mẫu ppt y học

1. Hướng dẫn khoa học:TS. Trần Vân Khánh
Đ NG C H IỖ Ọ Ả
NG H IÊ N C U Đ T BI N M T ĐO N G E N D Y S T R O PH INỨ Ộ Ế Ấ Ạ
M C Đ m R NA T R Ê N B NH NH ÂN LO N D NG CỞ Ứ Ộ Ệ Ạ ƯỠ Ơ
D U C H E NNE
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

2. ĐẶT VẤN ĐỀ
Gen Dystrophin
mRNA Dystrophin
3.0 MB
79 exons
14-kb mRNA
Protein Dystrophin 427 K Da
Xp21.1
X-chromosome
Tần xuất mắc bệnh khá
cao: 1/3500 trẻ trai
TW LS tiến triển nặng dần
Tử vong ngoài 20 tuổi do RL hô hấp
hoặc tổn thương cơ tim
Hiện nay chưa có PP điều trị tiệt căn.

3. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở VIỆT NAM
Ở VN, Các n/c tập
trung xác định đột
biến mức độ DNA ở
2 vùng trọng điểm
bỏ sót tổn thương.
Xác định đột biến
khắp cả chiều dài
gen dystrophin: mức
độ DNA cần 79 cặp
mồi, mức độ mRNA
cần 15 cặp mồi.

4. MỤC TIÊU
Xác định tỷ lệ mất đoạn từng exon và tỷ lệ phân
bố vùng đột biến mất đoạn của gen Dystrophin
trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

5. Tæng quan
1. Đ C ĐI M B NH D M DẶ Ể Ệ
2. D I T R U Y N H C C A D M DỀ Ọ Ủ
3. G E N D Y S T R O PH IN

6. T NG Q U ANỔ
1. Đ C ĐI M B NHẶ Ể Ệ DMD
 Bi u hi n lâm sàngể ệ
 B t đ u t 3-5 tu iắ ầ ừ ổ
 D b ngã, khó đi l i và thay đ iễ ị ạ ổ
t thư ế
 D u hi u Gowerấ ệ
 Gi phì đ i c b p chânả ạ ơ ắ
 Dáng đi l ch b chạ ạ
 Th ng t vong l a tu i 20.ườ ử ở ứ ổ

7. Gi phì đ i c c ngả ạ ơ ẳ
chân

8. Gower’s sign

9. Bình thường <248 IU/L
DMD >10000 IU/L
T NG Q U ANỔ
Xét nghiệm cận lâm sàng
Hoat độ enzym creatinin Kinase

10. Bình thường DMD BMD
Out-of-frame In-frame
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang
T NG Q U ANỔ

11. 2. DI TRUY N H C C AỀ Ọ Ủ DMD
Bệnh di truyền lặn đơn gen, liên kết NST X không có alen tương ứng trên Y
TỔNG QUAN
Genotyp và phenotyp của cha mẹ
Tần số con với các genotype khác nhau
Trai Gái
Cha Mẹ
XD
Y
lành
Xd
Y
bệnh
XD
XD
lành
XD
Xd
lành mang
gen bệnh
Xd
Xd
bệnh
XD
Y lành
XD
XD
lành
1 0 1 0 0
XD
Y lành
XD
Xd
lành mang gen
bệnh
1/2 1/2 1/2 ½ 0
XD
Y lành
Xd
Xd
bệnh
0 1 0 1 0
Xd
Y bệnh
XD
XD
lành
1 0 0 1 0
Xd
Y bệnh
XD
Xd
lành mang gen bệnh
1/2 1/2 0 1/2 1/2
Xd
Y bệnh
Xd
Xd
bệnh
0 1 0 0 1

12. P-dystrophin
M-dystrophin
C-dystrophin
S-dystrophin
(Dp116)
A-dystrophin
(Dp140)
G-dystrophin
(Dp71)
R-dystrophin
(Dp260)
exon
C1 M1 P1 2 3 29 R1 30 44 A1 45 55 S1 56 62 G1 63
C: Cortical
M: Muscle
P: Purkinje
R : R etinal
A1: Kidney
S1: Peripheral nerve
G: Dystrophin isoform
D p71
TỔNG QUAN
3. GEN DYSTROPHIN

13. TỔNG QUAN
Actin binding domain
Rod domain
Cystein rich domain
C terminal domain
cDNA
Exon 1-8 Exon 8 - 64
Exon
65 - 67
Exon 68 - 79
F- actin
β-dystroglycan
α-syntrophin
α-dystrobrevin
Exon1-8 Exon 62-67 Exon 73-74 Exon 74-76

14. Các dạng đột biến trên gen Dystrophin
524020１
Đ t bi n xoá đo n: 60-65%ộ ế ạ
Đ t bi n đi m : 25%ộ ế ể
Đ t bi n l p đo n: 5%ộ ế ặ ạ
C ác đ t bi n khác: 5%ộ ế

15. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
NHÓM CHỨNG
10 người, dùng như chứng để
chạy cùng mẫu BN
NHÓM NGHIÊN C UỨ
Xác định đột biến ở mức độ mRNA
Lựa chọn 10 BN được chẩn đoán
DMD dựa vào các tr/c điển hình:
Bệnh diễn tiến tuần tiến, yếu cơ, teo
cơ (teo gốc chi, nhiều nơi, đối xứng),
giả phì đại cơ, nồng độ CK tăng cao,
có tiền sử gia đình rõ.

16. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thu thập mẫu
Tách chiết mRNA từ
10ml máu ngoại vi
Tổng hợp cDNA Nested-PCR
Nhân dòng gen
(cloning)
Giải trình tự gen
xác định đột biến

17. PH NG PH ÁP NG H IÊ N C UƯƠ Ứ
1. ChiÕt t¸ch RNA:
T¸ch chiÕt RNA tõ 10 ml m¸u ngo¹i vi chèng ®«ng theo Kit isogen.
KiÓm tra chÊt l­îng vµ ®é tinh s¹ch RNA
- Điện di RNA
- Đo OD260/280nm
Tæng hîp cDNA.
KiÓm tra chÊt l­îng cDNA b»ng gen néi chuÈn GAPDH

18. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. PH N NG NESTEDPCRẢ Ứ
Sử dụng 15 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại toàn bộ chiều dài
gen dystrophin.
m R NA
1st
PCR
2nd
PCR
Dùng 1µl s n ph mả ẩ
1st
PCR làm khuôn
m u cho 2ẫ nd
PCR

19. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 Phản ứng PCR lần 1
Thành phần:
- 10 x buffer: 2 μl
- dNTP: 2 μl
- Taq polymerase: 0,2 μl
- Mồi xuôi: 1 μl
- Mồi ngược: 1 μl
- cDNA: 5 μl
- Nước cất: 8,8 μl
940
C/5phót 940
C/1phót
550
C/1 phót 720
C/3 phót
35 CK
720
C/5phót 40
C/∞
Chu trình PCR

20. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ
 Phản ứng PCR lần 2
Thành phần:
- 10 x buffer: 2 μl
- dNTP: 2 μl
- Taq polymerase: 0,2 μl
- Mồi xuôi: 1μl
- Mồi ngược: 1μl
- sản phẩm PCR lần 1: 1μl
- Nước cất: 12,8 μl
940
C/5phót 940
C/1phót
550
C/1 phót 720
C/3 phót
35 CK
720
C/5phót 40
C/∞
Chu trình PCR

21. PH NGƯƠ PHÁP NGHIÊN C UỨ
3. GI I TRÌNH T GENẢ Ự
 Nhân dòng gen (cloning):
 Giải trình tự gen:
Tinh s ch SP PCR t gelạ ừ
Chuy n vào vector t o dòng “pDriveể ạ
Cloning Vector”
Th c hi n các PP bi n n pự ệ ế ạ
Ch n l c khu n l c mang plasmid m c tiêuọ ọ ẩ ạ ụ
Tách chi t plasmidế
Tinh s ch DNA plasmid (kit QIAGEN)ạ
Gi i trình t gen theo quy trìnhả ự
So sánh v i trình t GeneBank xđ đ tớ ự ộ
bi n.ế

22. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN
1. TÁCH CHI TẾ RNA VÀ T NG H PỔ Ợ cDNA
rRNA 26S
rRNA 18S
mRNA
1 2 3 4 5

23. K T QU DO N NG Đ mRNAẾ Ả Ồ Ộ
Mã s BNố
N ng RNAồ độ
(ng/µl)
tinh s chĐộ ạ
(A260
/A280
)
1 980 1,82
2 1020 1,83
3 1120 1,83
4 1300 1,80
5 850 1,80
6 1230 1,85
7 1180 1,86
8 1050 1,80
9 970 1,87
10 1260 1,82
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

24. K t qu khu ch đ i cDNA b ng c p m i GADPHế ả ế ạ ằ ặ ồ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

25. 2.K T QU XÁC Đ NH Đ T BI NẾ Ả Ị Ộ Ế
• K t qu nghiên c u b nh nhân mã s 1.ế ả ứ ệ ố
M C P
2CD
Exon 17 Exon 22
18 19 20 21
635bp
17 22 23 24 25
1st
PCR: 1C – 1D
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN
2nd
PCR: 2C – 2D

26. • K t qu phân tích b nh nhân mã s 2ế ả ệ ố
C P M
Exon 68Exon 60
1st
PCR: 5A-5B
2nd
PCR: 5C -
c72r
61 62 63 64 65 66 67
60 68 69 70
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

27. • K t qu phân tích b nh nhân mã s 4ế ả ệ ố
698 bp
P M
Exon 20Exon 11
1st
PCR : 1A – 2D
2nd
PCR: c9f – c22r
12 13 14 15 16 17 18 19
11 20 21 22
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

28. • K t qu phân tích b nh nhân mã s 7ế ả ệ ố
1960 bp
738 bp
C P Exon 44 Exon 53
1st
PCR: 4A- 4D
2nd
PCR: 4C –
c56r 45 46 47 48 49 50 51 52
44 53 54 55 56
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

29. • K t qu phân tích b nh nhân mã s 10ế ả ệ ố
M C P
817 bp
1291 bp
Exon 48Exon 44
1st
PCR: 4A – 4D
2nd
PCR: 4C – 4D 45 46 47
44 48 49 50 51
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

30. • K t qu đi n di c a nhóm các b nh nhân khôngế ả ệ ủ ệ
có đ t bi n xóa đo nộ ế ạ
C P C P C P C P C P C P C P C P C P C PC P C P C P C P C P C P C P C P C P C P
1CD 1EF 2CD 2EF 3CD 3EF 4CD 4EF 5CD 5EF
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

31. 3.K t qu v t l đ t bi n xóa đo n và phân b v tríế ả ề ỷ ệ ộ ế ạ ố ị
các exon b xóaị đo n trên gen Dystrophinạ
Kết quả
Số
l ngượ
BN
T l %ỉ ệ
Có đột biến mất đoạn 5 50
Không tìm th y t bi nấ độ ế
m t o nấ đ ạ
5 50
T ng sổ ố 10 100
50%
50%
Có đột biến mất đoạn
Không tìm th y đ t bi n m t đo nấ ộ ế ấ ạ
T l đ t bi n xóa đo n trên gen Dystrophinỷ ệ ộ ế ạ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

32. Exon bị mất đoạn
Số lượng
BN
Tỷ lệ %
Mất đoạn exon vùng 1 - 19 2 40
Mất đoạn exon vùng 43 - 60 2 40
Mất đoạn exon ngoài vùng
hostpot
1 20
Tổng số 5 100
40%
40%
20%
M t đo n exon vùng 1 -ấ ạ
19Mất đoạn exon vùng 43 - 60
Mất đoạn exon ngoài vùng hostpot
S phân b vùng đ t bi n m t đo n trên gen Dystrophinự ố ộ ế ấ ạ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

33. K T LU NẾ Ậ
1. Bằng phương pháp xác định đột biến mất đoạn gen
Dystrophin ở mức độ mRNA chúng tôi đã phát hiện được
5 trong 10 bệnh nhân DMD (Tỷ lệ 50%) có đột biến mất
đoạn.
2. Trong 5 bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn, 80% bệnh
nhân có đột biến xảy ra ở vùng hotspot, bao gồm vùng
trung tâm (exon 46 ÷ 60) và vùng đầu tận 5’ (exon 1 ÷ 19)

34. - Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2007 đến tháng
10/2008.
- Địa điểm nghiên cứu: Labo trung tâm, Trường Đại học Y
Hà Nội.
KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH VÀ NƠI THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

35. KINH PHÍ
Trích từ đề tài: “Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây
bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong việc sàng lọc
bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng”.
Đề tài được tài trợ kinh phí từ ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học
cấp Bộ y tế.

36. Em xin trân trọng
cảm ơn!