NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ.Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Nghiên cứu (NC) ở các nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM là 10% [61], [105]. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% – 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17]. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% – 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần)
SGK cũ đặc điểm hệ tiêu hóa trẻ em rất hay nha.pdf
Nghien cuu tac nhan vi khuan gay viem phoi tho may va gene khang thuoc bang ky thuat sinh hoc phan tu
1. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY
VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN
TỬ.Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không
chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng
cao. Nghiên cứu (NC) ở các nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM là 10% [61],
[105]. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc
gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% –
52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17]. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây
tăng tỉ lệ tử vong (26% – 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23
ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5],
[41].
MÃ TÀI LIỆU CAOHOC.2019.00483
Giá : 50.000đ
Liên Hệ 0915.558.890
VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua
nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM được thiết
lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây
bệnh thôngqua cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản
đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50].
Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các
phảnứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển
này không thể áp dụng trong các trường hợp sau: VK Gram âm khó mọc,
mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng
như các VK yếm khí, VK không cấy được và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả
cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trước đó [50],
[57], [73], [74], [83], [97], [114].
Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phương pháp tham chiếu để
chẩnđoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73]. Vai trò của giải trình tự
gene 16S -rRNA trong định danh VK càng được chứng tỏ và được áp dụng
rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117]. Phương pháp giải trình tự
gene 16S – rRNA có thể phát hiện được hệ vi sinh trên đường hô hấp của
người khỏe và BN [29], [44],[88]. Tại Việt Nam số liệu từ các NC về định
danh VK dựa trên sinh học phân tử ở các BN VPTM chưa nhiều và chưa
2. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
được hệ thống đầy đủ.2
Ngày nay, VK đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu [58]. Đặc
biệtlà các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam [12], [20], [59], [74], [78], [101].
Tỉ lệ A. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001)
[8]; 8% (2004)[17]; 80% (2010) [11]; 90% (2012) [5]. Tuy nhiên, kháng sinh
đồ định lượng MIC bằng que E-test chưa được áp dụng rộng rãi và số liệu
chưa được hệ thống đầy đủ.Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA,
NDM thủy phân phổ rộng cáccephalosporin là thường gặp [81]. Trong nước,
việc tiếp cận có hệ thống gene khángthuốc của VK chính yếu gây VPTM
chưa được ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ.
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong
việc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang.
Chúng tôiđặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định
danh VK gây VPTM giữa hai phương pháp định danh VK dựa vào kiểu hình
và giải trình tự gene 16SrRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh
ở các nhóm VK gây VPTMphân bố như thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây
VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK
mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên
cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng
sinh và xác lập được những tác nhân liên quan đếnVPTM, giúp cho việc điều
trị BN tốt hơn.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN
GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Mục tiêu:
1. Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giảitrình
tự gene 16S – rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa
vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa.
2. Đánh giá MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây
viêmphổi thở máy.
3. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ
thuật PCR và mối liên quan với MIC
MỤC LỤC NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI
THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH
HỌC PHÂN TỬ
Trang
3. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Bảng từ viết tắt và đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ, sơ đồ
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
…………………………………………………………… 3
1.1. Định
nghĩa………………………………………………………………………3
1.2. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy
………………………………………………………. 5
1.3. Tỉ lệ tử vong
…………………………………………………………………………………
……….. 6
1.4. Bệnh
nguyên…………………………………………………………………………
……………….. 8
1.5. Các yếu tố nguy
cơ………………………………………………………………………………
.. 25
1.6. Chẩn
đoán……………………………………………………………………………
………………. 28
1.7. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập được từ
VPTM………………… 29
1.8. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng
thuốc……………………. 30
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
………………….. 32
2.1. Thiết kế nghiên
cứu……………………………………………………………………………
…. 32
2.2. Địa điểm nghiên cứu
…………………………………………………………………………….. 32
2.3. Thời gian nghiên cứu
……………………………………………………………………………. 32
4. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
2.4. Đối tượng nghiên
cứu…………………………………………………………………………….
32
2.5. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu
………………………………………………………….. 32
2.6. Tiêu chuẩn chọn mẫu
……………………………………………………………………………. 33
2.7. Phương pháp tiến
hành…………………………………………………………………………..
34
2.8. Phương pháp phát hiện gene kháng
thuốc…………………………………….45
2.9. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu
………………………………………………………. 45
2.10. Đạo đức trong nghiên
cứu……………………………………………………46
2.11. Liệt kê và định nghĩa các biến số (phụ lục 11)
……………………………………….. 462.12. Sơ đồ nghiên
cứu……………………………………………………………..47
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU……………………………………………………….. 48
3.1. Đặc điểm
chung…………………………………………………………………………
…………. 48
3.2. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển
…………………………………………. 50
3.3. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA
………………………… 51
3.4. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu dịch rửa phế quản
phế nang
…………………………………………………………………………………
…………………. 55
3.5. So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định
danh vi khuẩn
…………………………………………………………………………………
………….. 56
5. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
3.6. Tính độ nhạy và độ đặc hiệu của
PGM……………………………………………………. 58
3.7. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy
………………. 59
3.8. Kết quả kháng sinh
đồ……………………………………………………………………………
60
3.9. Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-
test……………………………………………… 66
3.10. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc
………………………………………………………. 73
3.11. Kết quả điều
trị………………………………………………………………………………
…… 75
Chương 4: BÀN
LUẬN…………………………………………………………………………
…… 76
4.1. Định danh vi khuẩn
……………………………………………………………………………….
77
4.2. Kết quả kháng sinh
đồ……………………………………………………………………………
91
4.3. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng
sinh……….. 98
KẾT LUẬN
…………………………………………………………………………………
………….. 105
KIẾN
NGHỊ…………………………………………………………………………
…………………. 108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban
6. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
đầu:…………………………….7
Bảng 1.2. Bệnh nguyên của viêm phổi thở
máy:……………………………………8
Bảng 1.3. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ ICU bệnh viện
Fatmawati:………..11
Bảng 1.4. Tần suất vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân viêm phổi tại
các khoa
ICU ở Việt
Nam:……………………………………………………………..12
Bảng 1.5.1. Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại
ICU
bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí
Minh:………………………….13
Bảng 1.5.2. Tác nhân vi khuẩn phân lập được từ các bệnh nhân thở máy tại
ICU
bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp
theo):……………..14
Bảng 1.6. Tính đa dạng của vi khuẩn phát hiện được bằng giải trình tự
gene:…….25
Bảng 1.7. Các yếu tố nguy cơ của
VPTM:…………………………………………26
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tạo các amplicon – phản ứng tạo “bản sao”
các
vùng V3, V6, V7 và V9 trong gen 16S-
rRNA:………………………………38
Bảng 2.2. Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa trong việc tinh sạch
phản
ứng PCR khuếch đại các vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-
rRNA:…..39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh – tạo “đầu bằng”
cho các
bản sao của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene 16S-
rRNA:…………………40
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tạo “thư viện” – phản ứng gắn Adapter và
trP1 vào
2 đầu các bản sao “đầu bằng” của vùng V3, V6, V7 và V9 trong gene
7. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
16SrRNA:……………………………………………………………………
……40
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo “bản sao” của các thư
viện:………….………41
Bảng 2.6. Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thư viện” gene vào
hạt ISP:
…………………………………………………………………………………
……42
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thư viện” gene vào hạt
ISP:………43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng tách mạch “thư viện” gene khỏi bản sao đã
gắn trên
hạt
SP:….……………………………………………………………………..43
Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghiên
cứu:…………………………49Bảng 3.2. Phân bố vi khuẩn phân lập được
bằng định danh truyền thống:………..51
Bảng 3.3. So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy và
giải
trình tự trên hệ thống
PGM:……………………………………………………….57
Bảng 3.4. Độ nhạy và độ đặc hiệu của
PGM:……………………………………….58
Bảng 3.5. Kết quả kháng sinh đồ khuếch tán
chung:………………………………60
Bảng 3.6. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Acinetobacter
spp:………………….61
Bảng 3.7. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Klebsiella
spp:…………………………….62
Bảng 3.8. Kháng sinh đồ khuếch tán đối với Pseudomonas
spp:………………….63
Bảng 3.9. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Acinetobacter
baumannii:…………66
Bảng 3.10. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với K.
Pneumoniae:…………………..67
Bảng 3.11. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Pseudomonas
8. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
aeruginosa:………68
Bảng 3.12. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Escherichia
coli:…………………69
Bảng 3.13. Kết quả kháng sinh đồ MIC đối với Burkholderia
cepacia:…………..70
Bảng 3.14. Phân bố gene kháng thuốc phát hiện
được:……………………………73
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa gene kháng thuốc và đề kháng kháng
sinh:……….74
Bảng 3.16. Kết quả người bệnh ra khỏi khoa
chung:………………………………75
Bảng 3.17. Kết quả điều
trị:………………………………………………………..75DANH MỤC
CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo thư viện cho kỹ thuật
NGS:………………………….………38
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiên
cứu:………………………………………………………47
Biểu đồ 3.1. Phân tích cụm trên 99 loài vi khuẩn định danh bằng giải trình tự
16SrRNA:……………………………………………………………………
…………53
Biểu đồ 3.2. Số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu DRPQPN:
………….55
Biểu đồ 3.3. Mối liên quan giữa vi khuẩn phân lập được và số ngày nằm
ICU:…..59
Biểu đồ 3.4. Mạng lưới của đa kháng kháng sinh đối với A. baumannii, K.
pneumoniae và P.
aeruginosa:..……………………………………………………65
Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ số kháng sinh bị đề
kháng:………………………………………7