PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH
β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX ARMS-PCR
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN VÂN KHÁNH
PHẠM THANH LOAN
CH 20- HÓA SINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU GEN-PROTEIN

www.themegallery.com Company Logo
NỘI DUNG
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
2. TỔNG QUAN
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PPNC
4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
5. KẾT LUẬN
6. KIẾN NGHỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ
- Phổ biến
- Nguyên nhân
hàng đầu
gây thiếu máu
nặng ở trẻ em
-Thể nặng phụ
thuộc truyền máu
suốt đời
- Thể nhẹ là
nguyên nhân phát
tán gen bệnh
Chưa có
phương pháp
điểu trị
triệt để
β-thalassemia
THIẾU MÁU HUYẾT TÁN
DI TRUYỀN

ĐẶT VẤN ĐỀ
 Gánh nặng cho gia
đình và xã hội

ĐẶT VẤN ĐỀ
Mục tiêu:
1. Xác định đột biến gen β-globin ở bệnh nhân bị
bệnh β-thalassemia.
2. Nhận xét mối liên quan giữa một số chỉ số cận lâm
sàng với các dạng đột biến phát hiện được.

TỔNG QUAN

HEMOGLOBIN
Hb: Hem + globin
Hem: Fe(2+) + porphyrin
Globin: 4 chuỗi
polypeptid giống nhau
từng đôi
- Chuỗi α: 141 axit amin
- Chuỗi β: 146 axit amin
Hemoglobin bình thường
Mô hình cấu trúc phân tử Hb

HEMOGLOBIN
Các loại hemoglobin ở người

BỆNH β-THALASSEMIA
Định nghĩa: Là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, được
phân loại thuộc nhóm D56.1 theo ICD 10 (International classification
disease), đặc trưng bởi sự giảm hay vắng mặt sự tổng hợp chuỗi β-globin
dẫn đến thiếu máu tan máu nặng.
- Lee và Cooley (1925), Wippe và Bradford (1936)

Phân bố bệnh thalassemia ở Việt nam
Nhóm chủng tộc Cỡ mẫu Tần xuất (%)
Kinh ở hà nội 401 1.5
Kinh miền Nam VN 446 1.7
Người Việt ở Mỹ 182 1.7 – 8.0
Mông 40 25.0
Tày 199 11.0
Rhade, Sê đăng, Khmer, Pa kô 228 8.3
Chăm, stiêng, Gia Jai 124 5.0
Vân kiều 78 2.6
Nguoàn: Hurst Detal(1983) JPediatr102:692-697;
KhanhNC(1993)YhoïcVieätNam8:11-16;
Fucharoenetal(1987) Hemoglobin11:65-88
Winter WP(2000)Hemovariants inhumpops.CRCPress, Florida,49-67

Nhóm chủng tộc Cỡ mẫu Tần xuất (%)
Kinh ở Hà Nội 401 1.2
Kinh miền Nam VN 1682 3.1 – 8.9
Người Việt ở Pháp 42 9.0
Người việt ở Mỹ 182 2.0
Vân Kiều 78 23.1
Mông 40 7.2
Rhade, Sê đăng, Khmer, Pa kô 598 5.8 – 38.6
Chăm, Stiêng, Gia Jai 290 29.1 – 55.9
Tần suất mang gen
Haemoglobin E của Việt Nam
Nguoàn: Hurst Detal(1983) JPediatr102:692-697;
KhanhNC(1993)YhoïcVieätNam8:11-16;
Fucharoenetal(1987) Hemoglobin11:65-88
Winter WP(2000)Hemovariants inhumpops.CRCPress, Florida,49-67

Kiểu gen Kiểu hình
Người
bình
thường
β/β
βĐB/βĐB
Tử vong sớm
Phụ thuộc
truyền máu thải
sắt suốt đời
Hb: 3-5g/dL
MCV: 50-70 fl
MCH: 20-22
pg
HbF:20-100%
HbA1: 0-80%
HbA2: 2-7%
βĐB/β
Thiếu máu nhẹ
Truyền bệnh
cho thế hệ sau
HC tăng, HC
nhỏ, nhược
sắc
HbF < 10%
βĐB/ HbE
Giống thể
nặng, biểu hiện
muộn hơn
Hồng cầu
nhỏ, nhược
sắc
HbF cao
HbE cao
HbA2: 5,5-
5,7%
Kiểu gene - kiểu hình

Biểu hiện lâm sàng

Cơ sở phân tử:
E I E II E III
Intron 1 Intron 2
5’ 3’CCAAT TATA
1-30 31-104 105-146
Đột biến
Chuỗi β
Giảm
(β+)
Mất hoàn toàn
(β0)

9 loại đột biến gen β-globin phổ biến ở Việt nam
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Cd17 A>T
- 28 A>G
Cd 26 G>A
IVS I-1 G>T
IVS I-5
G>C
Cd41/42 (– TCTT)
Cd71/72 +A
Cd95 +A
IVS II-654 (C>T)
Intron 1
Intron 2

ĐB BT BTĐB ĐB BT
ĐHT DHT BT
Kỹ thuật ARMS-PCR

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5’
5’
3’
A
T5’ 3’
G C
A
T
G
3’
5’3’3’ 5’ 3’ 5’5’3’ C
MK 1 2 3 4
Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR:

ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Nhóm bệnh: 52 Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh β-
Thalassemia
 Nhóm chứng: 5 người không mắc bệnh về máu.
 Thời gian NC: Từ tháng 2/2013 đến tháng 9/2013
 Địa điểm NC: TT nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà
Nội.
 KTNC: Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện 8 đột biến
gen gây bệnh β-thalassemia phổ biến ở Việt Nam và đột biến Cd26
gây thể HbE, xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR

Multiplex ARMS-PCR
ARMS-PCR
Không thấy đột biếnThấy đột biến
Kiểu gen
Liên quanvới CLS KẾT LUẬN
Thu thập mẫu
Tách DNA
QUY TRÌNH N/C:

Nhóm
Đột biến
Tên mồi Mồi
chung
Nồng độ
(μM)
Kích thước
Sản phẩm (bp)
1
-28(A>G)-ngược (ĐB-BT)
Cd17(A>T)-ngược (ĐB-BT)
IVS I-1(G>T)-ngược (ĐB-BT)
Cd41/42(-TCTT)-ngược (ĐB-BT)
Cd71/72(+A)-ngược (ĐB-BT)
E
(xuôi)
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
172
303
340
506
596
2
Cd 95(+A)-ngược (ĐB-BT)
IVS I-5( G>C)-ngược (ĐB-BT)
IVS II-654(C>T) - xuôi (ĐB-BT)
E
(xuôi)
0,2
0,2
0,2
626
344
810B
(ngược)
3
Cd 26 (G>A) HbE-ngược H
(ngược)
0,2 266
Các cặp mồi trong M.A.PCR và S.A.PCR

266bpCd26
Cd17 303bp
506bpCd41/42
596bp
Cd71/72
626bpCd95
RR R R B (R)F
E (F)
Pnc
H (F)
R
R R R
: Mồi chung
: Mồi nội chuẩn (Pnc)
: Mồi đặc hiệu
F : Mồi xuôi
R : Mồi ngược
Exon I Exon II Exon III
810bp
IVS II-654
-28 172bp
340bpIVS I-1
344bpIVS I-5
Minh họa ví trí gắn các cặp mồi trên gen HBB

Thành phần Thể tích (μL) Nồng độ
Nước cất 2 lần 4,5
GodTaq 12,5 2X
DNA 3 50ηg/mL
Mồi
Chung- xuôi 2,5 0,2μM
Cd71/72 M- ngược 0,5 0,2μM
Cd41/42M- ngược 0,5 0,2μM
Cd17M- ngược 0,5 0,2μM
IVS I-1M- ngược 0,5 0,2μM
-28 M- ngược 0,5 0,2μM
Tổng thể tích 25
Thành phần phản ứng M.A.PCR

Thành phần Thể tích (μL) Nồng độ
Nước cất 2 lần 2
GodTaq 5 2X
DNA 2 50ηg/mL
Mồi
Chung 0,5 0,2μM
Mồi đặc hiệu
(mồi thường)
0,5 0,2μM
Tổng thể tích 10
Thành phần phản ứng single ARMS-PCR :

Chu trình nhiệt của phản ứng

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả phát hiện đột biến trên bệnh nhân:
Kết quả tách chiết DNA
Kết quả Multiplex ARMS-PCR phát hiện đột biến
- Kết quả kiểm tra quy trình, mồi trên mẫu chứng
dương
- Kết quả trên bệnh nhân
 Kết quả S.A.PCR xác định kiểu gen
Kết quả giải trình tự gen kiểm tra

Kết quả tách chiết DNA:
- Nồng độ nằm trong khoảng 20-247ng/μL
- Độ tinh sạch : 1,8-2,0
(A 260/280nm)

Kết quả kiểm tra quy trình trên mẫu chứng dương

Kết quả kiểm tra mồi bằng phương pháp giải trình tự gen:

Không phát hiện
đột biến, 13 ( 25%)
Phát hiện đột biến,
39 (75%)
Phát hiện đột biến
Không phát hiện đột biến
Tỷ lệ đột biến phát hiện được:
39/52 (75%) bệnh nhân được phát hiện mang đột biến
13/52 (25%) không phát hiện thấy đột biến bằng M.A.PCR

Bước
phát hiện
Đột biến Kiểu
hình
NC này
n (%)
56
N.K.H.H
n (%)
33
Anchalee
n (%)
252
1
Cd41/42(-TCTT)
Cd17(A>T)
Cd71/72(+A)
IVS I-1(G>T)
- 28(A>G)
βº
βº
βº
βº
β+
17 (30,4)
12 (21,4)
5 (9,8)
5 (9,8)
3 (5,4)
11(33%)
4 (12,1)
4 (21,1)
3 (9,0)
0
107 (42,5)
45 (7,9)
8 (3,2)
8 (3,2)
28 (21,1)
2
IVS I-5( G>C)
Cd 95(+A)
IVS II-654(C>T)
β+
β0
β+
2 (3,6)
1 (1,8)
1 (1,8)
0
0
4(12,1)
11 (4,4)
0
19 (7,5)
3
Cd 26 (G>A) HbE 10
(17,8%)
7
(21,2%)
-
Tỷ lệ đột biến phát hiện
56 alen ĐB được phát hiện, gồm 9 loại Đột biến trong nghiên cứu
Cd 41/42 và cd17 chiếm tỷ lệ cao nhất

M.A.PCR trên bệnh nhân với nhóm mồi 1

Kết quả phát hiện kiểu gen bằng kỹ thuật S. ARMS-PCR:

Độ tuổi
Kiểu gen
4-16
N = 11 (21%)
Trên 16-57
N = 41 (79%)
Tổng
52
Đồng hợp tử
3 (27,3%) 2 (4,9%) 5
Dị hợp tử kép 6 (54,5%) 11 (26,8%) 17
Dị hợp tử 2 (18,2%) 15 (36,6%) 17
Không phát hiện
ĐB
0 13 (31,7%) 13
2. Mối liên quan giữa đột biến và một số chỉ số LS, CLS
Liên quan kiểu gen với lứa tuổi BN:
81,8% nhóm tuổi 4-16 có kiểu gen β ĐB/βĐB
31,7% nhóm tuổi 16-57

Kiểu gen
MĐ thiếu máu
Đồng hợp tử, Dị hợp tử kép
βĐB/βĐB
Dị hợp tử
βĐB/β
Không phát
hiện ĐB
Nặng
n=5 (9,6%)
2 (9,1%) 2 (11,8%) 1 (7,6%)
Trung bình
n=39 (75%)
17 (72,3%) 12 (70,6%) 10 (76,9%)
Nhẹ
Không thiếu máu
n=8 (12,2%)
3 ( 13,6%) 3 (17,6%) 2 (15,4%)
Tổng: 52 22 (100%) 17 (100%) 13 (100%)
2. Liên quan giữa kiểu gen và mức độ thiếu máu trên lâm sàng
Mức độ thiếu máu của bệnh nhân trong nghiên cứu chủ yếu là trung bình.
Kiểu gen βĐB/βĐB : 3 BN k thiếu máu hoặc nhẹ.
Kiểu gen βĐB/β : 2 BN thiếu máu nặng.

Nhóm mang kiểu gen ĐHT và DHT kép có mức Hb thấp hơn so với nhóm
mang kiểu gen DHT đơn (p=0,05)
Trong từng kiểu gen: giữa các nhóm (β0 và β+)
Liên quan giữa các dạng đột biến và một
số chỉ số huyết học: Hb, MCV, MCH
Kiểu gen nhóm
β0
Chỉ số Hb, MCV, MCH nhóm
β+
Đồng hợp tử
β0//β0 Thấp hơn β+// β+
Dị hợp tử kép
(không kết hợp
HbE)
β0// β0 Như nhau β0// β+
Dị hợp tử đơn
β0// β Cao hơn β+// β
β-thalassemia
Kết hợp HbE
β0// HbE Thấp hơn β+// HbE

 Mối liên quan giữa kiểu gen đột biến và mức
HbF( n=15)
kiểu gen DHT: HbF< 10%
Kiểu gen ĐHT: HbF > 15%
 Mối liên quan giữa kiểu gen đột biến và mức
Feritin huyết thanh (n=19).
Tất cả các bệnh nhân đều thấy mức Feritin
huyết thanh cao trên 1000ng/ml.

KẾT LUẬN
1. Áp dụng kĩ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện:
 39/52 (75%) bệnh nhân có đột biến gen β-globin
 Cd41/42 (-TCTT), Cd17 (A>T) chiếm tỷ lệ cao nhất.
2. Mối liên quan giữa một số chỉ số lâm sàng, CLS với các
kiểu gen của đột biến có phần khác biệt so với các
nghiên cứu khác.

KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để có được kết quả
khái quát hơn về tỷ lệ các loại đột biến
2. Làm thêm các phương pháp khác để phát hiện những
đột biến không nằm trong nhóm đột biến của nghiên
cứu này
3. Đánh giá khả năng phát hiện đột biến gen gây bệnh
trong cộng đồng

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR

Similar to PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR (20)

More from Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596

More from Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS-PCR