1. Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa
dạng sinh học quần thể vi sinh vật
SVTH: Lê Tuấn Dũng, Sầm Minh Hải,
Cao Xuân Bách , Lê Khắc Thắng
Lê Tiến Hòa

2. Đặt vấn đề
Vi sinh vật quanh ta Xử lý nƣớc thải
=>Cần phải có sự hiểu biết về đa dạng vi sinh vật

3. Nội dung
 Các phƣơng pháp
 Phƣơng pháp enzyme giới hạn
 Phƣơng pháp giải trình tự đặc hiệu
 DNA microarray
 Các phƣơng pháp lai
 Ứng dụng thực tiễn

4. Các phương pháp
 Phƣơng pháp truyền thống:
 Dựa vào hình thái: nhuộm,
nuôi khuẩn lạc
 Phản ứng sinh hóa
 Thực khuẩn thể - vi khuẩn
 Kháng nguyên bề mặt
 Hoạt chất kháng khuẩn

5. Phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử
 Dựa trên sự khác biệt về
cấu trúc DNA: kích thƣớc,
trình tự, sắp xếp
 Giải trình tự DNA
 Phân tích plasmid, DNA
 Lai DNA trên màng
DNA(đánh dấu bằng:
huỳnh quang,phóng xạ,...)

7. So sánh đặc điểm
Phương pháp truyền Phương pháp kỹ thuật
thống sinh học phân tử
•Thời gian lâu •Kết quả nhanh
•Thiếu chính xác •Chính xác cao
•Hạn chế với các vi sinh vật •Độ phân biệt lớn
gần nhau •Thiết bị máy móc phức
•Đơn giản, dễ tiến hành tạp, hóa chất đắt tiền
•Giảm rủi ro khi tiến hành
trên các vi sinh vật độc hại
 Trong thực tế, thƣờng kết hợp cả hai
phƣơng pháp

8. Phƣơng pháp sử dụng enzym giới hạn
Nguyên tắc
Dựa trên độ đặc hiệu của các
enzyme cắt giới hạn
(restriction enzym-RE)
Tên gọi enzym: EcoRI, RcoRV,..
VD : Escherichia coli Ry13
giống loài chủng
EcoRI: enzym đầu tiên tìm thấy
EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy

9. Các kiểu cắt của enzyme giới hạn

10. Phƣơng pháp sử dụng enzym giới hạn
Các bƣớc thực hiện
Trích AND
Cắt bằng các enzym giới hạn
Tách ADN trên gel agarose
Southern blotting
Phân loại đa dạng vi sinh vật

11. Các bƣớc

12. Các ứng dụng
• Xác định quan hệ huyết
thống
• Xác định tình trạng bệnh
• Lập bản đồ gen
• Phân tích đa dạng di truyền
• Xác định đa dạng vi sinh vật
đã định danh(dựa trên dữ
liệu vạch điện di có sẵn)
hoặc nhận biết đa dạng vi
sinh vật trong môi trƣờng
dựa trên sự khác biệt về các
vạch điện di.

13. Ƣu nhƣợc điểm
• Có độ đặc hiệu và độ nhậy cao cho phép
xác định nhanh chóng và chính xác có
mặt của không chỉ một loài vi khuẩn mà
còn cho phép xác định và phân biệt nhiều
loài vi khuẩn
• Tốn thiết bị và hóa chất, không thể hiện
kết quả tại chỗ.

14. PHƢƠNG PHÁP GiẢI TRÌNH TỰ
• Ứng dụng:
– Xác định các chủng, loài Vi khuẩn
• Nguyên tắc
– Các chủng vi khuẩn đều mang đoạn gen 16S
– Đoạn gen 16S có độ bảo thủ cao
– Không có sự trao đổi giữa các loài
– Mang tính đặc trƣng cho loài

15. Các bƣớc thực hiện
Các bƣớc thực hiện
1
• Lấy mẫu
2
• Tách chiết DNA
3
• PRC đoạn gen 16S
4
• Điện di kết quả pcr

16. DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophorensis)

17. Giải trình tự
Giải trình tự
• Giải trình tự mỗi sản phẩm thu đƣợc
sau điện di
• So sánh với ngân hàng gen
(database) xác định chính xác loài.

18. Hạn chế của phƣơng pháp
Hạn chế của phƣơng pháp
• Độ chính xác của taq DNA
polymerase không cao.
• Không phân biệt đƣợc DNA của tế
bào sống và chết trong mẫu ban
đầu.

19. Kết quả
Kết quả
• Phân loại, xác
định loài chính
xác hơn.
• Cơ sở phát triển
nghiên cứu về sự
tiến hóa của
giống, loài.

20. DNA Microarray

21. DNA Microarray là gì?

22. Kỹ Thuật DNA array
Mẫu
Chuẩn bị đích
Chuẩn bị mảng
Cơ sở dữ liệu trình tự
Tách DNA Thiết kế tập hợp mẫu dò
In lên mảng
Đánh dấu
Tiến hành lai
Xác định tín hiệu lai
Xác nhận lại mẫu dò
đã thiết kế, tiên
Xác đoán in silico
định Giải thích dữ liệu
VSV Định lượng thành phần quần xã vi
khuẩn

23. Các vấn đề khi áp dụng kỹ thuật DNA
microarray trong lĩnh vực môi trƣờng
• Về kỹ thuật
–Điều kiện lai không bao giờ tối ƣu
– Tính đa dạng rất lớn của môi trƣờng
• Về vấn đề phân tích
–Giải thích dữ liệu khó
–Cần có dữ liệu trƣớc đó về các loài vi
sinh vật

24. Khả năng phát triển kỹ thuật DNA
microarray trong quản lý môi trƣờng
• DNA microarray thỏa mãn các yêu cầu
–Xác định đồng thời nhiều loại VSV
–Sử dụng phƣơng pháp phân tích có thể
tự động hóa
–Giám sát RNA nhƣ chỉ thị định tính hoạt
tính VSV
–Định lƣợng mức độ RNA hoặc hoạt tính
VSV

25. Các kĩ thuật lai phân tử
• Khái niệm phƣơng pháp lai phân tử
• Cơ sở của phƣơng pháp lai phân tử
• Các yếu tố ảnh hƣởng
• Các phƣơng pháp lai phân tử

26. Cơ sở của phƣơng pháp lai phân tử
• Biến tính và hồi tính
DNA - RNA
• Tm
• Hạ từ từ to + điều kiện
thích hợp -> Bắt cặp
• u tuyệt đối

27. Yếu tố ảnh hƣởng
• Nồng độ và thời gian phản ứng
• Nhiệt độ
• Độ dài của các trình tự
• Lực ion

28. Các phƣơng pháp lai
Lai trong môi trƣờng lỏng Lai trên pha rắn

29. Lai tại chỗ (in situ) FISH

30. Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định
sự đa dạng của vi sinh vật Nitrate hóa trong
ao nuôi tôm.

31. Đặc điểm
ao
Lấy mẫu.
Sau lấy Lấy mẫu
mẫu bùn

32. Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa
2. Xác định mật số vi khuẩn Nitrobacter bằng kỹ thuật
Real-time PCR
Qui trình
Qui trình PCR: RT-PCR
• VKĐC: • Qui trình
Nitrobacter winogradskyi. nhiệt : 40
• Cặp mồi chu kỳ;
5’-GGCGTAGCAATACGTCAG -3’; 95oC (3’);
5’-ATCCGGTATTAGCCCAAG -3’ 95oC (45’’);
47oC (45’’),
72oC; (1’);
• Qui trình nhiệt: 72oC (3’).
35 chu kỳ; 95oC (3’), 95oC (45’), 47oC • Điện di
(40’), 72oC (1’), 72oC (3’). /agarose gel
• Điện di trong agarose gel 1,5%. 1,5%.

33. Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa
1. Xác định mật số VK Nitrosomonas bằng kỹ thuật
Real-time PCR
Qui trình
Qui trình PCR: RT-PCR
• VKĐC: • Qui trình
Nitrosomonas europaea NCIMB 11849. nhiệt :
• Cặp mồi 35 chu kỳ,
5’-GCCAATCTCAAAGCAC-3’. 95oC (10’);
5’-TCTGGTGAAAACCACTCC -3’. 95oC (1’);
55oC (1’);
• Qui trình nhiệt: 72oC (1’);
35 chu kỳ; 95oC (10’); 95oC (1’); 55oC 72oC (10’).
(1’); 72oC (1’); 72oC (10’).

34. Xác định mật số vi khuẩn nitrate hóa
Bảng 1: Biến động mật số N. europaea bằng phƣơng
pháp Real-time PCR
Bảng 2: mật số Nitrobacter bằng phƣơng pháp RT-PCR

35. Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ
thuật DGGE
Chu trình nhiệt cho PCR:
Hình 1: Sản phảm PCR khuếch đại với mồi 984f-GC và 1378R

36. Xác định sự đa dạng quần thể vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE
Hình 2: Cấu trúc quần thể vi khuẩn trong
bùn đáy ao nuôi tôm

37. Tài liệu tham khảo
• TS. Lê Thanh Hà, Bài giảng Công nghệ sinh học môi trƣờng,
ĐHBKHN
• PGS.TS Khuất Hữu Thanh, Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng
dụng, 2006, NXBKHKTHN
• Poursafa P, Kelishadi R, Moattar F, Rafiee L, Amin MM, Lahijanzadeh A, Javanmard SH.
Genetic variation in the association of air pollutants with
a biomarker of vascular injury in children and
adolescents in Isfahan, Iran.2011, PMID: 22091301 [PubMed] PMCID: PMC3214390
• Bona MG, Leal MJ, Martins LM, Silva RN, Castro JA, Monte SJ. Restriction
enzyme analysis of the hsp65 gene in clinical isolates from patients
suspected of having pulmonary tuberculosis in Teresina, Brazil. 2011
PMID: 22042395 [PubMed]
• Tạp chí khoa học và công nghệ, 2011