trichoderma trong quản lý nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long...
 
Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn...
Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn...Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn...
Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn...
 
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
Xây dựng chỉ số độc tính của kênh tham lương – bến cát thành phố hồ chí minh ...
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
 
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông ngh...
 
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lacticXác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụngNghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột gạo mầm và dự đoán hạn sử dụng
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystumNghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
Nghiên cứu quy trình sản xuất snack từ rong nâu sargassum polycystum
 
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
 
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
Sản xuất nấm paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp. gây hạ...
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyn...
 
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
Nghiên cứu tăng cường chế phẩm sinh học em fert 1 trong công nghệ sản xuất ...
 

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
 

Recently uploaded

1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
QucHHunhnh
 
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
QucHHunhnh
 
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdf
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdfMaking and Justifying Mathematical Decisions.pdf
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdf
Chris Hunter
 

Recently uploaded (20)

This PowerPoint helps students to consider the concept of infinity.
This PowerPoint helps students to consider the concept of infinity.This PowerPoint helps students to consider the concept of infinity.
This PowerPoint helps students to consider the concept of infinity.
 
1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
1029 - Danh muc Sach Giao Khoa 10 . pdf
 
Mixin Classes in Odoo 17 How to Extend Models Using Mixin Classes
Mixin Classes in Odoo 17 How to Extend Models Using Mixin ClassesMixin Classes in Odoo 17 How to Extend Models Using Mixin Classes
Mixin Classes in Odoo 17 How to Extend Models Using Mixin Classes
 
Grant Readiness 101 TechSoup and Remy Consulting
Grant Readiness 101 TechSoup and Remy ConsultingGrant Readiness 101 TechSoup and Remy Consulting
Grant Readiness 101 TechSoup and Remy Consulting
 
On National Teacher Day, meet the 2024-25 Kenan Fellows
On National Teacher Day, meet the 2024-25 Kenan FellowsOn National Teacher Day, meet the 2024-25 Kenan Fellows
On National Teacher Day, meet the 2024-25 Kenan Fellows
 
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
 
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SDMeasures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
 
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
1029-Danh muc Sach Giao Khoa khoi 6.pdf
 
Asian American Pacific Islander Month DDSD 2024.pptx
Asian American Pacific Islander Month DDSD 2024.pptxAsian American Pacific Islander Month DDSD 2024.pptx
Asian American Pacific Islander Month DDSD 2024.pptx
 
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdf
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdfMaking and Justifying Mathematical Decisions.pdf
Making and Justifying Mathematical Decisions.pdf
 
Introduction to Nonprofit Accounting: The Basics
Introduction to Nonprofit Accounting: The BasicsIntroduction to Nonprofit Accounting: The Basics
Introduction to Nonprofit Accounting: The Basics
 
Python Notes for mca i year students osmania university.docx
Python Notes for mca i year students osmania university.docxPython Notes for mca i year students osmania university.docx
Python Notes for mca i year students osmania university.docx
 
Explore beautiful and ugly buildings. Mathematics helps us create beautiful d...
Explore beautiful and ugly buildings. Mathematics helps us create beautiful d...Explore beautiful and ugly buildings. Mathematics helps us create beautiful d...
Explore beautiful and ugly buildings. Mathematics helps us create beautiful d...
 
Role Of Transgenic Animal In Target Validation-1.pptx
Role Of Transgenic Animal In Target Validation-1.pptxRole Of Transgenic Animal In Target Validation-1.pptx
Role Of Transgenic Animal In Target Validation-1.pptx
 
Advanced Views - Calendar View in Odoo 17
Advanced Views - Calendar View in Odoo 17Advanced Views - Calendar View in Odoo 17
Advanced Views - Calendar View in Odoo 17
 
Unit-IV; Professional Sales Representative (PSR).pptx
Unit-IV; Professional Sales Representative (PSR).pptxUnit-IV; Professional Sales Representative (PSR).pptx
Unit-IV; Professional Sales Representative (PSR).pptx
 
microwave assisted reaction. General introduction
microwave assisted reaction. General introductionmicrowave assisted reaction. General introduction
microwave assisted reaction. General introduction
 
Unit-IV- Pharma. Marketing Channels.pptx
Unit-IV- Pharma. Marketing Channels.pptxUnit-IV- Pharma. Marketing Channels.pptx
Unit-IV- Pharma. Marketing Channels.pptx
 
2024-NATIONAL-LEARNING-CAMP-AND-OTHER.pptx
2024-NATIONAL-LEARNING-CAMP-AND-OTHER.pptx2024-NATIONAL-LEARNING-CAMP-AND-OTHER.pptx
2024-NATIONAL-LEARNING-CAMP-AND-OTHER.pptx
 
ICT Role in 21st Century Education & its Challenges.pptx
ICT Role in 21st Century Education & its Challenges.pptxICT Role in 21st Century Education & its Challenges.pptx
ICT Role in 21st Century Education & its Challenges.pptx
 

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của một số loại cao chiết hoa sứ trắng (plumeria rubra l. acutifolia)

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT HOA SỨ TRẮNG (PLUMERIA RUBRA L. ACUTIFOLIA) Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trần Phương Thùy MSSV: 1311100744 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  • 2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
  • 3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
  • 4. Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC.........................................................................................................................i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................3 4. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................................3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................4 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng .....................................................................................4 1.1.1. Phân loại..........................................................................................................4 1.1.2. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................4 1.1.3. Phân bố............................................................................................................5 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng ..........................................................................6 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng............................................................8 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới ........................8 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật ..................................9
  • 5. Đồ án tốt nghiệp ii 1.2.1. Carbohydrate ...................................................................................................9 1.2.2. Alkaloid.........................................................................................................10 1.2.3. Flavonoid.......................................................................................................11 1.2.4. Saponin..........................................................................................................12 1.2.5. Tannin............................................................................................................13 1.2.6. Hợp chất glycoside........................................................................................14 1.2.7. Hợp chất phenolic..........................................................................................15 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật........................16 1.3.1. Khái niệm ......................................................................................................16 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn......................................................................................17 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột......................................................................17 1.4.1. Định nghĩa .....................................................................................................17 1.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................17 1.4.3. Tính chất nuôi cấy.........................................................................................17 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa .........................................................................................18 1.4.5. Sức đề kháng .................................................................................................18 1.4.6. Độc tố ............................................................................................................19 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên..................................................................................19 1.4.8. Khả năng gây bệnh........................................................................................20 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................22
  • 6. Đồ án tốt nghiệp iii 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................................22 2.1.1. Địa điểm ........................................................................................................22 2.1.2. Thời gian .......................................................................................................22 2.2. Vật liệu.................................................................................................................22 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................22 2.2.2. Địa điểm thu mẫu ..........................................................................................22 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................22 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ........................................................................................24 2.2.5. Hóa chất, dung môi .......................................................................................24 2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................25 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu.....................................................................25 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật .........................................................25 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ...........................................26 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật ................................................................27 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu .........................................................................27 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ........................28 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết .....................28 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................31 2.4. Bố trí thí nghiệm..................................................................................................32
  • 7. Đồ án tốt nghiệp iv 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng.....................................................................................32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng...............................................................................................34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................38 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng...........................................................................................................38 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng.....................................................................................39 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli........................................................................................39 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. ..............................................................................................42 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. .......................................................................................................44 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................................................................................48 3.2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại .......................................................................................................50 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ trắng từ dung môi ethanol 70%............................................................................................57
  • 8. Đồ án tốt nghiệp v TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62 PHỤ LỤC.........................................................................................................................1 Phụ lục A. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các loại dung môi khác nhau...............................................................................................1 Phụ lục B. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với 20 chủng vi khuẩn thử nghiệm...............................1 Phụ lục C: Cách pha các loại thuốc thử......................................................................38 Phụ lục D. Kết quả hình ảnh định tính một số thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ........................................................................................40
  • 9. Đồ án tốt nghiệp vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide NA: Non activity DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid PrAEE: Cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng
  • 10. Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh..........................................54 Bảng 3.2. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh...........................................55 Bảng 3.3. Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ mẫu Hoa Sứ trắng ..........................................................................................................................58
  • 11. Đồ án tốt nghiệp viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng.............................................................................................4 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát........................................................................32 Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng......................................33 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE............................34 Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng................................................................................................................................36 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau .38 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli...............................................................................................40 Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli (EtOH 70%) B. Vòng ức chế E0208 (EtOH 96%)....40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp.....................................................................................................42 Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%).......................................................................................42 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp................................................................................................................44 Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) ..................44 Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. ....................................................................................................46 Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B) ..........................................................................................................................47 Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp.......................................................................................................................49 Hình 3.11. A. Vòng ức chế V.cholerae của cao chiết EtOH 96% và B. Vòng ức chế V.harveyi của cao chiết EtOH 70%................................................................................49 Hình 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ..................................................................................................51 Hình 3.13. Vòng ức chế S.aureus (A) và P.aeruginosa ở cao chiết EtOH 70% (B) .....51
  • 12. Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nước là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh giá là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhưng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước nhà. Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất…Trong điều trị các vết thương phần mềm,
  • 13. Đồ án tốt nghiệp 2 nhiều tác giả trong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng khỏi. Hiện nay trên thế giới, phong trào quay về với thiên nhiên đang diễn ra mạnh mẽ và Việt Nam chúng ta cũng đang rất tích cực nghiên cứu về vấn đề này. Ở Việt Nam, các nghị định,các chương trình của nhà nước đã thúc đẩy việc phát hiện, nghiên cứu và sử dụng các nguồn cây thuốc trong kho tàng cây thuốc Việt Nam. Trong các cuốn sách nói về cây thuốc hầu hết đều có nhắc tới công dụng chữa bệnh của cây sứ trong đó có hoa sứ điển hình như trong cuốn sách Từ điển cây thuốc Việt Nam của tác Võ Văn Chi. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây sứ có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Thời xa xưa, dân gian thường dùng hoa đại phơi khô để làm thuốc chữa chứng ho, kiết lỵ và tiêu chảy. Với nghiên cứu khoa học và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng khi tách chiết bằng các dung môi khác nhau. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng.
  • 14. Đồ án tốt nghiệp 3 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với các vi khuẩn chỉ thị. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ thực hiện tách chiết trên những loại dung môi là cồn và nước. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.
  • 15. Đồ án tốt nghiệp 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng 1.1.1. Phân loại Giới: Plantae Bộ: Gentianales Lớp: Dicotyledons Họ: Apocynaceae (Trúc Đào) Chi: Plumeria Tên khoa học: Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại, bông Sứ, Chăm pa… Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cây cao khoảng 2 – 3 m, có khi cao đến 7 m.Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong queo, xù xì. Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại, cây có nhựa mủ. Lá cây Hoa Sứ trắng thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu. Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và
  • 16. Đồ án tốt nghiệp 5 các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá. Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành. Hoa Sứ trắng ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30 – 50 cm, phân nhánh ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng. Các bông có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì khoe sắc trắng của cánh hoa và tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng. Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng. Cây Hoa Sứ trắng có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15 cm. Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Hoa Sứ trắng khó đậu trái. Cây Hoa Sứ trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh. Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ Trắng có khả năng chịu hạn cao. Cây được nhân giống từ giâm cành là chính. Vào mùa mưa, những cành Sứ trắng giâm rất nhanh ra rễ và mọc khỏe. 1.1.3. Phân bố Hoa Sứ trắng là một trong số nhiều loài thuộc chi Plumeria. Chi này có nguồn gốc ở vùng Trung Mỹ. Do có hoa đẹp và đặc biệt có hương thơm, dần dần đã được con người trồng nhiều nơi trên thế giới để làm cảnh và lấy hương từ hoa. Ở nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam, Sứ trắng thường được trồng ở các đền đài, và dùng hoa của nó để thờ cúng. Nicaragua và Lào là hai nước lấy cây Sứ Trắng làm quốc hoa, ở đó nó được gọi với cái tên là Sacuajoche (Nicaragua) và Champa (Lào). Sứ Trắng có tên tiếng Anh là frangipani, xuất phát từ tên dòng họ Frangipani của một gia đình hầu tước đã nghĩ ra cách tạo một loại nước hoa có mùi của hoa Sứ Trắng. Ở Việt Nam, Cây Sứ trắng được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn biệt thự… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều.
  • 17. Đồ án tốt nghiệp 6 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng 1.1.4.1. Công dụng làm cảnh Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ những cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà,… đến những cây Sứ to được trồng trong sân vườn đem lại hương hoa và bóng mát cho ngôi nhà. 1.1.4.2. Công dụng dân gian của cây Sứ trắng Tính vị, tác dụng: Hoa Sứ trắng có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt lợi tiểu, hòa vị, nhuận tràng, bổ phổi, có tác dụng hạ huyết áp rất rõ. Vỏ cây có vị đắng tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm những tổ chức rắn chai chân. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây Sứ trắng có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng khác nhau: a) Công dụng của hoa Năm 1962, khoa Dược lý trường sĩ quan quân y Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng của Hoa Sứ và kết luận rằng “Hoa Sứ có tác dụng hạ huyết áp. Hoa khô có tác dụng mạnh hơn hoa tươi”. Hoa Sứ hạ huyết áp nhưng không làm giãn tĩnh mạch, không tác dụng đối với tuần hoàn ngoại biên mà tác dụng vào trung tâm. Tác dụng huyết áp xuất hiện nhanh và tương đối bền vững. Ngoài ra Hoa Sứ còn có một số công dụng sau: Dự phòng say nắng Viêm ruột, lỵ Khó tiêu, kém hấp thu và kém dinh dưỡng ở trẻ em Nhiễm khuẩn, viêm gan Viêm khí quản, ho
  • 18. Đồ án tốt nghiệp 7 b) Công dụng của vỏ thân, vỏ rễ Trong vỏ thân có gluside là agoniadin và một chất đắng là plumierite. Vỏ thân và rễ có hơi độc, vị đắng, tính mát. Dân gian thường sử dụng để chữa thủy thủng, làm thuốc tẩy xổ (dùng 8 – 15 g), táo bón lâu ngày (thay thế cho đại hoàng), nhuận tràng (dùng 3 – 5 g), viêm chân răng. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị tiêu chảy và dùng vỏ rễ để trị bệnh lậu và loét đường sinh dục. c) Công dụng của nhựa mủ Nhựa mũ thành phần chủ yếu là acid plumeric. Cũng có thể dùng nhựa mủ để tẩy xổ, nhưng liều thấp hơn nhiều so với vỏ thân , 0.5 – 0.8g/ngày dưới dạng nhũ dịch. Nhựa mủ còn được dùng để chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt. Ở Ấn Độ, người ta dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng xổ. d) Công dụng của lá Lá tươi chứa plumier và một số chất khác đã được sử dụng để điều trị loét, viêm (Bobbarala và ctv, 2000, Zaheer và ctv, 2010). Chiết xuất lá đã cho thấy dấu hiệu của hoạt động kháng khuẩn. Kinh nghiệm dân gian dùng lá cây Sứ trắng chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt. Một số bài thuốc dân gian từ Hoa Sứ: Chữa cao huyết áp, bằng cách dùng như sau: Hằng ngày sử dụng 12 - 20g hoa sứ (loại khô), đem sắc (nấu) lấy nước, uống thay trà trong ngày. Bong gân: Dùng một lá tươi rửa sạch, giã nhuyễn, trộn với một ít muối ăn đắp lên chỗ sưng. Lại dùng một ít lá tươi khác, hơ lên lửa cho héo và đắp phía ngoài rồi cố định bằng băng hoặc vải sạch. Ngày đắp 1 – 3 lần liên tục như vậy 1 – 2 ngày. Đau nhức hay mụn nhọt: Cũng dùng lá tươi giã nhuyễn đắp vào. Chân răng sưng đau: Vỏ rễ ngâm rượu, dùng ngậm rất hiệu quả (chú ý không được nuốt). Ho: Sử dụng 4 – 12g hoa sứ khô, sắc lấy nước, uống thay trà trong ngày.
  • 19. Đồ án tốt nghiệp 8 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng - Hoa chứa tinh dầu dễ bốc hơi (chừng 0,05 %) trong có citronellol, farnesol, geraniol, bornesitol, linalol, phenyl-ethyl alcohol, 2-methylbutan-1-ol. Các flavonoid như kaempferol, kaempferol-glycoside, quercetin, quercetin-glycoside.., quercitrin, rutin.. - Vỏ thân có beta-sitosterol, các iridoids như fulvoplumierin (0,25%), al lamcin và allamandin , plumieride (6%), p-benzoquinone, lignan loại liriodendrin.. - Rễ chứa beta-dihydroplumericic acid, beta-dihydroplumericine, isoplume ricine, plumericine. - Nhựa chứa acetyl-luoeol, alpha và beta-amyrin, cerotic acid, lupeol, lupe ol- acetate, oxymethyl-dioxycinnamic acid, plumieric acid.. - Lá chứa khoảng 5,6 % pectin. 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới 1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam chưa có bài viết cụ thể nào nghiên cứu về loài Hoa Sứ. 1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới Năm 2010, Ajay Singh Baghel và ctv đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước, ethanol, etyl acetate, chloroform. Năm 2015, Lawal và ctv đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria. Năm 2014, Muruganantham và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra. Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn của chiết xuất tinh dầu từ Plumeria rubra. Năm 2012, Ravi Kumar Goyal và ctv đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vỏ cây Plumeria alba.
  • 20. Đồ án tốt nghiệp 9 Năm 2010, Subur Khan và ctv đã nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học của Plumeria rubra và Plumeria alba. 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành. Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,.. (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. 2.Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm ba nhóm chính sau: Monosaccharide còn được gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản nhất của carbohydrate và không bị thủy phân. Monosaccharide được xem là sản phẩm oxy hóa không hoàn toàn của các polyalcol, công thức có chứa chức aldehyde và cetone. Oligosaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide. Phân tử oligosaccharide và polysaccharide đều do các monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết O-glycoside do nhóm hydroxyl hemiacetal của một gốc với một hydroxyl bất kì của một gốc khác. Thông thường người ta gọi oligosaccharide là những gluside chứa từ 2 - 10 gốc monosaccharide. Tùy theo số lượng monosaccharide mà người ta gọi disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide…
  • 21. Đồ án tốt nghiệp 10 Hầu hết các oligosaccharide dễ kết tinh, dễ hòa tan, có vị ngọt và có phân tử lượng xác định. Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside. Polysaccharide mang nhiều tính khác với mono và disaccharide như: không có phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình thành dung dịch keo. Phân tử polysaccharide có thể gồm một hoặc vài loại monome khác nhau, do đó người ta chia ra polysaccharide đồng thể và polysaccharide dị thể. 1.2.1.3. Vai trò Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng: Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglican...). Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phương Hà Linh Linh, 2011). 1.2.2. Alkaloid 1.2.2.1. Khái niệm Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất nhiều loài thực vật có alkaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất 0,05% alkaloid so với mẫu cây khô. 1.2.2.2 Phân loại Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia làm 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả - alkaloid (Pseudoalkaloid).
  • 22. Đồ án tốt nghiệp 11 Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ colchicin, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin. Lysin, phenylalanin, tryptophan, histidin, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N - dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino aicd, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (thí dụ conessin) và purin (cafein). Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.2.3. Vai trò Nhiều alkaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alkaloid có tác dụng kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin… có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alkaloid có tác dụng ức chế thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẫu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối như: morphin, codeine, cocaine. Các alkaloid được bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanol. 1.2.3. Flavonoid 1.2.3.1. Khái niệm Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn có màu vàng ( do từ flavus là màu vàng ); tuy vậy, một sắc tố
  • 23. Đồ án tốt nghiệp 12 có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn cơ bản. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhammose; L-Arabinose… Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glyside flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thường xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glycoside thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin… tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam – đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. 1.2.3.2. Vai trò Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng samonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon ( trích từ cây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu ) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất pyrethrin ( trích thừ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc ). 1.2.4. Saponin 1.2.4.1. Khái niệm Saponin còn gọi là saponosid do chữ la tinh Sapo = xà phòng (vì nó tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid phân bố khá rộng rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thường
  • 24. Đồ án tốt nghiệp 13 ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200o C trở lên và có thể trên 300o C. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxit barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. 1.2.4.2. Vai trò Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormon steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. 1.2.5. Tannin 1.2.5.1. Khái niệm Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật. Người ta gặp tannin hằng ngày trong cuộc sống ( trà, rượu vang đỏ, trong nhiều loại trái cây, đặc biệt là trong vỏ trái măng cục…). Các tannin có trọng lượng phân tử khoảng 500 – 3000. Các tannin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.5.2. Phân loại Tannin được phân thành hai nhóm chính là “tannin thủy giải được” và “tannin hóa đặc” tùy theo việc tannin có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc dung dịch acid. Tannin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol thí dụ như catechol hoặc epicatechol. Loại này khác với tannin thủy giải được vì nó không được thủy giải dưới tác dụng của acid vô cơ loãng.
  • 25. Đồ án tốt nghiệp 14 Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glcose với acid galic. Người ta cũng chia tannin loại này ra là tannin galic và tannin ellagic. 1.2.5.3. Vai trò Ở trong cây, tannin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. Là những chất đa phenol, tannin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây. Dung dịch tannin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da. Tannin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tannin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy. Tannin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá. Tannin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. 1.2.6. Hợp chất glycoside Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận của cây : lá, vỏ, hạt… Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng. Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần : phần đường và phần không đường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường. Phần đường của glycosid : phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L- arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác. Phần aglycon của glycosid : phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như : monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iriđoi, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol…
  • 26. Đồ án tốt nghiệp 15 1.2.7. Hợp chất phenolic 1.2.7.1. Khái niệm Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên, Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy, chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu. 1.2.7.2. Phân loại Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2- C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2(lignan, neolignan), (C6- C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ). Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. 1.2.7.3. Vai trò Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này. Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng.
  • 27. Đồ án tốt nghiệp 16 Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn. Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường. Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp, Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa. 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 1.3.1. Khái niệm Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).
  • 28. Đồ án tốt nghiệp 17 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008). 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột 1.4.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không nhưng nếu di động thì sẽ có tiên mao, không sinh bào tử. 1.4.2. Đặc điểm hình thái Tất cả các vi khuẩn thuộc học này đều là vi khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 – 4 µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình dạng không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có tiên mao phân bố khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không sinh bào tử. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 1.4.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trong môi trường lỏng, vi khuẩn làm đục đều môi trường sau 12 - 18h nuôi cấy, một số có thể phát triển thành váng trên mặt và lắng cặn dưới đáy ống,
  • 29. Đồ án tốt nghiệp 18 nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy. Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc: Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng. Dạng M: Hình thức này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau. 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: Di động hoặc không di động. Lên men hoặc không lên men một số loại đường. Hai loại đường thường được xác định nhất là glucose và lactose. Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. Có hay không có một số enzyme. Hai enzyme thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat như nguồn cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons. 1.4.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành bào tử nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100O C và bởi các hóa chất sát khuẩn kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị cho lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa thông thường. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều
  • 30. Đồ án tốt nghiệp 19 ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 1.4.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có độc tố. bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị ly giải. Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100 đến 500 KDa. Nội độc tố có tính rất độc chỉ cần 0,005 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ. Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100O C trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố như Shigella, E.Coli loại enterotoxigenic e.coli (ETEC ). Ngoại độc tố của Shigella làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có ba nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên than của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong dó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc. Không bị phá hủy ở 100O C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi bị xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành type huyết thanh.
  • 31. Đồ án tốt nghiệp 20 Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Có bản chất là protein, dễ bị phá hủy ở 100O C hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ưngsẽ xảy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá hủy, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn bào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhii). Kháng nguyên K nếu chi phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuối cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này. 1.4.8. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng
  • 32. Đồ án tốt nghiệp 21 đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm trùng máu. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột.
  • 33. Đồ án tốt nghiệp 22 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey) 2.2.2. Địa điểm thu mẫu Mẫu được thu tại nghĩa trang phường 8, quận Gò Vấp. 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi ThS. Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh bao gồm các chủng: Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli gồm: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. Coli O157:H7. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm: L. monocytogenes, L. innocua. Các vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: E. feacalis, S. aureus,P. aeruginosa.
  • 34. Đồ án tốt nghiệp 23
  • 35. Đồ án tốt nghiệp 24 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.2.4.1. Thiết bị Tủ sấy Máy lọc chân không Tủ ủ Bể đều nhiệt Tủ lạnh Bếp từ Tủ hấp autoclave Máy lắc 2.2.4.2. Dụng cụ Pipette pasteur Ống nghiệm Phễu lọc Giấy lọc Cân phân tích Kẹp ống nghiệm Micropipette loại 10 – 100 µl Micropipette loại 100 – 1000 µl Đầu tipe Bình môi trường 500 ml Chai môi trường 100 ml Cốc thủy tinh 1000ml Cốc thủy tinh 100ml Đĩa nhựa Eppendoff Que trang Dao cấy Ống trụ kim loại rỗng (d = 6 mm) Đèn cồn Bông không thấm Bông thấm Parafilm 2.2.5. Hóa chất, dung môi Môi trường nuôi cấy và tăng sinh Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Dung môi: ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 50%, Dimethylsulfoxid (DMSO), nước cất (Việt Nam).
  • 36. Đồ án tốt nghiệp 25 Hóa chất Ciprofloxacin 500 mg (Thái Lan). H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform, NaCl. Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2) 10%. Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu Tiến hành thu những mẫu Hoa Sứ trắng nở hoàn toàn, không héo. Sau đó, rửa sạch, để ráo rồi sấy khô đến trọng lượng không đổi và xay mẫu. Mẫu sau khi được xay thành bột được bảo quản trong các túi nhựa ở nhiệt độ 4o C để tiến hành tách chiết cao. 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật Tách chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan các hợp chất trong cây bằng phương pháp chiết ngâm và lắc để phá vỡ mẫu ở nhiệt độ thường. Sau đó thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi theo thể tích nhất định để tách chiết các hợp chất có trong cây nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây. Cách tiến hành: Mẫu hoa Sứ được ngâm trong dung môi theo tỷ lệ 1:20 để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được lắc ở 150 vòng/phút trong khoảng 18 – 24 giờ. Sau đó đem đi lọc để thu dịch chiết. Tiếp tục lặp lại 3 lần cho đến khi dịch lọc trong suốt. Tiến hành cô cách thủy ở 70o C để loại bỏ dung môi và thu cao. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở - 4o C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
  • 37. Đồ án tốt nghiệp 26 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5o C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4o C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được bảo quản trong tủ lạnh ở 4o C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15o C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
  • 38. Đồ án tốt nghiệp 27 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Cách tiến hành: Môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút ở 1 atm. Tiến hành hút 100µl dịch vi khuẩn khảo sát vào 20ml môi trường TSB trong đều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên sẽ làm đục môi trường. Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (cfu/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 . Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
  • 39. Đồ án tốt nghiệp 28 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng ức chế (mm). Cách thực hiện: Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 10-6 vào đĩa chứa môi trường TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa cho đến khi khô hoàn toàn. Sau đó đục lỗ thạch để tạo giếng với đường kính 6 mm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)1% theo nồng độ khảo sát. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch và dùng paraflim quấn xung quanh đĩa. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 37o C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. (Ramakrishnan, 2011). 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Sứ trắng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.3.7.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào
  • 40. Đồ án tốt nghiệp 29 và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O. Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.3.7.2. Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ 2.3.7.3. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.
  • 41. Đồ án tốt nghiệp 30 Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 2.3.7.5. Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất. Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.3.7.6. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1.5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.7.7. Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen. Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng.
  • 42. Đồ án tốt nghiệp 31 2.3.7.8. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành màu nâu đỏ đậm là triterpenoid. 2.3.7.9. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statistical Analysis System 9.4 (SAS). Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.
  • 43. Đồ án tốt nghiệp 32 2.4. Bố trí thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng. Thuyết minh quy trình: Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi thu được rửa sạch và sấy khô ở 40o C. Sau đó, xay nhuyễn thành bột. Tiến hành cân 40 g bột Hoa Sứ trắng và ngâm trong 800 ml các loại dung môi khảo sát (tỉ lệ 1 : 20 (w/v)) ở nhiệt độ phòng. Đối với dung môi nước cất: mẫu được ngâm với nước cất (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) chứa trong erlen thủy tinh. Cứ mỗi 4 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm và lọc theo cách như trên. Thu tất cả dịch lọc và cô cách thủy ở 70o C để thu nhận cao. Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu với ethanol (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) ở các nồng độ 50%, 70%, 96% trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt Mẫu Hoa Sứ trắng Tách chiết cao bằng các dung môi khác nhau Xử lý mẫu Đánh giá hàm lượng thu hồi của các loại cao chiết Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Định tính một số thành phần hóa học Đánh giá kết quả
  • 44. Đồ án tốt nghiệp 33 dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70o C để thu nhận cao chiết. Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Tiến hành đánh giá hàm lượng thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: H (%) = 𝑚1−𝑚0 m x 100 Trong đó: H: hàm lượng cao thu được (%) m1: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g) m0: khối lượng cốc ban đầu (g) m: khối lượng mẫu ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) Mẫu Hoa Sứ trắng Xử lý mẫu Ngâm dung môi (1:20) (w/v) trong 24 giờ Cô cách thủy 70o C Lọc tinh Cao chiết Đánh giá hàm lượng thu hồi Bã
  • 45. Đồ án tốt nghiệp 34 Sau khi xác định hàm lượng thu hồi các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 4o C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng Sau khi thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau, tiến hành quy trình khảo sát hoạt tính. Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong môi trường TSB Lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ Đo OD600nm Pha loãng về 106 cfu/ml Cấy trang trên môi trường TSA Đục lỗ (d = 6 mm) PrAEE Nồng độ 200 mg/ml Ủ 37o C trong 24 giờ Đo đường kính vòng kháng Hút 100 µl DMSO Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE
  • 46. Đồ án tốt nghiệp 35 Thuyết minh quy trình: Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ trắng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 20 ml môi trường TSB (riêng đối với các chủng Vibrio spp. thì bổ sung thêm 1,5% NaCl). Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha cho vào đĩa thạch TSA và trang đều. Dùng ống trụ kim loại có đường kính d = 6 mm, đục 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch. PrAEE được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 200 mg/ml. Hút 100 μl dịch cao chiết cho vào các giếng trong đĩa môi trường TSA. Các đĩa thạch được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó đem ủ ở 37o C trong vòng 24 giờ và đọc kết quả. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 2.4.3 Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Dựa vào quy trình Hình 2.8 có thể chia cao chiết Hoa Sứ trắng làm 2 phần Phần thứ nhất: Cao chiết Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành định tính alkaloid. Phần thứ hai: Cao Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho tan hoàn toàn, sau đó tiến hành pha loãng và lọc dung dịch qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch này đem phân tích, định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, steroid, phenolic, tannin, cardiac glycoside.
  • 47. Đồ án tốt nghiệp 36 Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng a) Định tính thành phần carbohydrat - Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Barfoed b) Định tính thành phần saponin Cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% Hòa tan trong dung dịch DMSO 1% Lọc Lọc Dịch trong Định tính thành phần hóa học Dịch trong Định tính thành phần hóa học Alkaloid Carbohydrate Saponin nn Cardiac glycoside Flavonoid Hợp chất Phenolic Tannin Steroid Amino acid
  • 48. Đồ án tốt nghiệp 37 - Thử nghiệm Foam (tạo bọt) c) Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer - Thử nghiệm Dragendorff - Thử nghiệm Hager - Thử nghiệm Wagner d) Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal - Thử nghiệm Keller Killiani e) Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline - Thử nghiệm Ferric chloride f) Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Lead acetate - Thử nghiệm Gelatin g) Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride - Thử nghiệm Lead acetate h) Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski - Thử nghiệm Libermann Burchard i) Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhydrin
  • 49. Đồ án tốt nghiệp 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70o C. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng từ các dung môi được trình bày trong hình 3.1 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau Dựa vào Hình 3.1 nhận thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Tuy cùng quy trình tách chiết nhưng hàm lượng thu hồi cao của các loại dung môi từ Hoa Sứ trắng không giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,01). Mẫu Hoa Sứ trắng được tách chiết bằng dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng trung bình là 36,27%. Kế đến là dung môi ethanol 50% và 70% với hàm lượng trung bình lần lượt là 33,63% và 26,97%. Cuối cùng hàm lượng thu hồi cao thấp nhất là của dung môi ethanol 96% là 18,10%.
  • 50. Đồ án tốt nghiệp 39 Trong nghiên cứu này, việc sử dụng các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như flavonoid, alkaloid, glycoside, saponin, tannin,... (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này có thể bốc hơi nhanh trong quá trình cô mẫu. Ngoài ra nó cũng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân cực. Theo các nghiên cứu liên quan đến việc khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi EtOH 70% để tiến hành tách chiết cao vì EtOH 70% có khả năng tách chiết rất nhiều chất có hoạt tính kháng khuẩn ra khỏi thực vật (Wendakoon và ctv, 2012). Với hàm lượng thu hồi của 4 loại dung môi khác nhau từ Hoa Sứ trắng thì nước là dung môi cho hàm lượng cao nhất nhưng chưa thể khẳng định rằng nước là dung môi có hoạt tính sinh học mạnh nhất đối với cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Do đó, cần phải đánh giá các hoạt tính sinh học mới có thể kết luận được dung môi tốt nhất cho quá trình tách chiết cao. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng Với mục tiêu nghiên cứu là chọn ra dung môi thích hợp để tách chiết cao có hoạt tính sinh học cao nhất từ mẫu Hoa Sứ trắng nên chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi tách chiết khác nhau đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày ở các Hình 3.2, Hình 3.4, Hình 3.6, Hình 3.8, Hình 3.10, Hình 3.12, Bảng 3.1 và Bảng 3.2. 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli
  • 51. Đồ án tốt nghiệp 40 Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm 4 chủng: E. Coli, ETEC, E. coli 0208 và E. coli O157:H7. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn E. Coli thể hiện trên Hình 3.2. Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli của cao chiết EtOH 70%; B. Vòng ức chế E.0208 của cao chiết EtOH 96% A B Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli
  • 52. Đồ án tốt nghiệp 41 Dựa vào kết quả thí nghiệm trên Hình 3.2 nhận thấy rằng các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đều thể hiện hoạt tính kháng nhóm Escherichia coli ngoại trừ cao chiết nước. Đối với cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng trong nhóm vi khuẩn Escherichia coli với đường kính trung bình từ 8,83 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% có hoạt lực mạnh nhất đối với chủng E.coli với đường kính vòng ức chế 11,17 mm nhưng thấp hơn hoạt tính của kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện khả năng ức chế chủng E.0208 với đường kính vòng ức chế trung bình cao nhất là 9,83 mm. Trong khi đó, ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng E.coli và E.O157:H7 với đường kính vòng ức chế trung bình 8,33 mm và 8,83 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng nhóm vi khuẩn Escherichia coli, cụ thể là trên chủng ETEC có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 12 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính ức chế 2/4 chủng đó là chủng ETEC và E.0208 và có đường kính vòng ức chế trung bình lần lượt là 9,67 mm và 9,33 mm. Cao chiết EtOH 70% (50 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. Cao chiết EtOH 50% chỉ thể hiện hoạt tính ức chế đối với chủng ETEC ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng chế lần lượt là 10,50 mm và 9,33 mm. Từ kết quả phân tích trên cho thấy rằng trong 4 loại cao chiết khảo sát thì cao chiết EtOH 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất nhưng lại có phổ kháng khuẩn hẹp hơn cao chiết EtOH 96%. Theo kết quả nghiên cứu của Baghel (2010) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ lá của Plumeria rubra thì cao chiết này kháng được chủng vi khuẩn E.coli với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 16 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết EtOH từ Hoa Sứ trắng nhưng lại sử dụng nồng độ khảo sát cao hơn (250 mg/ml). Mặt khác, khi so sánh với kết quả của Khalil (2012), hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Catharanthus roseus (dừa cạn) ở nồng độ 100 mg/ml ức chế được chủng
  • 53. Đồ án tốt nghiệp 42 E.coli với đường kính vòng kháng 11 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 100 mg/ml. Từ kết quả nghiên cứu của Kalpana và ctv (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá cây Moringa oleifera trên chủng vi khuẩn E.coli cho thấy cao chiết Moringa oleifera ức chế chủng E.coli với đường kính trung bình là 8,3 mm thấp hơn cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở cùng nồng độ 200 mg/ml. 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng L. innocua và L. monocytogenes và kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3.4. Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%) Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. A B
  • 54. Đồ án tốt nghiệp 43 Kết quả Hình 3.4 cho thấy cao chiết EtOH 70% và EtOH 96% ức chế được cả 2 chủng vi khuẩn nhóm Listeria spp. ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml. Và cùng nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml nhưng cao chiết nước chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở chủng L.monocytogenes. Đối với cao chiết EtOH 50% thì không có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Listeria spp.. Từ Hình 3.4 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng ức chế trung bình 9,67 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Nhưng ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện đường kính vòng ức chế cao nhất đối với chủng L.innocua là 9,00 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế tốt nhất trên chủng L.monocytogenes, L.innocua với đường kính vòng ức chế lần lượt là 13 mm và 10,83 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao EtOH 70% ức chế chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng kháng cao nhất là 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ có hoạt tính ức chế được chủng L.monocytogenes và không ức chế được chủng L.innocua. Ở nồng độ 200 mg/ml cao chiết nước có hoạt lực tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) và có đường kính vòng ức chế là 11,33 mm, theo như kết quả thống kê thì không có sự khác biệt (P > 0,01). Cao chiết nước ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế trên chủng L.monocytogenes với đường kính vòng kháng là 9,17 mm. Như vậy, khi so sánh với các loại cao chiết thì cao EtOH 70% có hoạt lực mạnh nhất khi khảo sát trên nhóm vi khuẩn Listeria spp.. Điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn Listeria spp. khá nhạy cảm với cao chiết EtOH 70%, đặc biệt là đối với chủng L.monocytogenes. So với nghiên cứu của Rozman (2009) ở cây Rosmarinus offcinalis L. với nồng độ160 mg/ml có khả năng kháng khuẩn trên chủng L. monocytogenes với đường kính vòng kháng là 8 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở nổng độ 100
  • 55. Đồ án tốt nghiệp 44 mg/ml có đường kính vòng kháng khuẩn là 9,67 mm cao hơn so với cây Rosmarinus offcinalis L. ở nồng độ 160 mg/ml. 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm 4 chủng : S.dublin, S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium được trình bày ở Hình 3.6. A B Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp.
  • 56. Đồ án tốt nghiệp 45 Qua kết quả Hình 3.6 cho thấy rằng các loại cao chiết khảo sát đều có hoạt tính ức chế đối với nhóm Salmonella spp., cụ thể là cao chiết EtOH 96% ức chế được 4/4 chủng ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng ức chế từ 8,50 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml, EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất ở chủng S.typhii, tiếp đến là S.dublin và S.enteritidis với đường kính vòng ức chế trung bình từ 11 mm đến 11,33 mm tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao EtOH 96% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với chủng S.typhii là 10,67 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% không có hoạt tính ức đối với nhóm vi khuẩn Salmonella. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml ức chế được 3/4 chủng, ở nồng độ 50 mg/ml chỉ ức chế được 2/4 chủng vi khuẩn nhóm Salmonella spp.. Ở nồng độ 200 mg/ml hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất thể hiện ở chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 11,83 mm không có sự khác biệt với ciprofloxacin về mặt thống kê (P > 0,01). Cao chiết EtOH 70% (100 mg/ml) có hoạt tính ức chế cao nhất đối với chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 9,83 mm và ở nồng độ 50 mg/ml có đường kính vòng ức chế là 8,17 mm. Điều này chứng tỏ, ở nồng độ càng cao thì hoạt lực của cao EtOH 70% càng mạnh. Đối với cao chiết EtOH 50% (200 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với chủng S.typhimurium nhưng lại ức chế được 3 chủng còn lại và đường kính vòng ức chế cao nhất là 12,33 mm đối với chủng S.dublin và tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được chủng S.dublin, có đường kính vòng ức là 10,83 mm và không có sự khác biệt với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Đối với cao nước chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với chủng S.enteritidis, ở nồng độ 200 mg/ml thì cho kết quả tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01), ở nồng độ 100 mg/ml có đường kính vòng ức chế trung bình 8,67 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01).
  • 57. Đồ án tốt nghiệp 46 Dựa vào kết quả nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2015) cho thấy rằng hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ Plumeria rubra ở nồng độ 40 mg/ml có đường kính vòng ức chế đối với chủng S.typhii là 12 mm tương đương với kết quả thử nghiệm của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng với đường kính vòng ức chế là 11,33 mm. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Nirosha (2013) cho thấy cao chiết ethanol từ lá Carica papaya L. có khả năng ức chế chủng vi khuẩn S.typhii ở nồng độ 250 mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm thấp hơn hoạt tính của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 200 mg/ml. 3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm 3 chủng: Shi.boydii, Shi.flexneri, Shi. Sonnei được trình bày ở Hình 3.8. Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp.
  • 58. Đồ án tốt nghiệp 47 Dựa vào kết quả trên hình 3.8 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% (200 mg/ml và 100 mg/ml) ức chế được 3/3 chủng vi khuẩn nhóm Shigella spp.. Ở nồng độ 200 mg/ml, cao chiết EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng ức chế trung bình 11 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính mạnh nhất đối với chủng Shi.flexneri và có đường kính vòng ức chế 10,17 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin về mặt thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 50 mg/ml chỉ ức chế được chủng Shi.flexneri với đường kính vòng ức chế là 8,83 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế được 3/3 chủng vi khuẩn nhóm Shigella spp., ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng cao nhất đối với chủng Shi.sonnei với đường kính vòng ức chế trung bình là 12,50 mm thấp hơn kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Trong khi đó, cũng ở nồng độ 200 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được 2 chủng Shi.boydii và Shi.flexneri với đường kính vòng ức chế lần lượt là 12,17 mm và 11,67 mm tương đương với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được chủng Shi.boydii với đường kính vòng kháng cao nhất là 10,17 mm và ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế với đường kính vòng ức chế cao nhất là 9,00 mm tương đương với chủng Shi.sonnei. Đối với cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được ở Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B)