Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI
ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN
ENZYME CHITINASE
Ngành: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện: Trần Đức Vinh
MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 7/2014
2. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ
Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt
4 năm đại học.
Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người đã nhiệt tình,
tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi những kiến thức chuyên
ngành để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật
tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tôi cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong
nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi.
Và cuối cùng, hơn ai hết, con xin cám ơn ba và mẹ, người đã hết lòng lo lắng, vất
vả để tạo điều kiện cho con đi học đến hiện nay và thực hiện ước mơ của mình. Con xin
cám ơn ba mẹ rất nhiều.
3. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu
và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công
trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Trần Đức Vinh
4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................4
1.1. Giới thiệu về Trichoderma...............................................................................4
1.1.1. Phân loại ...................................................................................................5
1.1.2. Lịch sử phát triển ......................................................................................5
1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma............................................................6
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................6
1.1.3.2. Đặc điểm sinh trƣởng.........................................................................8
1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma....................................9
1.1.4. Vai trò sinh thái.......................................................................................10
1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam...................10
1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp .....................................12
1.1.6.1. Bảo vệ thực vật.................................................................................12
1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng...........................................................12
1.1.6.3. Trong xử lí môi trƣờng.....................................................................13
1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm .........................................................13
1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi ........................................................14
1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. ........................................14
1.2.1. Cạnh tranh ..............................................................................................14
1.2.2. Kí sinh .....................................................................................................15
1.2.3. Bất hoạt enzyme của nấm bệnh...............................................................16
1.2.4. Tăng khả năng kháng của thực vật .........................................................16
1.3. Những nghiên cứu về enzyme chitinase ........................................................17
1.3.1. Giới thiệu về chitin..................................................................................17
1.3.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin........................................................17
5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.3.1.2. Lịch sử phát hiện của chitin .............................................................18
1.3.1.3. Sự phân bố của chitin trong tự nhiên ..............................................19
1.3.1.4. Điều chế chitin .................................................................................20
1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase.................................................................20
1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố....................................................................20
1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase.........................................................22
1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase ...........................................................23
1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase........................................................25
1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase .......................................................26
1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp
enzyme chitinase từ vi sinh vật .....................................................................28
1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ƣu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase
từ Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới...............................30
1.4 Sơ lƣợc về bệnh thán thƣ trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp
...............................................................................................................................32
1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt ...............................................................................32
1.4.1.1 Triệu chứng .......................................................................................32
1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh......................................................................33
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP......................................................34
2.1 Thời gian và địa điểm......................................................................................34
2.1.1 Thời gian ..................................................................................................34
2.1.2 Địa điểm...................................................................................................34
2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu...............................................................................34
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ...................................................................................34
2.2.1.1 Thiết bị ..............................................................................................34
2.2.1.2 Dụng cụ .............................................................................................34
2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu......................................................35
2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu..........................................................35
2.2.3.1 Môi trƣờng PDA ...............................................................................35
2.2.3.2 Môi trƣờng định tính sự sinh tổng hợp chitinase..............................36
6. Đồ án tốt nghiệp
iii
2.2.3.3 Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase ...36
2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................38
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
Trichoderma......................................................................................................38
2.3.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trƣờng thạch PDA....38
2.3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma trên môi trƣờng thạch .............................................................38
2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu .......40
2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase.....................41
2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase .........................42
2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS................42
2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn .........................................................45
2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................46
2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................46
2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................48
2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng
hợp chitinase của Trichoderma harzianum ......................................................49
2.3.11 Khảo sát sự ảnh hưởng các nguồn đường và hàm lượng đến sự sinh
tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum ..............................................51
2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Collectotrichum
sp .......................................................................................................................52
2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................53
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................53
3.1 Kết quả khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi
trƣờng thạch có cơ chất cảm ứng chitin 1%..........................................................53
3.2 Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum..................................................................55
3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum........................................................................................60
7. Đồ án tốt nghiệp
iv
3.4 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum........................................................................................62
3.5 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
của Trichoderma harzianum .................................................................................65
3.6 Ảnh hƣởng của nguồn đƣờng bổ sung đến sự sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum........................................................................................67
3.7 Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ
Trichoderma harzianum........................................................................................68
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................72
4.1 Kết luận ...........................................................................................................72
4.2 Kiến nghị.........................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................73
8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DNS Dinitrosalicylic acid
GlacNac N-acetyl glucosamine
kDa Kilo Dalton
MT Môi trƣờng
NSC Ngày sau cấy
PDA Potato D-glucose agar
9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC BẢNG
STT BẢNG NỘI DUNG TRANG
1 3.1
khả năng phân giải chitin của Trichoderma
harzianum trên môi trƣờng định tính sinh tổng hợp
chitinase.
56
2 3.2
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh môi
trƣờng nuôi cấy.
58
3 3.3
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
của nguồn cơ chất cảm ứng
63
4 3.4
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
ngày nuôi cấy
65
5 3.5
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
của pH môi trƣờng nuôi cấy
71
6 3.6
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
của nguồn dƣờng và tỷ lệ đƣờng bổ sung.
74
7 3.7 Đƣờng kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy ở 2
mẫu thí nghiệm
70
8 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua các ngày 80
10. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC HÌNH
STT HÌNH NỘI DUNG TRANG
1 1.1
Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi
trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA).
9
2 1.2 Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum 10
3 1.3
Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính
hiển vi quang học x100
11
4 1.4
Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của
Trichoderma spp. ở Việt Nam và trên thế giới.
14
5 1.5 Cấu trúc phân tử của chitin 20
6 1.6 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 26
7 1.7
Quả ớt bình thƣờng và quả ớt bị bệnh thán thƣ do
Collectotrichum spp.
35
8 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 43
9 3.1
Vòng phân giải chitin của T. harzianum trên môi
trƣờng dinh dƣỡng chứa chitin 1% sau 2 ngày nuôi
cấy.
54
10 3.2
Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase
theo môi trƣờng nuôi cấy.
55
11 3.3
Môi trƣờng A, B trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngàyvới
bào tử Trichoderma harzianum.
58
11. Đồ án tốt nghiệp
viii
12 3.4
Môi trƣờng C, D trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngày với
bào tử Trichoderma harzianum.
59
13 3.5
Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase
theo cơ chất cảm ứng.
60
14 3.6
Biều đổ đƣờng thể hiện sự biến đổi của hoạt tính
chitinase theo thời gian nuôi cấy
63
15 3.7
Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của chitinase theo pH
môi trƣờng ban đầu
65
16 3.8
Mặt sau (a) và mặt trƣớc (b) của tản nấm
Collectotrichum sp sau 3 ngày ủ với enzyme chitinase.
77
17 3.9
Mặt sau (c) và mặt trƣớc (d) của tản nấm
Collectotrichum sp sau 6 ngày ủ với enzyme chitinase.
77
12. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Trichoderma spp. là tác nhân kiếm soát sinh học có hiệu quả, đã có nhiều
nghiên cứu cho thấy khả năng đối kháng của chúng với các loài nấm hại thực vật
bằng các cơ chế khác nhau. Trong số đó, cơ chế sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có
một vai trò quan trọng, đặc biệt là hệ enzyme chitinase. Đây là hệ enzyme có khả
năng phân hủy chitin- thành phần cấu tạo nên vách tế bào của đa số loài nấm hại
cây trồng và kể cả côn trùng, từ đó ức chế sự phát triển của dịch bệnh. Ngoài ra,
chitinase còn nhiều ứng dụng có ý nghĩa khác nhƣ là dùng để xúc tác để tạo ra các
hợp chất có tác dụng giúp tăng sản xuất dịch nhầy, cải thiện khả năng bôi trơn khớp
để giảm triệu chứng của thoái hóa khớp, để tổng hợp các hợp chất
chitooligosaccharides… Trong các loài Trichoderma spp. thì Trichoderma
harzianum đƣợc chứng minh là có khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt hơn cả.
(Theo M.H. Et-Katatny, 2000)
Hiện nay, dân số ngày càng gia tăng một cách nhanh chóng, đi cùng là nhu
cầu về lƣơng thực cũng gia tăng theo. Song đối với khu vực khí hậu nhiệt đới gió
mùa nhƣ Việt Nam lại rất đa dạng về các loại nấm bệnh gây hại thực vật và chúng
phát triển rất nhanh trong nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi thế này, gây rất nhiều khó
khăn cho việc trồng trọt và ảnh hƣởng đến bảo quản sau thu hoạch. Để bảo vệ năng
suất cây trồng và chất lƣợng nông sản sau thu hoạch, nông dân sử dụng các chất
hóa học để ngăn cản sự tấn công của nấm bệnh. Ngay cà khi dùng thuốc diệt nấm
chuyên dụng thì hàng năm trên thế giới nấm bệnh thực vật vẫn gây ra thiệt hại 15%
sản lƣợng thu hoạch. Hơn nữa, khi sử dụng thuốc hóa học một cách chủ quan lại
chính là con dao hai lƣỡi, bởi các chất hóa học là nguy cơ tiềm tàng mà ngày nay
các nhà khoa học phát hiện ra chính chúng gây ra các bệnh ung thƣ và một số bệnh
lý nguy hiểm khác.
Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã nghiên cứu một thời gian dài
và đã tìm ra đƣợc một chìa khóa thích hợp nhất. Đó chính là những hợp chất sinh
13. Đồ án tốt nghiệp
2
học, thân thiện với môi trƣờng cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
Và hợp chất sinh học có thể ứng dụng đó chính là enzyme chitinase, đƣợc sinh ra từ
một số vi sinh vật nhất định.
Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài “Xác định
một số điều kiện nuôi cấy tối ƣu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận
enzyme chitinase.”
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm ra đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu để thu nhận enzyme chitinase từ
Trichoderma harzianum.
3. Nội dung nghiên cứu
Định tính khả năng sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma
harzianum.
Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, thời gian nuôi cấy đến sự
tổng hợp chitnase từ Trichoderma harzianum .
Khảo sát ảnh hƣởng của một số nguồn cơ chất cảm ứng, pH môi trƣờng,
nguồn đƣờng bổ sung đến khả năng sinh hoạt tính enzyme chitinase.
Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ
Trichoderma harzianum.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1 Phần mềm thống kê, tính toán
- Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010.
- Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.
4.2 Kết quả đạt được của đề tài
- Tìm ra đƣợc các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng Trichoderma
harzianum sinh tổng hợp chitinase.
14. Đồ án tốt nghiệp
3
5. Kết cấu đồ án
- Chƣơng 1: Tổng quan
- Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp
- Chƣơng 3: Kết quả và biện luận
- Chƣơng 4: Kết luận và đề nghị
15. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về Trichoderma
Trichoderma là một trong số ít những vi nấm có lợi, điều này đã đƣợc chứng
minh và chúng đã đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học đối với những
nấm gây bệnh (Chet, 1987; Chet et al., 1998). Trichoderma có thể phát triển mạnh
trong các thảm thực vật.
Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều
loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác…), nhiều loài trong chi này có khả
năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi
nấm đƣợc nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng đƣợc tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ
độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới
ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã
chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm Trichoderma
khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000).
Khi cộng sinh với cây, Trichoderma sẽ giúp cây tránh đƣợc khỏi sự xâm hại
của các loài nấm gây bệnh khác bằng các cơ chế nhƣ tấn công, ký sinh và lấy chất
dinh dƣỡng từ các loài nấm hại khác. Và yếu tố quan trọng để giúp chúng có thể
xâm nhập vào bên trong nấm hại chính là khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme
ngoại bào.
16. Đồ án tốt nghiệp
5
1.1.1. Phân loại
Giới (Kingdom): Nấm (Fungi)
Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota)
Lớp (Class): Sordariomycetes
Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae
Bộ (Order): Hypocreales
Họ (Family): Hypocreaceae
Chi (Genus): Trichoderma
Loài (Species) : Trichoderma spp.
1.1.2. Lịch sử phát triển
Chủng nấm Trichoderma đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794,
vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả đƣợc 3 loài:
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết đƣợc 7 loài
nấm Trichoderma đó là:
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
4- Trichoderma aureum Pers. (1796).
17. Đồ án tốt nghiệp
6
5- Trichoderma laeve Pers. (1796).
6- Trichoderma dubium Pers. (1801).
7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801).
Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã
phát hiện thêm khoảng 90 loài.
Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến
năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma đƣợc mô tả.
1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Hình 1.1: Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dịch
chiết khoai tây (PDA).
(Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com)
Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh
sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp
thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi
tăng trƣởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân
nhánh mạnh, thƣờng hình thành ở dạng gần nhƣ vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm
thƣờng mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ.
18. Đồ án tốt nghiệp
7
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở
cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,
không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy.
Hình 1.2: Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum
(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma)
Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu
vàng. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình
cầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài.
19. Đồ án tốt nghiệp
8
Hình 1.3: Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính hiển vi quang học
x100
1.1.3.2. Đặc điểm sinh trưởng
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn
hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng đƣợc
là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thƣờng có mặt trong môi trƣờng nuôi cấy loài
nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trƣờng có nhiều
dinh dƣỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh
trƣởng của Trichoderma. Nhƣng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trƣởng và phát
triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trƣờng nuôi cấy không nên có
sự có mặt của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hƣởng phần nào đến sự sinh trƣởng của
Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300
C [13], có một vài loài
Trichoderma tăng trƣởng đƣợc ở 350
C. Một số ít phát triển tốt ở 400
C (Samuels,
2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhƣng không thể phát
triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng
Trichoderma có tốc độ tăng trƣởng nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc đạt trung bình 2
cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982).
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác
nhau. Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống
trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum
20. Đồ án tốt nghiệp
9
thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thƣờng phân bố ở vùng có khí
hậu ấm áp.
Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều
kiện môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo dƣới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất
hiện trong điều kiện sáng. Bào tử trên môi trƣờng thạch agar dƣới ánh sáng 85 Lux
trong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio
cảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dƣới ánh sáng ban ngày trong
khoảng 3 phút hoặc dƣới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố
Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bƣớc sóng từ 380 nm - 440 nm, và
không hình thành bào tử ở bƣớc sóng dƣới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử
cảm quang bị hạn chế phát triển dƣới sự có mặt của các hóa chất nhƣ: azaguanine,
5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum
bromide,… các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây
là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T.
hazianum, T. viride và T. virens ở trong cả môi trƣờng lỏng và rắn có acide thích
hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trƣờng trung tính.
1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma
Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của
Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập đƣợc chất độc kết tinh từ sản phẩm
trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4).
Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6),
đƣợc sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp., còn sinh
tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh:
trichlorofore từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum.
Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn
sinh tổng hợp đƣợc một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh nhƣ: exo và
endoglucanse, cellobiose và chitinase.
21. Đồ án tốt nghiệp
10
1.1.4. Vai trò sinh thái
Ngoài tự nhiên Trichoderma thể hiện rất rõ vai trò sinh thái của chúng nhƣ:
ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh nhờ cơ chế kí sinh, phân giải các nguồn
chất thải hữu cơ nhƣ cellulose từ gỗ, lá,…
Theo Garret (1956), Trichoderma có đƣợc những khả năng trên là do các đặc
tính sau:
Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm nhanh.
Có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải cao.
Có khả năng tạo kháng sinh, chịu đƣợc cả kháng sinh.
1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam
Nấm Trichoderma đã đƣợc biết đến từ những năm 1920 và đƣợc xem là yếu
tố kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh trên cây trồng. Cho đến gần đây, các cơ
chế để kiểm soát đã đƣợc biết đến, bao gồm khả năng kí sinh, kháng nấm, cạnh
tranh về dinh dƣỡng, khả năng tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh. Nấm
Trichoderma xâm chiếm các lớp biểu bì rễ, lớp vỏ bên ngoài và đồng thời giải
phóng các phân tử chất có hoạt tính sinh học. Trichoderma spp. bắt đầu đƣợc ứng
dụng trong nông nghiêp để kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu về tính kí sinh
cũng đã chứng minh rằng loài nấm này tạo ra một hỗn hợp đa dạng các enzyme
kháng nấm, bao gồm: chitinase và β-1,3-glucanase. Các enzyme này cùng với một
số enzyme khác, cùng với hợp chất kháng nấm hỗ trợ nhau trong quá trình chống lại
các loài nấm bệnh.
Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma đƣợc đƣa vào ứng dụng
tính đối kháng nấm bệnh trên một số cây trồng. Sản phẩm Trichoderma 2000
(Israel) chứa Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani,
Sclerotium rolfssim Pythium. Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm
Trichoderma harzianum đối kháng với nhiều nấm bệnh. Sản phẩm Ecofit (India)
chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium,
22. Đồ án tốt nghiệp
11
Rhizoctonia, Macrophomia, Phytophthora trên cây bông vải, thuốc lá, cao su,.. và
nhiều loại rau. Sản phẩm BINAB-T-WP (Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma
harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống các bệnh ở rễ cây.
Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm khác ở nhiều nƣớc trên thế giới đƣợc ứng dụng
rộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI,
2001).
Ở Việt Nam, các tỉnh phía nam đang lƣu hành khoảng 30 sản phẩm có chứa
Trichoderma của nhiều công ty khác nhau, các sản phẩm này đã và đang góp phần
hạn chế các nấm bệnh trên cây trồng nhƣ hồ tiêu, ca cao, cà chua, dua hấu, dƣa leo,
cam quýt (Quang Ngọc, 2009). Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Cần Thơ đã phối
hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản phẩm phòng trừ bệnh hiệu quả theo
đối tƣợng nhƣ: Tricô-ĐHCT có khả năng phòng trừ bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau
màu do Fusarium; Tricô-Lúa Von phòng trừ bệnh lúa Von do Fusarium
moniliforme; Tricô- Nấm Hồng trị bệnh do Phytophthora trên sầu riêng, tiêu, cao
su,.. Tricô- Khóm trị bệnh do Phytophthora, Fusarium gây ra (Dƣơng Minh và cộng
sự, 2010).
Hình 1.4: Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của Trichoderma spp. ở Việt
Nam và trên thế giới.
23. Đồ án tốt nghiệp
12
1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp
1.1.6.1. Bảo vệ thực vật
Một số bệnh liên quan đến các bộ phận rễ cây rất khó trị bằng biện pháp hóa
học truyền thống, vì không thể tác động lên toàn bộ rễ bằng thuốc diệt nấm.
Trichoderma spp. đƣợc biết đến nhƣ là một tác nhân đối kháng lại với các nấm bệnh
của cây trồng và đã đƣợc ứng dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học cho cây trồng
trong nhà kính và ngoài ruộng, chúng có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh
khác nhau nhƣ: Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Pythium spp., Slecrotium
rofsii.
Một số loài Trichoderma đƣợc sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là
T. koningii, T. harzianum, T. viride, T. hamatum,...
1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa. Đã có
những công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningiii kích thích
sự nảy mầm và tăng trƣờng của cây. Đối với các loài đƣợc trồng trong nhà kính, T.
harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng
hoa.
Trichoderma đẩy mạnh tốc độ tăng trƣởng của cây trồng nhờ khả năng giúp
cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng bắp
đƣợc bổ sung T. harzianum T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lƣợng đạm ít hơn 40% so với
rễ không có T-22.
Trichoderma cải thiện cấu trúc đất và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát
triển của vi sinh vật nốt sần cố định Nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi
sinh vật hữu ích trong đất, tăng độ phì nhiêu và dinh dƣỡng cho cây trồng.
Tăng sức đề kháng cho cây trồng, một số chủng T. harzianum còn có thể
xâm nhập vào mô tế bào cây, làm tăng khả năng chống chịu bệnh của cây.
24. Đồ án tốt nghiệp
13
Các chủng nấm Trichoderma spp.trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh
không những cung cấp một nguồn phân bón xanh, hiệu quả mà còn góp phần kiểm
soát các bệnh hại cây trồng và tạo ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên.
1.1.6.3. Trong xử lí môi trường [17]
T. harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng, đã
đƣợc chứng minh có khả năng phân giải hiệu quả ciliatin, glycophosphat và amino
methylphosphonic.
T. harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật trƣờng đại học California) có thể
phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol.
T. harzianum CCT-4790 có thể phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất
sau 24 giờ, đây đƣợc xem nhƣ là một liệu pháp rất có tiềm năng trong việc xử lí các
hóa chất gây độc hại trong đất và trong đầm lầy.
1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm
Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã đƣợc khảo sát và cho
thấy có thể làm tăng hƣơng vị của men rƣợu. Đồng thời, các loại enzyme glucanase
và glucosidase đƣợc tiết ra có khả năng thủy phân các liên kết glycoside trong liên
kết glycoside-terpen từ đó giải phóng các hợp chất terpen, tạo mùi thơm đặc trƣng
cho sản phẩm.
Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thƣờng chứa đầy đủ hàm lƣợng β-amylase
nhƣng lại thiếu α-amylase, cho nên ngƣời ta phải bổ sung vào bột một lƣợng α-
amylase nhất định có thể lấy từ đại mạch nảy mầm, vi khuẩn hay nấm. Trong đó
nấm đƣợc xem là nguồn α-amylase phong phú và tốt nhất. Các nhà khoa học đã
chuyển thành công gen mã hóa α-amylase từ Trichoderma vào nấm men bánh mì
dƣới sự kiểm soát của promoter ACT1. Bánh mì tạo ra có kích thƣớc lớn hơn và ruột
bánh mì cũng mềm hơn, chậm cứng hơn làm kéo dài thời gian bảo quản.
25. Đồ án tốt nghiệp
14
1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi
Hiện nay trên thị trƣờng có chế phẩm EconaseTM
với các enzyme có nguồn gốc
từ Trichoderma reesei bổ sung vào thức ăn của gia súc, với các ƣu điểm:
- Thành phần dinh dƣỡng linh động hơn.
- Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền.
- Dễ tiêu hóa
- Làm tăng giá trị năng lƣợng của ngũ cốc
- Giảm lƣơng rác thải cho môi trƣờng
Ngoài ra còn có chế phẩm AvizymeTM
cũng chứa nhƣng ƣu điểm tƣơng tự
EconaseTM
thích hợp cho gia cầm trong giai đoạn đẻ trứng. PorzymeTM
là thƣơng
hiệu của một hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, protease, amylase bổ
sung vào khẩu phần ăn của lợn con vừa thôi bú. Tất cả enzyme này đều bắt nguồn
từ Trichoderma.
1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. [17]
Trichoderma spp. Phát triển nhiều cơ chế để ngăn chặn sự tấn công của các
loài nấm khác và hỗ trợ cho cây và rễ cây phát triển. Các cơ chế này bao gồm cạnh
tranh về không gian và dinh dƣỡng (Elad et al., 1999), kí sinh (Haran et al., 1996;
Lorito et al., 1996), sản sinh ra những hợp chất mang tính ức chế (Sivasithamparam
và Ghisalberi, 1998), bất hoạt các enzyme của tác nhân gây bệnh (Roco và Perez,
2001) và tăng khả năng kháng của thực vật (Kapulnik và Chet, 2000).
1.2.1. Cạnh tranh
Các loài Trichoderma thƣờng đƣợc xem là những đối thủ cạnh trạnh mạnh
mẽ (Samuels, 1996), chúng phát triển mạnh và nhanh chóng sử dụng các nguồn cơ
chất dinh dƣỡng để ức chế khả năng phát triển của nấm bệnh, ví dụ nhƣ Fusarium
spp. (Papavizas, 1985). Những loài Trichoderma, có thể bổ sung trực tiếp vào đất,
hay xử lí với hạt giống sẽ phát triển theo sự sinh trƣởng của hệ thống rễ của cây
đƣợc xử lí (Ahmad và Baker, 1987). Đất đƣợc xử lí với bào tử nấm T. harzianum sẽ
26. Đồ án tốt nghiệp
15
lấn áp các nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum và F. oxysporum f. sp.
melonis. Cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống đƣợc xem nhƣ là một cơ chế,
mặc dù nó không đƣợc chứng minh là hoạt động riêng rẽ (Silvan và Chet, 1989).
Ozbay và Newman (2004) đã chỉ ra rằng Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và
Chalara elegans bị ức chế mạnh mẽ bởi Trichoderma trong điều kiện in vitro. Cả
tác nhân gây bệnh và Trichoderma điều phát triển. Các nhà nghiên cứu quan sát
thấy rằng hoạt động ức chế của Trichoderma với nấm bệnh có liên quan đến nồng
độ và sự tích lũy CO2.
1.2.2. Kí sinh
Cách thức tƣơng tác và kí sinh sợi nấm của các loài Trichoderma với các tác
nhân gây bệnh trong đất đã đƣợc biết đến từ lâu (Chet et al., 1981; Denis và
Webster, 1971).Trichoderma phát triển hƣớng về sợi nấm của các nấm khác và
cuộn tròn lấy chúng, sau đó phân giải thành tế bào của mục tiêu bằng cách tiết ra
những enzyme phân giải khác nhau. Quá trình kí sinh này giới hạn sự phát triển và
hoạt động của các tác nhân gây bệnh thực vật.Trichoderma tấn công vào hệ sợi nấm
của mục tiêu sau khi cuộn lấy chúng và xâm nhập vào bên trong thành tế bào vật
chủ nhờ hệ phân giải.
Sự tƣơng tác kí sinh này mang tính đặc hiệu, Trichoderma sẽ nhận diện tính
hiệu từ vật chủ, rồi bắt đầu cuộn lấy vật chủ và xâm nhập chúng (Denis và Webster,
1971; Sivan và Chet, 1989). Hệ eznyme của Trichoderma giúp phân giải thành tế
bào vật chủ nhƣ β-1,3-glucanase và các enzyme phân giải chitin, đƣợc xem là các
enzyme chủ chốt trong hoạt động kí sinh này (Elad et al., 1982 Cherif và
Benhamou, 1990).
Endochitinase (42-kDa), chitobiosidase (40-kDa) và N-acetyl-b-D-
glucosamidase (73-kDa) từ T. atroviride chủng P1 và T. virens chủng 41 đƣợc công
bố là có khả năng ức chế đáng kể sự nảy mầm của bào tử và sự kéo dài sợi nấm của
nhiều nấm bệnh khác nhƣ Botrytis cinerea, Fusarium spp., Alternaria spp.,
Ustilago avenae, Uncinula necator và hầu nhƣ đối với tất cả các nấm mà thành
27. Đồ án tốt nghiệp
16
phần thành tế bào có chứa chitin (Di Pietro et al., 1993, Lorito et al., 1993, 1994,
1996; Schrimbock et al., 1994).
Nhiều enzyme đã đƣợc thu nhận và tinh sạch, khả năng ức chế sự nảy mầm
bào tử và kéo dài sợi nấm của nấm bệnh đã đƣợc kiểm nghiệm in vitro (Lorito et
al., 1998). Quan sát bởi kính hiển vi điện tử và kính hiển vi huỳnh quang cho thấy
rằng T. harzianumvà T. hamatum có khả năng kí sinh cà Sclerotium rolfsii và
Rhizoctonia solani. Nấm đối kháng tấn công tác nhân gây bệnh và tiết ra glucanase
và chitinase để thâm nhập vào bên trong thành tế bào vật chủ (Elad et al., 1983).
Trichoderma có thể sản sinh cellulase, β-1,3-glucanase và chitinase để mà phân giải
lớp glucan trong thành tế bào Pythium spp., chitin và glucan trong thành tế bào của
Rhizoctonia solani (Harman et al., 1980).
1.2.3. Bất hoạt enzyme của nấm bệnh
Bất hoạt enzyme của nấm bệnh là một cơ chế kiểm soát khác của
Trichoderma. Enzyme của Botrytis cinerea nhƣ là pectinase, cutinase, glucanase và
chitinase bị bất hoạt thông qua enzyme protease của chủng T39 tiết ra trên bề mặt
cây (Elad et al., 1999). Tác nhân gây bệnh thực vật Alternaria alternatacó thể tiết
enzyme endo-polygalacturonase và pectate lyase để phân giải các thành phần chứa
pectic của thành tế bào thực vật. Sự hiện hiện diện của Trichoderma harzianum làm
suy giảm 50% enzyme endo-polygalacturonase do nấm Alternaria alternata tiết ra
(Roco và Pertez, 2001).
Các loài Trichoderma khác hay các chủng phân lập khác thuộc mỗi loài có
thể khác nhau về khả năng kiểm soát sinh học. Do đó, việc phân lập và khảo sát các
loài Trichoderma tử các vùng khác nhau là rất quan trọng để tìm ra một loài hay
chủng thích hợp.
1.2.4. Tăng khả năng kháng của thực vật
Các chủng đặc trƣng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ,
sau đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều
này đƣợc xem nhƣ là phản ứng phòng vệ của cây. Khi bón T. harzianum vào rễ cây
28. Đồ án tốt nghiệp
17
đậu cho thấy rằng giảm đƣợc từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea
gây ra. Các nhà khoa học đã sử dụng T. harzianum T39 và chất benzothiadiazol để
kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng
T. harzianum T39 ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và
giảm đến 30% tổn thƣơng cho cây (Audenaert et al., 1998).
Theo Yedidia et al. (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có
liên quan đến rễ cây đƣợc xử lí với T. harzianum T-203. Những rễ đƣợc bổ sung
chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và perosidase
cao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ. Còn những cây dƣa leo đƣợc xử
lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ của
thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhƣng không giống với khi xử lí
bằng T. harzianum. Theo Khan et al., (2001) thì T. hamatum chủng 382 kích ứng
hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây
ra.
1.3. Những nghiên cứu về enzyme chitinase
1.3.1. Giới thiệu về chitin
1.3.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử của chitin
(Nguồn: http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/chitin.html)
29. Đồ án tốt nghiệp
18
Chitin (C8H13O5N)n gồm: 47,29% là C, 6,89% là N., 6,45% là H, 39,37% là
O. Chitin vốn đƣợc xem là một polymer sinh học nhiều thứ hai trong tự nhiên sau
cellulose, là một homopolysaccharide không hòa tan gồm các đơn phân là β-1,4-N-
acetylglucosamine.Chitin có thể đƣợc mô tả là 1 phân tử cellulose với một gốc
hydroxyl ở mỗi monomer đƣợc thay thế bởi một gốc acetyl amine, và chính sự khác
biệt đó làm tăng số lƣợng liên kết hidro giữa các polymer liền kề, tạo thành một
mạng lƣới khá vững chắc.
Chitin là một trong những thành phần quan trọng cấu tạo nên vách tế bào của
nhiều loài nấm bệnh thực vật cũng nhƣ lớp vỏ và biều bì của động vật chân đốt,
động vật giáp xác, côn trùng và động vật thân mềm. Chitin chiếm từ 22% đến 44%
thành phần cấu thành vách tế bào của nấm bệnh, và nó rất cần thiết cho cấu trúc của
sợi nấm (Peberdy, 1990). [17]
Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền nhờ vào các liên kết hidro ở trong và giữa
các mạch. Chitin không tan trong nƣớc, cồn, acid hay kiềm loãng và các dung môi
thông thƣờng khác. Nó chỉ tan trong các dung dịch nhƣ HCl đậm đặc, HNO3 đậm
đặc,…
Có 3 dạng chitin: α, β và γ. Dạng α, có nhiều trong vỏ cua và tôm, biểu bì
của côn trùng,… dạng này gồm các chuỗi đơn phân xuôi-ngƣợc xen kẽ nhau, dạng
sắp xếp này làm tăng tính bền của liên kết hidro, giúp cấu trúc ổn định hơn. Dạng β,
có trong động vật thân mềm nhƣ mực, gồm các chuỗi đơn phân song song. Trong
khi đó dạng γ gồm 2 sợi song song và một sợi song song xuôi-ngƣợc. Có thể chuyển
đổi từ dạng β sang α, sự chuyền đổi chỉ xảy ra theo một chiều. Dạng γ có thể
chuyển đổi thành α bằng cách xử lí với lithium thiocyanate.
1.3.1.2. Lịch sử phát hiện của chitin [11]
Năm 1811, một nhà khoa học ngƣời Pháp chuyên nghiên cứu về lịch sử của
tự nhiên, Henri Braconnot, đã phát hiện ra một hợp chất hữu cơ trong nấm rơm và
đặt tên cho nó là “fungine”.
30. Đồ án tốt nghiệp
19
Năm 1823, Odier tìm một chất tƣơng tự thế trong côn trùng, thực vật và đặt
tên cho nó là “chitine”
Năm 1843, Lassaigne chứng minh có sự hiện diện của Nitơ trong phân tử
chitin.
1.3.1.3. Sự phân bố của chitin trong tự nhiên [14]
Đối với prokaryote, chitin không hiện diện ở prokaryote mặc dù bản chất hóa
học nó cũng tƣơng tự cấu trúc khung polysaccharide của peptidoglycan. Gooday
(1995) đã công bố rằng chitin là một thành phần trong bào tử của Streptomyces.
Đối với vi nấm, hầu hết thành tế bào của vi nấm đều chứa chitin, chúng
chiếm 22%- 40% (Muzzarelli, 1977). Sự có mặt của chitin cùng với một số
polysaccharide khác đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu để phân loại nấm. Các sợi
polysaccharide có độ dài khác nhau phụ thuộc vào loài và vị trí tế bào (Gow và
Gooday, 1983).
Đối với nguyên sinh vật, chitin hiện diện trong nang, thành tế bào của một số
cilliates, amoebae, chrysophytes, tảo và trong gai của tảo cát, dạng tinh khiết nhất
của chitin đƣợc phân lập từ loài tảo Thalassiosira fluvitalis (Bartnicki- Garcia và
Lippman, 1982).
Đối với động vật, chitin đƣợc tìm thấy trong thành phần cấu trúc của một ít
cơ quan, nhƣ trong các lớp da của động vật chân đốt, tuyến trùng và động vật thân
mềm, và trong niêm mạc ruột, khung xƣơng ngoài của côn trùng. Phần xƣơng ngoài
của côn trùng chứa một lƣợng khá lớn phức hợp chitin- protein, trong khi vỏ của
loài giáp xác ngoài phức hợp chitin-protein còn có CaCO3 (Kramer và
Muthukrishnan, 1997).
Chitin trong tự nhiên tồn tại ở dạng acetyl hóa và deacetyl hóa cực kì ít. Nấm
mốc Absida coerulae đƣợc tìm thấy là có chitosan trong thành phần cấu tạo vách tế
bào. (Muzzarelli et al., 1994)
31. Đồ án tốt nghiệp
20
1.3.1.4. Điều chế chitin
Chitin trong tự nhiên không tồn tại ở dạng tự do mà liên kết với các hợp chất
khác nhƣ protein, khoáng chất, lipid và chất màu. Để tách các chất này ra khỏi
chitin. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp để tinh chế chitin, thƣờng ngƣời ta tiến
hành theo các bƣớc sau: loại protein, loại khoáng chất và tẩy màu.
Loại khoáng: trong thành phần vỏ tôm, cua thì loại khoáng chiếm nhiều nhất
là CaCO3, và để loại nó đi các nhà nghiên cứu đã sử dụng các tác nhân acid
đậm đặc nhƣ: HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH,… Nhƣng HCl đƣợc dùng
nhiều hơn cả bởi nó có thể loại khoáng gần nhƣ triệt để và không gây các
phản ứng phụ đáng kể.
Loại protein: các chất hóa học đƣợc dùng để loại protein nhƣ: NaOH,
NaHCO3, KOH, K2CO3,… Trong đó, NaOH đƣợc sử dụng thƣờng nhất bởi
tính phổ biến của nó.
Tẩy màu: thƣờng để tẩy màu ngƣời ta xử lí bột vỏ tôm, cua với các hợp chất
nhƣ Ethanol, Aceton hoặc dùng các chất có tính oxi hóa mạnh nhƣ H2O2,
KMnO4,...
1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase
1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố
Hệ enzyme thủy phân chitin (chitinase) thuộc nhóm enzyme thủy phân
(Hydrolase) có khả năng thủy giải liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai
monomer N-acetyl glucosamine trong mạch chitin.
Trong tự nhiên, sự phân giải chitin chủ yếu đƣợc thực hiện bởi vi sinh vật,
mặc dù rằng enzyme phân giải chitin có thể đƣợc tìm thấy trong cả thực vật, động
vật có xƣơng sống và động vật không xƣơng sống. Chitinase đƣợc tìm thấy trong
đƣờng tiêu hóa của động vật có xƣơng sống (Gooday, 1990), trong khi động vật
không xƣơng sống cần chitinase để phân giải lớp biểu bì cũ. Còn chitinase ở thực
vật lại là enzyme cảm ứng tiết ra để đáp trả sự tấn công của vi sinh vật, ví dụ nhƣ
32. Đồ án tốt nghiệp
21
thành tế bào của nấm bệnh thƣờng cấu tạo bởi một lớp chitin [17]. Hay là ở trong
nộc độc của một số loài côn trùng cũng chứa một lƣợng chitinase để tạo thuận lợi
cho sự xâm nhập của chất độc vào cơ thể con mồi. [16], [10]
Chitinase là enzyme phân hủy chitin- vốn là một trong những thành phần
của vách tế bào nấm, côn trùng… trong tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn, nấm có khả
năng sinh tổng hợp chitinase ngoại bào, nhƣng đƣợc các nhà khoa học chú ý nhiều
nhất là Trichoderma.
Chitinase của vi nấm gồm có ba loại đƣợc công nhận dựa trên khả năng phân
giải cơ chất chitin (Sahai và Manocha, 1993). Những enzyme phân giải chitin đó là
exochitinase, endochitinase và N-acetylglucosaminidase. Sự phối hợp của các
enzyme trên có thể thủy phân chitin thành dạng monomer là N-acetylglucosamine.
Chitinase của vi nấm có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 27-130 kDa. [17]
Thành phần hệ enzyme chitinase của Trichoderma: Các loài Trichoderma sử
dụng hệ enzyme phân giải chitin cùng với enzyme β-1,3-glucanase để thủy phân
vách tế bào nấm bệnh và do đó làm giảm mức độ bệnh (Haran et al., 1995). Hệ
enzyme phân giải chitin của T. harzianum là phức hợp của 6 enzyme (Haran et al.,
1995): hai β-1,4 N-acetylglucosaminidase (Chit 102 và Chit 73) và bốn
endochitinase (chit 52, chit 42, chit 33 và chit 31). Các enzyme phân giải chitin
đƣợc tổng hợp và tiết ra trong suốt quá trình phát triển của Trichoderma trong môi
trƣờng có chitin là nguồn cacbon duy nhất. Chỉ có chit 20 đƣợc tiết nội bào với
nồng độ thấp khi mà Trichoderma phát triển trên môi trƣờng chứa glucose. Sự phức
hợp và đa dạng về hệ enzyme phân giải chitin của T. harzianum liên quan đến sự bổ
trợ của 6 enzyme trên, chúng cần thiết giúp cho T. harzianum đối kháng với phổ
rộng các nấm bệnh thực vật (Haran et al., 1995). [17]
Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh
khoảng 2 năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370
C trong trƣờng hợp không
có mặt cơ chất. Chu kì bán hủy ở 370
C là 40 ngày và ở 50
C là 230 ngày. [15]
33. Đồ án tốt nghiệp
22
Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt cơ chất là chitin.
Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200
C là k= 0.145/h
1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase [15], [12]
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên và
tạo ra các đoạn oligosaccharides, trong đó, chiếm đa số là các diacetylchitiobiose
(GlcNac)2, đã đƣợc nghiên cứu trên dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm
Trichoderma harzianum.
Chitin 1,4-β- chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm
chính là dimer chitobiose.
N-acetyl-β-D-glucosamidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin tử một
đầu, cho ra sản phẩm là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.
Chitobiose là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 monomer N-acetyl-D-
glucosamine
Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylglucosamidase có thể hoạt động
trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động
kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm là những cơ chất
thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylglucosamidase.
34. Đồ án tốt nghiệp
23
Hình 1.6:Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase
(Nguồn: http://tai-lieu.com)
1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase
a) Chitinase từ vi khuẩn.
Vi khuẩn sinh tổng hợp chitinase nhằm mục đích đáp ứng nhu cầu dinh
dƣỡng. Chúng thƣờng tổng hợp nhiều loại chitinase để phân cắt các loại chitin đa
dạng trong tự nhiên.
Chitinase đƣợc tìm thấy trong các vi khuẩn nhƣ: Chromobacterium,
Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là Streptomyces.
Enzyme chitinase là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng. Vì vậy, trong
môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ngƣời ta đều cho thêm vào nguồn cơ chất chitin, để
làm chất cảm ứng cho khả năng sinh tổng hợp chitinase.
35. Đồ án tốt nghiệp
24
b) Chitinase từ vi nấm
Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loại nấm sợi. Các chủng nấm sợi cho
enzyme chitinase cao nhƣ: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia,… đặc biệt là ở các
loài nấm lớn nhƣ: Lycoperdon, Coprinus,…
Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan
trọng về mặt dinh dƣỡng nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá
trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần
chính của vách tế bào.
c) Chitinase từ thực vật
Các thực vật bậc cao có khả năng tổng hợp chitinase nhu cao su (Hevea
brasiliensis), thuốc là (Nicotiana spp.), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), cà
rốt, khoai lang, đậu nành,… và một số loài tảo biển cũng có khả năng sinh tổng hợp
chitinase. Chitinase ở thực vật tồn tại ở các mô nhất định hoặc cơ quan sinh sản
nhƣ: hạt giống, củ, hoa và đƣợc cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân có hại trên
thực vật. Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các
enzyme chống bệnh khác. Ví dụ nhƣ: endochitinase mang tính base trong lá đậu tập
trung trong không bào.
d) Chitinase từ động vật
Ở động vật, chitinase tồn tại ở các mô, các tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa
của nhiều động vật không xƣơng nhƣ: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt.
Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày
của loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát, chim, thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra, enzyme chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn
trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của loài chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase còn giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài trong quá
trình tiến hóa hay lột xác.
36. Đồ án tốt nghiệp
25
1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase [17]
So với các enzyme khác nhƣ protease, cellulase, amylase,.. thì chitinase lại là
một enzyme đƣợc nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn
khá hạn chế. Đối tƣợng nghiên cứu sớm nhất và nhiều nhất là xạ khuẩn
Streptomyces (L.R. Berger và D.M Renolds, 1958; R.Grupta, R.K. Saxena, P.
Chatuvedi và J.S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tƣợng này nhằm thu
chitinase để phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A. Carroad và R.A. Tom có công
trình nghiên cứu về phƣơng pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp
đó là nghiên cứu của I.G. Cosio, R.A. Fisher, P.A (1982) đề cập đến quá trình sản
xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin.
Về sau, những năm 1989, việc thu nhận chitinase đƣợc nghiên cứu trên các
đối tƣợng khác nhƣ: Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski) với hoạt tính
enzyme chitinase là 15,1 (U/ml), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và M.V.
Deshpand) với hoạt tính là 2,0 (U/ml) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của
chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào nấm.
Trong những năm trở lại đây, nấm sợi Trichoderma dần trở thành đối tƣợng
nghiên cứu sản xuất chitinase phổ biến. Năm 1991, C.J. Ulhoa, J.F Peberdy nghiên
cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum. Năm
1999, P.A . Felse và T. Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận
chitinase của Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok Pandey và
cộng sự nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase có tính kháng nấm
từ Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn. Dƣờng nhƣ
Trichoderma là chi nấm đến nay đƣợc phát hiện là có hoạt tình chitinase khá cao,
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt là trong bảo vệ thực vật.
Vi khuẩn cũng là một đối tƣợng đƣợc nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp
chitinase. Năm 1998, B. Bhushan, G.S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu
nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây nhất, năm 2009, S.M. Akir và cộng sự nghiên
cứu tối ƣu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận chitinase từ Bacillus licheniformis bằng
37. Đồ án tốt nghiệp
26
phƣơng pháp bề mặt đáp ứng ( RSM). Ƣu điểm của chitinase từ vi khuẩn là khả
năng bền nhiệt.
Trên đối tƣợng thực vật, cũng có một số nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm
2004, Isabela S. Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu nhận
trên đối tƣợng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonia L.) và cây họ đậu
Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonia L. là
loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen
(1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang.
1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase [26], [8], [3], [19]
a) Sản xuất glucosamine
Glucosamine là một hoạt chất quý, đƣợc sản xuất từ chitin trong vỏ tôm hoặc
chitonsan, nó chủ yếu đƣợc dùng trong y học để chữa thoái hóa khớp.
Do glucosamine làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt,
khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp,
ngăn chặn bệnh tiến triển.
b) Tổng hợp chitooligosaccharides
Hiện nay các hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharides ngày càng
đƣợc nghiên cứu chuyên sâu. Trong y học, ngƣời ta sử dụng các chitohexaose và
chitoheptaose làm tác nhân kháng ung thƣ.
Enzyme chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đƣợc dùng để sản xuất
chitopentaose và chitotriose từ huyền phù chtiin (Murao và cộng sự, 1992).
c) Chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase
Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong
việc chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện hầu hết
trong vách các loài nấm bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm.
Do đó có thể đánh dấu chitin đặc hiệu cho vi nấm, tạo cơ sở cho một phƣơng pháp
38. Đồ án tốt nghiệp
27
chuẩn đoán nhanh bệnh truyền nhiễm bằng chitinase từ Vibrio parahemolyticus,
enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin nên có thể dùng nhƣ một đầu dò trong việc
chuẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện đặc hiệu các vách tế bào nấm hay các vết
chồi của nấm men.
d) Kiểm soát muỗi và các côn trùng gây hại
Do cấu tạo lớp da của côn trùng phần lớn có chứa chitin, nên enzyme
chitinase đƣợc xem nhƣ là chiếc kìm sinh học, phá vỡ sự bền vững của lớp da thông
qua phân giải chitin, điều này làm giảm sức sống của côn trùng, từ đó tạo điều kiện
cho các tác nhân kiểm soát côn trùng gây hại, qua đó giảm thiểu quy mô dịch bệnh.
e) Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần.
Phần lớn cấu tạo của tế bào vi nấm có thành tế bào cấu tạo từ chitin. Do đó
hệ enzyme chitinase đặc biệt có hiệu quả trong trƣờng hợp này, chúng giúp phá vỡ
thành tế bào vi nấm, tạo dạng tế bào trần, tạo thuận lợi cho quá trình nghiên cứu các
quá trình sinh học của vi nấm.
Dahiya (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận đƣợc từ
chủng Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần ở nấm Trichoderma reesei,
Aspergillus Niger, Pleutotus florida…
f) Kiểm soát nấm bệnh trên cây trồng
Enzyme chitinase đƣợc dùng để ức chế sự phát triển của nấm, côn trùng và
động vật chân đốt gây hại thực vật. Các loài nấm bệnh bị ức chế bởi chitinase nhƣ:
Fusarium, Gliocladium, Rhizoctonia, Ustilaigo, Botrytis, Slecrotium,… các loài côn
trùng thuộc bộ cánh vảy Leppidoptera (sâu cải, thuốc lá)… bộ cánh cứng
Coeoptera (bọ cánh cứng khoai tây, bọ vòi voi vỏ tròn, bọ cánh cứng đậu Mexico
và ấu trùng sống ở rễ bắp)… Bộ cánh đều Homoptera (rệp bông cải, rệp khoai tây,
rệp đỏ Califonia)…x` [9]
Ngƣời ta sử dụng enzyme chitinase nhƣ là một tác nhân kiểm soát sinh học
an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu sinh học
39. Đồ án tốt nghiệp
28
Theo Hirohi Ihui, thì enzyme chitinase luôn hiện diện trong cơ thể của thực
vật, chitinase là β-1,3-glucanase đƣợc tạo ra ở mô thực vật khi tế bào bị kích thích
bởi nấm bệnh có chƣa chitin, từ đó phân giải vách tế nào nấm bệnh và ngăn chặn sự
phát triển của dịch bệnh. CHIT40, CHIT42 và CHIT72 có tác động lên kéo dài của
sợi nấm của nhiều nấm hại thực vật nhƣ: Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago
avenae,… khi chúng đƣợc ủ với dịch enzyme. [20]
g) Các chế phẩm mới: [21]
Ngày nay, các nhà khoa học đã kiến nghị sử dụng chitinase kết hợp với các
tác nhân kháng nấm (nhƣ: Amphotericin B, 5-flourocytosi, Griseofulvin,
Allylamines,…)
Enzyme chitinase có thể giúp phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm
ở liều lƣợng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân, do khi có mặt chitinase thì sự
xâm nhập của thuốc vào cơ thể nấm bệnh dễ dàng.
1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp enzyme
chitinase từ vi sinh vật [5], [23]
b) Ảnh hưởng của pH:
Giá trị tối ƣu của enzyme chitinase thƣờng dao động trong khoảng 4-9 đối
với thực vật bậc cao và tảo, 4,8- 7,5 ở thú và 3,5- 8,0 ở vi sinh vật.. Chúng thƣờng
thể hiện hoạt tính ở pH hơi acid, có tính ổn định tốt.
pH tối ƣu của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng. Đa số
các nghiên cứu về chitinase chỉ ra khoàng pH tối ƣu là 5,0 khi sử dụng các cơ chất
là bột chitin, pH thuộc khoảng kiềm yếu khi sử dụng cơ chất là glycol chitin. Hoạt
tính của enzyme chitinase bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ dày
động vật có xƣơng sống thì vẫn có thể hoạt động ở pH= 3,0.
Giá trị pH môi trƣờng ban đầu có sự ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp
enzyme chitinase của vi sinh vật. Tùy thuộc vào loài, các chủng vi sinh vật mà pH
thích hợp dao động từ pH hơi acid đến pH hơi kiềm. Theo Takashi và cộng sự
40. Đồ án tốt nghiệp
29
(2002), chủng Aspergillus sp. tổng hợp chitinase tốt nhất ở pH môi trƣờng ban đầu
là 5-6. Còn theo Nguyễn Hồng Thƣơng và cộng sự (2003) thì Trichoderma
harzianum có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt ở pH= 4-6.
b) Chất cảm ứng của enzyme chitinase
Có nhiều loài vi sinh vật prokaryotic và eukaryotic có khả năng sinh sinh ra
enzyme phân giải chitin khi mà có sự hiện diện của chitin trong môi trƣờng phát
triển của chúng (Jeniaux, 1996; Monreal và Reese, 1969). Sự hình thành chitinase
trong vi sinh vật đƣợc cho là đƣợc kiểm soát bởi một hệ thống ức chế-cảm ứng,
trong đó chitin hoặc sản phẩm thủy phân của chitin đóng vai trò là chất cảm ứng.
Sự cảm ứng hệ enzyme chitinase ngoại bào rất hiệu quả khi trong môi trƣờng
nuôi cấy Trichoderma có mặt nguồn carbon là chitin (dạng bột, dạng thô hoặc dạng
huyền phù), vách tế bào nầm hay hệ sợi nấm. Không có hoặc hiệu quả cảm ứng kém
khi thành phần môi trƣờng có chứa chitosan, cellulose, chitin chƣa tinh sạch hoặc
laminarin. Theo Felse và Panda (2000), thì khi nồng độ chitin khoảng 1%-1,5% là
vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase. Và chitin huyền phù là có khả năng
cảm ứng sinh tổng hợp chitinase tốt nhất (Bhushan, 2003; Nampoothiri et al.,
2003).
Quá trình sinh tổng hợp enzyme đƣợc điều chỉnh bởi sự ức chế dị hóa
(Neidhardt, 1960; Holzer 1976)., thể hiện qua việc, sự hình thành hệ enyzme
chitinase in vitro bị ức chế bởi tỉ lệ gia tăng của hàm lƣợng đƣờng glucose, sucrose
và sản phẩm cuối của quá trình phân giải chitin. Điều này đã đƣợc nghiên cứu rõ
hơn ở endochitinase 42kDa (CHIT42) và gene mã hóa ThEn-42 của T. harzianum.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Enzyme chitinase có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 250
C đến 800
C
và bị mất hoạt tính hoàn toàn khi bị đun sôi. Nhìn chung , nhiệt độ tối ƣu cho
enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400
C. Tùy thuộc vào từng loài hay
chủng nấm Trichoderma mà sẽ có nhiệt độ tối ƣu khác nhau.
41. Đồ án tốt nghiệp
30
Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến cả quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh
vật bởi vì khi nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ kìm hãm sự sinh trƣờng của nấm sợi,
thậm chí giết chết chúng. Nhiệt độ tối ƣu cho nấm sợi phát triển là 28-320
C, cao
nhất là 500
C.
d) Ảnh hưởng của nguồn khoáng
Các chất khoáng nhƣ Fe, Zn, Mg, Cu,… có vai trò tham gia vào quá trình
chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, trong thành phần cấu tạo
của các protein, coenzyme, điều hòa pH môi trƣờng nuôi cấy nên phần nào có sự
ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ
Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới
a) Ở Việt Nam
Năm 2007, tác giả Tô Duy Khƣơng, chuyên ngành vi sinh, trƣờng Đại học
khoa học tự nhiên có một nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase
của Trichoderma spp, đƣợc công bố trong luận án thạc sĩ “Khảo sát sự sinh tổng
hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh
thực vật” và thu đƣợc những kết quả tƣơng đối tốt. Tác giả nhận định môi trƣờng
chứa các thành phần: Pepton, Cao nấm men, Glucose, MgSO4.7H2O, K2HPO4,
KH2PO4, FeSO4.7H2O, ZnSO4, cơ chất chitin huyền phù 1% cho khả năng sinh tổng
hợp chitinase tốt nhất, với thời gian tối ƣu là 7 ngày, hoạt tính enzyme thu đƣợc là
2280,43 x10-3
UI/ml.
Năm 2010, tác giả Lê Thị Huệ đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase
của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma. Và bƣớc đầu thu
chế phẩm enzyme chitinase thô từ Aspergillus để phòng trừ sâu tơ và sản xuất
glucosamine. Trong công trình nghiên cứu của mình, tác giả thu nhận enzyme
chitinase từ chủng Aspergillus awamori với hoạt độ là 101,61 (UI/gCPE)
42. Đồ án tốt nghiệp
31
Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase
từ Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số loài nấm bệnh.
Năm 2013, hai tác giả Phạm Thị Lịch và Trần Thanh Thủy hoàn thành công
trình “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzyme chitinase
thô từ chủng Trichoderma sp.” Hai tác giả kết luận rằng điều kiện thích hợp thu
enzyme chitinase hoạt độ cao từ chủng Trichoderma BL2 là : Trấu 50g, Cám 40g,
pepton 0,5g, glucose 1g, KH2PO4 0,3g, K2HPO4 0,7g, MgSO4,7H2O 0,5g,
FeSO4.7H2O 0,5g, ZnSO4 0,001g, chitin huyền phù 1%, pH= 5, 60% độ ẩm và
nuôi cấy trong 60 giờ. Hoạt tính chitinase đạt đƣợc là 37.416 (UI/ml).
b) Trên thế giới
Năm 2000, M.H. Et-Katatny, W. Somitsch, K.-H. Robra, M.S. Et-Katatny và
G.M. Gübitz đã có một công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitinase của Trichoderma harzianum, đƣợc công bố trong bài báo “Production of
Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the
Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii”. Kết quả của nghiên cứu tác giả nhận
định rằng chủng T. harzianumsinh tổng hợp enzyme chitinase tốt nhất ở điều kiện
pH=6, nồng độ cơ chất chitin cảm ứng là 1%.
Trong bài báo “ Extracellular chitinase production by Trichoderma
harzianum in submerged fermentation (2004)” của các tác giả Sandhya C, Adapa
LK, Nampoothiri KM, Binod P, Szakacs G, Pandey A, đã nhận định rằng điều kiện
nuôi cấy để thu đƣợc chitinase có hoạt tính tốt nhất là ở 300
C, trong 96 giờ, nguồn
cơ chất chitin là 1,5%, bổ sung 0,42% pepton (đóng vai trò làm nguồn ni-tơ).
Trong bài báo cáo “Regulation of chitinaes synthesis in Trichoderma
harzianum” của 2 tác giả Cirano J. Ulhoa và John F. Peberdy, đã nhận định rằng
điều kiện nuôi cấy chủng Trichoderma harzianum 39,1 để thu nhận chitinase tốt
nhất là ở 280
C, pH= 6.
43. Đồ án tốt nghiệp
32
1.4 Sơ lƣợc về bệnh thán thƣ trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum
sp
1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt
1.4.1.1 Triệu chứng [2]
Bệnh gây hại trên thân, lá, quả và hạt, nhƣng chủ yếu là gây hại trên quả vào
giai đoạn chín. Biểu hiện ban đầu của bệnh là có đốm nhỏ, hơi lõm, ƣớt trên bề mặt
vỏ quả, sau 2-3 ngày kích thƣớc đƣờng kính mô bệnh có thể đạt đến 1cm. Vết bệnh
lúc ấy thƣờng có dạng hình thoi, lõm và phân ranh giữa mô bệnh là một đƣờng màu
đen chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ. Các vết bệnh
có thể liên kết với nhau làm cho quả bị thối, vỏ khô và có màu trắng vàng bẩn.
Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiên tƣợng thối ngọn ớt. Chồi
bị hại có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây bị chết dần hoặc cây có
quả nhƣng ít và kém chất lƣợng.
Trên những trái ớt đã lớn, khi bị nhiễm bệnh, thƣờng có những vết lõm
xuống, hình vòng tròn và hơi ƣớt. Khi gặp thời tiết thuận lợi, bệnh lan rất nhanh, vết
bệnh có màu nâu nhạt đến đậm, vết bệnh thƣờng có những hạch bào tử màu vàng.
Ngoài ra bệnh còn xuất hiện trên cây con, gây chết rạp lá ớt và gây lốm đốm.
(Nguồn: thuocbvtv.com)
Hình 1.7 Quả ớt bình thƣờng và quả ớt bị bệnh thán thƣ do Collectotrichum spp.
44. Đồ án tốt nghiệp
33
1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh do hai loại nấm Collectotrichum nigum và Collectotrichum capsici gây
ra. Hai loại nấm trên thƣờng song song gây bệnh làm cho quả ớt bị thối nhanh
chóng.
Đĩa cành nấm C.nigum đƣờng kính từ 120-180 µm, có nhiều lông gai đen
nhọn ở đỉnh, kích thƣớc 55-190x 6,5- 65 µm, bào tử phân sinh hình bầu dục hoặc
hình trụ hai đầu tròn, không màu, đơn bào và kích thƣớc là 18-25x 3 µm. Cành bào
tử phân sinh ngắn hình gậy, kích thƣớc 20-50x25 µm.
Đĩa cành nấm C.capsici có đƣờng kính 70-100 µm có lông gai đen màu nâu
sẫm, đỉnh có màu hơi nhạt có nhiều ngăn ngang và dài tới 150 µm. Bào tử phân sinh
không màu, đơn bào, hơi cong nhƣ hình lƣỡi liềm, kích thƣớc 17-28x3-4 µm có giọt
dầu bên trong.
Collectotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển
trên cuống bào tử trong dạng thể quả đƣợc gọi là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào
tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp
chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách
ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong và bào tử trong suốt. Cùng với bào tử và
cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn
nhọn, không phân nhánh.
45. Đồ án tốt nghiệp
34
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Thời gian và địa điểm
2.1.1 Thời gian
7/4/2014 đến 29/6/2014
2.1.2 Địa điểm
Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Đại học Công nghệ Tp.HCM, cơ sở 1, 475A
(số cũ: 144/24) Điện Biên Phủ, P.25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM.
2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ
2.2.1.1 Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV-Vis 2550
- Máy ly tâm Universal 320
- Nồi hấp khử trùng (Autoclave)
- Máy lắc
- Kính hiển vi quang học
- Cân phân tích
- Tủ lạnh Toshiba
- Máy chƣng cất nƣớc
2.2.1.2 Dụng cụ
- Erlen 250 ml
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 600ml, 1000ml.
- Ống đong 50ml, 100ml,
- Falcon
- Eppendorf
46. Đồ án tốt nghiệp
35
- Que cấy
- Đũa thủy tinh
- Bông thấm nƣớc, bông không thấm nƣớc (Bạch tuyến, Bảo thạch)
- Bao nhựa, dây thun, giấy báo
- Micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp.
- Đèn cồn.
2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu
Chủng Trichoderma harzianum phân lập đƣợc từ nấm linh chi.
2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu
2.2.3.1 Môi trường PDA
D-Glucose 4g
Agar 4g
Dịch chiết khoai tây 200ml
Cloramphenicol 0.005g
pH: 6-7
Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây đƣợc cắt hạt lựu, cho vào
cốc 2 lít, đong nƣớc cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng
10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.
47. Đồ án tốt nghiệp
36
2.2.3.2 Môi trường định tính sự sinh tổng hợp chitinase [5]
NaNO3 3,5 g/l
K2HPO4 1,5 g/l
MgSO4.7H2O 0,5 g/l
KCl 0,5 g/l
FeSO4.7H2O 0,01 g/l
Cloramphenicol 0,005 g/l
Đong dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6-7
2.2.3.3 Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase
Thành phần môi trƣờng A [18]
MgSO4.7H2O 0,2 g
K2HPO4 0,9 g
KCl 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,002 g
ZnSO4 0,002 g
MnSO4 0,002g
Cloramphenicol 0,005 g
Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6-7
48. Đồ án tốt nghiệp
37
Thành phần môi trƣờng B: [16]
Pepton 1 g
Urea 0,3 g
KH2PO4 0,2 g
MgSO4.7H2O 0,3 g
Tween 80 1,2 g
(NH4)2SO4 1,4 g
CaCl2 0,3 g
Cloramphenicol 0.005 g
Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6-7
Thành phần môi trƣờng C: [15]
Pepton 0,5 g
Cao nấm men 0,5 g
Glucose 1g
MgSO4.7H2O 0,5 g
K2HPO4 0,7 g
KH2PO4 0,3 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
ZnSO4 0,001 g
Cloramphenicol 0,005 g
Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6-7
49. Đồ án tốt nghiệp
38
Thành phần môi trƣờng D:
Glucose 1g
NH4NO3 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
K2HPO4 0,7 g
KH2PO4 0,3 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
ZnSO4 0,001 g
Cloramphenicol 0,005 g
Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít.
pH: 6-7
2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
Trichoderma
2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trường thạch PDA
Chuẩn bị môi trƣờng PDA nhƣ mục 2.2.1 Cho vào bình môi trƣờng Ducan
200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm, 15 phút. Hấp xong, để môi trƣờng hạ
xuống khoảng 500
C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, ta tiến hành cấy điểm
Trichoderma (từ ống giống), rồi lật úp đĩa (tránh tụ nƣớc trên bề mặt thạch) rồi ủ ở
28-320
C.
2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma trên môi trường thạch [4]
Nguyên tắc: khi nuôi cấy trong môi trƣờng thạch có bổ sung chitin, nấm sợi
sẽ sinh ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng polymer có cấu trúc
mạch ngắn hơn, thậm chí tạo thành monomer N-acetyl-D-glucosamine. Các dạng
50. Đồ án tốt nghiệp
39
này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi cho thuốc thử
Lugol vào, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp
enzyme chitinase của nấm sợi. Phƣơng pháp này chỉ dùng để định tính enzyme, chỉ
đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme chứ không xác định chính xác hoạt
độ của enzyme.
Thực hiện:
Cách pha dịch Lugol (Nguyễn Đức Lƣợng) [7]
Iodine 1 g.
KI 2 g.
Nƣớc cất 300 ml.
Hòa tan rồi giữ trong lọ màu.
Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ mục 2.2.2.2, cho vào bình môi trƣờng Ducan
200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm, 15 phút. Hấp xong, để môi trƣờng hạ
xuống khoảng 500
C rồi tiến hành đổ đĩa.
Trong khi đợi thạch đông, ta sẽ tiến hành lấy khuẩn lạc Trichoderma đƣợc
nuôi cây trong đĩa PDA sau 4 ngày nuôi cấy bằng cách: lấy cây đục lỗ thạch có
đƣờng kính 5mm (khử trùng bằng cồn 960
, đốt trên ngọn lửa đèn cồn) để đục lỗ,
đục trên cùng 1 đƣờng tròn chu vi tâm là điểm đã cấy trƣớc đó.
Sau đó, đặt miếng thạch từ đĩa PDA sang đĩa chứa môi trƣờng có chitin, đặt
miếng thạch ngay tâm đĩa ủ ở 28-320
C. Sau 2 ngày, tiến hành đổ Lugol vào đĩa để
quan sát vòng phân giải, lugol đổ ngập bề mặt đĩa 1 ít, để 15p rồi đổ lugol thừa ra,
cho ít nƣớc cất vào đĩa, đổ nƣớc cất ra, rồi tiến hành quan sát.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa
51. Đồ án tốt nghiệp
40
2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu
(Trần Thạnh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lƣợng, 2005)
Hình 2.1: Buồng đếm hồng cầu Neubauer
(Nguồn: http://www.hausserscientific.com)
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thƣớc rất nhỏ (nấm
men, bào tử nấm mốc).
Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó: là một phiến kính hình
chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên
mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lƣới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là
1/25 mm2
, lại đƣợc chia thành các ô vuông nhỏ ( thƣờng là 16 ô), mỗi ô có diện tích
là 1/400 mm2
và chiều cao là 1/10. Nhƣ vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là
1/400x0.1=1/4000 mm3
.
Thực hiện: Trichoderma harzianum đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch PDA
khoảng 7 ngày thì bào tử sẽ mọc kín đĩa. Ta cho vào đó 20 ml nƣớc muối sinh lý
chứa Tween 80 0.1%, rồi dùng đũa thủy tinh cạo sạch lớp bào tử trên đĩa, sau đó
dùng micropipet hút từ đĩa ra 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc muối sinh lý có
chứa Tween 80 0.1% để pha loãng mẫu, ta dƣợc độ pha loãng 10-1
, lặp lại đến khi
52. Đồ án tốt nghiệp
41
có đƣợc các độ pha loãng 10-2
,10-3
,10-4
. Sau đó tiến hành đếm bào tử bằng buồng
đếm hồng cầu.
Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lƣới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy
mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên
lƣới đếm, chú ý không để tạo bọt khí trong lƣới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống
rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành
đếm bào tử trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô con và
những bào tử nằm trên 2 cạnh bên trài và ở trên. Đếm lần lƣợt từ ô con 1 đến ô con
16.
Chú ý: nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ
không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm đƣợc trong 5 ô phải lớn hơn 200 mới đảm bảo
tính chính xác của phƣơng pháp.
Tính số lƣợng bào tử theo công thức sau:
N=
Với:
N : Số lƣợng bào tử trong 1 ml huyền phù.
a : Số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con).
b : Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô X 5 = 80 ô con).
1000 : Số chuyển mm3
thành ml ( 1000mm3
= 1 ml)
n : Số lần pha loãng dịch huyền phù.
2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase
Bước 1 : Chuẩn bị môi trường: nhƣ mục 2.2.2.3
Phối vào mỗi erlen 50ml môi trƣờng, sau khi chuẩn bị xong, ta sẽ tiến hành
hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm, 15 phút. Để nguội khoảng 300
C, , rồi tiến hành cấy
bào tử nấm Trichoderma vào. Sau đó, tiến hành ủ trên máy lắc với 150 vòng/phút.
53. Đồ án tốt nghiệp
42
Bước 2: Chuẩn bị giống
Đĩa PDA nuôi cấy điểm Trichoderma 7 ngày, ta cho 20ml nƣớc muối sinh lý
vô trùng vào rồi lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối trên bề mặt thạch. Sau đó dùng
Micro pipett hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa môi trƣờng sao
cho mật độ bào tử đạt 106
/ml.
2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase (Nguyễn Đức
Lƣợng) [7]
Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong môi
trƣờng lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy
phân là các enzyme hòa tan trong nƣớc. Do đó, để thu nhận enzyme trong trƣờng
hợp nuôi cấy chìm là phải thu nhận dịch nuôi cấy (sau khi tách sinh khối và các
thành phần không hòa tan của môi trƣờng).
Thực hiện: Sau khi nuôi cấy trong điều kiện môi trƣờng cụ thể. Ta tiến hành
lọc môi trƣờng nuôi cấy qua giấy lọc, thu dịch lọc.
2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS [6]
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng
khử và thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS). Cƣờng độ màu của phản ứng tỉ lệ
thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở
bƣớc sóng 540 nm. Dựa vào biểu đồ đƣờng chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử
DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử trong mẫu nghiên cứu
Phƣơng trình phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử và DNS acid:
54. Đồ án tốt nghiệp
43
Thực hiện:
a) Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine:
Ống nghiệm
Đối
chứng
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N-acetyl-D-
glucosamine
10 mg/ml
(ml)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Nƣớc cất
(ml)
10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9
Nồng độ N-
acetyl-D-
glucosamine
(mg/ml)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
OD540nm
- Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã đƣợc rửa và làm
khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS.
- Đun sôi các ống test 10 phút (có đậy nắp hay nút bông không thấm nƣớc).
- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nƣớc cất vào ống nghiệm. Đo mật
độ quang ở bƣớc sóng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng.
55. Đồ án tốt nghiệp
44
- Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vễ đƣờng chuẩn
glucose với trục hoành là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục
tung là mật độ quang (OD). Tìm phƣơng trình biễu diễn mối quan hệ tuyến
tính giữa 2 giá trị: y=ax+b và hệ số tƣơng quan R2
nhờ phần mềm Excel.
b) Xác định hoạt độ enzyme chitinase:
Nguyên tắc: hoạt độ chitinase đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp định
lƣợng N-acetyl-D-glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lƣợng N-
acetyl-D-glucosamine tạo ra đƣợc xác định theo phƣơng pháp Elson- Morgan.
Thực hiện:
Chuẩn bị các ống nghiệm đã đƣợc rửa sạch và làm khô
- Ống phản ứng::
Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù
chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 300
C trong
60 phút.
Ngƣng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi
Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc
đều, đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.
Thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều và đo OD ở bƣớc sóng 535 nm.
- Ống không phản ứng:
Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme
bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin
vào rồi làm tƣơng tự nhƣ cách bƣớc của ống phản ứng.
c) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lƣợng enzyme cần thiết để
giải phóng 1 µg N-acetyl-D-glucosamine từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt
độ phản ứng nhất định.
Đơn vị hoạt tính = (U/ml)
56. Đồ án tốt nghiệp
45
Với a: hàm lƣợng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đƣờng chuẩn.
n: hệ số pha loãng.
v: thể tích hỗn hợp phản ứng.
t: thời gian phản ứng (phút).
V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml)
2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn (Nguyễn Đức Lƣợng) [7]
Nguyên tắc: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những dung
môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc) tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch, còn những dụng môi có hằng số điện môi nhỏ (nhƣ aceton,
ethanol,…) lại ngăn chặn sự phân tán của phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó,
độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự liên kết của các phân tử
protein với nhau và tạo thành tủa. Đây là kiểu kết tủa thuận ngịch, nghĩa là protein
có thể hòa tan lại trong nƣớc.
Dùng cồn 960
làm tác nhân tủa có nhiều thuận lợi: rẻ tiền, không có tác dụng
ức chế hay làm mất hoạt tính enzyme và nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ
dàng tách cồn ra khỏi tủa bằng phƣơng pháp sấy nhiệt độ thấp hay bằng quạt gió.
Thực hiện: Lấy cồn từ tủ lạnh, từ từ cho vào dịch lọc enzyme đã làm lạnh,
khuấy nhẹ cho cồn hòa đều với dịch enzyme. Sau đó, để hỗn hợp vào tủ lạnh.
Lƣợng cồn dùng để tủa enzyme thƣờng gấp 2- 2,5 lần lƣợng dịch enzyme. Sau 15-
24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành 2 lớp. Đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để
protein- enzyme dạng tủa, sau đó hòa tan tủa trong đệm thích hợp. Các bƣớc nên
tiến hành ở điều kiện 40
C.
57. Đồ án tốt nghiệp
46
2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum
Nguyên tắc: Vi sinh vật cần các yếu tố dinh dƣỡng nhất định để có thể sinh
trƣờng, phát triển và dùng để làm nguồn nguyên liệu tổng hợp các hợp chất cần
thiết.
Thực hiện:
Chuẩn bị các môi trƣờng nuôi cấy nhƣ mục 2.2.3.3, sau đó cho 50ml môi
trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm, 15 phút. Để nguội
rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật độ 106
bt/ml. Ủ lắc
150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase.
MT A MT B MT C MT D
Lọc lấy dịch nuôi cấy
Xác định hoạt độ enzyme
Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen
2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum
Nguyên tắc: Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các nguồn cơ chất cảm
ứng khác nhau, chúng sẽ tác động đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của
Trichoderma.
58. Đồ án tốt nghiệp
47
Thực hiện:
Lần lƣợt thay thế dịch huyền phù vỏ tôm 1% bằng dịch huyền phù chitin 1%,
1% dịch nấm Fusarium 7 ngày nuôi cấy lắc, 1% nấm linh chi và môi trƣờng không
bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng.
Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 nhƣng thay thế thành phần cơ chất,
sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210
C, 1
atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật
độ 106
bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính
chitinase.
Chuẩn bị sinh khối nấm bệnh:
Nuôi cấy nấm bệnh Fusarium trên môi trƣờng PDA 4 ngày, sau đó cắt
1cm2
thạch có chứa nấm bệnh cho vào 100ml môi trƣờng PDB trong erlen
250ml để tăng sinh, lắc 150v/p trên máy lắc trong 7 ngày (M. H. El-Katatny,
2000), rồi tiến hành hấp bỏ ở 1210
C, 30 phút để diệt nấm bệnh sau đó thu
dịch sinh khối làm nguồn cơ chất cảm ứng.
Chuẩn bị dịch chitin huyền phù 1%:
Lấy 5g bột chitin, cho từ từ vào 50ml HCl đậm đặc, khuấy đều trong 1
giờ, rồi ủ qua đêm, sau đó cho 250 ml Ethanol 960
(lạnh) vào để tạo dịch
huyền phù, sau đó ta đem hỗn hợp rửa lại bằng nƣớc cất, có thể bằng phƣơng
pháp lọc hay li tâm 4000v/p trong 5 phút, đến khi pH đạt 5 thì cho 500ml
nƣớc cất, ta đƣợc dịch chitin huyền phù 1%, rồi để trữ trong tủ lạnh để sử
dụng.
Chuẩn bị nấm linh chi:
Chuẩn bị 10g nấm linh chi, tiến hành trích ly bào tử nấm linh chi
trong cốc thủy tinh bằng 100ml cồn 960
, cạo sạch bào tử trên tai nấm rồi để
cồn bốc hơi hết. Sau đó mang tai nấm (khi này không còn bào tử nấm) đi xay
nhỏ ra. Bào tử dính trên cốc thủy tinh cũng sẽ đƣợc hòa trong 10ml nƣớc cất,
59. Đồ án tốt nghiệp
48
để lấy dịch bào tử. Cho bã nấm xay nhỏ vào trộn với dịch bào tử ở trên, ta
đƣợc mẫu nấm linh chi. Khi sử dụng ta sẽ lấy mẫu nấm linh chi bổ sung vào
môi trƣờng nuôi cấy với tỉ lệ 1% (w/v).
MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.7
Không cơ chất Chitin Vỏ tôm Nấm linh chi Fusarium
Lọc lấy dịch nuôi cấy
Tiến hành đo hoạt độ enzyme.
Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen
2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum
Nguyên tắc: Ở mỗi thời điểm khác nhau của quá trình sinh trƣờng, vi sinh
vật sƣ dụng các nguồn cơ chất trong môi trƣờng nuôi cấy bằng một hay một số hệ
enzyme. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme chitinase theo thời gian nuôi cấy
Trichoderma harzianum nhằm xác định đƣợc thời gian tối ƣu để thu đƣợc enzyme
chitinase có hoạt tính cao nhất.
Thực hiện:
Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 cơ chất là dịch vỏ tôm huyền phù
1%,, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210
C,
1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật
60. Đồ án tốt nghiệp
49
độ 106
bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính
chitinase.
MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.8
Nuôi cấy trong 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ
Lọc lấy dịch nuôi cấy
Tiến hành đo hoạt độ enzyme
Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen
2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum
Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trƣởng của nấm cũng
thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+
có trong môi trƣờng sẽ
làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hƣởng khả năng
thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổitrạng thái
điện ly các phân tử của chất dinh dƣỡng, từ đó làm giảm khả năng sử dụng dinh
dƣỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đó, pH ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme có mặt
trên thành tế bào. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme chitinase theo pH môi trƣờng
nuôi cấy ban đầu nhằm xác định đƣợc thời gian tối ƣu để thu đƣợc enzyme chitinase
có hoạt tính cao nhất
Thực hiện:
Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 với cơ chất là dịch vỏ tôm huyền
phù 1%, pH đƣợc thay đổi từ 5-8 bẳng đệm photphate, sau đó cho 50ml môi trƣờng
vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy