Các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh

1. PGS. TS. Cao Minh Nga
BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Döôïc TP. HCM

2. IV
Môû ñaàuI
II
III
Phöông phaùp Vi sinh hoïc
Phöông phaùp Mieãn dòch hoïc
Phöông phaùp Sinh hoïc phaân töû
V Keát luaän

3. I. Môû ñaàu
Vi sinh vật (VSV): - gây nhiều bệnh nhiễm nguy hiểm.
- có thể gây dịch, đại dịch.
Các bệnh nhiễm VSV:
- thường có triệu chứng lâm sàng điển hình
VD: bệnh tả, sốt xuất huyết, …
- một số khác: không có triệu chứng điển hình
VD: viêm gan virus A, B, C, D, E và G, …
Xét nghiệm chẩn đoán ( ) đóng vai trò quan trọng:
(+) từng bệnh lý cụ thể
là tiêu chuẩn vàng: nhiều bệnh nhiễm VSV

4. I. Môû ñaàu (tt)
Các phương pháp (pp) bệnh nhiễm VSV chính:
- pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy.
- pp miễn dịch học: phản ứng kháng nguyên – kháng thể
- pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu
Các pp (sinh hóa, huyết học, giải phẫu bệnh, … )
Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh
, theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV.

5. II. Phöông phaùp Vi sinh hoïc
Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi
2. Nhuộm
Nuôi cấy vi vi khuẩn (VK):
1. Nuôi cấy - Phân lập VK
2. Kháng sinh đồ
Nuôi cấy virus
1. Định danh
2. Định typ huyết thanh, …

6. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi:phát hiện VSV còn sống, di động
VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira.
2. Nhuộm: nhiều pp
- nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram của VK

7. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi
2. Nhuộm: - nhuộm Gram
- Nhuộm kháng acid - Nhuộm bạc:
M. tuberculosis trên phết nhuộm Legionella_Silver_Stain

8. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp
Nuôi cấy vi khuẩn:
1. Nuôi cấy phân lập VK: trên các môi trường thích hợp
Môi trường BA - S. aureus Môi trường EMB - E. coli

9. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp
Nuôi cấy vi khuẩn:

10. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp
Nuôi cấy vi khuẩn:
1. Phân lập VK
2. Kháng sinh đồ:
2.1. Phương pháp khuếch tán
trên đĩa thạch (Kirby Bauer)

11. 2.2. Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng
4 2 1 0,5 0,25 0,12 0
104 cfu
mg/ml
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml
(Minimum inhibitory concentration - MIC)

12. II. PP Vi sinh hoïc (tt)
Quan sát trực tiếp
Nuôi cấy vi khuẩn
Nuôi cấy virus:
Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử

13. II. Phöông phaùp Mieãn dòch hoïc
Khái niệm
Phân loại
Các phản ứng miễn dịch (MD) thường dùng
trong Vi sinh lâm sàng: 1. Phản ứng ngưng kết
2. Phản ứng MD đánh dấu:
- MD huỳnh quang
- ELISA
Nhận định kết quả

14. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
Khái niệm:
1. ĐN: Là phản ứng kháng nguyên - kháng thể (KN - KT)
2. Mục đích: Xác định hoặc / và
- chuẩn độ một KN
- định lượng hiệu giá một KT
- đo lường một phức hợp KN-KT
- đo lường các nhân tố tham gia / hệ thống MD.
VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể.

15. Khaùng nguyeân• Điểm quyết định KN (epitope):
phần trên phân tử KN có khả
năng liên kết đặc hiệu vào phần
liên kết với KN trên phân tử KT

16. TươngtácKN-KT

17. Hiện tượng vùng

18. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
Phân loại:
A. Phản ứng dựa trên sự tạo thành “hạt”:
1. Kết tủa (precipitation reaction): KN hòa tan.
2. Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình
B. Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT:
1. Kết hợp bổ thể (complement binding reaction)
2. Trung hòa (neutralization reaction)
C. Phản ứng MD đánh dấu:
1. MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction)
2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)
3. MD phóng xạ (radio immmuno assay - RIA).

19. Các phản ứng MD có độ nhạy khác nhau
Loại phản ứng MD Ngưỡng phát hiện (mg/ml)
Kết tủa / môi trường lỏng
Kết tủa / thạch:
- khuếch tán đơn (Mancini)
- khuếch tán kép (Ouchterlony)
- MD điện di (Immuno electrophoresis )
20
10
3
50
Ngưng kết: - trực tiếp
- gián tiếp
- ngưng kết vi khuẩn
0,5
0,001
0,001
Cố định bổ thể (CF) 0,1
Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1
Định lượng MD phóng xạ (RIA) 0,0001
Định lượng MD enzym (EIA) 0,0001

20. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng:
A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction):
- Ngưng kết: nhóm máu, nhóm VKĐR, …
- Latex, ngăn ngưng kết (HI)
B. Phản ứng MD đánh dấu:
- MDHQ (IF),
- ELISA

21. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction)
Tạo mạng

22. Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(thụ động)
Ngưng kết hồng cầu thụ động
KN hoặc hapten KT / mẫu
gắn trên giá khoác

23. Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(thụ động) - 2
Ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược
KT / giá khoác KN / mẫu

24. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(Hemagglutination Inhibition - HI)

25. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
B. Phản ứng MD đánh dấu:
1. MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF)
VD: RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …
* Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry):
đếm & phân loại TB.
2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).
VD: HBV, HCV, HIV, Rubella, …

26. 1. PƯ MD huyønh quang: nguyeân lyù

27. Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng
(thuốc nhuộm fluorescein)

28. Virus sởi tạo hợp bào từ các tế bào Vero bị nhiễm.
Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết
(thuốc nhuộm rhodamin)

29. 2. Phản ứng ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )
* Muïc ñích:
ñònh löôïng KN hoaëc KT hoøa tan / dòch sinh hoïc.
* Nguyeân lyù cô baûn:
KT/pha raén + KN/maãu + KTE + Subtrate
KN/pha raén + KT/maãu + Khaùng KTE + Subtrate
maøu: So maøu (maét / maùy ño OD)
* Kyõ thuaät thöïc hieän: - "Caïnh tranh”
- "Khoâng caïnh tranh"

30. ỏ
ỏ
E E E EEH2SO4
E E E E E
E E E E ETMB
a.MD Cạnh tranh ELISA:
Phản ứng màu tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể

31. b. ELISA theo phương pháp “sandwich”

32. c. ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA
(IgM antibody capture-ELISA)
Máy đo quang
Máy ủ Máy rửa
Kháng IgM
IgM /maãu
KN ñaõ bieát
Cộng hợp
Cơ chất
Đo Mật độ quang (OD)

33. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
Nhận định kết quả:
1. Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN & KT):
Mỗi phản ứng có ngưỡng phát hiện nhau
nên định lượng.
2. Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý.
VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200
(200 đơn vị/ml huyết thanh) (+) khi 400 đ.v/ml.

34. II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
Nhận định kết quả (tt):
3. Kết quả (+) tính giả:
thường dùng nhiều phản ứng cùng lúc.
4. Đáp ứng KT: có thay đổi về lớp Ig
- IgM: xuất hiện trước
- IgG: xuất hiện sau, thay thế nhanh chóng cho IgM.
5. Tiến triển của hiệu giá KT trong HTh BN:
“huyết thanh kép”

35. Schematic diagram representing the course of
acute rubella infection from the time of initiation
of the infection by droplet spray

36. III. Phöông phaùp Sinh hoïc phaân töû
(khuếch đại đoạn gen đặc hiệu)
Mở đầu:
- 1985: Kary Mullis California, USA
- 1993: giải Nobel Hoùa học
Ứng dụng kỹ thuật SHPT
trong chẩn đoán bệnh nhiễm VSV

37. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Mở đầu: Các kỹ thuật SHPT thông dụng:
1. PCR (Polymerase Chain Reaction)
* RT-PCR (Reverse Transcriptation-PCR)
* Real-time PCR
* Multiplex-PCR
* Nested PCR
2. Lai phân tử (Dot-Blot)
3. Giải trình tự chuỗi
(Sequencing)
4. RFLP

38. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Mở đầu (tt):
Ứng dụng kỹ thuật SHPT:
1. Chẩn đóan & nghiên cứu vi sinh học (VSH)
2. Chẩn đóan & nghiên cứu di truyền học
3. Nghiên cứu & ứng dụng công nghệ sinh học
4. Giải trình tự bộ gen người & động vật

39. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Mở đầu
Ứng dụng trong chẩn đoán ( ) bệnh nhiễm VSV:
1. Phát hiện & định lượng VSV gây bệnh
2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh
3. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh
4. Xác định kiểu gen của VSV gây bệnh
5. Xác định kiểu gen của ký chủ

40. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
1.1. Phát hiện VSV gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh mới
VD: HCV (1989), HGV (1995), virus SARS (2003), ….
VSV không thể hoặc khó nuôi cấy thường qui
virus: HBV, HCV, HIV, HPV, …
VK: Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, …

41. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
1.1. Phát hiện VSV gây bệnh (tt)
VSV cho KQ chậm / nuôi cấy: M. tuberculosis
VSV khó nuôi cấy vì có rất ít / BP, đã KS
- Lao thất bại nuôi cấy,
- Viêm màng não mủ, lậu đã KS

42. Phát hiện sản phẩm PCR/ lao
• Điện di trên gel agarose (1,5%)
• Nhuộm bằng ethidium bromide (10mg%)
• Đo bằng thang DNA (DNA ladder)
• Sản phẩm PCR có kích thước 450 bp
và/ hoặc 225 bp
Giếng T: Thang chuẩn 100bp.
Giếng 1-8: Mẫu (+) MTB.
Giếng 9-10: Mẫu (-) MTB.
1 2 3 4 5 T 6 7 8 9 10

43. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
1.2. Định lượng VSV gây bệnh
Đánh giá tình trạng bệnh lý.
Vd: HCV, HBV, ….
Theo dõi điều trị
Vd: HCV, HBV, HIV, ….
Phát hiện sớm sự kháng thuốc trong điều trị
Vd: HBV, HIV, ….

44. Real-Time PCR
Laø 1 kyõ thuaät PCR söû duïng chaát huyønh quang ñeå
phaùt hieän & ñònh löôïng
1 hoaëc nhieàu trình töï DNA ñích trong phaûn öùng PCR

45. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh
Gen mã hóa cho độc tố LT của E. coli
Gen mã hóa cho độc tố SEA, SEB của S. aureus
(pp Multiplex PCR)
Gen mã hóa cho độc tố CT của V. cholerae
…

46. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
3. Xác định kiểu gen (genotype) của VSV gây bệnh
Định typ dựa trên trình tự nucleic acid:
Sự khác biệt >10% : loại (type) mới
2 – 10%: thứ type (subtype)
< 2% : biến thể (variant)
VD:
- HCV có 6 genotyp (1-6),
- HPV có hơn 100 genotype, …

47. * Real-time RT-PCR
xác định Genotype HCV
Đọc KQ:
Genotype HCV 1
Mẫu
Chứng âm
Nếu mẫu chỉ dương
tính (có chu kỳ
ngưỡng vượt qua
Threshold Position)
với probe 1

48. Reverse Dot-Blot xaùc ñònh genotype HPV
• Nguyeân lyù:
- PCR phaùt hieän HPV-DNA: duøng caëp primer (181 bp) gen
L1 / HPV genome (trình töï ñích)
- Lai phaân töû: saûn phaåm PCR ñaùnh daáu + caùc maãu doø ñaëc
hieäu cho 24 typ HPV ñaõ coá ñònh saün / maøng lai nylon
+ 8 typ Low-risk : 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71 & 81.
+ 16 typ High-risk: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82.
- Phaûn öùng taïo maøu: khi (+) tính

49. Nguyên tắc phương pháp lai Reverse Dot blot
(Lai phân tử)

50. Reverse Dot-Blot xaùc ñònh genotype HPV
• Ñoïc keát quaû treân maøng lai:
Töø sô ñoà caùc typ treân maøng lai trong hoäp RDB ñaõ bieát
=> Ñoïc keát quaû: ñònh genotype HPV
Ví duï:
Chứng +: Dương tính.
Mẫu đồng nhiễm type 6, 11, 81, 16, 18, 33, 58, 66, 68.

51. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh
Lao: PCR phát hiện đột biến (ĐB)
- kháng rifamicin / gen rpoB
- kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G)
Staphylococcus aureus:
Multiplex PCR phát hiện gen kháng methicillin
Streptococcus pneumoniae: pp PCR-SSCP
khảo sát đột biến kháng penicillin / gene pbp 2X

52. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh (tt)
HBV: phát hiện ĐB kháng Lamivudin, kháng Adefovir, …
HIV: phát hiện các ĐB kháng thuốc khác nhau.
…
pp: Real-Time PCR, PCR-RFLP, Sequencing

53. III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):
5. Xác định kiểu gen của ký chủ
VD: Đối với bệnh nhân viêm gan C phát hiện điểm đa
hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism)
nằm gần gen IL28B trên nhiễm sắc thể 19 của người.
KQ: - Kiểu gen đáp ứng thuốc tốt: đồng hợp tử
- Kiểu gen đáp ứng thuốc kém: dị hợp tử

54. V. Keát luaän
Có nhiều pp chẩn đoán xác định bệnh nhiễm VSV.
Cần chọn lựa pp chẩn đoán phù hợp với:
- tình trạng bệnh lý
- mục đích chẩn đoán
- điều kiện trang thiết bị, tay nghề của nhân viên
- tình hình và nhu cầu thực tiễn
Nâng cao hiệu quả: chẩn đoán & điều trị bệnh,
kiểm soát dịch bệnh.