Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT
TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN
LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN THỊT
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th.S. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện : Phạm Khánh Hưng
MSSV: 105111082 Lớp: 10DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

2. LỜI CẢM ƠN
Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việc
làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cách
làm việc một mình cũng như trong tập thể. Tuy có những thành công và cũng không
tránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều.
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths. Phạm
Minh Nhựt. Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đã
giúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học. Những lời khuyên, kinh
nghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp
em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống. Em cảm ơn thầy!
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang. Chính lòng
nhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của một
người làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quá
trình làm đồ án. Em cảm ơn chị rất nhiều!
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinh
học – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths. Huỳnh Văn Thành đã tạo điều
kiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thí
nghiệm.
Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thời
gian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn.
Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quá
trình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua. Xin gửi lời cảm ơn đến
hai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viên
trong suốt quá trình làm đồ án.
Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánh
bên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian
qua. Con xin chân thành cảm ơn mọi người!

3. Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014
Sinh viên
Phạm Khánh Hưng

4. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ công
trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu của
mình.
Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014
Sinh viên,
Phạm Khánh Hưng

5. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của con
người ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhu
cầu ăn uống của con người cũng được nâng cao. Cũng từ đó, công tác bảo quản thực
phẩm luôn là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng. Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâm
nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người.
Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiều
phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,
việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, do sự
thiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng các
hóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định. Trong khi
đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu,
đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian.
Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng
phương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môi
trường.
Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảo
quản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thì
hướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và
đặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. Do đó, việc
nghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thực
phẩm ngày được quan tâm phát triển.
Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm.
Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản
thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng không xa lạ với
chúng ta, đó là vi khuẩn lactic, những vi khuẩn này được con người chúng ta sử

6. Đồ án tốt nghiệp
2
dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay. Bacteriocin là hợp chất
kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩn
Gram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh
mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Ngoài bacteriocin,
các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môi
trường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic,
acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng
và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thực
phẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừng
khẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao.
Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sát
yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn
Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng
sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi
khuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống. Kết quả đã phân lập
được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền
thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định được
thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng
khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L.
plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính
kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa được
xác định. Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
các hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể
làm tiền đề cho các ứng dụng sau này.
Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn
từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt”. Nghiên cứu
này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chất
bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực

7. Đồ án tốt nghiệp
3
phẩm. Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công
nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí
Minh.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả
bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum
SC01.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn
Lactobacillus plantarum SC01.
- Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn
Lactobacillus plantarum SC01.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất
kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang
(2013).
- Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus
plantarum SC01 đối với thịt heo.

8. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
1.1.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic
Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thích
được quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic.
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên tách
được acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002).
Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của
chuỗi phản ứng của quá trình lên men.
Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt
động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt
tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt,
2001).
Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu.
Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881
(Nguyễn Lân Dũng, 2002).
Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn. Do đó, các
chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao. Trong
đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và
Streptococcus.
Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩm
chính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat.
Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau,
củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc
miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt, trong sản các sản
phẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi

9. Đồ án tốt nghiệp
5
khuẩn lactic. Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút
các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998).
Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L. bulgarius, L. helviticus, L.
casei, L. ferment, L. brevis. Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải
tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau
quả, trái cây: L. plantarum, L. delnikii, L. ferment, L. brevis.
- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L. acidophilus, S.
faecalis, S. bovis, S. salivanius, S. pyogenes.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra
hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường,
điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi.
- Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính
khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài.
Hình 1.1. Tế bào Streptococcus
- Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu
khuẩn.

10. Đồ án tốt nghiệp
6
Hình 1.2. Tế bào Pediococcus
- Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình que, có lúc
lại có hình ovan.
Hình 1.3. Tế bào Bifidobacterium
- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5
– 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung.
Hình 1.4. Tế bào Leuconostoc

11. Đồ án tốt nghiệp
7
- Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que
ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm).
Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến
nhất.
Hình 1.5. Tế bào Lactobacillus
1.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa
Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thống
nhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau:
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm
này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử.
Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên men
được saccharose và một số khác không lên men được maltose. Một số vi khuẩn
lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài
L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột).
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổng
hợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase.
Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thành
phần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP. Các LAB chỉ có thể tạo
ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn

12. Đồ án tốt nghiệp
8
cacbon. Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng có
thể phát triển trong điều kiện hiếu khí.
Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là con
đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate. Con
đường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó con
đường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol,
acetate… (Khalid, 2011).
1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển được
trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4
+
. Vi khuẩn lactic
cần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn
(glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbon
khác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau.
Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic là
monosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào
và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic...
(Tortora và Funke, 1992).
Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp
được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và
phát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có
một số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ.
Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm
(Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994):
- Nhóm cần phức hợp các acid amin.
- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon.
- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy
nhất.

13. Đồ án tốt nghiệp
9
Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton,
peptit, cazein...
Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng. Các vi
khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai
trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả
năng sinh tổng hợp được vitamin. Vitamin thường được bổ sung vào môi trường
bằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men...
Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acid
pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin... Các acid nicotinic và acid pantotenic
đặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998).
Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ,
độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy.
Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng có
ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩn
này. Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng:
- Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin...
- Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin...
- Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic.
Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic. Chúng vừa có vai trò
cung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các
acid amin tự do.
Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người ta
thường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vai
trò là chất đệm. Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạt
tính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch.
Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt là
magiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic.
Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi
có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom. Mangan và magiê còn là

14. Đồ án tốt nghiệp
10
yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme. Magiê còn có tác dụng làm tăng khả
năng hấp thu đường của vi khuẩn lactic. Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng
làm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần Thanh
Thủy, 2003).
1.1.3. Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic. Tùy
theo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lên
men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình.
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic
và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng,
2002).
Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men
lactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phương
thức trên.
1.1.3.1. Lên men lactic đồng hình
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acid
lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB
(Embden – Meyerhof – Parnas). Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân
tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớn
trong công nghiệp thực phẩm.
Phương trình tóm tắt:
C6H6O6 + 2ADP + 2Pv
Vi khu ẩn lactic
Lên men đồng hình
2CH3-CHOH-COOH + 2ATP

15. Đồ án tốt nghiệp
11
Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình
Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.
acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricus, L .casei, Streptococus, S. cremoris, S.
thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002).
1.1.3.2. Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid
lactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,
etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành các
sản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997).
Phương trình tóm tắt:
2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q
Trong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol
20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%.
Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat).
Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và
trizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con
đường PP. Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra
tương tự như lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật,
môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999).

16. Đồ án tốt nghiệp
12
Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides,
L. oenos, L. cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Bifidobacterium bifidum.
Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2
như sự lên men lactic dị hình thông thường.
Hình 1.7. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình
1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
1.2.1. Phân loại
Theo Orla – Jensen (1919) và Bergey (1923) vi khuẩn Lactobacillus
plantarum thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Chi: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus plantarum

17. Đồ án tốt nghiệp
13
1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum
L. plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 –
1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm. Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic
và đã được giải mã hoàn toàn. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300
C và có khả năng
chịu nồng độ NaCl 5,5 %.
Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng
lên men.
- Nhóm I chỉ lên men hexose duy nhất thành axid lactic và không thể lên men
gluconate hay pentoses.
- Nhóm II vừa có thể lên men hexose thành axid lactic, vừa có thể lên men
gluconate hay pentose.
- Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2.
Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa
của con người. L. plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong
quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải… L.
plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như
một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến.
L. plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid. Chúng không có
khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường
khác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid. Việc sinh ra NO giúp ngăn
chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter
pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011).
L. plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy. Khi có oxy, L. plantarum
có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide. Khi không có oxy, L. plantarum sẽ
lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình).
L. plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng. Mangan giúp cho L. plantarum
chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2.
H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganese
cofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983).

18. Đồ án tốt nghiệp
14
L. plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều
kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non. Kí
sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng
tích cực đến tế bào vật chủ.
L. plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên
men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn
(Molin, 2010).
1.2.3. Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum
Cũng như các chủng LAB khác, L. plantarum đều trải qua quá trình lên men
lactic. Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo ra
chiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic,
ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic,
acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của
nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm.
Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con
đường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và
diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate.
Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L. plantarum,
plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh
tổng hợp protein nhờ ribosome. Trong tế bào L. plantarum có mang các gene mã
hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins. Qua quá trình
phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo ra
plantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn.
1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum sản sinh ra
1.3.1. Plantaricin
Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L. plantarum sản xuất ra ít nhất 6
bacteriocins khác biệt. Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền
chất có chứa glycine. L. plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen
PlnE và PlnF. Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và

19. Đồ án tốt nghiệp
15
PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt
(PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai
vùng điều hòa PlnC và PlnD. Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L.
plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với
L. plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và
Propionobacteria.
Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau. Chúng gồm
30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương
tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau. Các bacteriocins hoạt động
với tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ. Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻ
hoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả.
Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide
phân lập từ L. plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh. Các gen cấu trúc chỉ
ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motif
đôi. Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino. Plantaricin S được coi là kiểm
soát quá trình lên men và bảo quản ô liu. Một bacteriocin gồm hai peptide khác là
plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Các thành phần
lantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự
(Zacharof và Lovitt, 2012).
1.3.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác
Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L.
plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản
sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus…
Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid
bên ngoài, H+
từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào
giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+
ra khỏi tế bào làm cho
vi khuẩn bị mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đường
phân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các

20. Đồ án tốt nghiệp
16
anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ức
chế sinh trưởng hoặc có thể chết.
Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con
đường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong quá trình tăng trưởng
hiếu khí của L. plantarum. Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác
động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát
triển. Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các
vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị
tiêu diệt.
1.4. Bacteriocin và quá trình thu nhận, tách chiết, tinh sạch các hợp chất
kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic
1.4.1. Hợp chất bacteriocin
Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên vào năm 1925 trong quá trình
nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự
phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt vi
khuẩn E. coli.
Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ở
riboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin có hoạt tính
kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số
vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng
sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật.
Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động
của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống…Các
bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp. Đặc tính diệt
khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi
các dung môi hữu cơ. Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷ
phân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính. Do có bản chất protein nên

21. Đồ án tốt nghiệp
17
bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể
người và các vấn đề sức khoẻ khác.
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên, việc
phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Bacteriocin được phân loại với
nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng
và trình tự chuỗi amino acid. Bacteriocin được chia tha
̀ nh 3 lớp:
- Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (<
5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic
bacteriocin lớp I được chia thành 2 lớp phụ:
+ Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất. Nisin
thuộc nhóm này.
+ Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện
âm hoặc không tích điện. Đại điện: Meracidin.
Hình 1.8. Bacteriocin lớp I
- Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên,
ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường. Nhóm này được chia tha
̀ nh 3
lơ
́ p nhỏ:

22. Đồ án tốt nghiệp
18
+ Lơ
́ p IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại
diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P. Các
bacteriocin nhóm này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp.
+ Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, những
peptid này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là:
Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK.
+ Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin không
đồng nhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau. Đại diện:
Divergicin A và Acidocin B.
- Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, không
bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khả
năng bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Đại diện gồm có Acidofilicin
A và Lactacins A, B.
- Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành
phần lipid và cacbohydrate. Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức
năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch.
1.4.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus,
Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram
âm kém vì màng ngoài của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin.
Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàm
lượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm.
Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng.
Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngoài tế bào. Không gây nguy hiểm
sinh lý tế bào.
- Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong
tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn.

23. Đồ án tốt nghiệp
19
Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của Bacteriocin
Trong đó:
- Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotic gồm những phân tử lưỡng tính dài có thể
tiêu diệt các tế bào bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất.
- Lớp II (Sakasin): mang điện dương trong môi trường trung tính và chứa
một vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực. Dẫn đến làm thay đổi tính thấm của màng
tế bào.
- Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào.
1.4.3. Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng
khuẩn
Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm. Đặc
biệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiện
sản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp. Lợi thế của việc sản xuất invitro là
do không có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế,
bất hoạt bởi protease. Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm soát các quy trình lên men thì
sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến

24. Đồ án tốt nghiệp
20
các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon và
Phumkhachorn, 2010).
Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tử
bacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học. Ngoài ra, nhiệt
độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trò quan trọng
trong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làm
giảm khả năng sản xuất. Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đến
sản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối.
Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộc
vào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và quá trình chuyển hóa
của LAB.
Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thể
được phân biệt:
- Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammonium
sulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao
áp.
- Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủa
ammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược pha
lỏng cao áp.
- Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cô lập thông qua một quy
trình duy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độ
hấp thụ bacteriocin có sẵn thông qua điều chỉnh pH của môi trường lên men thô.
Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phương
pháp đầu tiên.
Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh
sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus
amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium
RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi
Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007).

25. Đồ án tốt nghiệp
21
1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn
a. pH
Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0. Hoạt tính kháng khuẩn
của bacteriocin vẫn hoạt động trong môi trường có tính acid hoặc trung tính. Sự ổn
định của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thực
phẩm. Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốt
trong pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong môi trường có pH 8,0 - 12,0.
b. Nhiệt độ
Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phòng, hoạt tính kháng khuẩn
của bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ được
hoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210
C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạt
động yếu ở nhiệt độ thấp.
c. Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme
Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tính
kháng khuẩn của bacteriocin. Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin và
trypsin không gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ các
chủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001).
d. Các chất hoạt động bề mặt
Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khả
năng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau. Đối với hợp chất
kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS,
Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5
mM vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv,
2011). Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lại
làm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA
và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất
từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013).

26. Đồ án tốt nghiệp
22
1.5. Một số phƣơng pháp bảo quản thực phẩm và tình hình ứng dụng các sản
phẩm từ vi sinh vật
1.5.1. Một số phương pháp bảo quản thực phẩm
Thực phẩm không được bảo quản thường bị biến đổi dẫn đến mất giá trị dinh
dưỡng và giá trị cảm quan. Những biến đổi đó do những nguyên nhân sau:
- Do vi sinh vật: vi sinh vật có sẵn trong thực phẩm hoặc nhiễm từ bên ngoài
vào.
- Do enzyme: enzyme có sẵn trong tế bào vi khuẩn có trong nguyên liệu thực
phẩm.
- Do phản ứng giữa các chất bên trong thực phẩm với nhau và chất bên trong
thực phẩm với bao bì.
- Do độc tố: độc tố vi khuẩn có sẵn trong thực phẩm.
- Do kí sinh trùng và côn trùng.
Có nhiều phương pháp để bảo quản thực phẩm gồm: phương pháp vật lý,
phương pháp hóa học và phương pháp sinh học.
1.5.1.1. Phương pháp vật lý
a. Phương pháp làm khô
 Phương pháp sấy tự nhiên (phơi nắng)
- Là phương pháp sử dụng nhiệt của ánh sáng mặt trời để làm khô sản phẩm
- Thích hợp cho các loại hạt ngũ cốc, các loại thủy sản ướp muối (cá, tôm,
mực…)
- Hong khô rau quả mà không cần nắng.
 Phương pháp sấy nhân tạo
- Sấy khô: dùng lò sấy than, củi… để làm bay hơi nước trong thực phẩm.
Chất lượng sản phẩm không cao (chất dinh dưỡng, vitamin bị ảnh hưởng).
- Sấy phun: đặc thù của phương pháp này là cô đặc sản phẩm bằng cách dùng
vòi phun cao áp dạng sương mù trong buồng sấy có nhiệt 950
C để diệt các vi sinh
vật đồng thời tạo ra sản phẩm khô.

27. Đồ án tốt nghiệp
23
- Sấy thăng hoa: nước trong thực phẩm (thể lỏng) chuyển sang dạng hơi nước
và tạo thành thể rắn.
- Sấy bằng bức xạ: làm sản phẩm nóng bằng cách dùng các đèn hồng ngoại
có công suất 250-500W, chiếu tia hồng ngoại (0,75 - 4µm) vào sản phẩm.
- Sấy bằng điện cao tần: là phương pháp đặt sản phẩm sấy vào điện trường
xoay chiều có tần số dao động cao (500kHz) giúp cho sản phẩm khô đều và nhanh.
Để giữ sản phẩm được trong thời gian dài thì các sản phẩm sau khi làm khô
phải được làm nguội ngay, bao gói tốt, tránh hút ẩm trở lại, giữ nơi khô mát.
b. Phương pháp sử dụng nhiệt
 Phương pháp nhiệt độ thấp
- Làm lạnh: chủ yếu được áp dụng để bảo quản rau quả tươi.
Nhiệt độ hạ xuống gần 00
C, tinh thể nước đá chưa xuất hiện, hệ thống men
(trong nguyên liệu và trong VSV) hoạt động yếu đi dẫn đến kìm hãm những biến
đổi về lý, hóa, sinh; hoạt động vi sinh vật.
- Làm lạnh đông (đông lạnh): là phương pháp giúp giữ thực phẩm vài tháng
đến vài năm.
Nhiệt độ của thực phẩm được hạ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của các dung
dịch nước trong thực phẩm giúp phần lớn nước trong thực phẩm bị đóng băng,
màng tế bào của vi sinh vật bị nén mạnh. Các quá trình sống của vi sinh vật và hoạt
động của các hệ thống men bị kiềm chế.
 Phương pháp nhiệt độ cao: là phương pháp diệt vi sinh vật và cả bào tử của
chúng
- Thanh trùng Pasteur (gián đoạn và liên tục)
Thanh trùng gián đoạn: phương pháp này dùng một lò hấp Pasteur, bên trong
có một thùng chứa được bao quanh bởi hơi nước lưu thông. Trong thùng chứa này,
sữa được làm nóng và được khuấy đều trong suốt thời gian khử trùng. Sau đó sữa có
thể được làm nguội trong thùng chứa. Ngoài ra, người ta có thể làm nóng sữa một
phần trong một lò hình ống trước khi đưa vào thùng chứa. Phương pháp này ít dùng
để thanh trùng sữa, thường dùng để thanh trùng những sản phẩm từ sữa hơn.

28. Đồ án tốt nghiệp
24
Thanh trùng liên tục: trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp
Pasteur tiệt khuẩn nhanh ở nhiệt độ cao. Môi trường làm nóng sản phẩm có thể chứa
hơi nước hoặc nước nóng ở chân không. Sữa thô ở 40
C được cho chảy qua các thíết
bị của lò hấp Pasteur này, nó dược làm nóng đến nhiệt độ khử trùng khoảng
720
C/16 giây. Sau khi khử trùng, sữa được chảy vào một thiết bị làm nguội đến 40
C
hoặc thấp hơn. Sau cùng, sữa được chuyển vào một hệ thống đóng gói sản phẩm.
- Phương pháp UHT (Ultra-high temperature)
Phương pháp UHT thanh trùng thực phẩm ở nhiệt độ lớn hơn 100o
C, thực
phẩm được thanh trùng trước khi đóng gói, rồi được cho vào các đồ chứa đã được
khử thanh trong điều kiện vô trùng.
Phương pháp UHT tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và bào tử, kể cả vi sinh vật
chịu nhiệt có bào tử. Thực phẩm dược xử lí bằng phương pháp UHT có thể để được
đến 6 tháng mà không cần làm lạnh.
c. Phương pháp sử dụng tia bức xạ
Trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp Pasteur tiệt khuẩn
nhanh ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên việc chiếu xạ lại gây nguy hiểm cho con người khi
ăn các loại thực phẩm này.
d. Phương pháp hút chân không
Ở phương pháp này, người ta đặt các sản phẩm thực phẩm trong những bao bì
không thấm khí và hút không khí ở trong ra, tạo ra một môi trường chân không.
Trong trường hợp này những quá trình oxi hoá thường xảy ra dưới tác dụng
của không khí bị kìm hãm mạnh, lớp bề mặt của sản phẩm không bị khô, giữ được
màu sắc và tính chất ban đầu của sản phẩm.
e. Phương pháp dùng dòng điện cao tần
Sản phẩm được đặt trong điện trường của dòng điện xoay chiều có tần số cao
để thanh trùng.
Các phân tử tích điện trong sản phẩm (ion, điện tử) sẽ dao động do tác dụng
của điện năng, chuyển điện năng được hấp thụ thành nhiệt năng để làm chết vi sinh
vật.

29. Đồ án tốt nghiệp
25
f. Phương pháp siêu âm
Siêu âm là sóng âm có tần số dao động cao mà con người không cảm thụ
được. Dưới tác dụng của siêu âm, môi trường lỏng (sản phẩm) truyền âm bị xô đi
đẩy lại, bị ép và tạo chân không liên tiếp sinh ra nhiều khoảng trống. Lúc đó, các
chất hòa tan và hơi của chất lỏng lập tức dồn vào các khoảng trống ấy, gây ra tác
dụng cơ học làm chết vi sinh vật ở trong môi trường.
g. Phương pháp lọc thanh trùng
Kỹ thuật màng lọc góp phần bảo quản thực phẩm bằng cách giữ lại vi sinh vật
trên màng và do đó dịch lỏng thấm qua sẽ vô khuẩn.
h. Phương pháp đóng gói bằng thay đổi khí quyển
Tính năng của công nghệ bảo quản bằng cách bao gói sản phẩm trong khí
quyển thay đổi (MAP) nhằm kéo dài tuổi thọ của thực phẩm đã được nhận biết cách
đây nhiều năm. Ngày nay thực phẩm đóng gói trong MA bao gồm thịt tươi và nấu
chín, thịt gia cầm và cá, rau quả, mì sợi, phomat, các loại bánh nướng từ bột mì,
khoai tây chiên, cà phê và trà.
i. Bảo quản bằng áp lực thủy tĩnh cao
Dựa trên nguyên tắc thủy tĩnh, áp lực thủy tĩnh tại một điểm cho trước bằng
nhau ở mọi hướng và áp lực được truyền đi lập tức và giống nhau qua môi trường
truyền áp lực.
Sử dụng phương pháp vật lí có thể bảo quản thực phẩm tốt nhưng gây tốn
kém, quá trình phức tạp và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng khi sử
sụng các tia chiếu xạ.
1.5.1.2. Phương pháp hóa học
Sử dụng các chất hóa học để ức chế tác nhân làm biến đổi các thành phần hóa
học trong thực phẩm.
- SO2 (sulfurous dioxide): Khí SO2 ảnh hưởng đến các quá trình oxy hóa
trong tế bào vi sinh vật, đồng thời cũng có tác dụng tương hỗ với các nhóm
cacboxyl của các hợp chất đặc biệt có trong thành phần của chất nguyên sinh, làm

30. Đồ án tốt nghiệp
26
thay đổi trạng thái lý, hóa học của chất nguyên sinh. Khí SO2 dùng trong bảo quản
rau quả. Không dùng các hợp chất SO2 để bảo quản thịt, ngũ cốc, đậu đỗ, sữa.
- NO3 (nitrate): NaNO3, KNO3. Nitrit được ứng dụng trong công nghiệp chế
biến thịt với mục đích giữ màu đỏ cho thịt muối mặn, làm thuốc sát khuẩn trong bảo
quản cá, thịt và các chế phẩm từ cá, thịt (cá, thịt muối hoặc ướp lạnh). Sử dụng làm
chất sát khuẩn và giữ màu cho thịt, các sản phẩm thịt, cá và phomat. Khi ăn phải
thức ăn chứa nhiều nitrit có thể gây ngộ độc.
- Acid benzoic, muối benzoat: ức chế mạnh nấm men và nấm mốc, có tác
dụng yếu đối với vi khuẩn. Tác động lên màng tế bào nấm, ức chế quá trình hô hấp
của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, ức chế quá trình biến
dưỡng các hợp chất đa lượng (N, P,…) của sinh vật. Acid benzoic được sử dụng
nhiều trong bảo quản trái cây và rau quả.
Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm thay đổi mùi vị sản phẩm, ảnh hưởng tới
thận của người sử dụng.
Dùng benzoic hoặc benzoat trong bảo quản sản phẩm có thể làm cho sản phẩm
bị thâm đen, và dễ nhận biết dư vị, làm giảm chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm.
Acid benzoic có thể tác động hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây kích
ứng mắt.
- Ester diethyl của acid pyrocarbonic : ethylpyrocarbonat hoàn toàn không
độc đối với người, khi tiếp xúc với nước sẽ phân hủy dần dần thành ethanol và
CO2.Dùng trong bảo quản nước quả, quả tươi. Sử dụng ethylpyrocarbonat để thay
thế phương pháp sulfite hoá trong bảo quản rượu nho và nước quả.
- Carbonic (CO2): Khí carbonic tác động tới quá trình trao đổi chất của vi
sinh vật, ức chế một vài quá trình biến dưỡng của vi sinh vật. Nấm mốc nhạy cảm
hơn đối với khí carbonic, còn vi khuẩn thí ít nhạy cảm hơn. Nồng độ khí carbonic
cao ức chế sự phát triển của những vi khuẩn hiếu khí và cả vi khuẩn yếm khí.
- Ozon (O3): Ozon có tính oxi hóa rất mạnh, tác động trực tiếp tới các chất
sống gây biến đổi và bất hoạt các đại phân tử sinh học, gây rối loạn các hoạt động
sống của vi sinh vật.

31. Đồ án tốt nghiệp
27
- Chất gia tăng áp suất thẩm thấu : Sử dụng đường hay muối trong bảo quản
thực phẩm làm gia tăng áp xuất thẩm thấu của môi trường, tạo áp suất thẩm thấu
cao nên nước trong tế bào thấm ra khỏi màng tế bào chất và gây ra hiện tượng co
nguyên sinh, đồng thời tế bào vi sinh vật không thể hấp thu được các chất dinh
dưỡng, làm ức chế hoạt động và sự phát triển của vi sinh vật.
- Acid acetic (ngâm dấm): acid acetic làm giảm pH của sản phẩm, làm cho
quá trình trao đổi ion của vi sinh vật không thực hiện được. Sự thay đổi quá lớn của
nồng độ ion trong và ngoài màng tế bào làm rối loạn các quá trình trao đổi chất của
vi sinh vật, ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm.
- Kháng sinh được sản xuất theo phương pháp hóa học: các chất kháng sinh
có tác dụng chủ yếu với vi khuẩn, tác động yếu đối với nấm mốc, nấm men. Tác
dụng là là làm ngưng tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; phá vỡ tính thẩm thấu của
màng tế bào, ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, ảnh hưởng đối
với acid nucleic. Các chất kháng sinh được phép dùng: biomixin (clotetraxyclin),
teramixin, oreomixin,…
- Chất chống oxy hóa: các chất chống oxy hóa có đặc tính dễ bị oxi hóa hơn
so với các chất béo có trong thực phẩm. Sự oxi hóa các hợp chất chống oxi hóa sẽ
làm giảm sự oxi hóa của các chất béo trong thực phẩm. Các chất chống oxy hóa có
hai dạng như sau:
Acid (hoặc muối hay ester của chúng) như acid citric, acid ascorbic,... Hợp
chất phenol làm chậm khả năng oxy hóa chất béo và dầu có trong thực phẩm.
Phương pháp hóa học làm thực phẩm dễ bị nhiễm và tích lũy các chất hóc học
gây độc trong thực phẩm, gây tác dụng xấu cho con người
1.5.1.3. Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học là phương pháp bảo quản thực phẩm nhờ vi sinh vật, nó
đem lại hiệu quả cao và không gây độc cho con người, ví dụ:
- Phương pháp lên men

32. Đồ án tốt nghiệp
28
Sử dụng các vi sinh vật lên men tạo ra acid làm thay đổi pH môi trường ức chế
sự phát triển của vi sinh vật gây hại thực phẩm và kéo dài thời gian bảo quản thực
phẩm. Điển hình là vi khuẩn lactic.
Trong quá trình lên men, các vi khuẩn này tiết ra acid lactic và acid acetic làm
acid hóa môi trường, kiềm hãm và tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm. Ngoài
ra, vi khuẩn lactic còn tiết ra bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao.
- Phương pháp sử dụng bacteriocin
Bacteriocin là các protein có tính kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng và gây
ngộ độc thực phẩm, nó được các vi sinh vật chủ yếu là nhóm vi khuẩn sinh lactic
tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Nisin là một bacteriocin được sinh
ra bởi Lactococcus lactis và Streptococcus lactis. Nisin liên kết với anion
phospholipid sau đó chúng di chuyển vào tế bào gây rối loạn quá trình trao đổi ion
và làm chết vi sinh vật. Bacteriocin dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biến
phomat, bảo quản đồ hộp, nước ép quả đóng hộp…
- Phương pháp sử dụng enzyme
Lyzozyme có trong sữa động vật, xúc tác quá trình cắt đứt nối peptidoglycan
trên vách tế bào vi khuẩn.
Lactose peroxidase và Glucose peroxidase từ sữa bò A.niger, xúc tác quá trình
oxy hóa, giải phóng chất độc hay các sản phẩm làm bất hoạt vi khuẩn.
Glucose oxidase từ Penicillium, A.niger, xúc tác quá trình oxy hóa loại bỏ cơ
chất hay chất dinh dưỡng.
Hydrolase từ các nguồn khác nhau, xúc tác quá trình thủy phân polysaccharide
ngoại bào.
1.5.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới và tại Việt
Nam
1.5.2.1. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới
Sản phẩm công nghệ sinh học nói chung và sản phẩm từ vi sinh vật nói riêng
đã được ứng dụng vào nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược, môi trường,
trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

33. Đồ án tốt nghiệp
29
a. Trong công nghiệp sản xuất acid lactic
Từ năm 1881, con người đã bắt đầu ứng dụng lên men lactic để sản xuất acid
lactic ở quy mô công nghiệp.
Từ các nguyên liệu như rỉ đường, tinh bột, dịch thải công nghiệp sản xuất
đường và bánh kẹo, dịch thủy phân từ cám gạo, cám ngô, người ta sản xuất một
lượng lớn acid lactic đáp ứng cho nhu cầu của nhiều ngành công nghiệp: dược, dệt,
da, nhuộm, chất dẻo, mỹ phẩm, sơn và vật liệu cao cấp…
Vi khuẩn lactic được sử dụng cho mục đích này thuộc loại lên men đồng hình,
có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 45 – 480
C, có lợi thế để ngăn ngừa sự gây nhiễm,
như: Lactobacillus delbruckii, L. bulgaricus, L. leichmanii. Nguồn đạm cần cho sự
lên men tạo acid lactic thường là dịch chiết ngô hay sunphat amon. Gần đây, người
ta sử dụng vi khuẩn lactic cố định trong alginate natri để lên men liên tục ở 430
C,
pH = 5,7 với hiệu suất lên men đạt 97% (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Acid lactic
được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, trong in ấn,
chế tạo chất dẻo, sơn, dược phẩm và mỹ phẩm.
Lactate natri, lactate canxi và một số muối lactic khác được dùng làm chất giữ
ẩm, chất nhủ hóa, chất làm đông trong ngành mỹ phẩm… Lactate sắt được dùng để
bổ sung sắt cho sữa mẹ và bệnh nhân thiếu máu.
Acid lactic còn được dùng làm nguyên liệu để chế các sản phẩm dưỡng tóc và
làm giảm sự lão hóa của tóc. Lactate canxi cũng được dùng làm nguyên liệu trong
sản xuất kem đánh răng.
b. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Việc sử dụng quá trình lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, thịt, cá,
trứng, sữa không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà con nhằm đưa ra thị trường có
tính chất và hương vị mong muốn. Đây là một trong những phương pháp bảo quản
thực phẩm phổ biến hiện nay.
Có thể thực hiện quá trình lên men thực phẩm theo 2 cách:

34. Đồ án tốt nghiệp
30
- Sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu hoặc có sẵn trong
không khí. Theo cách này, người ta thường áp dụng để chế biến các thực phẩm lên
men ở quy mô nhỏ, thủ công, trang thiết bị đơn giản.
- Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuẩn chủng bổ sung vào nguyên liệu để
điều khiển quá trình lên men. Phương pháp này được áp dụng ở quy mô công
nghiệp như sản xuất sữa chua, phomat, váng sữa, bơ.
- Ngoài việc sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản thực phẩm,
người ta còn dùng chúng để sản xuất một lượng acid lactic và muối lactate dùng làm
phụ gia thực phẩm. Các vi khuẩn lactic cũng đóng vai trò rất quan trọng trong sản
xuất bánh mì đen (Tortora và Funke, 1992).
Gần đây người ta phát hiện ra vài trò to lớn của vi khuẩn lactic với sức khỏe
của người và động vật. Khu hệ vi khuẩn lactic trong đường ruột người và động vật
có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh, tăng cường tiêu hóa, bảo vệ đường
ruột. Các nghiên cứu về vấn đề này làm cơ sở tạo ra các chế phẩm sống (probiotic)
giúp cân bằng hệ VSV đường ruột, giảm cholesteron trong máu, bệnh không dung
nạp lactoza, viêm dạ dày cấp. Các chế phẩm này còn tạo ra các thức ăn có bổ sung
khoáng, vitamin cho người bệnh, người ăn kiêng và gia súc, gia cầm (Vũ Hồng
Thắng, 1998).
Nhờ giá trị đặc biệt của các thực phẩm lên men lactic đối với sức khỏe con
người mà đến nay các sản phẩm lên men ngày càng được sử dụng rộng rãi và được
tiêu thụ với khối lượng rất lớn.
c. Trong nông nghiệp
Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic có sẵn trong đất đã phân giải dường và
cacbon hydrat tạo thành acid lactic. Acid này có tác dụng như:
- Kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi, đặc biệt là hệ vi sinh vật
phân giải đường, tạo điều kiện phân giải nhanh các đại phân tử hữu cơ trong đó có
các chất khó phân gải như lignin, cenlulose, tinh bột mà không gây hại cho đất.
- Ức chế sự phát triển của các vi nấm có hại như Fusarium, giun tròn và các
đối tượng chuyên phá hại mùa màng.

35. Đồ án tốt nghiệp
31
Trong chăn nuôi, vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình ủ chua thức ăn gia
súc. Nhờ ủ chua, thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi, phần lớn các
chất dinh dưỡng như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh… được bảo đảm góp phần
tăng năng suất trong chăn nuôi, đồng thời góp phần hạ giá thành sản phẩm.
Nhiều loại thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus, nấm đã được sản
xuất, ứng dụng đại trà. Chỉ riêng chế phẩm thuốc trừ sâu Bt, hàng năm đã mang lại
lợi nhận hàng trăm triệu đô la Mỹ. Sản xuất thuốc BVTV sinh học không chỉ phát
triển mạnh ở các nước phương Tây, mà còn phát triển ở cả Trung Quốc, Thái Lan.
Phân bón sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn (Rhizobium, Azotobacter,
Bacillus…), xạ khuẩn (Frankia), nấm (Mycorhiza), tảo lam đã được các nước trên
thế giới nghiên cứu, sản xuất và áp dụng rộng rãi. Phân vi sinh làm tăng năng suất
cây trồng 7-15% và tiết kiệm 20% phân khoáng. Riêng phân vi khuẩn nốt sần,
doanh số thế giới hàng năm đạt 25 triệu USD, trong đó riêng Mỹ chiếm 19 triệu
USD.
d. Trong y học
Acid lactic được sử dụng rộng rãi để điều chế một số loại thuốc sát trùng, một
số loại thuốc dưới dạng muối canxi.
Các vi khuẩn lactic sinh kháng sinh được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu
hóa sống” dùng để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân
bằng hệ VSV đường ruột. Trong đó nỗi bật là L. acilophilus khi bổ sung vào đường
tiêu hóa, tại ruột già chúng phát triển ức chế một số bệnh đường ruột khác. Chúng
tiết ra các chất diệt khuẩn, kháng sinh, chất kháng độc tố kháng hệ miễn dịch kích
thích sự tạo thành interferon làm giảm quá trình hình thành các khối u. Đặc biệt
trong quá trình sinh trưởng các vi khuẩn này thường sử dụng cholesterol nên có vai
trò làm giảm lượng cholesterol được hấp thu vào cơ thể (Salmien và Deighton,
1998).
e. Ứng dụng trong bảo vệ và xử lý môi trường
Xử lý các chất thải, phế liệu trong nông nghiệp - nông thôn bằng công nghệ
vi sinh để bảo vệ môi trường và sản xuất ra khí sinh học (biogas), phân bón hữu

36. Đồ án tốt nghiệp
32
cơ… phục vụ dân sinh và nông nghiệp. Những nước có công nghệ phát triển trong
lĩnh vực này là Nhật Bản, Mỹ, EU và Canada.
1.5.2.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men
truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản
phẩm men tiêu hoá đông khô. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước
đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng
khuẩn từ các nguồn sản phẩm lên men và các sản phẩm men tiêu hoá đông khô có
sẵn trên thị trường. Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều
kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực
phẩm tự nhiên.
Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các
sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có
nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm
này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng
hợp bacteriocin. Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm
nem chua. Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp
phần tạo hương vị cho nem chua.
Việt Nam đã nghiên cứu hoàn thiện một số công nghệ sản xuất phân vi sinh
vật, thức ăn bổ sung cho gia cầm, chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật và bả diệt chuột
sinh học; ứng dụng thành công công nghệ biogas để xử lý chất thải hữu cơ…
Sử dụng vi sinh vật để làm phân bón (phân VSV cố định Nitơ tự do hoặc hội
sinh; phân VSV phân giải phot phat khó tan từ vi khuẩn hoặc nấm mốc; phân VSV
có nguồn gốc từ nấm Mycorhiza, vi khuẩn Rhizobium, xạ khuẩn Frankia cho cây
lâm nghiệp: Thông, Keo, Phi lao, Sao đen), chế phẩm VSV bổ sung thức ăn gia
cầm...
Chế phẩm thuốc BVTV sinh học được ứng dụng rộng rãi như NPV, V-Bt để
trừ sâu khoang, sâu xanh hại rau, màu, bông, đay, thuốc lá; chế phẩm vi khuẩn

37. Đồ án tốt nghiệp
33
huỳnh quang (Pseudomonas fluorescens) phòng trừ bệnh hại rễ cà phê, vải thiều,
lạc.
Nhiều kết quả nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt côn trùng đã đạt được kết
quả tốt như: Metarhizium flovoviridae trừ mối, châu chấu hại mía (hiệu quả phòng
trừ đạt 76%), Beauveria bassiana trừ sâu róm hại thông (hiệu quả phòng trừ đạt
93,6%), hay Beauveria bassiana và Metarhizium aníopliae phòng trừ sâu hại dừa đạt
hiệu quả từ 56-97%; nấm đối kháng Trichoderma trừ bệnh khô vằn trên ngô đạt
hiệu quả 45-50%, hạn chế bệnh lở cổ rễ đậu tương 51-58%. Hiện nay, các nhà khoa
học đang hoàn thiện qui trình sử dụng nấm Exserohilum monoceras để trừ cỏ lồng
vực.
Trong lĩnh vực xử lý môi trường: đã ứng dụng thành công công nghệ Biogas
để chuyển các chất thải hữu cơ thành khí đốt. Đã xử lý rác thải, than bùn... làm phân
bón. Những nghiên cứu trong ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải,
chuyển đổi sinh học các nguồn phụ, phế thải nông, lâm nghiệp cũng đang được tiến
hành.
1.6. Yêu cầu đối với việc sử dụng chất bảo quản sinh học trong thực phẩm
- Chất bảo quản sinh học được sử dụng không có tính độc và kích thích sự
kháng thuốc của vi sinh vật khác.
- Được cơ quan thẩm quyền công nhận và cho phép sử dụng.
- Phải được sử dụng một cách hợp kinh tế trong công nghiệp.
- Sản phẩm có bổ sung chất bảo quản sinh học phải không bị ảnh hưởng.
Ví dụ: chất bảo quản sinh học không gây tác động xấu đối với đánh giá cảm
quan của sản phẩm.
- Vẫn tỏ ra hiệu quả khi được dùng ở nồng độ tương đối thấp.
- Chất bảo quản sinh học phải đủ bền khi được cất trữ.
- Không được sử dụng trong chữa bệnh hoặc dùng làm phụ gia thực phẩm
cho động vật hay bổ sung vào thức ăn giúp tăng sự phát triển của động vật.

38. Đồ án tốt nghiệp
34
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –
Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2014 đến tháng 06/2014.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được sử dụng trong nghiên cứu được cung
cấp bởi Lê Ngọc Thùy Trang (2013).
2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị
Vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella, Listeria monocytogenes được
cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM.
2.2.3. Nguồn mẫu khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm của hợp chất kháng
khuẩn vi khuẩn L. plantarum
Nguồn mẫu là thịt nạc đùi tươi được mua từ cửa hàng Vissan Quận Bình
Thạnh.
2.2.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.4.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MRS OPTSC01 (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013)
Môi trường Tryptone Soya Borth (HiMedia - Ấn Độ)
Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)
Môi trường Saline Pepton Water (SPW)
Môi trường Plate Count Agar (PCA)
Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB)

39. Đồ án tốt nghiệp
35
Môi trường Briliant Green Bile Lactose borth (BGBL)
Môi trường Eosine Methylene Blue Agar (EMB)
Môi trường Tryptone
Môi trường MR-VP
Môi trường Simon Citrate Agar (SCA)
Thuốc thử Kovac’s
Thuốc thử Methyl Red
Thuốc thử α-naphtol 5%
Dung dịch KOH 40%
Dung dịch NaOH 2M
Môi trường Baird Parker (BP)
Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya (RV)
Môi trường Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)
Môi trường TSI
Môi trường Mannitol Phenol Red both
Môi trường Urea broth
Môi trường LDC
2.2.4.2. Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
Đĩa petri Đũa thủy tinh
Ống nghiệm Giấy đo pH
Ống đong 50ml, 100ml Ống Falcon
Becher 100ml, 250ml, 500ml Các loại đầu típ
Pipette 1ml, 10ml, 25ml Đèn cồn
Ống ly tâm Eppendorf Micropipette 100µl, 1000µl
Bình môi trường 250ml, 500ml, 1l Dao cắt mẫu
Dây cấy ria, dây cấy thẳng, que cấy trang Kẹp gắp mẫu
Bông y tế và bông không thấm nước

40. Đồ án tốt nghiệp
36
b. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh Máy đo UV - VIS
Tủ ấm 300
C, 370
C Máy ly tâm
Bể điều nhiệt Tủ hút
Cân phân tích Máy lắc
Tủ lạnh Bếp từ
Autoclave Máy nước cất
Máy đo pH
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu
Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất
quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ
thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích.
Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường
hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.
Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9
ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1
. Tiếp tục từ
ống nghiệm 10-1
hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
loãng ta được độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng
độ cần thiết.
Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta
được nồng độ pha loãng 10-1
. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha
loãng ở nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng
ta được nồng độ pha loãng 10-2
. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng
(Phạm Minh Nhựt, 2014).

41. Đồ án tốt nghiệp
37
Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu
2.3.2. Phương pháp tăng sinh
Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi
trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi
lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm
bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và
môi trường.
Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trong
glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa
10ml môi trường MRS broth. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370
C trong 48 giờ.
Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong
glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa
10ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt
độ phòng.
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
Nguyên tắc: đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật
được cấy trên môi trường thạch nghiêng và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh
vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển đến tủ mát (3 – 50
C) để bảo quản.

42. Đồ án tốt nghiệp
38
Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật
luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh
vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa
là 3 tháng cấy chuyển giống một lần.
Đối với chủng LAB: cấy chuyển định kỳ 2 tuần/1 lần trên ống thạch nghiêng
chứa môi trường MRS agar. Bảo quản trong trong tủ mát.
Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên
ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40
C
(Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Nguyên tắc: ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, ta
có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là
việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước
trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn
chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.
Vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút dịch
tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch, thu cặn có chứa sinh khối.
Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150
C (Nguyễn
Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.3.3. Phương pháp vi gói L. plantarum trong hỗn hợp gelatine và aginate
Nguyên tắc: vi gói là phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các
polymer có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo như gelatine và aginate để bẫy, nhốt
và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ. Giúp tế bào cách
ly được với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự thất thoát
của số lượng tế bào. Vi gói giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào,
các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường không thuận lợi như độ acid
cao, muối mật, sốc nhiệt hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên
men... và sản sinh hợp chất kháng khuẩn tại những nơi ta mong muốn. Từ đó có thể

43. Đồ án tốt nghiệp
39
làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại, giúp việc bảo quản chủng, giống tế bào
được lâu dài hơn.
Chủng L. plantarum sau khi tăng sinh cấp 1 trong môi trường MRS đi ly tâm
thu cặn và pha loãng với nước muồi sinh lý với thể tích bằng với lượng dịch trong
bỏ đi. Trôn đều hỗn hợp gelatine (6%) và aginate (2,5%) với nhau theo tỷ lệ 4 : 1
thành một hỗn hợp gel. Tiếp tục trộn đều hỗn hợp gel với sinh khối L. plantarum
theo tỷ lệ 2 : 1, theo nghiên cứu của Lê Trần Hồng Xuân.
Sử dụng ống bơm tiêm hút hỗn hợp gel và sinh khối L. plantarum và nhỏ
thành từng giọt trong dung dịch hổ trợ tạo gel là dung dịch CaCl2 (2%), ngay lập tức
các polymer gelatine và alginate bao quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi
liên kết với ion Ca2+
tạo thành các hạt gel tròn chứa chủng L. plantarum. Các thao
tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng (Đỗ Quốc Cường, 2009).
Sau đó có thể bảo quản chúng trong dung dịch đường lactose 10% trong tủ
mát 40
C hoặc có thể tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS.
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp: đối với dịch sau ly tâm của LAB sau khi nuôi cấy trong môi
trường thích hợp được xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị bằng
phương pháp đồng nuôi cấy (Vaseeharan và Ramasamy, 2003).
Vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong các erlen chứa 10ml TSB rồi đem đi lắc
với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ
thị được đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt
mật độ 106
cfu/ml.
Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch L.
plantarum SC01 sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 2
µl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật
độ 106
cfu/ml cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn dịch L. plantarum SC01 sau ly
tâm và môi trường TSB ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ rồi tiến hành xác định hoạt
tính ức chế vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp đo độ đục đã trình bày ở trên. Từ đó,
đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn của

44. Đồ án tốt nghiệp
40
dịch tế bào L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate
2,5 % sau ly tâm thông qua tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị.
Phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau
(Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012):
% Tỷ lệ ức chế = ( 𝟏 −
𝑶𝑫𝑻𝑵
𝑶𝑫Đ𝑪
) 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
2.3.5. Phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)
Cho 25g mẫu vào 225ml SPW
và đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh
lý đến độ pha loãng cần sử dụng
Hút 1ml ở mỗi độ pha loãng cho vào
2 đĩa petri vô trùng
Đổ môi trường PCA đã được làm
nguội đến 450C vào các đĩa trên
Lắc đều, chờ đĩa thạch nguội ủ ở
nhiệt độ 300C trong 72 giờ
Đọc kết quả, chọn các kết quả từ
25 - 250 khuẩn lạc
Tính toán kết quả

45. Đồ án tốt nghiệp
41
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml
dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều
kiện vô trùng. Thời gian đồng nhất mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu. Khi đó được
dung dịch pha loãng 10-1
.
Dịch pha loãng sẽ được pha loãng bằng cách dùng micropipette với đầu tip vô
trùng hút 1 ml vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, lắc đều được dịch pha
loãng 10-2
. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
Tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự
kiến chứa từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật.
Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa
petri vô trùng tương ứng với mỗi độ pha loãng. Tiến hành đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml
môi trường PCA ở nhiệt độ 45 – 500
C. Xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim
đồng hồ từ 3 – 5 lần để mẫu và môi trường được trộn đều chờ đĩa nguội đem ủ ở
nhiệt độ 300
C trong 72 giờ.
Tiến hành đọc kết quả bằng cách đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa
sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật
độ tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau:
A (CFU/g) =
𝑁
𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖
Trong đó:
A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
f: độ pha loãng tương ứng
(Phạm Minh Nhựt, 2014).

46. Đồ án tốt nghiệp
42
2.3.6. Phương pháp định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa
Cho 25g mẫu vào 225 ml SPW và đồng nhất mẫu
Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng hợp lý
Hút 1 ml ở mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri vộ trùng.
Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C
và đợi trong 30 phút
Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng
tủa muối mật, đường kính > 0,5mm
Ở mỗi đĩa chọn 3 - 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi
trường BGBL
Ủ 370C trong 24 giờ
Tính tỷ lệ xác nhận R
Tính tổng số Coliform (cfu/g)

47. Đồ án tốt nghiệp
43
Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung
dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi
đó được dung dịch pha loãng 10-1
.
Hút 1 ml dịch pha loãng mẫu vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa và chọn
2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Tùy vào mẫu cần kiểm định mà chọn độ pha loãng
thích hợp. Đổ vào mỗi đĩa 5ml môi trường TSA đã được làm nguội đến 450
C, trộn
đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim
đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ. Đổ thêm 10 – 15ml môi
trường VRB. Chờ môi trường đông đặc ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ. Chọn các
đĩa từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ
đậm và đường kính >0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật.
Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã
đếm được với các hình dạng khác nhau cấy sang môi trường canh BGBL và ủ ở
370
C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi có bọt khí xuất hiện trong ống
Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số
khuẩn lạc khẳng định.
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms
theo công thức sau:
A (CFU/g hay CFU/ml) =
𝑁
𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖
x R
Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng
v: thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ xác nhận
Với R =
Số ống BGBL dương tính
Tổng số ống BGBL thử nghi ệm
Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ
có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014).

48. Đồ án tốt nghiệp
44
2.3.7. Phương pháp định lượng Staphylocuccus aureus bằng phương pháp cấy
trang
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng S. aureus bằng phương pháp cấy trang
Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung
dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi
đó được dung dịch pha loãng 10-1
, tương tự tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành
pha loãng mẫu đến độ pha loãng cần sử dụng.
Cho 25 g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất
Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2
Hút 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-2 cho vào đĩa môi
trường BP có bổ sung egg yolk rồi tiến hành cấy trang
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP:
tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen và có quầng sáng bao
quanh
Cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ
Ủ 370C trong 24 giờ
Xác định tỷ lệ ngưng kết và tính tổng số S. aureus
(cfu/g)

49. Đồ án tốt nghiệp
45
Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP và
cấy trang đều cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng.
Ủ ở nhiệt độ 370
C trong 48 giờ đối với môi trường BP. Sau 48 giờ, trên môi trường
BP khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng, có vòng
sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
Quy trình khẳng định được thực hiện bằng cách: cấy chuyển vào ống nghiệm
chứa 0,2ml huyết tương thỏ. Tiến hành ủ ở 370
C và theo dõi sau 24 giờ từ đó xác
định tỷ lệ ngưng kết R. Tỷ lệ xác nhận (tỷ lệ ngưng kết) là tỷ số giữa khuẩn lạc cho
kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.
Đếm số lượng các khuẩn lạc và dựa vào tỷ lệ ngưng kết R để tính mật độ S.
aureus theo công thức:
A (CFU/g hay CFU/ml) =
𝑁
𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖
x R
Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng
v: thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ xác nhận
Với R =
Số ống huy ết thanh dương tính
Tổng số ống huy ết tương thử nghi ệm
Kết quả S. aureus được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ
có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014).

50. Đồ án tốt nghiệp
46
2.3.8. Phương pháp định tính E. coli trong thực phẩm
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình định tính E. coli
Chuẩn bị mẫu và tiến hành pha loãng mẫu. Hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng ở
nồng độ 10-1
vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL, ủ ở nhiệt độ 440
C trong
Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu
Hút 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa
10 ml môi trường BGBL
Ủ ở nhiệt độ 440C trong 24 giờ
Chọn các ống BGBL đục và có sinh hơi cấy chuyển sang môi
trường EMB
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng của E. coli trên EMB: tròn, dẹt, đường
kính <0,5mm, có ánh kim tím
Cấy vào các môi trường: 1 Trypton, 2 MR - VP, 1 Simmons
Citrate
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Thử nghiệm IMViC

51. Đồ án tốt nghiệp
47
24 giờ. Sau đó, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và
có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB rồi mang đi ủ ở 370
C
trong 24 giờ.
Nhận dạng khuẩn lạc E. coli: khuẩn lạc tròn, dẹt, có tâm đen, có bờ đều,
đường kính >0,5mm và có ánh kim tím.
Những khuẩn lạc nghi ngờ được cấy vào các ống thử nghiệm sinh hóa sau đây:
1 ống canh trypton, 2 ống MR – VP, 1 ống Simmon citrate để thực hiện nghiệm
thức IMViC (Indol, Methyl Red, VP, Citrate):
- Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi
trường canh trypton. Phản ứng Indol là dương tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề
mặt, phản ứng là âm tính khi không có sự xuất hiện của vòng đỏ ở trên.
- Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn
trong môi trường MR – VP, lắc đều. Phản ứng MR là dương tính khi canh khuẩn
chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính là khi canh khuẩn không chuyển màu.
- Thử nghiệm Voges – Proskauer: cho 3 giọt thuốc thử α – napthol 5 % vào
canh khuẩn MR – VP, lắc đều. Sau đó, bổ sung 1 giọt KOH 40%, lắc đều rồi quan
sát sau 10 phút. Phản ứng VP là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ,
phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu.
- Thử nghiệm Citrate: trong môi trường Simmon Citrate, phản ứng là dương
tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang
xanh lam, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển
màu.
Khẳng định phát hiện E. coli khi các nghiệm thức cho kết quả như sau:
Thử nghiệm Indol (+)
Thử nghiệm Voges – Proskauer (-)
Thử nghiệm Methyl Red (+)
Thử nghiệm Citrate (-)
(Phạm Minh Nhựt, 2014)

52. Đồ án tốt nghiệp
48
2.3.9. Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình định tính Salmonella trong mẫu thịt
Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung
dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều kiện vô
trùng. Tiến hành quá trình tiền tăng sinh bằng cách ủ các bao nylon chứa mẫu đã
Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Hút 0,1 ml canh trường cho vào ống nghiệm chứa10
ml môi trường RV
Ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ
Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ
370C trong 24 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên XLD:
tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá
lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường xung quanh
chuyển sang màu đỏ
Cấy vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi
trường TSI, Indole, VP, Urea, Manitol, LDC
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Sử dụng các loại thuốc thử để kiểm tra

53. Đồ án tốt nghiệp
49
được pha loãng và đồng nhất ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ. Trộn môi trường canh
sau khi đã ủ 24 giờ trước cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV.
Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420
C trong thời gian 24 giờ.
Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh
chọn lọc RV cấy ria trên môi trường chọn lọc cho Salmonella là XLD. Trên môi
trường XLD khuẩn lạc đặc trưng Salmonella có màu hồng trong suốt, có hay không
có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi
trường XLD chuyển sang màu hồng. Tất cả các đĩa sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ
370
C trong 22 – 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để
khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa.
Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella lên men glucose,
lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, LDC và mannitol. Các chủng Salmonella
cho kết quả thử nghiệm như sau:
- Thử nghiệm trên môi trường TSI: Salmonella chỉ lên men được glucose
trong các môi trường TSI nên phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa
số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên
môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi làm vỡ thạch môi trường hoặc môi
trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm.
- Thử nghiệm Urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay
đổi pH môi trường, sau khi cấy môi trường vẫn giữ nguyên được màu tím nhạt.
- Thử nghiệm lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa
chuyển sang màu vàng.
- Thử nghiệm LDC: sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu
môi trường được chuyển sang màu ban đầu.
- Thử nghiệm Indole và VP đều (+).
(Phạm Minh Nhựt, 2014).
2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Statgraphics
centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey.

54. Đồ án tốt nghiệp
50
2.4. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Vi khuẩn L. plantarum SC01
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến
hoạt tính hợp chất kháng khuẩn
Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt
tính hợp chất kháng khuẩn
Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động
bề mặt đến hoạt tính hợp chất kháng
khuẩn
Khảo sát hiệu quả ức chế của hợp chất
kháng khuẩn từ L. plantarum đối với vi
khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát
Đánh giá khả năng bảo quản thịt của hợp
chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01
đối với vi khuẩn chỉ thị