Download luận án tiến sĩ ngành sinh học với đề tài: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng kỹ thuật lamp (Loop-mediated isothermal amplification)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------o0o-----------
TRẦN THỊ THANH HUYỀN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM
Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP
(Loop - mediated isothermal amplification)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2013

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------o0o-----------
TRẦN THỊ THANH HUYỀN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM
Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP
(Loop - mediated isothermal amplification)
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ SỐ: 62.42.40.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI
2. PGS. TS. KIỀU HỮU ẢNH
HÀ NỘI - 2013

3. LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, phòng Đào
tạo Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô
trong Khoa Sinh học nơi đã đào tạo, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành tốt quá trình học tập của mình.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải - Viện Trưởng
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người hướng dẫn chính
của tôi trong nghiên cứu này. GS định hướng nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có
cơ hội tiếp cận với các khía cảnh mới của công nghệ sinh học và hoàn thành tốt luận án của
mình, đồng thời luôn luôn động viên, khích lệ tôi trong công việc. Tôi xin được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Kiều Hữu Ảnh là người đồng hướng dẫn của tôi. PGS đã là
người chỉ đường, định hướng cho tôi không chỉ trong công việc chuyên môn mà truyền tải cho
tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống của mình
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thị Trung – Phòng Kỹ
thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người đã cận kề cùng tôi trong công việc và dành
nhiều thời gian thảo luận các phương pháp nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án
của mình. Đồng thời, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ Phòng Kỹ thuật di
truyền, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi từ những
ngày đầu làm việc nơi đây cho đến khi tôi hoàn thành toàn bộ kết quả luận án. Tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn đến TS. Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện về mặt thời gian cho tôi trong thời gian
làm luận án.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới Bố-Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng
và dạy dỗ tôi, Chồng và con là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên để tôi có đủ nghị lực để
hoàn thành nhiệm vụ của mình.
Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013
TRẦN THỊ THANH HUYỀN

4. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên chính thức
thực hiện các nghiên cứu. Các số liệu và kết quả thí nghiệm được trình bày trong luận án là trung thực
và không trùng lặp với bất kỳ công trình nào khác.
NGHIÊN CỨU SINH
Trần Thị Thanh Huyền

5. MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ 6
1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus 6
1.1.2. Bệnh gan mủ thận 9
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh 9
1.1.2.2. Đường lây truyền 11
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh 12
1.1.2.4. Bệnh tích 13
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh 16
1.1.2.6. Điều trị bệnh 16
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri 18

6. 1.2.1. Đặc điểm sinh học 18
1.2.2. Đặc điểm hệ gen 23
1.2.3. Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh 24
1.3. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH 24
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Edwarsiella ictaluri 28
1.4.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 28
1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử 29
1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications) 30
1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP 32
1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 33
1.5.3. Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP 35
1.5.4. Các phương thức phát hiện sự khuếch đại của phản ứng
LAMP
38
1.5.4.1. Điện di trên gel agarose 38
1.5.4.2. Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang 39
1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng 40
1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP 42
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt
Nam
43
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

7. 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 46
2.1.1. Vật liệu 46
2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị 47
2.2. PHƯƠNG PHÁP 48
2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 49
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử 51
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn 51
2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli 51
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 52
2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi 53
2.2.2.5. Kĩ thuật PCR và LAMP 55
2.2.2.6. Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế 56
2.2.2.7. Ghép nối các đoạn DNA 57
2.2.2.8. Biến nạp DNA plasmid 58
2.2.2.9. Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 59
2.2.2.10. Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit 59
2.2.2.11. Xác định trình tự nucleic acid 60
2.2.3. Tối ưu các điều kiện phản ứng LAMP 60

8. 2.2.3.1. Xác định độ biến thiên Mg2+
trong phản ứng 60
2.2.3.2. Xác định nồng độ Mg2+
tối ưu 60
2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu 61
2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu 61
2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu 61
2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu 61
2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 61
2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP 61
2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP 62
2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ 62
2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm 62
2.2.4.2. Xác định LD50 63
2.2.4.3. Giải phẫu mô học 64
2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính 64
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM 66
3.1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 68
3.1.2. Nhuộm Gram 69
3.1.3. Khả năng di động, sinh indol và sinh H2S 69

9. 3.1.4. Xác định hoạt tính catalase 72
3.1.5. Hoạt tính chondroitinase 73
3.1.6. Hoạt tính tan huyết 74
3.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
PHÂN TỬ
76
3.2.1. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn 76
3.2.2. Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S 77
3.3.PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18
CỦA VI KHUẨN E. ictaluri
79
3.3.1. Phân lập gen eip18 80
3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt 81
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp 81
3.3.4. Xác định trình tự gen eip18 83
3.4.THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri 86
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5 86
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7 87
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40 88
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm 91
3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn 93
3.5.PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ
THUẬT LAMP
95

10. 3.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP 95
3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP 97
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng 97
3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng 98
3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng dNTPs 99
3.5.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mồi 100
3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ betaine 100
3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ 101
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử
dụng chỉ thị Calcein
105
3.5.2.8. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng
phương pháp LAMP
108
KẾT LUẬN 110
KIẾN NGHỊ 112
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN
113
TÀI LIỆU THAM KHẢO 114
PHỤ LỤC

11. NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
at Attogram
BHI Brain Heart Infusion Môi trường dịch thể BHI
BHIA Brain Heart Infusion Agar Môi trường thạch BHI
Bp Base pair Cặp bazơ
CFU Conoly forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc
cs Cộng sự
CT Công thức
Da Dalton
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long
EIM Edwardsiella ictaluri medium Môi trường đặc hiệu E. ictaluri
EtBr Ethidium Bromide
EIA Enzyme immunoassay Miễn dịch enzym
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn
enzym
FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hòa Kỳ
FDR Flourescent dectection reagent Thuốc thử phát hiện bằng huỳnh
quang

12. fg Femtogram
ha Hecta
Kb Kilo base
Mb Mega base
LAMP Loop-mediated isothermal
amplification
Khuếch đại đẳng nhiệt có tạo
thành vòng
OD Optical Density
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal Ribonucleic acid
TAE Tris-acetate-EDTA
UV Ultraviolet

13. DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1 Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 8
2 Bảng 1.2. Các loài cá vật chủ mà vi khuẩn E. tarda và E. ictaluri gây
bệnh
22
3 Bảng 2.1. Danh sách các mồi nhân gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
bằng kỹ thuật LAMP và PCR
47
4 Bảng 2.2. Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) trước khi gây cảm
nhiễm
63
5 Bảng 2.3. Bố trí công thức thí nghiệm cảm nhiễm cá tra 63
6 Bảng 3.1. Kí hiệu và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra
Việt Nam
66
7 Bảng 3.2. Hoạt tính phân giải chondroitin của các chủng nghiên cứu 75
8 Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ
cá tra Việt Nam
76
9 Bảng 3.4. So sánh trình tự gen eip18 của các dòng E5/4, E40/3 và Ei/10
với trình tự gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri và gen evpC của
vi khuẩn E. tadar bằng chương trình ClustalW
84
10 Bảng 3.5. LD50 của các mẫu vi khuẩn cảm nhiễm vào cá tra giống
P. hypophthalmus
88
11 Bảng 3.6. Chỉ tiêu sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập sau cảm
nhiễm
94
12 Bảng 3.7. So sánh giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP và PCR 105

14. DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
1 Hình 1.1 Cá tra bị bệnh gan mủ thận với bụng sưng to và nhiều đốm
trắng ở nội tạng
12
2 Hình 1.2. Bệnh tích trên gan thận và tỳ tạng 13
3 Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử
(A) và nhuộm Gram (B)
19
4 Hình 1.4. Bộ kit API-20E với các giếng phản ứng sinh hóa 29
5 Hình 1.5. Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 34
6 Hình 1.6. Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP 38
7 Hình 1.7. Quy trình phát hiện tác nhân gây bệnh bằng phương pháp
LAMP
39
8 Hình 1.8. Nguyên tắc của sự phát quang bởi Calcein 41
9 Hình 1.9. Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục, bằng huỳnh
quang hoặc soi dưới đèn UV
42
10 Hình 2.1. Bản đồ vector tách dòng pJet 1.2/blunt 46
11 Hình 3.1. A- Giải phẫu nội tạng cá tra khỏe mạnh A và
B - cá tra biểu hiện bệnh gan thận mủ
67
12 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn E7 và E. ictaluri ATCC 33202
trên môi trường EIM
68
13 Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn E. tarda và vi khuẩn phân lập
từ mẫu gan, thận, tỳ tạng cá bệnh trên môi trường BHIA
68

15. 14 Hình 3.4. Hình ảnh nhuộm Gram của mẫu vi khuẩn phân lập được kí
hiệu E40 bắt màu Gram âm và đối chứng là vi khuẩn Bacillus
subtilis bắt màu Gram dương
69
15 Hình 3.5. Khả năng di động, sinh indol và H2S của các các mẫu phân
lập tại Việt Nam E5, E7, E10, E40
70
16 Hình 3.6. Phản ứng phân giải tryptophan thành gốc indol 72
17 Hình 3.7. Khả năng sinh catalaza của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu và
E.i- E. ictaluri ATCC 33202
72
18 Hình 3.8. Hoạt tính chondroitinase của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 74
19 Hình 3.9. Hoạt tính tan huyết của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 75
20 Hình 3.10. Điện di kiểm tra sản phẩm tách genom trên gel agarose 77
21 Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của các mẫu vi khuẩn E5, E7 và
E40 phân lập tại Việt Nam so với các loài gần gũi dựa trên
trình tự rADN 16S
78
22 Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế tách dòng gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri 79
23 Hình 3.13. Phân lập gen eip18 từ vi khuẩn E. ictaluri 80
24 Hình 3.14. A. Kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid tách từ tế bào
E. coli DH 10B. B. Kết quả PCR đoạn gen eip18 trên plasmid
bằng cặp mồi Eip18
82
25 Hình 3.15. A - Kết quả điện di đồ sản phẩm cắt plasmid bằng enzym
hạn chế BglII. B - Kiểm tra điện di đồ sản phẩm cắt plasmid
bằng enzym KpnI
83
26 Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm plasmid đã tinh sạch của các dòng tế
bào E5/4, Ei/10 và E40/3
83
27 Hình 3.17. So sánh trình tự gen eip18 của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 85

16. với trình tự gen eip18 đã được công bố trên Ngân hàng Gene
28 Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E5
86
29 Hình 3.19. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E7
87
30 Hình 3.20. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E40
88
31 Hình 3.21. Đốm trắng trên nội quan cá tra. A- Cá thu ở ao nuôi thâm
canh; B- Cá được gây cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri
trong phòng thí nghiệm; C- Cá khỏe mạnh
91
32 Hình 3.22. Đặc điểm mô bệnh học của cá tra gây cảm nhiễm bởi vi
khuẩn E . ictaluri
92
33 Hình 3.23. Kết quả tái phân lập vi khuẩn trên cá tra sau khi cảm nhiễm
bằng các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
94
34 Hình 3.24. Phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 95
35 Hình 3.25. Cắt sản phẩm LAMP bằng enzyme Mnl I 97
36 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 98
37 Hình 3.27. Ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng LAMP khuếch đại
gen eip18 của mẫu vi khuẩn E. ictaluri E7
99
38 Hình 3.28. Ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến phản ứng LAMP 100
39 Hình 3.29. Ảnh hưởng của tỷ lệ mồi (A) và nồng độ Betain (B) đến
phản ứng LAMP
101
40 Hình 3.30. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến phản ứng LAMP 102
41 Hình 3.31. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến sự phát quang của
Calcein
102

17. 42 Hình 3.32. Giá trị OD400 tương ứng với các nồng độ MgSO4 khác nhau 103
43 Hình 3.33. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị Calcein
dưới tia UV trong điều kiện phòng có chiếu sáng (A) và trong
buồng tối (B)
104
44 Hình 3.34. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị SYBR
Green I
105
45 Hình 3.35. Giới hạn phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP 106
46 Hình 3.36. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phản
ứng LAMP
108

18. 1
MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò
quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Hoạt
động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa
có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và
góp phần đẩy lùi nghèo đói ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở
lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng
bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với
diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tính đến năm 2011 [15]. Cá tra Pangasius
hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong
những đối tượng xuất khẩu tiềm năng. Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra
hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo thống kê của Hiệp
hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới
đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt
1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu
Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16].
Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực
Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh
diễn ra hàng năm gây thiệt hại không nhỏ cho người dân, ảnh hưởng nghiêm trọng tới
môi trường thủy sản và các ngành kinh tế liên quan. Một trong những bệnh nguy hiểm
trên cá tra là bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng được phát hiện
lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá thâm canh
trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lan rộng ra các tỉnh
nuôi cá tra lân cận và cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre,
Sóc Trăng [3]. Thời kỳ cao điểm của bệnh dịch thường vào tháng 9 tới tháng 12. Bệnh
được đánh giá là vô cùng nguy hiểm do tốc độ lây lan nhanh, khó kiểm soát và khó

19. 2
điều trị do bệnh không có những triệu chứng điển hình ở giai đoạn sớm. Tốc độ lây lan
của bệnh tỷ lệ thuận với mức độ thâm canh, mật độ nuôi cá trên một đơn vị diện tích ao
nuôi. Thêm vào đó, vấn đề quản lý nguồn nước, quản lý thức ăn và khống chế bệnh
dịch còn chưa đáp ứng kịp với việc mở rộng diện tích nuôi trồng hàng năm dẫn đến
việc khi đã xuất hiện bệnh thì thường gây ra dịch cho cả một vùng nuôi trồng thủy sản.
Do đó, việc xác định sớm và nhanh tác nhân gây bệnh sẽ đóng góp không nhỏ vào vấn
đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành
kinh tế liên quan. Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả. Năm
2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp. [43]. Một năm sau
đó tác giả lại đính chính tác nhân gây bệnh là Edwardsiella ictaluri [36]. Cũng trong
năm đó, ở Indonesia nhóm nghiên cứu của Kei Yuasa và cs lần đầu tiên chứng minh E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá tra [119]. Năm 2003 Trần Thị
Minh Tâm và cs công bố tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Hanfia alvei và Pleisiomonas
shigelloides [11]. Khác hoàn toàn với các kết quả nghiên cứu trước đây, khi Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 công bố tác nhân gây bệnh là Clostridium sp. - trực khuẩn
Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là
trực khuẩn Gram âm [7]. Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác
nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus
là vi khuẩn E. ictaluri [94]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ là E. ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến
cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra. Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần phải được làm sáng tỏ.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân
gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc,
xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương
pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một

20. 3
phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng
nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng
định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng
trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến
hành đề tài:
“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam
Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification”
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius
hypophthalmus.
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật LAMP.

21. DOWNLOAD ĐỂ XEM ĐẦY ĐỦ NỘI DUNG
MÃ TÀI LIỆU: 50624
DOWNLOAD: + Link tải: Xem bình luận
Hoặc : + ZALO: 0932091562