Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TRONG
CAO CHIẾT LÁ ĐẮNG (VEMONIA AMYGDALINA
DEL)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn :Th.S NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG
Sinh viên thực hiện : TỪ CÔNG TÍNH
MSSV: 1311100768 Lớp: 13DSH05
TP. Hồ Chí Minh, 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ
sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Nguyễn
Thị Thu Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng
đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách
nhiệm về lời cam đoan này.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên
Từ Công Tính

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại
học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến
thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Thu
Hƣơng, ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ
em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các
thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng
cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em
hoàn thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
nhƣ trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên
Từ Công Tính

i
MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................4
Giới thiệu về cây lá đắng. ...............................................................................4
1.1.
Nguồn gốc.................................................................................................4
1.1.1.
Cây lá đắng thuộc họ Cúc (Asteraceae) là họ lớn và phổ biến rộng rãi hiện nay,
bao gồm 1000 chi và 20,000 loài, phân bố ở khắp các nƣớc trên thế giới. Cây lá
đắng. sống đƣợc ở rất nhiều môi trƣờng khác nhau. Ở nƣớc ta, có 125 chi và
350 loài, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến các vùng núi cao tới 3000 m so
với mặt biển. [1]. ................................................................................................4
Phân loại ..................................................................................................4
1.1.2.
Đặc điểm và sự phân bố............................................................................4
1.1.3.
Tính chất dược lý của cây lá đắng. ...........................................................5
1.1.4.
Tổng quan về các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn trong thực vật.7
1.2.
Alkaloid.....................................................................................................7
1.2.1.
Flavonoid..................................................................................................9
1.2.2.
Steroid.....................................................................................................12
1.2.3.
Tanin.......................................................................................................13
1.2.4.
Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật..........................................16
1.3.
Định nghĩa tách chiết hợp chất hợp chất từ thực vật..............................16
1.3.1.
Các phương pháp tách chiết cao từ thực vật...........................................17
1.3.2.
Phương pháp tách chiết cao một số chất từ thực vật ..............................24
1.3.3.
Cơ sở khoa học kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp có trong thực vật.....26
1.4.
Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn ...........................................................26
1.4.1.
Cơ chế kháng khuẩn của một số hợp chất ở thực vật..............................26
1.4.2.
Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của thực vật ở thế giới và tại
1.4.3.
Việt Nam...........................................................................................................28
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration - MIC) ở
1.4.4.
cao chiết thực vật..............................................................................................29

ii
Các nhóm vi khuẩn gây hại phổ biến ở ngƣời...............................................30
1.5.
Nhóm Escherichia coli............................................................................30
1.5.1.
Nhóm Samonella.....................................................................................32
1.5.2.
Bacillus sppp...........................................................................................34
1.5.3.
Staphylococcus arueus............................................................................35
1.5.4.
Nhóm Listeria spp...................................................................................36
1.5.5.
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................38
Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................38
2.1.
Địa điểm nghiên cứu...............................................................................38
2.1.1.
Thời gian nghiên cứu..............................................................................38
2.1.2.
Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................38
2.2.
Nguồn mẫu..............................................................................................38
2.2.1.
Vi sinh vật chỉ thị....................................................................................38
2.2.2.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị..................................................................39
2.2.3.
Phƣơng pháp nghiên cứu...............................................................................40
2.3.
Phương pháp xử lí nguồn mẫu................................................................40
2.3.1.
Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật.....................................40
2.3.2.
Phương pháp pha loãng mẫu..................................................................40
2.3.3.
Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị...............................................41
2.3.4.
Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật..................................41
2.3.5.
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật......42
2.3.6.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)..........................42
2.3.7.
Phƣơng pháp xử lí số liệu .......................................................................43
2.3.8.
Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................43
2.4.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất
2.4.1.
thu hồi cao từ cây lá đắng. ...............................................................................45
Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính
2.4.2.
kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng........................................................46
Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .........................47
2.4.3.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................49
Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây lá
3.1.
đắng. ....................................................................................................................49

iii
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây lá đắng....50
3.2.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E. coli
3.2.1.
..........................................................................................................................50
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau
3.2.2.
trên Bacillus Cereus .........................................................................................52
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các loại dung môi trên
3.2.3.
nhóm Salmonella. .............................................................................................54
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi trên S.
3.2.4.
Aureus...............................................................................................................56
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau
3.2.5.
trên nhóm Listeria monocytogenes. ..................................................................58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................61
1. Kết luận .......................................................................................................61
2. Kiến nghị.....................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................62
PHỤ LỤC A.............................................................................................................1
Kết quả thu hồi cao chiết từ cây lá đắng. ...............................................................1
PHỤ LỤC B .............................................................................................................2
1.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E. Coli2
1.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau
trên Bacillus Cereus............................................................................................3
1.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các loại dung môi trên
nhóm Salmonella................................................................................................4
1.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi trên S.
Aureus. ...............................................................................................................5
1.5. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau
trên nhóm Listeria monocytogenes.....................................................................6
PHỤ LỤC C.............................................................................................................7
Kết quả xử lý số liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết trên các
nhóm vi khuẩn. ......................................................................................................7
1.1. Kết quả xử lý số liệu của S.Aurius............................................................7
1.2. Kết quả xử lý số liệu B. Cereus ................................................................8
1.3. Kết quả xử lý số liệu Samonella. ..............................................................9
1.4. Kết quả xử lý số liệu E. Coli...................................................................10

iv
1.5. Kết quả xử lý số liệu Listeria monocytogenes. .......................................11

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
- NB: Nutrient Broth
- NA: Nutrient Agar
- EMB: Eosin Methylene Blue Agar
- XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar
- DMSO: dimethylsulfoxid

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng E.coli của cao chiết trên các dung môi ....50
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus của cao chiết các dung
môi ...............................................................................................................................52
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Salmonella của cao chiết các dung môi....54
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng S.aureus của cao chiết các dung môi ........56
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của cao chiết
các dung môi ................................................................................................................58

vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây lá đắng.....................................................................................................4
Hình 1.2. Công thức phân tử Enpherine.........................................................................8
Hình 1.3. Một số Eucoflavonoid...................................................................................10
Hình 1.4. Cấu tạo Isoflavon và rotenoid.......................................................................10
Hình 1.5. Cấu tạo Calophyllolid...................................................................................11
Hình 1.7. Cấu tạo Steroid .............................................................................................12
Hình 1.8. Cấu tạo Tanin ...............................................................................................13
Hình 1.9. Cấu tạo Acid digallic và Acid trigallic..........................................................14
Hình 1.10. Cấu tạo penta-O-galloyl-glucose. ...............................................................15
Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt.............................................................................18
Hình 1.12. Bộ chiết Soxhlet .........................................................................................20
Hình 1.13. Máy chiết Kumagawa.................................................................................21
Hình 1.14. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc ..................................................................................21
Hình 1.15. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn................................................................23
Hình 1.16. Cột chiết pha rắn.........................................................................................24
Hình 1.17. Cơ chế kháng khuẩn ...................................................................................28
Hình 1.18. Hình vi khuẩn Escherichia coli ..................................................................31
Hình 1.19. Hình vi khuẩn Salmonella ..........................................................................33
Hình 1.19. Hình vi khuẩn Bacullus spp........................................................................34
Hình 1.20. Hình vi khuẩn Staphylococcus arueus........................................................35
Hình 1.21. Hình vi khuẩn Listeria monocytogenes.......................................................36
Hình 2.1. Hình ảnh cây Lá đắng...................................................................................38
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .................................................................44
Hình 2.4. Mẫu ngâm trong dung môi ...........................................................................45
Hình 2.4. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ....................................46
Hình 2.6. Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)............................................47
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây Lá đắng. ....49
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E.coli....................51

viii
Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi khác nhau trên
Bacillus Cereus. ...........................................................................................................53
Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên nhóm
Salmonella spp. ............................................................................................................55
Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên S. Aureus..........57
Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi khác nhau trên nhóm
Listeria monocytogenes................................................................................................59

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ nhiều thế kỷ nay, những bài thuốc Y học cổ truyền đƣợc coi nhƣ một kho
tàng dƣợc liệu quý báu. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió mùa nên
đƣợc thừa hƣởng nguồn động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với
nhiều cây, con dƣợc liệu quý. Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học
rất phong phú và là một trong những định hƣớng làm chất dẫn đƣờng để các nhà
khoa học có thể tổng hợp ra nhiều loại hoạt chất mới chống lại các bệnh hiểm
nghèo, các chất bảo quản thực phẩm cũng nhƣ các chế phẩm phục vụ nông nghiệp
có hoạt tính cao mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Việc sử dụng các loại thuốc
thảo dƣợc theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hƣớng
ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học (Các thuốc chữa
bệnh có nguồn gốc tự nhiên chiếm tới 60% ). Chế phẩm thảo dƣợc dù chỉ có một
loại dƣợc liệu nhƣng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi
trƣờng hợp hầu hết còn chƣa xác định đƣợc rõ hoạt chất của chúng. Vì vậy, những
bài thuốc sử dụng thảo dƣợc hay những cây dƣợc liệu là đối tƣợng để cho các nhà
khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ
thiên nhiên. Từ đó định hƣớng cho việc nghiên cứu, gieo trồng, thu hoạch, chiết
xuất ra các loại hoạt chất mới hay bằng con đƣờng bán tổng hợp để tạo ra những
chất có hoạt tính sinh học cao, nhanh chóng đƣa vào công tác chữa trị nhiều loại
bệnh thông thƣờng cũng nhƣ nan y. Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa thực vật
những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
Hiện phong trào sử dụng lá cây “Mật gấu” làm thuốc rất phổ biến. Thực chất
đây là cây Lá đắng (khi nhai lá có cảm giác đắng nhƣng sau đó lại có vị ngọt trong
miệng) ở dạng ăn nhƣ rau hoặc nấu nƣớc uống. Cây này đƣợc sử dụng từ rất lâu
trong y học dân gian ở một số nƣớc Châu Phi (Nigeria, Cameroon, Zimbawe) và
Châu Á trong đó hiện phổ biến ở các Nƣớc Đông Nam Á.
Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng
kháng khuẩn trong cao chiết từ cây lá đắng ”.

2
2. Tình hình nguyên cứu:
2.1. Nghiên cứu trong nƣớc:
2.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc:
Effect of Vernonia amygdalina Del. Leaf Ethanolic Extract on Intoxicated
Male Wistar Rats Liver (Iwo MI, Sjahlim SL, Rahmawati SF).
Các tính chất chống oxy hóa trong chất chiết xuất lá Methanolic
của Vernonia Amygdalina Del.(Adesanoye OA, Farombi EO,Niger J Physiol Khoa
học . 2014).
3. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hƣởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi cao từ lá
cây lá đắng..
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá cây lá đắng.
- Xác định chỉ số MIC của cao chiết từ lá cây lá đắng.
4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu về cở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu làm cơ sở
cho các nhiệm vụ tiếp theo.
- Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm thu nhận dịch chiết lá cây lá đắng bằng
kỹ thuật chiết ngâm dầm trong ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc.
- Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá cây lá đắng.
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây lá đắng trên các
chủng vi khuẩn.
- Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ lá cây lá đắng.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu: Thu thập và nghiên cứu các tài liệu
liên quan đến cây lá đắng, phƣơng pháp tăng sinh, pha loãng, bảo quản và giữ
giống vi sinh vật, phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao chiết thực, phƣơng
pháp đục lỗ thạch khảo sát kháng khuẩn, phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế
tối thiểu, phƣơng pháp xử lý số liệu.

3
- Phƣơng pháp thí nghiệm: Dựa trên các tài liệu nghiên cứu làm cơ sở tiến
hành các thí nghiệm nhằm giải quyết nội dung nghiên cứu.
- Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng Microsoft Excel và phần mềm xử lí số
liệu Minitab 15.
6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài
- Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm thu nhận dịch chiết lá cây lá đắng
bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc.
- Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá cây lá đắng.
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây lá đắng trên các
chủng vi khuẩn.
- Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ lá cây lá đắng.
7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp
- Mở đầu
- Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
- Chƣơng 2: Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
- Chƣơng 3: Kết quả
- Kết luận và kiến nghị
- Tài liệu tham khảo

4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Giới thiệu về cây lá đắng.
1.1.
Nguồn gốc
1.1.1.
Cây lá đắng thuộc họ Cúc (Asteraceae) là họ lớn và phổ biến rộng rãi
hiện nay, bao gồm 1000 chi và 20,000 loài, phân bố ở khắp các nƣớc trên thế
giới. Cây lá đắng. sống đƣợc ở rất nhiều môi trƣờng khác nhau. Ở nƣớc ta, có
125 chi và 350 loài, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến các vùng núi cao
tới 3000 m so với mặt biển. [1].
Phân loại
1.1.2.
Phân loại khoa học của cây Lá đắng:
Giới Plantae
Bộ Asterids
Họ Asteraceae
Chi Vemonia
Loài Vemonia Amygdalina
Tên khoa
học
Vemonia Amygdalina
Del
Hình 1.1. Cây lá đắng
Đặc điểm và sự phân bố
1.1.3.
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật học
Cây lá đắng sống lâu năm, là dạng cây bụi mọc thẳng đứng, chỉ cao từ 2-3m,
đƣờng kính thân rất nhỏ khoảng 2-4 cm, cây thƣờng phân nhánh ở cành gốc, khi
còn non thân cây đƣợc phủ một lớp lông trắng mịn về già lớp lông này rụng dần

5
hết; cuống lá dài, phiến lá hình trái xoan ngƣợc, mép lá có hình răng cƣa, lá đơn
mọc cách, phiến lá hình trái xoan có thể dài tới 20 cm, đầu lá nhọn, đuôi là nhọn
hoặc hình nêm. Cây này có nguồn gốc từ châu Phi và hiện nay cây có mặt khắp nơi
trên thế giới do cây dễ trồng dễ mọc.
1.1.3.2. Phân bố
Ấn độ (Bihar, Madhya Pradesh, Odisha, West Bengal); châu Phi nhiệt đới;
hiện nay cây Lá Đắng đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam,
cây lá đắng đƣợc trồng ở nhiều nơi do đặc tính dễ trồng .
Tính chất dược lý của cây lá đắng.
1.1.4.
Những hợp chất trong Lá đắng có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh do quá
trình viêm mạn tính, lão hoá, bệnh nhiễm giun sán, động vật nguyên sinh
(protozoan) và vi khuẩn.
Theo công bố trên Quyển Y – Sinh học thực nghiệm tháng 2 năm 2004
(Experimental Biology and Medicine of February 2004 Edition) cho thấy lá Đắng
có tác dụng hạ thấp tỉ lệ nguy cơ bị ung thƣ vú.
Lá Đắng dùng nấu dạng canh rau hay xay nhuyễn lấy nƣớc uống nhƣ dạng
nƣớc bổ dƣỡng trong nhiều dạng bệnh lý khác nhau. Nhiều thầy thuốc ở Châu Phi
khuyên ngƣời dân dùng trị bệnh đƣờng tiêu hoá, đái tháo đƣờng, chán ăn, kiết lỵ và
các chứng rối loạn tiêu hoá.
Các Polyphenol có tính kháng viêm và anti – oxidant, thải độc, bảo vệ thận,
gan, hỗ trợ điều trị một số bệnh ngoài da. Giảm đƣờng huyết, bao vệ tim mạch do
giúp ổn định lipid máu.
Kiểm soát đƣờng huyết nhờ các hợp chất đắng trong lá nên tốt cho ngƣời đái
tháo đƣờng.
Tăng cƣờng hệ miễn dịch cho cơ thể. Chữa rối loạn tiêu hóa, đau bụng và tả
lỵ.
Hạ sốt và điều trị cảm lạnh tích cực nhờ các hợp chất xanthones, acid phenolic
trong lá.

6
Điều trị các bệnh qua đƣờng tình dục nhƣ bệnh lậu nhờ tác dụng của các chất
chống oxy hóa trong lá. Chống giun sán.
Chống ung thƣ.
Duy trì sức sống tình dục. Giúp nhuận trƣờng và chữa táo bón.
Chống sốt rét vì chất đắng trong lá có thể thay thế cho quinin.
Chữa đau họng, ho, trừ đờm, chỉ cần nhai một lá trƣớc khi đi ngủ vào ban
đêm và sáng sớm sẽ thấy giảm các triệu chứng ho.
Tăng cƣờng khả năng sinh sản, uống nƣớc lá đắng giúp kích thích khả năng
sinh sản ở phụ nữ khó sinh. Các lá có chứa nhiều carotene, giúp cân bằng quá trình
tổng hợp các hormon sinh dục nữ và duy trì nồng độ estrogen do đó giúp phụ nữ
khỏe mạnh và kéo dài tuổi xuân.
Chống buồn nôn và tăng cƣờng cảm giác ngon miệng.
Hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B và C.
Tăng tiết sữa cho con bú. Hạ cholesterol xấu.
Tẩy độc cho cơ thể, bảo vệ gan thận.
Giảm đau và làm êm dịu thần kinh dễ ngủ. Chống mẩn ngứa ngoài da.
Một số bài thuốc dân gian:
 Lấy 10 lá, rửa sạch, bỏ vào bình hãm với 1.5 lít nƣớc sôi, đợi khoảng 15
phút là uống đƣợc. Uống thay nƣớc lọc hàng ngày. Cách này giúp duy trì sức sống
tình dục, chống xuất tinh sớm.
 Lấy 8 lá mật gấu, rửa sạch, giã nát hoặc xay nhuyễn, pha với nửa cốc bia,
vắt lấy nƣớc uống trƣớc khi đi ngủ để trị thoái hóa đốt sống cổ.
 Ấn Độ: dùng lá chữa tiểu đƣờng, dùng cành, rễ hỗ trợ điều trị HIV, hạ sốt,
giảm ho, phát ban, cảm cúm, viêm vú.
 Congo: dùng lá và vỏ rễ chữa kiết lỵ, viêm dạ dày, ruột, sốt rét, viêm gan,
nhiễm giun.
 Nam Phi: dùng rễ chữa sán máng (huyết hấp trùng), hiếm muộn, rối loạn
kinh nguyệt.

7
 Ở khu vực Tây Phi: dùng lá làm trà lợi tiểu, chữa táo bón, nhiễm trùng da,
đái đƣờng, bệnh chuyển hóa liên quan đến gan…
 Ở Châu Phi: Trong một thí nghiệm lâm sàng sơ bộ, ngƣời ta dùng nƣớc
sắc từ 25g lá tƣơi của cây Lá đắng điều trị cho các bệnh nhân sốt rét bởi ký sinh
trùng đơn bào Plasmodium falciparum mức độ nhẹ ở châu Phi thấy rằng 67% có
phản ứng lâm sàng, và trong số đó thì 71% là có các triệu chứng tái phát.[6]
Không
có phản ứng phụ trong quá trình thí nghiệm sơ bộ.
Tổng quan về các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn trong
1.2.
thực vật
Alkaloid
1.2.1.
1.2.1.1. Định nghĩa
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ alkali (tiếng ả rập) là kiềm. Những hợp chất
alkaloids có chứa dị vòng nitơ, có tính base thƣờng gặp ở trong nhiều loài thực vật
và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật, có phản ứng kiềm cho các
muối với acid và các muối này dễ kết tinh, chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên
quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, có giá trị chữa bệnh cao và
độc đáo (R.H.F. Manske, 1973).
1.2.1.2. Phân loại
Các alkaloid thông thƣờng đƣợc phân loại theo đặc trƣng phân tử chung của
chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất đƣợc sử dụng để tạo ra phân tử. Khi không biết
nhiều về tổng hợp sinh học của các alkaloid, thì chúng đƣợc gộp nhóm theo tên gọi
của các hợp chất đã biết.
Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:
Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cyt
isin, sppartein, pelletierin.
Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin
Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin
Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin,
brucin, veratrin, cevadin

8
Nhóm isoquinolin:Các ancaloit gốc thuốc phiện
nhƣ morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, .
Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin
Nhóm indol:
Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin
Các ergolin: Các ancaloit từ cựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamin, axít
lysergic v.v
Hình 1.2. Công thức phân tử Enpherine
1.2.1.3. Tính chất của alkaloid
Tính base: alkaloid là các base yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhƣng độ
kiềm của alkaloid không giống nhau do ảnh hƣởng khác nhau của lớp điện tích
nguyên tử N gây ra và ảnh hƣởng của các nhóm chức khác. Tính base của alkaloid
giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3. Các
base yếu sẽ cần môi trƣờng acid mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dich
nƣớc. Vì vậy ở môi trƣờng acid yếu một số alkaloid base mạnh có thể chuyển thành
muối trong khi các base yếu vẫn tồn tại trong dung dịch dƣới dạng base.
Tính hòa tan: Hầu hết các alkaloid base thực tế không tan trong nƣớc nhƣng
tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, ete và các ancol bậc thấp. Một số nhóm
alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan đƣợc một phần trong nƣớc hoặc trong
kiềm. Ngƣợc lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và không tan trong
các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid nhƣ loại bay

9
hơi hoặc không bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết xuất cho thích hợp (Phan Đình
Châu, 1997).
1.2.1.4. Vai trò của alkaloid
Các alkaloid trong thực vật có hàm lƣợng rất thấp và khó tách chiết. Có vai
trò rất lớn trong y học, dƣợc phẩm…
Đối với thực vật: là những chất chuyển hóa thức cấp, chất bài tiết hoặc là sản
phẩm cuối trong quá trình chuyển hóa thực vật. Là những chất dự trữ nitơ trong
thực vật. Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật.
Đối với con ngƣời: alkaloid thƣờng có hoạt tính sinh học mạnh đến rất mạnh.
Một số chất dùng làm chất độc trong săn bắn (tubocurarin, curare) (Phan Đình
Châu, 1997).
Flavonoid
1.2.2.
Flavonoid là một nhóm lớn các hợp chất tự nhiên hay gặp trong thực vật,
thƣờng có màu sắc, phần lớn là màu vàng. Tuy nhiên một số hợp chất có màu xanh,
tím, đỏ cũng đƣợc xếp và nhóm lớn flavoid vì đứng về mặt hóa học, chúng có cùng
một loại khung (Ngô Văn Thụ, 1978).
Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào cấu
tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6C3C6, flavonoid đƣợc phân thành các nhóm
sau: Eucoflavonoid: flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon,
antocyanin,anthocyanidin.

10
Hình 1.3. Một số Eucoflavonoid
- Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh
thảo, cây la apirenin và luteolin.
- Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc - Asteraceac tập trung nhiều
nhất ở vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tƣơng, Trinh nữ hoàng cung, Dƣơng
xỉ…). Không tìm thấy ở động vật.
- Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid.
Hình 1.4. Cấu tạo Isoflavon và rotenoid
- Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid

11
Hình 1.5. Cấu tạo Calophyllolid
1.2.2.3. Tính chất của flavonoid
Tính chất đặc trung của các hợp chất flavonoid là phản ứng xianidin (hỗn hợp
Mg + HCl trong môi trƣờng cồn etylic) hƣớng H+ vào nối đôi của vòng C.
Các hợp chất flavonoid tham gia phản ứng phân hủy kiềm (đen hồi lƣu với
dung dịch KOH 30 – 50%) sẽ mở vòng piron (đối với các nhóm có sự đóng vòng
C) rồi dẫn đến tạo thành các dẫn xuất acid thơm, phenol, acid acetic. Tùy theo
nhóm thế vào vị trí thế với vòng A, B mà có các dẫn xuất acid thơm và phenol khác
nhau.
Ngoài ra cấu trúc các hợp chất flavonoid có hai vòng benzen nên nó tham gia
đầy đủ các phản ứng nhƣ nhân thơm bình thƣờng, (Ngô Văn Thụ, 1978).
1.2.2.4. Vai trò
Một số dẫn chất của flavonoid có tác dụng thông tiểu nhƣ quecxitrin có trong
lá diếp cá, scoperozit có trong cây Sarothamnus scoparius K
Một số có tác dụng kháng khuẩn nhƣ acvicularin, guajaverin.
Các flavonoid của cam thảo có tác dụng chống loét dạ dày và tá tràng.
Một số flavonoid có tác dụng chống dị ứng.
Một số isoflavonoid thuộc nhóm rotenoid ví dụ nhƣ rotenone thì có tác dụng
diệt côn trùng.

12
Đặc biệt, flavonoid còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và
giảm tính giòn và tính thấm của thành mạch (Ngô Văn Thụ, 1978).
Steroid
1.2.3.
1.2.3.1. Đặc điểm
Steroid là một loại hợp chất hữu cơ. Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử
cacbon liên kết với nhau mang hình thức của bốn vòng hợp nhất: ba vòng
cyclohexane (đƣợc xem nhƣ là vòng A, B, và C trong hình bên phải) và một vòng
cyclopentane (vòng D). Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn
liền với cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng.
Steroid là các hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc
tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm
cả các sterol và acid mật, thƣợng thận, và kích thích tố giới tính. Một số steroid có
nguồn gốc thiên nhiên nhƣ: hợp chất digitalis, và các tiền chất của một số loại
vitamine nhất định. Steroid rất đa dạng và phong phú, bao gồm các hình thức của
một số loại vitamine D, digitalis, sterol (ví dụ: cholesterol) và các acid mật.
Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid, với một nhóm hydroxyl tại vị trí - 3
và một khung lấy từ cholestane (G.P.Moss, 1989).
Hình 1.6. Cấu tạo Steroid
1.2.3.3. Tính chất
Steroid dể tan trong chloroform, ete, rƣợu nóng, không tan trong nƣớc.

13
Trong cơ thể steroid bị oxy hóa tạo ra các dẫn xuất axid cholic, dezoxy -
cholic có trong mật giúp tạo nhũ và hấp thụ lipid ở ruột.
Steroid có thể bị oxy hóa tạo ra các hoocmone sinh dục đực và sinh dục cái.
1.2.3.4. Vai trò
Trong ngành sinh lý học và y học, các steroid quan trọng nhất là cholesterol,
và các hocmone, và các tiền chất của chúng. Steroid điều khiển một số các quá
trình trao đổi chất của cơ thể. Tất cả các hocmone giới tính tự nhiên đều là steroid.
Các hocmone steroid của vỏ thƣợng thận bao gồm Glucocorticoids nhƣ các nhánh
cortisone, cortisol, mineralocorticoids và aldosterone. Steroid phân tử cơ bản có
cấu trúc bao gồm 4 vòng carbon nối liền với nhau, các lớp khác nhau của steroid có
chức năng khác nhau nhƣ Anabolic steroid tăng khối lƣợng cơ bắp, steroid chống
viêm (hoặc corticosteroid) có thể làm giảm sƣng , đau , và làm dịu các biểu hiện
khác của viêm.
Tanin
1.2.4.
Là một hợp chất polyphenol đa nguyên tử với nhóm chức quan trọng nhất là
nhóm phenolic hydroxyl, có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các
hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid). Và tính thuộc da đƣợc
xem nhƣ một tiêu chuẩn cơ bản để xếp các nhóm hợp chất khác vào tanins.
Hình 1.7. Cấu tạo Tanin

14
Có thể chia làm 2 loại chính:
Tanin thuỷ phân đƣợc hay tanin pyrogallic. Loại tanin này có những đặc
điểm sau:
Khi thuỷ phân bằng acid hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra phần
đƣờng thƣờng là glucose, đôi khi gặp đƣờng đặc biệt ví dụ đƣờng hamamelose
(xem công thức hamamelitanin ở phần dƣới). Phần không phải là đƣờng là các
acid.Acid hay gặp là acid gallic. Các acid gallic nối với nhau theo dây nối depsid để
tạo thành acid digallic, trigallic.
Hình 1.8. Cấu tạo Acid digallic và Acid trigallic
- Khi cất khô ở 180-200o
C thì thu đƣợc pyrogallol là chủ yếu.
Một số loại Tanin thuộc loại pyrogallol:

15
Hình 1.9. Cấu tạo penta-O-galloyl-glucose.
1.2.4.3. Tính chất của tanin
- Tanin thƣờng là bột vô định hình từ màu ngả vàng cho đến màu nâu sáng,
không mùi hoặc mùi rất nhẹ, vị rất chát, gây săn se niêm mạc.
- Khối lƣợng phân tử từ 500 – 20000, điểm chảy không cố định mà thay đổi
tùy cách chiết xuất, phân lập.
- Tanin thƣờng là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân
cực nhƣ cồn, glycerin, aceton…
- Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ
- Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)
- Tạo phức tủa bền với các dun dịch của protein (Albumin, Gelatin…) nên có
tính thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nƣớc, không bị trƣơng phồng hay thối rửa.
1.2.4.4. Vai trò của tanin
Tanin đƣợc dùng làm thuốc bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng
nhƣ thuốc trừ sâu.
Trong y học tanin còn đƣợc dùng là chất kháng khuẩn, thƣờng dùng làm
thuốc súc miệng. Ngoài ra tanin còn có công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy.

16
Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật
1.3.
Định nghĩa tách chiết hợp chất hợp chất từ thực vật
1.3.1.
Tách chiết là phƣơng pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các
mô thực vật. Sản phẩm thu đƣợc của quá trình tách chiết là một dung dịch chứa các
chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này đƣợc gọi là dịch chiết. Có ba quá trình
quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:
- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Các yếu tố ảnh hƣởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi,
nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thƣớc tiểu phân bột dƣợc liệu...) sẽ
quyết định chất lƣợng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Các phƣơng pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phƣơng pháp ngâm
dƣợc liệu đƣợc ngâm trong 1 lƣợng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để
các chất tan trong dƣợc liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó đƣợc rút hết ra
và dung môi mới đƣợc thêm vào và quá trình ngâm - chiết đƣợc lập lại cho tới khi
lấy hết các chất khỏi dƣợc liệu. Trong phƣơng pháp chiết kiệt, dung mội đƣợc dịch
chuyển trong khối dƣợc liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong
quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dƣợc liệu tan vào dung môi và nồng độ
dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dƣợc liệu. Nhƣ vậy, chiết
kiệt là 1 quá trình chiết ngƣợc dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối
khối dƣợc liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dƣợc liệu có lƣợng hoạt chất thấp nhất
do vậy quá trình chiết đƣợc thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các
hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất
kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì
phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác
nhau là dung môi hay đƣợc dùng. Cồn có thể hòa tan đƣợc nhiều nhóm hoạt chất,

17
không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trƣờng hợp, dƣợc liệu tƣơi đƣợc thả
từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển nhƣ trên, các kỹ thuật chiết mới nhƣ chiết với
sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dƣới áp suất
cao v.v... đã đƣợc phát triển để nâng cao hiệu quả cũng nhƣ chất lƣợng chiết xuất.
Các phương pháp tách chiết cao từ thực vật
1.3.2.
1.3.2.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Nguyên tắc của sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan
tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các
hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các
hợp chất có tính phân cực mạnh.
Việc chiết lỏng – lỏng đƣợc thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô
ban đầu đƣợc hoà tan vào pha nƣớc. Sử dụng lần lƣợt các dung môi hữu cơ, loại
không hoà tan với nƣớc hoặc loại có thể hỗn hợp đƣợc với nƣớc để chiết ra khỏi
pha nƣớc các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung
môi).
Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nƣớc mà pha hữu cơ nằm ở lớp
trên hoặc ở dƣới so với pha nƣớc.
Việc chiết đƣợc thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến
dung môi phân cực ví dụ nhƣ: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,
buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi
lần một lƣợng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào
dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các
lần chiết đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4,
MgSO4, CaSO4…, đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết.
1.3.2.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn
a. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn
kém, phức tạp.

18
Hình 1.10. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy
bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa
đặt bên dƣới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng
để chứa dung môi tinh khiết.
Bột cây đƣợc xay thô đạt kích cỡ thích hợp. Mẫu không nên to vì sẽ chiết
không kiệt, mẫu xay quá mịn sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt đƣợc
lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây đƣợc đặt vào bình, lên trên lớp
bông thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn
lên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp
bột. Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía
trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.
Để yên sau một thời gian, thƣờng là 12 – 24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho
dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh
khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết
chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.

19
b. Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ,
bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan
một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây.
Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ
yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm
vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch
chiết đƣợc lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ đƣợc cao chiết. Tiếp
theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một
lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp
bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm
dung dịch chiết bị trào ra ngoài).
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lƣợng dung môi cố
định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không
thể hòa tan thêm đƣợc nhiều hơn: có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết
là chiết nhiều lần, mỗi lần một lƣợng ít dung môi.
Dung môi sau khi đƣợc thu hồi, đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan
và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[5]

20
Hình 1.11. Bộ chiết Soxhlet
c. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa
Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống nhƣ máy chiết
Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây đƣợc đặt gần nguồn nhiệt hơn.
Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng
tìm thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này)
và ống ngƣng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết đƣợc rót ra và
lọc ngang giấy lọc. Dung môi đƣợc cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần nhƣ
thế đến khi chiết kiệt.[5]

21
Hình 1.12. Máy chiết Kumagawa
d. Phương pháp chưng cất
Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành
hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ
yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chƣng cất.
Hình 1.13. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc
Dụng cụ: Có thể tự ráp lấy hệ thống lôi cuốn hơi nƣớc kiểu cổ điển với những
dụng cụ thủ tinh có sẵn trong phòng thí nghiệm (bình cầu, erlen, bếp đun, ống

22
ngƣng hơi nƣớc, các ống nối bằng thủy tinh…) hoặc theo kiểu cải tiến Dean - Stark
(là tên của 2 nhà khoa học) với nguyên tắc giống nhƣ kiểu cổ điển nhƣng hệ thống
gọn gàng hơn, nhờ sử dụng một ống gạn. Kiểu cải tiến Dean - Stark có hai loại ống
gạn: để sử dụng với loại tinh dầu nhẹ hơn nƣớc hoặc loại nặng hơn nƣớc. Trên
thành ống gạn có khắc các vạch (ml) để giúp biết ngay thể tích tinh dầu vừa đƣợc
lôi cuốn.
Thực hành: Sự lôi cuốn hơi nƣớc thƣờng đƣợc thực hiện trên cây tƣơi mới thu
hái về. Mẫu cây đƣợc cắt nhuyễn, đƣợc đặt vào bình cầu, cho nƣớc cất vào bình sao
cho phần thể tích mẫu cây và nƣớc chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ
thống và cắm bếp điện đun nóng.
Nƣớc trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nƣớc bay
lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ trở lại thể
lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nƣớc
và lớp tinh dầu.[5]
e. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn
Nguyên lý của phƣơng pháp siêu tới hạn: Đối với một chất thông thƣờng,
dƣới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng
thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa
lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất
lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt
gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều
đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian
giữa khí và lỏng.

23
Hình 1.14. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn
Vì vậy khi CO2 đƣợc đƣa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn
(31 ), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn.
Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tƣợng cần tách ra
khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ
cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài
còn sản phẩm đƣợc tháo ra ở bình hứng.
Trích ly bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn cho các sản phẩm tự nhiên có
hoạt tính sinh học cao. Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở áp suất cao và nhiệt độ vừa
phải để trích ly nên các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sẽ không bị phân hủy.
Sự thay đổi áp suất và nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chọn lọc các chất hòa tan, nhờ
đó có thể phân đoạn sản phẩm ly trích ở các nồng độ cao thấp khác nhau. CO2 sau
khi trích sẽ hoàn toàn tách ra ở dạng khí sau khi giảm áp nên sản phẩm có thể đƣợc
coi là 100% sạch không dung môi độc hại, đem lại giá trị sử dụng và giá trị thƣơng
mại cao cho sản phẩm trích ly.[33]
f. Kỹ thuật chiết pha rắn
Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai
pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nƣớc hoặc dung môi
hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn.

24
Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silica gel xốp trung tính,
hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã đƣợc ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc
hydrocarbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu
cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ
(thƣờng là cột có kích thƣớc 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với
đƣờng kính 3 – 4 cm (đĩa chiết).
Hình 1.15. Cột chiết pha rắn
Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ,
dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng
tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại
trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu.
Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi
thích hợp.
Phương pháp tách chiết cao một số chất từ thực vật
1.3.3.
1.3.3.1. Tách chiết hợp chất alkaloid
Cơ sở và nguyên tắc tách chiết alkaloid:
- Dựa vào những định luật chi phối của quá trình tách chiết là khuếch tán,
thẩm thấu, thẩm tích, độ hòa tan.
- Dựa vào khả năng hòa tan của alkaloid trong các dung môi hữu cơ, vo cơ và
nƣớc mà ta tiến hành tách chiết các alkaloid ra khỏi nguyên liệu.
- Dựa vào các tính chất lí hóa của alkaloid mà ta tiến hành tách chiết và tinh
sạch.

25
Các phƣơng pháp đƣợc áp dụng để tách chiết alkaloid:
- Tách chiết bằng dung môi hữu cơ.
- Tách chiết bằng dung dịch acid vô cơ hoặc hữu cơ
1.3.3.2. Tách chiết hợp chất flavonoid
Không có một phƣơng pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nƣớc và trong các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycosid thƣờng dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan
trong dung môi kém phân cực. Thông thƣờng để chiết các flavonoid glycoside,
ngƣời ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nƣớc
nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng
độ khác nhau và nƣớc thƣờng chiết đƣợc phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp
CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy flavonoid. Các
chất anthocyanin thƣờng kém bền vững nhất là các acyl anthocyanin đƣợc acyl hoá
với các acid aliphatic do đó ngƣời ta thƣờng chiết bằng methanol có mặt của các
acid yếu nhƣ acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Đối với những chất dễ bị
biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì
nên làm đông khô.
Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, ngƣời ta dùng muối chì để kết tủa.
Sau khi thu tủa ngƣời ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid đƣợc
giải phóng.
1.3.3.3. Tách chiết hợp chất tanin
Tanin hầu nhƣ không tan trong các dung môi kém phân cực, tan đƣợc trong
cồn loãng, tốt nhất là nƣớc nóng. Hiệu suất chiết đƣợc nâng cao nếu đƣợc tác động
bằng siêu âm. Sau khi chiết bằng nƣớc, có thể tủa tanin bằng (NH4)2SO4, lọc, lấy
tủa, hoà lại trong aceton nƣớc (6:1), cất đến khô rồi rửa bằng ether. Trong quá trình
chiết xuất, muốn tránh sự oxy hoá thì có thể cho thêm vào dịch chiết một ít acid
ascorbic hoặc metabisulfit. Muốn tách tanin ngƣời ta thƣờng chiết từng phân đoạn
theo độ phân cực của dung môi rồi sắc ký qua gel với Sephadex hoặc sắc ký điều

26
chế với chất hấp phụ là polyamid, triển khai bằng cồn nƣớc với các độ cồn khác
nhau, cũng có thể tách bằng sắc ký giấy (Ngô Văn Thụ, 1978).
1.3.3.4. Tách chiết hợp chất steroid
Đặc tính của sdteroid là không phân cực, nên rất kém tan trong nƣớc, nhƣng
tan trong dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực nhƣ eter, dầu hỏa,
benzene, chloroform, aceton,… nên dùng các chất này để tách chiết.
Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ thƣờng là hỗn hợp của steroid và các
chất béo, các chất kém phân cực khác trong nguyên liệu nhƣ: lipid, caraten. Phải
thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi steroid, sau đó chiết
steroid bằng dung môi hữu cơ. Thực hiện sắc ký (cột, bản mỏng, giấy…) để phân
lập hoặc kết tinh phân đoạn để tinh chế steroid.
Cơ sở khoa học kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp có trong thực
1.4.
vật
Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn
1.4.1.
Là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự
phát triển của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử,
hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi
khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa. Thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các
loài vi khuẩn khác nhau với một nồng độ rất nhỏ (Nguyễn Thƣợng Hiền, 2010).
Cơ chế kháng khuẩn của một số hợp chất ở thực vật
1.4.2.
Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật bao gồm việc phá vỡ
màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng
chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây
đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của
tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant
secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi
tác động tƣơng tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hƣởng tác động tới hoạt
động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013).

27
- Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. Do tác động lên quá
trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi
áp suất thẩm thấu.
- Ức chế chức năng của màng tế bào: Cơ chế làm mất chức năng của màng
làm cho các phân tử có kích thƣớc lớn và các ion bị thoát ra ngoài
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:
+ Nhóm amino glycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome
làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
+ Nhóm chlorarnphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các aid amin mới vào chuỗi polypeptide.
+ Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
- Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid:
+ Nhóm rifampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao
mã tạo thành mRNA.
+ Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
+ Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
+ Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.

28
Hình 1.16. Cơ chế kháng khuẩn
Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của thực vật ở thế giới
1.4.3.
và tại Việt Nam
1.4.3.1. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới
Tại các nƣớc châu Âu: Anh, Pháp, đặc biệt Đức là quốc gia tiến bộ nhất có
nhiều công trình nghiên cứu khoa học về thảo dƣợc. Tại Đức, một ủy ban gồm
nhiều bác sĩ, dƣợc sĩ, chuyên gia về chất độc đã hoàn thành một tài liệu với trên
400 chuyên đề mô tả công dụng, tác dụng phụ, phân lƣợng của nhiều loài thảo dƣợc
khác nhau.
Tại Mỹ, thảo dƣợc rất thông dụng với thổ dân bản xứ. Cơ quan The American
Botanical Council, Austin – Texas, dựa vào hai công trình của Đức và Anh, đã soạn
thảo một tài liệu nói về 26 loài thảo dƣợc thông dụng. Những năm gần đây, Viện
Sức Khỏe Hoa Kỳ đã thành lập một trung tâm nghiên cứu về thảo dƣợc.
Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh đƣợc công dụng
diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích đƣợc
hợp chất Alicin trong tỏi có công dụng nhƣ thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác
tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nƣớc tinh chất từ tỏi có thể chữa đƣợc nhiều
bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella.

29
Vào năm 1967, Binz đã chứng minh đƣợc quinin rất độc với Paramecium.
Quinin ở nồng độ 1/20000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium để điều trị các
bệnh do Paramecium gây ra.
Năm 1877, R.Koch đã nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều
loại tinh dầu. Cũng trong thời gian này, Chamberland đã chứng minh rằng nhiều
loại tinh dầu có khả năng kháng khuẩn, các thí nghiệm này đƣợc nhiều ngƣời nhƣ
Cadeae, Mennic, Bering… tiếp tục nghiên cứu.
1.4.3.2. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam
Năm 1959, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc có tác
dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hƣởng cùng cộng sự đƣa ra chế
phẩm Tô Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng
khuẩn
Năm 2012, Trần Ngọc Hùng và Trƣơng Thị Thành Vinh đã nghiên cứu bƣớc
đầu trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất từ cây cỏ mực
(Eclipta prostrata L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococus spp.
Qua 20 năm nghiên cứu theo dõi trên động vật và ngƣời (1987-2007) tập thể
của các cán bộ khoa học của Học Viện Quân Y, Viện Lão Khoa, Viện Quân Y 103,
Bệnh Viện Lao Và Bệnh Phổi TW, Bệnh Viện Xanh Pôn, Bệnh Viện U Bƣớu Hà
Nội,.. đã chiết xuất thành công Cao toàn phần của loài Azolla microphylla có tên là
Phylamin đƣợc thƣơng mại hóa dƣới tên “Mediphylamin”
Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hƣơng đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn
của cao chiết từ tỏi (Allium sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời.
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration - MIC)
1.4.4.
ở cao chiết thực vật
1.4.4.1. Khái niệm MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration - MIC) là nồng
độ thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi sinh
vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy.

30
1.4.4.2. Ý nghĩa của chỉ số MIC
- Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn có thể áp dụng cho các
phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện tuyến tỉnh, bện viện khu vực, bện
viện tuyến trung ƣơng, các viện vệ sinh dịch tễ và các cơ sở nghiên cứu.
- Phƣơng pháp chuẩn thức đƣợc áp dụng nhằm xác định nồng độ chất diệt
khuẩn nhỏ nhất ức chế đƣợc sự phát triển của vi khuẩn giúp cho việc nghiên cứu
lựa chọn và tính toán liều dùng khi áp dụng trên ngƣời. Phƣơng pháp này giúp cho
con ngƣời biết đƣợc nồng độ ức chế và tiêu diệt đối với từng loại vi khuẩn với nồng
độ chất diệt khuẩn thích hợp để chế tạo ra sản phẩm thƣơng mại hoặc sử dụng trong
y học
- Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn
phù hợp với từng loại vi sinh vật...Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa
vào dữ liệu MIC. Chọn đƣợc nồng độ tối ƣu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn
kháng thuốc.
- Ngoài ra còn có ý nghĩa về:
+ Dƣợc động học (pharmacokinetucs = PK): là sự thay đổi nồng độ của chất
diệt khuẩn thay đổi theo thời gian.
+ Dƣợc lực học (pharmacodynamics = PD) : là mối quan hệ giữa nồng độ với
hiệu quả của một chất diệt khuẩn trên vi sinh vật gây bệnh
Các nhóm vi khuẩn gây hại phổ biến ở ngƣời
1.5.
Nhóm Escherichia coli
1.5.1.

31
Hình 1.17. Hình vi khuẩn Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) là một loại trực khuẩn đƣờng ruột sống ở ruột già,
xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ sau khi sinh 2h và tồn tại đến khi cơ thể động
vật chết.
E. coli có hình gậy ngắn, kích thƣớc 2 – 3 x 0,6 µm.
Phần lớn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhƣng một số không
thấy di động.
Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu Gram (-),
có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn.
Bình thƣờng E. coli cƣ trú ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay phía
trƣớc của ruột non. Khi sức đề kháng của con vật giảm, E. coli mới phát triển
mạnh, tăng cƣờng độc lực và gây bệnh cho cơ thể.
Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp, có đủ ba loại kháng nguyên
O, H, K. Kháng nguyên K có 3 loại: L, A, B nên E. coli có nhiều typ huyết thanh
khác nhau, có ít nhất 130 kháng nguyên O, 80 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên
H.

32
1.5.1.2. Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đƣờng tiểu, với cơ thể yếu
thì gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy.
 Bệnh tiêu chảy do E. coli: các E.coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời gồm
có:
Entertoxigenic E. coli (ETEC): là loại E. coli sinh độc tố ruột. ETEC là một
nguyên nhân quan trọng gây bệnh tiêu chảy nặng, thƣờng xẩy ra ở các xứ nhiệt đới
và có thể gặp ở các lứa tuổi khác nhau, nhƣng đặc biệt ở trẻ nhỏ thƣờng thấy bệnh
cận lâm sàng nặng dể dẫn tới tình trạng kiệt nƣớc và rối loạn điện giải. ETEC còn
là nguyên nhân thƣờng gây tiêu chảy cho khách du lịch từ các nƣớc phát triển sang
các nƣớc đang phát triển.
Enteropathogenic E. coli (EPEC): EPEC hiện nay đƣợc biết gồm một số type
huyết thanh thƣờng gây bệnh tiêu chảy cấp (bệnh viêm dạ dày – ruột) ở trẻ nhỏ (trẻ
dƣới một tuổi), có thể gây thành dịch.
Enteroinvasive E. coli (EIEC): là loại E. coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời lớn
và trẻ em với các triêu chứng nhƣ đau bụng quặn, mót rặn, đi tiêu nhiều lần, phân
có nhiều mũi nhầy và máu.
Enteroadherent E. coli (EAEC): là loại E. coli bám dính đƣờng ruột gây bệnh
do bám và niêm mạc và làm tổn thƣơng chức năng ruột.
Nhóm Samonella.
1.5.2.
Salmonella là trực khuẩn gram âm, có khả năng di động, kích thƣớc tế bào
khoảng 0,5 – 3 µm. Là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370
C,
pH tối ƣu 7,2 – 7,6.

33
Hình 1.18. Hình vi khuẩn Salmonella
Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng miệng và hầu hết là do ăn phải
thức ăn bị nhiễm nhƣ thực phẩm, sữa, nƣớc uống… Sau khi xuyên qua hàng rào
acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1
màng nhày và vào thành ruột.
Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân ngƣời hay động vật, từ
ngƣời bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của
chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng
nhiễm vào các thực phẩm không đƣợc bảo quản kĩ, trong quá trình giết mổ cũng
cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn
thực phẩm.
Khả năng gây bệnh của một số loài:
- Salmonella typhi: chỉ gây bệnh ở ngƣời. Ở nƣớc ta bệnh thƣơng hàn chủ yếu
do S.typhi gây ra
- Salmonella paratyphi A: chỉ gây bệnh thƣơng hàn cho ngƣời và cũng hay
gặp ở nƣớc ta sau S.typhi
- Salmonella paratyphi B: gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu cho ngƣời, đôi khi ở
cả súc vật. Bệnh thƣờng gặp ở các nƣớc châu Âu
- Salmonella paratyphi C: gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu, viêm dạ dày ruột và
nhiễm khuẩn huyết. Bệnh thƣờng gặp ở các nƣớc Đông Nam Á

34
- Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis: Gây bệnh cho ngƣời và
gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm đọc
do thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella
- Salmonella cholera suis: loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết
Bacillus sppp
1.5.3.
Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thƣớc 0,5
– 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động,
có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào,
kích thƣớc từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào
tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100o
C trong 180 phút), chịu ẩm, tia
tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài
chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus
subtilis trong 200 – 300 năm.
Hình 1.19. Hình vi khuẩn Bacullus spp.
Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, chúng
có khả năng tạo ra bào tử gần nhƣ hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông"

35
trong thời gian dài. Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa
số là vô hại.
Hai loài đƣợc xem là quan trọng về mặt y học là Bacillus anthracis (gây
ra anthrax) và Bacillus cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tƣơng
tự Staphylococcus). Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus
subtilis và Bacillus coagulans. B. subtilis là một sinh vật hiếu khí sống ký sinh có
bào tử có thể sống sót trong độ nóng cao thƣờng thấy khi nấu ăn. Nó chính là tác
nhân làm cho bánh mì hƣ. B. coagulans có thể phát triến đến tận mức pH 4.2 và
gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính
acid mà bình thƣờng có thể khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp
nhất). Ấu trùng Paenibacillus gây ra các chứng bệnh của ong mật ở ong mật.
Staphylococcus arueus
1.5.4.
Staphylococus aureus là tụ cầu khuẩn gram dƣơng, không di động, không sinh
bào tử, có đƣờng kính < 1µm. S.aureus thƣờng đứng thành từng cụm giống nhƣ
chum nhỏ và xắp xếp theo mọi hƣớng.
Hình 1.20. Hình vi khuẩn Staphylococcus arueus

36
Ở ngƣời khoẻ mạnh mang khoảng 30% Staphylococus aureu ở trên da và
niêm mạc, khi có những tổn thƣơng ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức
năng thì các nhiễm trùng do Staphylococus aureus dễ dàng xuất hiện.
Staphylococus aureus gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng,
nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. Staphylococus aureus còn có
khả năng hình thành độc tố ruột trong thực phẩm, do đó nó có thể hình thành nên
chứng nhiễm độc.
Nhóm Listeria spp.
1.5.5.
Listeria sppp. là trực khuẩn gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi phát
triển ở nhiệt độ từ 1-450
C, không sinh bào tử, có long ở một đầu nên có thể di động
Listeria sppp. là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5 , chiều dài
khoảng 1-2. Vi khuẩn thƣờng đứng riêng lẻ hoặc nối với nhau thành một chuỗi. vi
khuẩn có thể tồn tại ở pH từ 4,3-9,6.
Hình 1.21. Hình vi khuẩn Listeria monocytogenes
Nhóm vi khuẩn Listeria sppp. có khoảng 10 loài và rất hiếm gây bệnh ở ngƣời
trừ vi khuẩn Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) gây ra một căn bệnh gọi
là listeriosis gây bệnh ở cả ngƣời và động vật. L. monocytogenes là tác nhân gây
chết đặc biệt là ở trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô

37
cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. L. monocytogenes tác động
vào hệ thần kinh trung ƣơng và có dấu hiệu lâm sàng là viêm màng não.
Ở phụ nữ mang thai, khi ngƣời mẹ bị nhiễm L. mococytogenes thì không có
triệu chứng rõ ràng hoặc chỉ có triệu chứng nhẹ nhƣ bị cảm cúm trong khi bào thai
và thai nhi lại bị ảnh hƣởng nghiêm trọng hơn bao gồm sẩy thai, chết non, viêm
màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Vi khuẩn L. monocytogenes còn gây
nhiễm định vị nhƣ viêm màng kết, nhiễm trên da, bệnh của hạch bạch huyết.

38
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.
Địa điểm nghiên cứu
2.1.1.
Địa điểm thu mẫu: Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –
Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM.
Thời gian nghiên cứu
2.1.2.
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 30/04/2017 đến tháng 16/07/2017
Vật liệu nghiên cứu
2.2.
Nguồn mẫu
2.2.1.
Lá cây Lá đắng đƣợc lấy từ Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh thời gian
hái lá từ 9h đến 11h giờ sáng cho vào túi nilong vô trùng và vận chuyển về phòng
thí nghiệm để tiến hành các thí nghiệm.
Hình 2.1. Hình ảnh cây Lá đắng
Vi sinh vật chỉ thị
2.2.2.
Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 5 chủng vi khuẩn đƣợc
cung cấp bởi Viện sinh Học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh, bao gồm:
- Vi khuẩn Salmonella
- Vi khuẩn E. Coli
- Vi khuẩn Staphylococcus arueus

39
- Vi khuẩn Bacillus Cereus
- Vi khuẩn Listeria monocytogenes
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.3.
2.2.3.1. Hóa chất – môi trường
- Môi trƣờng NB (Nutrient Broth) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trƣờng EMB (Eosin Methylene Blue Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trƣờng XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc)
- Ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90% (Việt Nam)
2.2.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Pipet 1ml, 10ml
- Micropipette 100ml, 100ml
- Bình chứ môi trƣờng 250ml, 500ml
- Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
- Đầu tuýp 100µl, 1000µl
- Que cấy vòng, que trang, que gắp
- Đèn cồn
- Thƣớc đo
- Bông gòn thấm và không thấm
- Đũa thủy tinh
- Ống đục lỗ đƣờng kính 6mm
2.2.3.3. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
- Tủ ủ (Memmert Germany)
- Tủ lạnh Toshiba
- Autolave (Huxky Đài Loan)

40
- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
- Cân phân tích (Orbital Germany)
- Bếp từ (Billy – England)
- Máy nƣớc cất (Branstead USA)
Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.
Phương pháp xử lí nguồn mẫu
2.3.1.
Lá cây sau khi thu hái về đƣợc rữa sạch bằng nƣớc máy, để ráo trong bóng
râm rồi giã nhỏ để ngâm mẫu tiến hành các thí nghiệm.
Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
2.3.2.
Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có
thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào
là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể
nƣớc trong tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm
hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol.
Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp rồi hút 1 ml
dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa
sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ
lạnh -150
C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007).
Phương pháp pha loãng mẫu
2.3.3.
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có
vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở
các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân
tích vi sinh vật. Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử
dụng trong trƣờng hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi
sinh vật trong mẫu.
Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa
9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1
. Tiếp tục từ
ống nghiệm 10-1
hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha

41
loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc
nồng độ cần thiết.
Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha
loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-1
. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml
dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch
pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2
. Và tiếp tục pha loãng tƣơng tự nhƣ mẫu
lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị
2.3.4.
Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn đang đƣợc bảo quản phát triển lại
bình thƣờng vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bƣớc
đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh
dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh
dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh
vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi
chất giữa vi sinh vật và môi trƣờng.
Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc
giữ trên môi trƣờng NB hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh
khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB. Sau đó tiến hành lắc với
tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên
làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).
Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật
2.3.5.
Mẫu thực vật đƣợc tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phƣơng
pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thƣờng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi,
loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp.
Nguyên tắc phƣơng pháp chiết ngâm: mẫu thực vật đƣợc ngâm trong dung
môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào
dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3

42
giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán
các chất tan.
Mục đích: Thu hồi cao chiết thực vật ở dạng cao đặc với độ ẩm < 20% để tiến
hành các thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành: Mẫu đã xử lí cân và ngâm với dung môi thích hợp trong vòng 24
giờ, sau đó lọc lấy dịch lọc. Tiến hành cô cách thủy ở 700
C dịch lọc tới khô thu
đƣợc cao chiết. Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn
bằng cách khuấy hoặc rút dịch chiết ở dƣới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cƣỡng bức
dung môi) (Nguyễn Thƣợng Đông và Đặng Quang Chung, 2008).
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật
2.3.6.
Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch
hay còn gọi là phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch.
Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào
trong môi trƣờng thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả
năng ức chế vi khuẩn thì xuất hiện vòng ức chế xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác
định đƣợc hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đƣờng kính vòng ức chế
(mm).
Cách thực hiện: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa với mật độ thích
hợp cho vào môi trƣờng NA (hoặc các môi trƣờng thích hợp với từng vi khuẩn) và
tiến hành trang đều đến khô. Sau đó dùng ống đục lỗ có đƣờng kính 6mm tạo các
giếng trên mặt đĩa thạch, hút dịch cao chiết thực vật vào giếng, ngay tại giếng các
chất kháng khuẩn trong dịch cao chiết thực vật khuếch tán vào môi trƣờng thạch và
đối kháng với vi sinh vật chỉ thị, ngăn cản hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật
chỉ thị xung quanh giếng (Aibinu và ctv, 2007).
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
2.3.7.
Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trƣờng lỏng
(broth dilution method)

43
Nguyên tắc: dựa trên sự thay đổi độ dục của dung dịch chƣa dịch cao chiết và
dịch vi khuẩn. Quan sát độ đục kết luận nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp
nhất mà tại đó ống nghiệm không bị đục.
Phƣơng pháp xử lí số liệu
2.3.8.
Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lí thống kê theo phƣơng pháp thống kê sinh
học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel. Kết quả
thí nghiệm đƣợc đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm bằng
phƣơng pháp thống kê trong Statgraphic Centurion XV veusion 15.1.02 với trắc
nghiệm Tukey.
Bố trí thí nghiệm
2.4.
Tiến trình thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá
đắng đƣợc trình bày ở hình 2.1:

44
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Mẫu cây
Xử lí mẫu
Khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn cao tổng
Xác định MIC
Cao tổng từ các loại
dung môi khác nhau
Tách chiết cao chiết từ
các dung môi khác nhau
Đánh giá hiệu suất thu
hồi cao chiết

45
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu
2.4.1.
suất thu hồi cao từ cây lá đắng.
Hình 2.4. Mẫu ngâm trong dung môi
Mẫu cây
Xử lí mẫu
Ngâm dung môi
Tỉ lệ 1/3(w/v) trong 24
giờ
Dung môi
Nƣớc
Ethanol
500
Ethanol
700
Ethanol
900
Lọc tinh
Bảo quản
lạnh 40
C
Cô cách thủy
(700
C)
Dịch lọc
Cao thuốc

46
Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt
2.4.2.
tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng.
Hình 2.4. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết
Đầu tiên đối với vi sinh vật chỉ thị tiến hành quy trình tăng sinh. Sử dụng que
cấy vòng lấy sinh khối của các chủng vi sinh vật chỉ thị từ các ependoff giữ giống
sang các erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bƣớc sóng 600 nm để xác
định mật độ vi khuẩn và dịch vi khuẩn đƣợc pha loãng để đạt mật độ 106
cfu/ml.
Hút 100 µl dịch đã pha loãng cho vào đĩa NA, EMB, XLD trang đều đĩa cho đến
khi dịch khô, dùng ống trụ kim loại có đƣờng kính 6 mm tiến hành đục 3 lỗ trên
đĩa.
Ủ 370
C/24 giờ
Tăng sinh trong
môi trƣờng NB
Đo OD600nm
Pha loãng về 106
cfu/ml
Đỗ đĩa
Đục lỗ (d = 6mm)
Môi trƣờng NA,
XLD,EMB
Đọc kết quả
Cao chiết
Dịch cao chiết
+DMSO 10%
Cấy trang
Nhỏ dịch

47
Đối với cao chiết cần khảo sát tiến hành pha trong DMSO 10% để đạt nồng
độ 1 g/ml. Sử dụng micropipette hút dịch cao chiết cho vào các lỗ đã đƣợc đục trên
đĩa, tiến hành ủ ở 370
C trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn
có trên đĩa.
Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
2.4.3.
Hình 2.6. Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Đầu tiên tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị bằng cách sử dụng que cấy
vòng lấy sinh khối sau đó cấy vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB, đem lắc ở 150
vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bƣớc
Tăng sinh trong
môi trƣờng NB
Đo OD600nm
Pha loãng về 106
cfu/ml
Môi trƣờng NB
Ủ 370
C/24 giờ
Ống nghiệm vô trùng
Cao chiết
Pha loãng
nhiều nồng độ
theo cấp số 2
+DMSO 10%
Quan sát độ đục
Xác định MIC

48
sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và sau đó pha loãng về mật độ 106
cfu/ml.
Cao chiết ethanol 50% đƣợc hòa tan với DMSO 10% thành dãy nồng độ theo
cơ số 2 từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml. Hút a ml cao chiết từ các dãy nồng độ khác
nhau cho vào ống nghiệm có chứa sẵn môi trƣờng NB. Dịch cao chiết bổ sung vào
ống nghiệm với tỷ lệ 1:3 (v/v). Sau đó hút dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho vào
ống nghiệm. Đối với đối chứng dƣơng chỉ có dịch cao chiết và môi trƣờng dinh
dƣỡng không chứa vi sinh vật chỉ thị, đối chứng âm chứa môi trƣờng dinh dƣỡng
và vi sinh vật chỉ thị không chứa cao chiết. Tất cả ống nghiệm đƣợc đem ủ ở 370
C
trong 24 giờ.
Tiến hành đọc kết quả bằng cách so độ đục của các ống nghiệm thử nghiệm
với đối chứng dƣơng.

49
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ
3.1.
cây lá đắng.
Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác
nhau từ cây lá đắng.
Dựa vào hình 3.1 nhận thấy rằng hiệu suất tách chiết cao lá đắng của các
dung môi khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Kết quả tách chiết cao cho thấy hiệu suất cao của các dung môi nƣớc, ethanol
50%, ethanol 70% không có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về măt thống kê.
Trong đó, hiệu suất tách chiết của dung môi ethanol 70% lớn nhất với hiệu suất cao
trung bình là 25%. Kế đến là dung môi nƣớc, ethanol 50%, ethanol 90% có hiệu
suất trung bình lần lƣợt là 19%; 22%; 18 %. Dung môi cho hiệu suất tách chiết cao
thấp nhất so với các dung môi khác với hiệu suất cao trung bình là 18%.
Từ kết quả trên cho thấy dung môi ethanol 70% là dung môi tách chiết tốt
nhất đối với cây lá đắng. nó có thể hòa tan nhiều nhất các hợp chất có hoạt tính
sinh học so với các dung môi còn lại trong lá cây lá đắng.
Trong một số nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng dung môi để tách chiết
hợp chất từ cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi ethanol 70%
0
5
10
15
20
25
Ethanol
50%
Ethanol
70%
Ethanol
90%
Nƣớc
22
25
18 19
HIỆU SUẤT

50
để tiến hành tách chiết vì ethanol 70% đƣợc biết nhƣ một dung môi vạn năng có
khả năng tách chiết rất nhiều hoạt tính sinh học ra khỏi thực vật. Tuy nhiên, để
đánh giá dung môi nào phù hợp tách chiết các hoạt tính sinh học có trong cây lá
đắng. ngoài hiệu suất thu hồi cao cần phải tiến hành đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn của cao chiết từ các dung môi này.
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây lá
3.2.
đắng.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E.
3.2.1.
coli
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng E.coli của cao chiết trên các dung
môi
Dung môi Mean
(mm)
MIC
(mg/ml)
Nƣớc 10,3 50
ETHANOL 50% 11,6 50
ETHANOL 70% 12,3 25
ETHANOL 90% 11 50
KHÁNG SINH 33,6
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm
E. coli đƣợc trình bày ở hình 3.2.

51
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm
E.coli
Dựa trên hình 3.2nhận thấy rằng ngoại trừ cao chiết nƣớc các loại cao chiết
của các dung môi nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, từ cây lá đắng
đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi sinh vật chỉ thị E. coli.
Đối với cao chiết ethanol 70% từ cây Lá đắng kháng khuẩn đƣợc E. Coli
mạnh nhất. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện thông qua đƣờng
kính vòng kháng khuẩn cũng mạnh nhất trong các loại cao chiết khảo sát (đƣờng
kính từ 10 đến 12 mm). Trong khi đó, đối với cao chiết ethanol 50% mặc dù cũng
khá rộng đối với nhóm E. coli nhƣng hoạt tính của chúng không cao bằng cao chiết
ethanol 50%. Đối với cao chiết ethanol 90% từ cây Lá đắng kháng khuẩn thấp hơn
các loại dung môi khác.
Kết quả này cho thấy đối với nhóm E. coli, hoạt tính kháng khuẩn của cao
chiết ethanol 70% là tốt nhất so với cao chiết bằng các loại dung môi khác. Tuy
nhiên, so với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin nồng độ 500 µg/ml thì hoạt
tính của cao chiết ethanol 50% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
0
10
20
30
40
Nƣớc Ethanol
50%
Ethanol
70%
Ethanol
90%
KHÁNG
SINH
10,3 11,6
12,3 11
33,6
Đƣờng
kính
vòng
kháng
khuẩn
Dung môi

52
Từ kết quả đánh giá chỉ số MIC của các cao chiết từ cây Lá đắng đƣợc trình
bày ở bảng 3.2 nhận thấy giá trị MIC của cao chiết ethanol 70% đối với chủng vi
khuẩn khảo sát 25 mg/ml giá trị thấp nhất. Điều này có nghĩa cao chiết ethanol 70%
có khả năng kháng khuẩn cao hơn các loại cao chiết khác.
So với nghiên cứu của cây Eupatorium odorata đối với vi khuẩn Shi. flexneri,
S. aureus, P. aeruginosa, của Natheer (2012) có giá trị MIC là 25mg/ml tƣơng đồng
với giá trị MIC của cao chiết ethanol 70% nhƣng so với các loại dung môi khác thì
lại thấp hơn.
Từ kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC của các cao chiết nƣớc, ethanol 50%,
ethanol 90%, từ cây Lá đắng trên các chủng vi khuẩn khảo sát là 50 mg/ml cao hơn
so các nghiên cứu khác trên cùng một chủng vi khuẩn ngoài trừ cao chiết ethanol
70% có giá trị tƣơng đồng 25 mg/ml. Nguyên nhân có thể là do phƣơng pháp sử
dụng khác nhau, dung môi tách chiết khác nhau, nguồn mẫu ảnh hƣởng đến giá trị
MIC.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác
3.2.2.
nhau trên Bacillus Cereus
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus của cao chiết các
dung môi
Dung môi Mean
(mm)
MIC
(mg/ml)
Nƣớc 10 100
ETHANOL 50% 11,3 50
ETHANOL 70% 11,6 50
RTHANOL 90% 12 50
DOI CHUNG 25
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với Bacillus
Cereus đƣợc trình bày ở hình 3.3.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)

Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)

Similar to Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del) (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (19)

Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vernonia amygdalina del)