Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu

I H C QU C GIA HÀ N I
TRƯ NG I H C KHOA H C T NHIÊN
Nguy n C m Dương
PHÂN TÍCH A D NG DI TRUY N NGU N
TÀI NGUYÊN M T S LOÀI CÂY DƯ C LI U
VI T NAM B NG CH TH ADN
LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C
Hà N i - 2010

I H C QU C GIA HÀ N I
TRƯ NG I H C KHOA H C T NHIÊN
Nguy n C m Dương
PHÂN TÍCH A D NG DI TRUY N NGU N
TÀI NGUYÊN M T S LOÀI CÂY DƯ C LI U
VI T NAM B NG CH TH ADN
Chuyên ngành: Di truy n h c
Mã s : 60 42 70
LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C
NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C: TS. inh oàn Long
Hà N i - 2010

L I C M ƠN
có th hoàn thành lu n văn này, trư c tiên tôi xin g i l i c m ơn sâu
s c t i TS. inh oàn Long, Ch nhi m b môn Di truy n h c, Khoa Sinh h c ã
tr c ti p hư ng d n, ch b o tôi trong công tác nghiên c u khoa h c. ng th i,
tôi cũng mu n trân tr ng c m ơn các cán b thu c Khoa tài nguyên dư c li u,
Vi n Dư c li u (B Y t ), ã cung c p và giúp tôi phân lo i m u th c v t s d ng
trong nghiên c u này.
Qua ây tôi mu n ư c bày t lòng bi t ơn chân thành nh t t i các th y, cô
giáo c a b môn Di truy n h c, Khoa Sinh h c trong ó c bi t là Th.S Tr n Th
Thùy Anh ã t o i u ki n thu n l i và ng viên tôi trong su t quá trình h c t p
t i b môn. Tôi xin ư c g i l i c m ơn t i Ban giám c PTNT Công ngh
Enzyme và Protein thu c Khoa Sinh h c ã luôn t o i u ki n thu n l i cho tôi v
trang thi t b và cơ s v t ch t trong quá trình h c t p và nghiên c u. tài
nghiên c u c a tôi ư c h tr m t ph n tài chính t tài Klept.09.05 thu c
PTNT Công ngh Enzym và Protein.
Cu i cùng tôi xin bày t lòng bi t ơn vô cùng sâu s c t i b m , các bác và
c bi t là anh ch tôi, nh ng ngư i ã luôn h tr tôi v m i m t trong su t quá
trình h c t p t i Trư ng i h c Khoa h c T nhiên ( HQG Hà N i). Nhân d p
này, tôi trân tr ng g i l i c m ơn t i các anh ch khóa trên, b n bè thân thi t luôn
c vũ, ng viên và sát cánh bên tôi trong su t quá trình h c t p v a qua.
Hà N i, tháng 12 năm 2010
H c viên
Nguy n C m Dương

i
DANH M C CÁC T VÀ CH VI T T T
T vi t t t Nghĩa ti ng Vi t Nghĩa ti ng Anh
ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid
ADNts ADN t ng s Total DNA
ARN Axit ribonucleic Ribonucleic acid
ASSOCHAM Hi p h i thương m i và công nghi p
n
The Associated Chambers of
Commerce and Industry of India
cs c ng s Co-workers
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide
bp C p bazơ nitơ base pair
ddH2O Nư c c t kh trùng hai l n Double distilled water
DDT Thu c tr sâu dichloro-diphenyl-
trichloroethane
Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane
dNTP Deoxyribonucleotit triphosphat Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetraacetat Ethylene diamine tetraacetate
HPLC S c ký l ng cao áp High pressure liquid chromatography
IUCN Liên minh b o t n thiên nhiên th
gi i
International Union for Conservation
of Nature
kb Kilo bazơ Kilo base
NTSYS Ph n m m h th ng phân lo i s Numerical Taxonomy System
M Thang ADN chu n Marker
OD M t quang ph h p th Optical Density
OPA,OPC Các m i oligonucleotit
PCR Ph n ng chu i trùng h p ADN Polymerase Chain Reaction
RAPD a hình phân o n ADN nhân b n
ng u nhiên
Random Amplified Polymorphic
DNA
RAPD-PCR Tương t như RAPD
Rb1 Nhóm ginsenoside Rb1 (có m t c a
protopanaxadiol)
The ginsenoside Rb1 group
RFLP a hình dài các o n gi i h n Restriction fragment length
polymorphism

ii
T vi t t t Nghĩa ti ng Vi t Nghĩa ti ng Anh
Rg1 Ginsenoside nhóm Rg1 (có ch a
protopanaxatriol)
The ginsenoside Rg1 group
STR/SSR Trình t vi v tinh Microsatellite/simple tandem repeats
TBE m g m Tris, Borate và EDTA Tris/Borate/EDTA buffer
TE m g m có Tris và EDTA
UPGMA Thu t toán phân c p d a trên giá tr
trung bình
Unweighted pair group with arthmetic
means
V Vol Volte
v/v T l pha theo th tích/th tích Volume/volume
WHO T ch c Y t th gi i World Health Organization

iii
M C L C
M U..................................................................................................................1
Chương 1. T NG QUAN TÀI LI U......................................................................3
1.1. T NG QUAN V CÂY DƯ C LI U....................................................................3
1.2. T NG QUAN V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U ...............................................7
1.3. LÝ DO TH C HI N TÀI................................................................................12
1.3.1. Th c tr ng nghiên c u v cây dư c li u Vi t Nam hi n nay.....................12
1.3.1.1. Nghiên c u v chi Acanthopanax..........................................................12
1.3.1.2. Nghiên c u v chi Illicium ...................................................................14
1.3.1.3. Nghiên c u v chi Morinda ..................................................................15
1.3.1.4. Nghiên c u v chi Panax L...................................................................16
1.3.2. Ch th ADN – Ch th RAPD-PCR..............................................................19
1.3.3. M c tiêu c a tài ......................................................................................22
Chương 2. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U ..............................24
2.1. V T LI U TH C V T........................................................................................24
2.1.1. Chi Acanthopanax .......................................................................................24
2.1.2. Chi Illicium..................................................................................................26
2.1.3. Chi Morinda................................................................................................27
2.1.4. Chi Panax L. ...............................................................................................28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U...........................................................................31
2.2.1. Tách chi t ADN t ng s b ng phương pháp Mini-CTAB c i ti n ................31
2.2.2. Phân tích di truy n b ng k thu t RAPD-PCR.............................................33
2.2.3. i n di ADN trên gel agarose......................................................................34
2.2.4. D ng cây quan h di truy n b ng ph n m m NTSYSpc 2.02h.....................35
Chương 3. K T QU VÀ TH O LU N...............................................................38
3.1. K T QU TÁCH CHI T ADN T NG S .............................................................38

iv
3.1.1. K t qu tách chi t ADNts t các m u th c v t thu c chi Acanthopanax ......38
3.1.2. K t qu tách chi t ADNts t các m u th c v t thu c chi Illicium.................38
3.1.3. K t qu tách chi t ADNts t cây Ba kích (Morinda officinalis How)...........39
3.1.4. K t qu tách chi t ADNts các m u th c v t thu c chi Panax L. ..................39
3.2. K T QU PHÂN TÍCH TÍNH A D NG DI TRUY N C A CÁC LOÀI CÂY
THU C TRONG NGHIÊN C U................................................................................41
3.2.1. S a d ng di truy n gi a các loài cây thu c thu c chi Acanthopanax ....42
3.2.1.1. Phân tích a hình loài ngũ gia bì gai (A. trifoliatus).............................43
3.2.1.2. Phân tích a hình loài ngũ gia bì hương (A. gracilistylus)....................46
3.2.2. S a d ng di truy n gi a loài cây thu c thu c chi Illicium. ....................48
3.2.2.1. Phân tích a d ng di truy n loài h i hương.......................................48
3.2.2.2. Phân tích a d ng di truy n c a các loài h i núi..................................51
3.2.3. S a d ng di truy n c a loài cây thu c Ba kích.......................................53
3.2.4. S a d ng di truy n c a loài cây thu c thu c chi Panax L......................56
3.2.5. Bư c u xác nh t p h p m t s ch th RAPD-PCR giúp phân bi t
nhanh ngu n nguyên li u t các loài th c v t trong nghiên c u .........................61
3.2.5.1. Ch th ADN giúp phân bi t ngu n dư c li u t các loài dư c li u
Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ................................................................61
3.2.5.2. Ch th ADN (RAPD-PCR) giúp phân bi t ngu n dư c li u t loài
h i hương v i các loài h i núi.........................................................................63
3.2.5.3. Ch th ADN (RAPD-PCR) giúp phân bi t các d ng hình thái khác
nhau c a loài Ba kích ......................................................................................64
3.2.5.4. Ch th ADN (RAPD-PCR) giúp phân bi t các loài Sâm Vi t Nam,
Sam Vũ Di p và Tam th t hoang .....................................................................66
K T LU N VÀ KI N NGH .................................................................................68
K T LU N...........................................................................................................68
KI N NGH ..........................................................................................................69
TÀI LI U THAM KH O.......................................................................................70

v
DANH M C CÁC B NG
Trang
B ng 1. Th h ch th ADN u tiên 7
B ng 2. Th h ch th ADN th hai 7
B ng 3. Th h ch th ADN m i 10
B ng 4. Danh sách m u cây dư c li u ư c thu th p và phân tích trong nghiên c u 25
B ng 5. Thành ph n (b ng bên trái) và quy trình nhi t (b ng bên ph i) c a ph n ng
RAPD-PCR 34
B ng 6. S băng RAPD a hình thu ư c t các m u qu n th loài Acanthopanax
trifoliatus và A. gracilistylus phân tích v i 16 m i ng u nhiên. 42
B ng 7. S băng ADN a hình thu ư c t các m u qu n th loài Ngũ gia bì gai (A.
trifoliatus) (ký hi u G) thu t i Lào Cai, Cao B ng và L ng Sơn ư c phân tích theo t ng
m i RAPD. 45
B ng 8. S băng RAPD a hình thu ư c t các m u qu n th loài Illicium verum và các
loài h i núi phân tích v i 15 m i ng u nhiên. 48
B ng 9. S băng RAPD a hình thu ư c t các m u qu n th loài Ba kích (Morinda
officinalis) v i các d ng hình thái khác nhau: d ng thân có lông (L); d ng thân không có
lông (K); d ng qu t (T) và d ng qu r i (R) v i 12 m i ng u nhiên. 53
B ng 10. S băng RAPD a hình thu ư c t các m u thu c ba loài Sâm Vi t Nam
(SVN), Sâm Vũ Di p (SVD) và Tam th t hoang (TTH) phân tích v i 13 m i ng u nhiên. 57
B ng 11. T p h p các ch th ADN (ch th RAPD-PCR) c trưng có th giúp phân bi t
các loài dư c li u trong nghiên c u. 67

vi
DANH M C CÁC HÌNH
Trang
Hình 1. nh các loài th c v t thu c chi Acanthopanax trong nghiên c u: a-b) B i cây, lá và
hoa cây Ngũ gia bì gai; c-d) B i cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương. 26
Hình 2. a-b) Hình thái lá và qu cây H i hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái
và qu c a cây h i núi (I. anasitum). 27
Hình 3. Hình thái các lo i ki u hình c a cây Ba kích s d ng trong nghiên c u: a) qu t ;
b) qu r i; c) thân có lông; d) thân không có lông. 28
Hình 4. Các loài th c v t thu c chi Panax L. trong nghiên c u: a) Sâm Vi t Nam (P.
vietnamensis); b) Sâm Vũ Di p (P. bipinnatididus); c) d ng trung gian gi a Sâm Vũ Di p-
Tam th t hoang; d) Tam th t hoang (P. stipulenatus). 29
Hình 5. B n các a phương thu m u dư c li u trong nghiên c u 30
Hình 6. ADNts tách chi t t các ph n mô khác nhau: hình bên trái - ADNts t các m u cây
H i hương (I); hình bên ph i - ADNts t các ph n mô khác nhau cây sâm (V). M: thang
ADN chu n. Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng 4. 40
Hình 7. nh i n di ADN t ng s các m u dư c li u ư c thu th p trong nghiên c u:
a) m u các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) m u các loài H i
hương (I) và H i núi (N); c) m u các loài Ba kích (K); d) m u các loài Sâm Vi t Nam
(S), Sâm Vũ Di p (V), Tam th t hoang (T) và d ng trung gian Sâm Vũ Di p-Tam th t
hoang (VT). M: thang ADN chu n. Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng 4. 40
Hình 8. Hình nh i n di m t s s n ph m RAPD-PCR các m u Ngũ gia bì gai (G) và
Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên c u: a) S n ph m i n di v i m i OPC9; b) S n ph m
i n di v i m i OPA5. M: thang ADN chu n. Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng
4. 43
Hình 9. Sơ hình cây v quan h di truy n gi a các m u thu c hai loài cây thu c Ngũ gia
bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hi u G) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus – ký
hi u H) thu th p ư c Vi t Nam trên cơ s phân tích ch th RAPD-PCR. Ngu n g c và
c i m c a các m u nêu B ng 4. 44
Hình 10. Sơ cây quan h di truy n c a 39 m u H i hương v i 11 m u H i núi trong
nghiên c u. Ngu n g c và c i m c a các m u ư c nêu t i B ng 4. 52
Hình 11. Sơ hình cây ph n ánh m i quan h di truy n gi a 25 dòng Ba kích trong
nghiên c u. Ngu n g c và c i m c a các m u ư c trình bày t i B ng 4. 54

vii
Hình 12. Băng ng hình (ch ra b i hình u mũi tên) c a các m u Sâm Vi t Nam (S),
Sâm Vũ Di p (V), Tam th t hoang (T) và d ng trung gian gi a Sâm Vũ Di p-Tam th t
hoang (VT) tương ng v i m i OPA14, OPC1 và OPA7. 57
Hình 13. Cây quan h di truy n gi a các m u Sâm Vi t Nam (ký hi u S), Sâm Vũ Di p (ký
hi u V), d ng trung gian c a Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang (ký hi u VT) và Tam th t
hoang (ký hi u T) trong nghiên c u l p b i s li u thu ư c t phân tích RAPD-PCR.
Ngu n g c và c i m c a các m u ư c nêu B ng 4. 59
Hình 14. Băng ng hình (ch ra b i hình mũi tên) c a các m u ngũ gia bì gai (G) và ngũ
gia bì hương (H) trong nghiên c u v i m i OPA10. Ngu n g c và c i m các m u ư c
nêu b ng 4. 62
Hình 15. Băng c trưng phân bi t (ch ra b i hình mũi tên) c a các m u Ngũ gia bì gai
(G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên c u v i m i OPA12 (hình bên trái) và m i
OPA1 (hình bên ph i). M: thang ADN chu n. Trong ó, ch th OPA12750 và OPA1500 c
trưng cho các m u thu c loài Ngũ gia bì gai; ch th OPA12950 và OPA1300 c trưng cho
các m u thu c loài Ngũ gia bì hương. Ngu n g c và c i m các m u ư c nêu B ng 4. 62
Hình 16. Băng ng hình (ch ra b i hình mũi tên) c a các m u thu c nhóm loài H i
hương (I) (hình bên ph i) và các loài H i núi (N) trong nghiên c u v i m i OPA7 (hình
bên trái). M: thang ADN chu n. Băng c trưng phân bi t c a h i núi là băng có kích
thư c 1800 bp. Ngu n g c và c i m các m u ư c nêu B ng 4. 63
Hình 17. Băng ng hình (ch ra b i hình mũi tên) t t c 25 m u Ba kích trong nghiên
c u v i ch th OPA17. D ng hình thái thân có lông (L), không có lông (K), d ng hình thái
qu t (T) và hình thái qu r i (R). Ngu n g c và c i m các m u ư c nêu B ng 4. M:
thang ADN chu n. 64
Hình 18. Hình nh i n di các m u Ba kích v i m i OPA1. Băng ng hình gi a hai d ng
hình thái thân có lông (L) và không có lông (K) có kích thư c 600 bp và 300 bp (ch ra b i
hình mũi tên). Băng c trưng phân bi t c a ki u hình thái thân không có lông có kích
thư c 1100 bp. Ngu n g c và c i m các m u ư c nêu B ng 4. M: thang ADN chu n. 65
Hình 19. nh i n di các m u Sâm Vi t Nam (S), Sâm vũ di p (V), d ng trung gian (VT) và
Tam th t hoang (T) v i m i OPA14 và OPC16, hình mũi tên ch ra các băng c hi u phân bi t
còn hình u mũi tên ch ra các băng chung. M: thang ADN chu n (1kb marker). Ngu n g c và
c i m c a các m u ư c nêu B ng 4. 66

LU N VĂN TH C SĨ
1
M U
Theo ư c tính hơn 80% dân s trên toàn th gi i hi n nay v n ph thu c vào
các lo i thu c có ngu n g c th o dư c trong vi c chăm sóc s c kh e. Các li u pháp
ch a b nh d a vào th o dư c ư c ánh giá thông qua tính kh d ng và d a vào
kinh nghi m lưu truy n t th h này sang th h khác. Ph n l n các loài cây thu c
hi n nay ch y u ư c thu hái t t nhiên. Vi c thu hái như v y n u không có s
ki m soát ch t ch d gây nên s suy ki t tài nguyên di truy n c a các loài cây
thu c nói riêng cũng như c a ngu n tài nguyên th c v t nói chung. ây cũng là
nguyên nhân có th d n t i ch t lư ng s n ph m kém n nh. Bên c nh ó, nhi u
loài dư c li u quý hi m có th b làm gi ho c thay th b ng các d ng dư c li u có
hình thái tương t , d n t i nh ng tác d ng không mong mu n khi s d ng.
Vi t Nam có g n 4.000 loài cây thu c. V i th m nh v tài nguyên dư c li u
d i dào như v y, chúng ta có th hy v ng phát hi n và phát tri n ư c thu c m i t
ngu n tài nguyên t nhiên phong phú này. Tuy v y, hi n nay công tác b o t n, gìn
gi , ch n t o gi ng và phát tri n ngu n gen cây thu c v n chưa phát huy h t ti m
năng. Nhi u loài cây thu c quý hi m ang có nguy cơ tuy t ch ng do b khai thác
t và thi u k ho ch.
Nh ng v n trên t ra m t yêu c u c p thi t là c n có các bi n pháp b o t n
và phát tri n ngu n tài nguyên dư c li u c a nư c ta, cũng như c n phát tri n công
tác ki m nh dư c li u nh m ánh giá hi u qu ngu n nguyên li u ban u b o
m ch t lư ng s n ph m ph c v ngành công nghi p dư c trong nư c v lâu dài.
Trên th gi i, vi c s d ng các ch th ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP,
SSR, ...) ngày càng ư c dùng r ng rãi trong các nghiên c u phân lo i, phân tích a
d ng sinh h c, xác nh kho ng cách di truy n và c trưng cá th và qu n th th c
v t nh m m c ích b o t n và ch n gi ng. So v i các ch th truy n th ng (ch th
hình thái và ch th hóa h c), thì ch th ADN mang nh ng ưu i m n i b t: d th c
hi n trong i u ki n phòng thí nghi m, không ph thu c vào các y u t môi trư ng
và hi n tư ng tương tác gen, có th xác nh ư c các bi n d ADN trong các giai
o n khác nhau và các cơ quan khác nhau th c v t. Vi c phân tích các ch th

LU N VĂN TH C SĨ
2
ADN cho phép ánh giá m t cách chính xác m c a d ng di truy n c a m t loài
cây thu c nào ó nh m nh hư ng b o t n, ch n, t o và nhân gi ng phù h p, áp
ng yêu c u c a quá trình phát tri n m t n n công nghi p ch bi n dư c li u b n
v ng.
Trên cơ s ó, chúng tôi ã ti n hành nghiên c u phân tích tính a d ng di
truy n c a m t s loài cây thu c quý nư c ta ho c ang b e d a c n ư c ưu
tiên b o t n, ho c có c i m hình thái gi ng nhau c n có s h tr c a các k
thu t sinh h c phân t trong công tác phân lo i.
Lu n văn này trình bày k t qu phân tích ch th ADN (ch y u d a trên k
thu t RAPD-PCR) c a 4 nhóm loài cây thu c ư c thu th p nư c ta, ó là: 1) chi
Acanthopanax (h Araliaceae) g m 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax
trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus W.W. Smith); 2) chi
Illicium g m loài H i hương (Illicium verum Hook.f) và m t s loài H i núi
(Illicium spp.); 3) m t s d ng hình thái khác nhau v c i m thân và qu c a loài
Ba kích (Morinda officinalis How.); 4) chi Nhân sâm (Panax; h Ngũ gia bì
Araliaceae) g m 3 loài là Sâm Vi t Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), Sâm
Vũ Di p (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam th t hoang (Panax stipuleanatus
H.T. Tsai et K.M. Feng).

Chng 1. T ng quan tài li u NCD LU N VĂN TH C SĨ
3
Chương 1. T NG QUAN TÀI LI U
1.1. T NG QUAN V CÂY DƯ C LI U
Vi c s d ng các loài cây dư c li u làm thu c nh m phòng ch ng và i u tr
b nh ã ư c áp d ng t lâu trong l ch s loài ngư i [61]. Vi c s d ng cây dư c
li u có l ã ư c b t u ngay t th i c i (Bensky và Gamble, 1993). Trong n n
văn hóa c xưa, con ngư i t ng h p nh ng thông tin v cây dư c li u d a trên các
bài thu c ư c lưu truy n trong dân gian qua ó phát tri n lên thành các cu n dư c
i n v cây dư c li u. Nh ng minh ch ng s m nh t cho nh ng hi u bi t c a con
ngư i ư c ghi chép l i v dư c li u ư c ghi nh n t i n , Trung Qu c, Ai
C p, Hi L p, La Mã và Xy-ri kho ng 5000 năm trư c. Ví d như nh ng thông tin
c xưa nh t v cây dư c li u c a ngư i Ai C p ư c t ng h p trong 2 cu n sách là
Charak Samhita và Sushruta Samhita [59].
Ư c tính có kho ng 25% các lo i thu c ư c s d ng hi n nay trên th gi i có
ngu n g c t th c v t và có kho ng 121 h p ch t có ho t tính ang ư c s d ng.
Trong t ng s 252 lo i thu c thi t y u mà WHO ã li t kê thì có t i 11% có ngu n
g c t th c v t [68]. G n như 80% dân s Châu Phi và Châu Á ph thu c vào các
lo i thu c c truy n chăm sóc s c kh e [56, 81, 92].
Kho ng 3 th p k trư c ây, theo Lipp (1996) ch có m t lư ng nh các s n
ph m có ngu n g c t cây th o m c ư c ki m nghi m trên m t s b nh c th
[59]. Tính n nay, trên th gi i hi n v n còn nhi u ngư i ưa dùng các s n ph m có
ngu n g c t thiên nhiên i u tr m t s lo i b nh t t (theo Nazma và c ng s ,
2010). Các s n ph m ư c ch bi n t cây dư c li u thư ng ư c s d ng các
b nh nhân m c m t s b nh m n tính, bao g m ung thư vú (12%; Burstein, 1999),
các b nh v ph i (21%; Strader, 2002), virut gây suy gi m mi n d ch ngư i (HIV)
(22%; Kassler, 1991), b nh hen suy n (24%; Blanc, 2001) và r i lo n th p kh p
(26%; Rao, 1999).
Kho ng 960 loài th c v t ã ư c s d ng b i ngành công nghi p th o dư c
n thì có t i 178 loài th c v t vư t qua s n lư ng 100 t n m i năm [41]. Th
trư ng dư c li u t i n ang bi u l m t s tăng trư ng c bi t có th t

4
doanh thu là 145.000 tri u rubi (tương ương kho ng 3,1 t ôla M ) vào năm 2010.
ng th i vi c xu t kh u dư c li u c a qu c gia này có th t doanh thu là 90.000
tri u rubi (tương ương 2 t ô la M ) (theo th ng kê c a t ch c ASSOCHAM,
2008 [59]).
nh hư ng c a cây dư c li u t i s c kh e con ngư i
Thông thư ng m i ngư i thư ng tin r ng nguy cơ gây h i c a các lo i th o
dư c là r t ít, tuy nhiên trong th c t nhi u báo cáo ã ch ra r ng s n ph m t cây
dư c li u có th d n t i nh ng h u qu nghiêm tr ng. Vi c dùng sai các lo i dư c
li u hay các s n ph m dư c li u gi m o ã t ra m t v n vô cùng quan tr ng
v an toàn cũng như tính hi u qu c a các s n ph m dư c li u. Nhi u lo i dư c
ph m ph bi n th m chí có giá thành t hi n nay th c ch t là nh ng s n ph m thay
th kém ch t lư ng ho c là các s n ph m dư c li u thô ã ư c làm gi [19]. Vi c
làm gi các s n ph m t dư c li u cũng như vi c dùng sai chúng có th d n t i
nhi u b nh như suy th n, tim m ch, … ã ư c ghi nh n t i nhi u nơi trên th gi i
như Anh qu c [19, 59], M [59, 97], n [59], Vi t Nam [2]…
M t v n khác trong vi c s d ng các loài dư c li u ó chính là s có m t
c a kim lo i n ng (th y ngân, chì , arsen, …) có kh năng gây c [19, 26, 54, 72].
Vi c nhi m c ã ư c ghi nh n t t c các bư c t bư c kh i u là thu th p
dư c li u thô cho t i công o n s n xu t [19, 54]. Ghi nh n u tiên v trư ng h p
nhi m c kim lo i n ng vào năm 1978 t i Anh. Sau ó ã có hơn 50 trư ng h p
nhi m c kim lo i n ng t nhi u vùng khác nhau trên th gi i bao g m trong ó có
l c a n , B c M , Trung ông, Tây Âu và Australia [26, 72]. S l ng ng
c n thu c di t c trong các cây dư c li u cũng là m t v n gây nh hư ng nghiêm
tr ng trong quá trình phát tri n và y m nh vi c qu c t hóa các s n ph m dư c
li u truy n th ng. S nhi m c t các cây dư c li u thô cũng như các s n ph m
hay ch ph m c a nó (s pha ch , s c thu c,…) ư c ghi nh n là ngày càng tăng.
M t nghiên c u g n ây v i 280 m u có ngu n g c t 30 loài dư c li u Trung
Qu c v l ng ng c n thu c tr sâu cho th y có t i 78,5% m u có ch a t i
thi u m t lo i thu c tr sâu organochlorine như PCNB, aldrin, BHC hay DDT [94],

5
u là nh ng ch t có nguy cơ nh hư ng t i s c kh e ngư i s d ng [92]. Các loài
cây dư c li u thư ng có thành ph n các ch t r t ph c t p chính là nguyên nhân d n
t i khó khăn trong vi c tìm ra phương pháp lo i b tri t các ch t l ng ng b t
l i mà không làm m t di các thành ph n có ho t tính có trong các loài cây này [59].
Bên c nh ó, ã có nh ng báo cáo t ng h p l i v n nhi m n m trong quá trình
thu hái, b o qu n, s n xu t và phân ph i các s n ph m dư c li u trên th gi i [59].
Vi c thu hái trên quy mô r ng và không có tính ki m soát các loài th c v t là
nguyên nhân d n t i vi c làm suy ki t ngu n tài nguyên di truy n, bao g m trong
ó là các loài cây dư c li u [59]. Ví d như, loài anh ào Châu Phi (Pygeum hay
Prunus africanum) ư c s d ng r ng rãi i u tr b nh liên quan t i u ti n li t
tuy n, ang ph i ng trư c nguy cơ c n ki t ngu n tài nguyên, d n t i h sinh thái
b nh hư ng nghiêm tr ng do vi c khai thác quá m c loài cây này châu Phi.
Chính vì l ó, k t năm 1995, trong Công ư c Thương m i v ng v t và th c
v t hoang dã - CITES (Convention of International Trade in Endangered Species),
loài th c v t này ã ư c thêm vào ph n ph l c dành cho các loài c n ư c b o v
[59, 79]. Theo sau ó T ch c IUCN cũng ưa loài dư c li u này vào trong danh
sách các loài có nguy cơ ti t ch ng (Sách ). Loài àn hương (Santalum spp.)
phân b Nam Á, Indonesia, Australia và Nam Thái Bình Dương dùng s n xu t
các s n ph m g và d u thơm, cũng g p trư ng h p tương t .
T nh ng nghiên c u trên, chúng ta nh n th y vi c phát tri n m t h th ng
ánh giá hi u qu các loài cây dư c li u và các thành ph n c a nó là m t vi c làm
thi t y u. Nh ng phương pháp m b o ch t lư ng cũng như an toàn c a các s n
ph m này ã và ang ư c phát tri n trên toàn th gi i, thông qua ó y m nh vi c
tiêu chu n hóa s n ph m u ra, góp ph n toàn c u hóa các s n ph m có ngu n g c
t dư c li u. Bên c nh ó vi c tiêu chu n hóa ngu n dư c li u ang ư c phát tri n
r ng kh p trên ph m vi toàn th gi i. ây là m t vi c làm có tính kh thi, nhưng l i
r t khó th c hi n. Vì r ng, quá trình ki m nh các lo i dư c li u không ư c
th c hi n m t cách ng b trên toàn b các qu c gia. Do ó, hi n nay trên th gi i

6
có r t nhi u phương pháp ư c áp d ng ki m nh ngu n dư c li u và các s n
ph m c a chúng [59].
Tiêu chu n hóa dư c li u
Tính ph c t p c a quá trình tiêu chu n hóa dư c li u
Cây dư c li u có r t nhi u c tính riêng, chính i u này làm cho các s n
ph m t cây dư c li u khác v i các lo i thu c t ng h p [59]. Chúng thư ng ch a
ng th i nhi u h p. Ví d như dư c ph m Huang-qin (Scutellaria baicalensis) có
t i hơn 2000 h p ch t [73]. Nh ng c i m v m t hóa h c c a các loài cây dư c
li u b nh hư ng b i các i u ki n v thu hái, qui trình s n xu t và phân b . Nh ng
c i m v m t sinh lý, di truy n cũng như nh ng bi n i v môi trư ng (quang
chu kỳ, khí h u, i u ki n t, dinh dư ng) u có th gây nh hu ng t i các c
i m hóa sinh và kh năng tích lũy các h p ch t th c p th c v t. Thành ph n các
h p ch t th c c p trong dư c li u còn ph thu c vào th i gian thu hái, các phương
pháp b o qu n, s y khô, tách chi t thu ư c s n ph m óng gói cu i cùng [59].
Tính n nh t t c các giai o n c a quy trình s n xu t có ý nghĩa quan tr ng
m b o hi u qu ch a b nh và an toàn cho ngư i s d ng.
Có r t nhi u lo i ch th như ch th hình thái, hóa h c, ch th liên quan t i h
gen (ADN), ch th liên quan t i các protein (izozym), u là nh ng công c có th
dùng xác nh các thành ph n có trong cây dư c li u [59, 76].
Dư c i n Trung Qu c ( n b n năm 2005) th ng kê có t t c 282 ch th hóa
h c ư c s d ng cho các loài cây thu c [59]. ây là m t công c h u ích dùng
xác nh s làm gi cũng như s khác bi t c a các s n ph m dư c li u có ngu n g c
khác nhau, ki m tra tính n nh c a các s n ph m có tính ch t c quy n [59]. Các
thành ph n có c tính có th s d ng như là các ch th hóa h c trong các phương
pháp sàng l c [49]. Tính cho t i th i i m hi n t i, v n còn có r t nhi u loài dư c
li u không có ch th hóa h c phù h p ki m nh ch t lư ng. Theo cu n Dư c
i n Trung Qu c, ch có 282 trong t ng s 551 loài dư c li u có 1 ho c 2 ch th
hóa h c ki m nh ch t lư ng. Thi u nh ng ch th hóa h c, m c tinh s ch

7
c a các ch th ang có chính là nguyên chính c n tr vi c ki m nh ch t lư ng c a
các s n ph m dư c li u.
Các h p ch t trao i th c p là các ch th ư c s d ng r ng rãi trong vi c
ki m nh và tiêu chu n hóa các loài cây dư c li u. Do không b nh hư ng b i
tu i, i u ki n sinh lý và các nhân t môi trư ng, nên các ch th d a trên phân t
ADN còn ư c s d ng phân bi t nh ng bi n d gi a và trong loài v i nhau. Ch
th a hình phân o n ADN ư c nhân b n ng u nhiên (RAPD) là ch th ư c áp
d ng thành công trong vi c ánh giá s khác bi t gi a các loài Taxus wallichiana
Neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula, Allium schoenoprasum L., A.
paniculata ư c thu th p t nhi u vùng a lý khác nhau [39]. Phân tích RAPD và
Eastern blotting s d ng 2 kháng th ơn dòng ginsenoside Rb1 và Rgl ã ư c áp
d ng thành công trong viêc xác nh 3 loài sâm là: Panax notoginseng, P.
quinquefolius và P. japonicus. u tiên, ngư i ta s d ng ch th RAPD phân
bi t các loài Panax spp. v i nhau. Sau ó b ng k thu t Eastern Blot xác nh s có
hay không có m t ch t ginsenoide Rc trong các s n ph m tách chi t nh lo i tên
loài P. notoginseng trong phân tích Eastern blotting [76].
M c an toàn và hi u qu s d ng c a các loài dư c li u ư c hình thành
thông qua quá trình s d ng lâu dài c a chúng. M c dù ã có nh ng phép th
nghi m lâm sàng ng u nhiên trên m t s loài dư c li u, nhưng có th ki m nh
m t cách tri t thì c n ph i có nh ng nghiên c u lâm sàng y cùng v i các
nghiên c u v m t c tính h c trên các loài dư c li u này [59].
1.2. T NG QUAN V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
Nh ng ti n b g n ây trong lĩnh v c sinh h c phân t ã cung c p nh ng
công c m i áp d ng vào vi c làm sáng t nh ng nghi v n còn t n t i trong các
nghiên c u v ti n hóa, hình thái h c và phân lo i h c. Nh ng ch th ADN có nhi u
ưu i m so v i các ch th hình thái vì chúng g n li n v i v t ch t di truy n, tương
i d phân tích trong phòng thí nghi m và ít b nh hư ng b i các y u t môi
trư ng [24].

8
Trong hai th p k g n ây, m t s k thu t ch th phân t ã ư c phát tri n
phân tích v các h gen, ph n l n là xác nh nh ng khác bi t gi a các cá th
trong cùng m t loài ( a hình di truy n) ho c tìm m i tương quan gi a a hình di
truy n v i các tính tr ng nh t nh. Tuy nhiên, vì giá thành tương i cao tăng lên
cùng v i s phát tri n c a các ch th phân t , cho nên nh ng phương pháp này m i
ch ư c áp d ng trên m t s lư ng h u h n các loài, và a s là m i ch ư c ti n
hành các nư c phát tri n. Vi c ng d ng các ch th phân t còn có xu hư ng khu
trú vào m t lư ng nh các tính tr ng ho c m t s vùng c a h gen. Vi c k t h p các
phương pháp và s phát tri n c a vi c l p b n ã ưa ra tri n v ng áp d ng các
ch th phân t trên quy mô r ng, v i s lư ng l n, qua ó làm gi m chi phí u tư
[24].
Theo Maheswaran (2004) t ng k t, s phát tri n c a các ch th ADN có th
chia làm 3 th h : (i) th h ch th ADN u tiên b t u t năm 1975 t i năm
1989; (ii) th h ch th ADN th hai b t u t năm 1990 n năm 1993; (iii) th h
ch th ADN hi n nay b t u t năm 1994 cho t i nay. Vi c ra i c a k thu t a
hình dài các o n c t gi i h n (RFLP; Grodzicker và cs, 1974) ã ánh d u kh i
i m c a th h ch th ADN u tiên. Ban u, ch th RFLP ư c thu t các loài
virut [31], sau ó ã ư c ki m ch ng khi phân tích nhóm gen globin ngư i [36].
Ti p theo ch th RFLP, m t lo t các ch th ADN ư c phát tri n như: VNTR-
Variable Number Tandem Repeats (Các m nh l p l i có th t v i m t t n s khác
nhau; Jeffreys, 1985); ASO-Allele Specific Oligonucleotides (xác nh m t trong
hai d ng sơi ơn c a m t phân t ADN s i kép b ng các oligonucleotide; Saiki và
cs, 1985); … B ng 1 li t kê m t s ch th ADN ư c phát tri n trong th h ch th
ADN u tiên.
Cu c cách m ng trong lĩnh v c nghiên c u v di truy n h c phân t trên các
vi v tinh – dãy trình t ADN l p l i c a 2-, 3-, 4- và 5 nucleotide xu t hi n r i rác
su t h gen c a các sinh v t nhân chu n ã ánh d u s ra i c a th h ch th
ADN th hai. Các trình t l p l i ơn gi n (SSR) này g n ây ã ư c xác nh là
nh ng ch th phân t ư c dùng trong vi c l p b n h gen c a m t qu n xã và

9
ư c ưa dùng trong các nghiên c u trên i tư ng th c v t. M t s ch th khác
ư c phát tri n trong giai o n này ư c li t kê t i B ng 2.
B ng 1. Th h ch th ADN u tiên
Năm Ký hi u Tên y (ti ng Anh) Tài li u tham kh o
1974 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Grofzicker và cs. (1974)
1985 VNTR Variable Number Tandem Repeats Jeffreys và cs. (1985)
1986 ASO Allele Specific Oligonucleotides Saiki và cs. (1986)
1988 AS-PCR Allele Specific Polymerase Chain Reaction Landegren và cs. (1988)
1988 OP Oligonucleotide Polymorphism Beckmann (1988)
1989 SSCP Single Stranded Conformational Polymorphism Orita và cs. (1989)
B ng 2. Th h ch th ADN th hai
1990 RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA Williams và cs. (1990)
1990 AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Welsh và McClelland (1990)
1990 STMS Sequence Tagged Micro Satellite Sites Beckmann and Soller (1990)
1991 RLGS Restriction Landmark Genome Scanning Hatada và cs. (1991)
1992 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Akopyanz và cs. (1992)
1992 DOP-PCR Degenerate Oligonucleotide Primer - PCR Telenius (1992)
1992 SSR Simple Sequence Repeats Akkaya và cs. (1992)
1993 MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling Caeteno-Anolles và cs.
(1993)
1993 SCAR Sequence Characterized Amplified Region Paran và Michelmore (1993)
V i s phát tri n g n ây c a sinh h c phân t m ra tri n v ng áp d ng nhi u
lo i k thu t phân t xác nh cũng như dùng c i ti n h gen c a nhi u loài
sinh v t khác nhau. Thông tin liên quan t i n n t ng c a nh ng k thu t này cũng
như ng d ng c a chúng u có ngu n g c t vi c áp d ng công ngh lên nh ng d
án h gen. Kho ng 10 năm g n ây khoa h c ã ch ng ki n s hình thành c a m t
dãy các ch th phân t v i kh năng th c hi n cao ư c k t h p v i s thay i t
phương th c th công cho t i s t ng hóa m t cách hoàn ch nh. Theo ó th h
ch th này s có kh năng ti m tàng vô cùng to l n trong s tìm hi u nh ng bi n d
m c ADN. Trong th h ch th ADN m i này có th k n các ch th như

10
ISSR, là ch th ư c phát tri n trên n n t ng th h ch th SSR; hay SNP ( a hình
các ơn nucleotide)… là các ch th có hi u qu cao trong vi c phân tích a hình di
truy n.
B ng 3. Th h ch th ADN m i
1994 ISSR Inter Simple Sequence Repeats Zietkiewicz và cs. (1994)
1994 SAMPL Selective Amplification Of Micro Satellite
Polymorphic Loci
Morgante và Vogel (1994)
1994 SNP Single Nuleotide Polymorphism Jordan và Humphries (1994)
1995 AFLP
(SRFA)
Amplified Fragment Length Polymorphism
(Selective Restriction Fragment Amplification)
Vos và cs. (1995)
1996 ISTR Inverse Sequence-tagged Repeats Rohde (1996)
1997 DAMD-
PCR
Directed Amplification Of Mini Satellite
DNA-PCR
Bebeli và cs. 1997
1999 IRAP Inter-retrotransposon Kalendar và cs. (1999)
c i m c a các ch th phân t nói chung và ch th ADN nói riêng
M c a hình
K thu t s d ng chính xác ch th di truy n có m c a hình cao nên ư c
áp d ng trong vi c l p b n h gen. M c a hình trong s các ch th di truy n
ph thu c vào lo i ch th và phương pháp ư c s d ng xác nh ra nó.
S lư ng các alen
Có hai ki u ch th : ch th liên quan t i 2 alen và ch th liên quan t i nhi u
alen ( a alen).
Tính c hi u v locus
Các ch th ư c chia ra thành hai nhóm chính: các ch th liên quan t i 1 locus
(ch có m t v trí trên h gen) và ch th liên quan t i a locus (nhi u v trí trên h
gen). Các ch th liên quan n ơn locus thư ng ư c áp d ng trong vi c l p b n
h gen trong khi ó các ch th liên quan t i a locus ư c áp d ng cho các
nghiên c u xây d ng tàng thư ADN ho c phân tích a d ng di truy n chung.
B n ch t c a các alen

11
B n ch t c a các ch th liên quan t i 2 alen ư c xác nh là ng tr i khi mà
c hai alen này u ư c quan sát th y con lai. N u ch có m t trong hai alen
ư c quan sát th y thì ch th tương ng v i alen ó ư c xác nh là tr i. Các ch
th ng tr i s mang nhi u tính thông tin hơn so v i các ch th tr i b i vì các ch
th ng tr i có th phân bi t ư c các ki u gen d h p t v i các ki u gen ng h p
t . Chính i u này cho phép s xác nh các ki u gen và t n s alen các locus m t
cách chu n xác. Do ó, nh ng ch th ng tr i ư c ưa dùng hơn so v i các ch th
tr i trong nghiên c u l p b n gen và phân tích a d ng di truy n.
Ngoài nh ng c i m trên, khi nghiên c u v các ch th ADN, các nhà
nghiên c u còn chú ý t i các c i m v m t k thu t (các phương pháp kèm
theo); yêu c u v m t ch t lư ng c a ADN; kh năng t ng hóa; các chi phí ho t
ng (ti n lương, các thi t b phòng thí nghi m, máy móc, hóa ch t, …); chí phí
phát tri n
Nh ng c i m c n có c a m t ch th ADN lý tư ng
M t ch th ADN lý tư ng là m t ch th h i t nh ng c i m c n có như
sau:
- Có th t o ra ư c m t cách d dàng
- Phân tích ơn gi n và nhanh
- Có tính a d ng và tính l p l i cao
- Di truy n ng tr i và có s tái xu t hi n trên toàn h gen
- Ch n l c m t cách trung tính v i nh ng i u ki n c a môi trư ng ho c i u
ki n th c hi n
- S li u có th ư c thay i gi a các phòng thí nghi m khác nhau.
Vi c ch n ra ư c m t ch th phân t mang y t t c các tiêu chu n trên
là m t i u h t s c khó khăn. Như v y, m c tiêu t ra là c n ph i phát tri n ư c
m t lo i ch th phân t h i các c i m k trên. Nhi u ch th phân t ã ư c
s d ng ánh giá a hình ADN. Chúng ã ư c phân lo i thành các ch th d a
vào các phép lai và các ch th d a trên ph n ng PCR. Nh ng c i m c a các ch
th d a vào phép lai ư c th c hi n b i phép lai gi a phân o n ADN ã ư c c t

12
b i enzym gi i h n endonuclease, v i m t u dò ư c ánh d u. Trong k thu t
PCR, các phân o n ADN ư c nhân b n trong i u ki n in vitro v i s tr giúp
c a các trình t oligonucleotit c hi u ho c tương ng (còn ư c g i là m i) và
các enzym ADN polymerase ch u nhi t. Các phân o n ADN ư c nhân b n này
ư c phân chia nh i n di và các băng ư c xác nh b i nhi u phương pháp như
nhu m băng (s d ng thu c nhu m ethidium bromide) và phương pháp phóng x t
ghi.
Cùng v i nh ng ti n b c a enzym ADN polymerase ch u nhi t, vi c s d ng
PCR trong các nghiên c u và các phòng thí nghi m lâm sàng ang tăng lên m t
cách nhanh chóng. PCR có nh y cao và v n hành m t t c r t nhanh. Nh ng
ng d ng c a nó trên các m c ích phân tích s a d ng ã m ra vô s nh ng kh
năng m i trong lĩnh v c sinh h c phân t .
1.3. LÝ DO TH C HI N TÀI
1.3.1. Th c tr ng nghiên c u v cây dư c li u Vi t Nam hi n nay
Theo th ng kê c a t ch c IUCN, hi n Vi t Nam có hơn 10.000 loài th c v t
có vai trò cung c p ngu n th c ăn, thu c .... Theo i u tra c a Vi n Dư c li u, nư c
ta có g n 4000 loài cây thu c. V i th m nh v tài nguyên dư c li u d i dào như
v y, chúng ta có th hy v ng phát hi n và phát tri n ư c thu c m i t ngu n tài
nguyên t nhiên phong phú này. Tuy v y, hi n nay công tác b o t n, gìn gi , ch n
t o gi ng và phát tri n ngu n gen cây thu c v n chưa phát huy h t ti m năng. Nhi u
loài cây thu c quý hi m ang có nguy cơ tuy t ch ng do b khai thác t và thi u
k ho ch. Theo s li u c a các cơ quan ch c năng thì có t i 50% nguyên li u dư c
li u c a nư c ta là nh p v t nư c ngoài. Trong hoàn c nh ó, m t chi n lư c khai
thác, b o t n cũng như gây gi ng h p lý ngu n tài nguyên dư c li u nói chung và
tài nguyên cây thu c nói riêng là v n mang tính c p thi t và có ý nghĩa th c ti n.
1.3.1.1. Nghiên c u v chi Acanthopanax
Trên th gi i, chi Acanthopanax có kho ng 35 loài, h u h t phân b vùng
ông Á, ít loài có ông Nam, phía Nam và ông B c châu Á. Trong ó, Trung

13
Qu c có t i 26 loài, Hàn Qu c có 17 loài, Nh t B n có 9 loài. Theo Huy Bích,
Vi t Nam ch có 3 loài thu c chi Acanthopanax ó là Acanthopanax trifoliatus (L.)
Merr., A. gracilistylus W.W. Smith và A. senticosus Harms [1, 2, 45, 50].
Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai nói riêng và các loài thu c chi Acanthopanax
nói chung và thư ng ư c xem có công d ng g n gi ng nhau trong y h c c truy n.
nư c ta, chúng là thành ph n ư c b sung trong các v thu c b gan, b th n,
làm m nh gân c t, ch a th p kh p, lưng g i m i au, tr em ch m bi t i, phù
thũng, kích thích tình d c, ... [2, 58, 64].
Các nghiên c u v hóa h c và dư c lý h c
Ngư i ta b t u chú ý nghiên c u v các loài thu c chi Acanthopanax t
kho ng năm 1965, v i vi c tìm ra các glycosit eleuthrosid A, B, C, D và E t v r
c a A. senticosus. T ó n nay, ã có r t nhi u công trình nghiên c u v các h p
ch t t nhiên c a chi Acanthopanax bao g m: triterpenoid, triterpen glycosid,
diterpenoid, diterpen glycosid, lignan, phytosteroid, flavonoid, phenolic, curmrin và
các axit béo [1, 2, 43]. Nh ng nghiên c u v tác d ng dư c lý c a d ch chi t Ngũ
gia bì hương có tác d ng long m, ch a ho (Du Jianh và cs, 1992); ngăn c n và
gi i phóng các y u t ông máu và làm t c m ch máu (Chen và cs, 1996); i u hòa
mi n d ch, i u tr các b nh t mi n hay d ng [22, 65, 74].
Hi n nay, loài Ngũ gia bì hương Vi t Nam ch còn l i m t vài t p h p cá th
t nh Hà Giang và Lào Cai, trong ó m t s cá th Ngũ gia bì hương Lào Cai có
ngu n g c ư c ưa t Hà Giang v tr ng. S lư ng và khu phân b c a Ngũ gia bì
gai g n ây b thu h p nhi u so v i trư c ây. Theo i u tra vào các năm 1973-1987
L ng Sơn, Cao B ng và Lai Châu, ngu n Ngũ gia bì gai Vi t Nam tương i
phong phú và xác nh ư c tr lư ng n vài trăm t n dư c li u. áng ti c, hi n
nay c Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai ch còn m t s lư ng ít i m c t nhiên
và còn l i là ư c tr ng m t s hàng rào xung quanh nhà ngư i dân [2].
Trên th trư ng hi n nay có bày bán m t s d ng dư c li u khô g i chung là
“Ngũ gia bì” nhưng không phân bi t ây là dư c li u c a loài cây thu c nào. Như
ã trình bày ph n trên, thu t ng “Ngũ gia bì” ư c nhi u ngư i s d ng g i

14
cho các loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus), Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) và
m t s loài khác thu c chi Acanthopanax. Trư c th c tr ng suy gi m nghiêm tr ng
c a hai loài cây thu c Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương Vi t Nam, công tác b o
t n nh m phát tri n hai loài cây thu c quý này là m t vi c làm có tính c p thi t. Tuy
v y, t ư c m c tiêu ó, vi c thăm dò và ánh giá m c a d ng di truy n
c a ngu n gen v n có là m t vi c làm có ý nghĩa cơ b n.
1.3.1.2. Nghiên c u v chi Illicium Vi t Nam
Cây H i hương (Illicium verum Hook.f) ư c bi t n t lâu trong n n y h c
c truy n c a nhi u qu c gia trên th gi i như m t lo i th o dư c có v cay, mùi
thơm, tính m. T i Vi t Nam H i hương ư c bi t n trong các bài thu c gây kích
thích trung ti n, tăng cư ng tiêu hóa, l i s a, l i ti u, ch a ng c th t cá, r n c n,
… Hi n nay, H i hương còn ư c bi t t i là ngu n nguyên li u ưa thích bào ch
axit shikimic, là ti n ch t c a thu c Tamiflu®
- lo i thu c ư c ánh giá là có hi u
qu nh t trong vi c i u tr b nh cúm gia c m H5N1. H i hương l i có vùng phân
b tương i h p, hi n nay H i hương ch phân b các t nh phía b c Vi t Nam
(Cao B ng, B c K n, L ng Sơn và Qu ng Ninh) và m t s t nh mi n nam Trung
Qu c. Trư c nhu c u s d ng thu c Tamiflu ngày m t tăng trên toàn th gi i
(WHO, 2005), n u không có chi n lư c khai thác h p lý thì r t có kh năng d n n
suy ki t ngu n tài nguyên dư c li u này.
Các nghiên c u v hóa h c và dư c lý h c
Qu c a cây H i hương có ch a cathechin, protocatechin, tinh d u và m t s
h p ch t vô cơ khác [2, 83]. Xu t phát t nh ng ng d ng c a H i hương trong n n
y h c c truy n hi n nay, nh ng nghiên c u v thành ph n hóa h c c a H i hương
ch y u t p trung vào tinh d u h i [2, 27, 88, 96]. Các nghiên c u v dư c lý c a
tinh d u h i ã ư c th nghi m trên các ch ng vi khu n Candida albicans,
Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Bacillus mycoides [2].
Tinh d u h i ã ư c ch ng minh có kh năng: c ch quá trình hình thành u trúng
cũng như quá trình n tr ng c a nhi u loài sâu b gây nh hư ng n mùa màng
(Muskesh Kumar Chaubey, 2008); i v n v i histamine và acetylcholine, làm

15
gi m co th t cơ trơn ru t [2]; ngăn ng a c ch và hình thành các ch t sinh ung
thư gan (Amit Singh Yadar, 2007).
Bên c nh loài H i hương (Illicium verum Hook.f) v n có giá tr y - dư c h c
thì t i Vi t Nam còn t n t i m t s loài khác thu c h h i (Illiciaceae) thư ng ư c
g i chung là h i núi, như I. griffithii, I. majus, … (Phan K L c, 2003) v n ít có giá
tr y dư c h c hơn, th m chí m t s loài ư c xác nh là có c t . Theo mô t c a
Huy Bích và c ng s (2003), s tương ng v m t hình thái c a cây H i hương
v i các loài h i núi là khá cao, chính là nguyên nhân chính gây khó khăn trong vi c
thu hái úng dư c li u t cây H i hương, th m chí có th d n n vi c dùng sai
dư c li u do thu hái nh m.
1.3.1.3. Nghiên c u v chi Morinda
Ba kích (Morinda officinalis How) là loài cây nhi t i c h u c a Vi t Nam.
Theo i u tra c a Vi n Dư c Li u (B Y t ), cây Ba kích ch th y phân b m t s
t nh trung du và mi n núi th p phía b c, bao g m Qu ng Ninh, L ng Sơn, B c
Giang, Thái Nguyên, Phú Th , Hòa Bình và Hà Tây. M t vài a phương khác cũng
phát hi n th y nhưng không áng k . Ba kích thư ng ư c s d ng ph bi n làm
thu c b th n kinh, b gân c t, ch a th p kh p, gi m xơ c ng ng m ch. Ba kích
có tác d ng tăng cư ng kh năng sinh lý i v i nam gi i có ho t ng sinh d c y u
[2]. Ba kích còn ư c s d ng c i thi n s c kh e, giúp ăn ng t t hơn và gi m
au m i kh p ngư i cao tu i.
Các nghiên c u v m t hóa h c và dư c lý h c
H p ch t ư c nghiên c u nhi u nh t r cây Ba kích chính là nhóm h p ch t
anthraglucosid [2]. B ng phương pháp nghiên c u ph huỳnh quang và UV, nhóm
nghiên c u Yao H. và cs (2004) ã ch ng minh hàm lư ng c a các anthraquinon có
m i liên quan v i c u trúc r c a Ba kích: có m ch phloem phát tri n và xylem nh .
Theo tài li u y h c Trung Qu c, Ba kích có tác d ng ch ng l i các tác ng b t l i
c a hydrocortisone i v i s teo tuy n giáp, teo v tuy n thư ng th n [2]. Thêm
vào ó, Ba kích có th ư c s d ng ch a b nh au lưng, gi m v t thâm, au m t
và th m chí c au răng, tác d ng tăng l c (theo nghiên c u c a Cui C. và cs

16
(1995), gi m au ch ng viêm (nghiên c u c a Choi J. và cs, 2005), kháng viêm (các
nghiên c u c a Kim I.T. và cs, (2005) và Soon Y.Y. và Tan B.K. (2002)), tác d ng
ch ng stress (nghiên c u c a Li Y.H. và cs, 2001).
nư c ta, theo ghi nh n c a Vi n Dư c Li u, do s khai thác quá m c trong
m t th i gian dài t trư c năm 1975 cùng v i vi c r ng b tàn phá nhi u làm cho s
lư ng c a cây Ba kích trong t nhiên b suy gi m nghiêm tr ng và ngày càng khan
hi m. Hi n nay, cây Ba kích ã ư c ưa vào tr ng xen trong m t s mô hình trang
tr i nh trung du và mi n núi th p phía B c như t i Phú Th , Thái Nguyên, Hòa
Bình, Tam o...
1.3.1.4. Nghiên c u m t s loài cây thu c chi Panax
Các loài cây thu c thu c chi Panax v n là nh ng dư c li u quý ư c s d ng
t lâu i. Vi t Nam, theo Nguy n T p (2005) hi n có năm loài cây thu c thu c
chi Panax , ba trong s ó là nh ng loài b n a m c t nhiên, g m Sâm Vi t Nam
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm Vũ Di p (Panax bipinnatifidus Seem.) và
Tam th t hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng). c bi t, Sâm Vi t
Nam còn là loài c h u h p c a nư c ta, hi n ch phân b vùng núi Ng c Linh
thu c a ph n hai t nh Qu ng Nam và Kon tum (vì v y loài này còn có tên g i là
Sâm Ng c Linh) ( Huy Bích, 2003). Trên th gi i, Sâm Vũ Di p ư c tìm th y
Trung Qu c, b c Mianma, ông-b c n và Nêpal. nư c ta, Sâm Vũ Di p
phân b h p vùng núi Hoàng Liên Sơn (thu c a ph n Sapa, Bát Xát, Lào Cai)
và huy n Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính là i m c c nam c a b n phân
b Sâm Vũ Di p trên th gi i (kho ng 23˚ vĩ B c) ( Huy Bích, 2003).
Kh năng b i b s c kho và ch a b nh c áo c a các loài dư c li u này ã
khi n trong m t th i gian dài chúng b khai thác m nh m và thi u quy ho ch. Hi n
nay, c s lư ng và vùng phân b c a ba loài dư c li u trên Vi t Nam ã suy
gi m nghiêm tr ng, Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang th m chí còn ng trư c nguy
cơ tuy t ch ng. Hi n tr ng này t ra cho chúng ta m t yêu c u c n nhanh chóng có
các chi n lư c b o t n, ch n t o gi ng, phát tri n ngu n tài nguyên dư c li u quý
giá nêu trên.

17
Các nghiên c u v m t hóa h c và dư c lý h c
Dư c li u t Sâm Vi t Nam, Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang u là thân r
và r c . H p ch t sinh h c ư c quan tâm nh t c a các loài sâm là các saponin
triterpen (g i chung là ginsenoside). Các nghiên c u dư c h c ã ch ra r ng ho t
tính sinh h c khác nhau c a các saponin là do c u trúc sapogenin và thành ph n
ư ng quy t nh [4, 86, 87]. Các nghiên c u v dư c lý h c ch ra r ng Sâm Vi t
Nam có tác d ng: ngăn ch n ung thư gây b i các tác nhân hoá h c (Takao
Konoshima và c ng s , 1999); tác d ng b o v gan in vitro chu t; tác d ng gi m
th i gian ng do thu c pentobarbital và gi m t n thương d dày chu t nh t ch u
stress tâm lý (Nguyen T.T., 1996), cũng như có kh năng ch ng stress (Huong
N.T.T., 2005)… So v i Sâm Vi t Nam, các nghiên c u v tác d ng dư c lý c a
Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang còn tương i ít và m i m [2].
M t v n g p ph i i v i hai loài cây thu c Tam th t hoang và Sâm Vũ
Di p là trong t nhiên, ngoài hai d ng hình thái i n hình (lá x sâu c a Sâm Vũ
Di p và lá không x c a Tam th t hoang) còn t n t i m t s d ng hình thái trung
gian gi a hai d ng i n hình là lá x nông. Hi n tư ng này d n n s nh m l n
và khó phân bi t hai loài dư c li u trên trong quá trình thu hái, ch bi n và s
d ng. V m t hình thái, vi c x p d ng trung gian này vào nhóm Sâm Vũ Di p
hay Tam th t hoang v n chưa ư c th ng nh t, t n t i hai nhóm ý ki n trái
ngư c là nên x p nh ng cá th này vào loài Sâm Vũ Di p hay Tam th t hoang.
Hi n tư ng này gây khó khăn cho công tác ki m nh ngu n nguyên li u làm thu c
ban u (v n ch y u d a vào các ch th c m quan), d n n ch t lư ng s n ph m
kém n nh.
Nh ng d n li u trên ây cho th y r ng vi c khai thác, s d ng và phát tri n
ngu n tài nguyên cây thu c nư c ta hi n nay t n t i nhi u h n ch và khó khăn.
Ph n l n các loài cây thu c hi n nay ư c thu hái ch y u t các ngu n t nhiên,
thư ng không rõ v b n ch t di truy n, thành ph n hóa h c cũng như các ho t tính
sinh h c. Phương pháp thu hái trên cho th y m t s như c i m như: (i) vi c thu hái
không có quy ho ch các loài cây thu c t t nhiên d gây suy ki t ngu n tài nguyên

18
di truy n, do ó nhi u loài cây thu c quý hi m càng có nhi u nguy cơ b tuy t
ch ng; (ii) vi c thu hái này không áp ng ư c yêu c u c a công nghi p s n xu t
dư c ph m do: ngu n nguyên li u u vào không n nh v m t hóa h c, ho t ch t
sinh h c mong mu n, có th nh m l n v i các loài cây có hình thái tương t nhưng
l i không có ho t tính mong mu n, th m chí là có c tính; (iii) các d ng nguyên
li u t nhiên có nguy cơ nhi m c cao (nhi m ch t di t c , thu c tr sâu, kim lo i
n ng, vi sinh v t...).
Vì v y, công tác tiêu chu n hóa và ki m nh dư c li u là m t vi c làm c p
thi t. m b o cho công tác b o t n và phát tri n a d ng di truy n các loài
dư c li u quý hi n nay Vi t Nam, c n có s ánh Cho n nay, nư c ta v n
chưa có s quan tâm úng m c i v i công tác phát tri n các vùng nguyên li u
cây thu c. Thêm vào ó, công tác ch n t o gi ng cây dư c li u và tiêu chu n
hóa ngu n dư c li u ban u cũng h n ch , do ó chưa áp ng ư c nhu c u
c a th trư ng trong nư c. Nhi u công ty dư c ph m c a Vi t Nam hi n nay ch
y u u s d ng ngu n nguyên li u nh p kh u ph c v cho quá trình s n xu t
c a mình (ph n l n ư c nh p v t th trư ng Trung Qu c do h có th áp ng
nhanh chóng nguyên li u cho s n xu t v i giá c h p lý, t ch t lư ng t t và
phong phú v ch ng lo i).
Riêng i v i các loài cây thu c, m t trong nh ng yêu c u hàng u hi n
nay c a n n công nghi p dư c ph m d a trên dư c li u t nhiên là yêu c u tiêu
chu n hóa ngu n nguyên li u ban u. Trong ó, vi c xác nh thành ph n các
h p ch t có ho t tính sinh h c, ho t l c sinh h c và c tính, cũng như công tác
ch n t o gi ng các loài cây thu c có vai trò h t s c quan tr ng. Trong quá trình
ó, vi c phân tích các ch th ADN cho phép ánh giá m t cách chính xác m c
a d ng di truy n c a m t loài cây thu c nào ó nh m nh hư ng b o t n,
ch n, t o và nhân gi ng phù h p, áp ng yêu c u c a quá trình phát tri n m t
n n công nghi p ch bi n dư c li u b n v ng (Kalpana et al., 2004). Ngoài ra,
g n ây m t s nghiên c u còn cho th y ch th ADN các loài cây thu c còn có
th s d ng như m t công c hi u qu giúp phân lo i các d ng dư c li u có c

19
i m hình thái gi ng nhau, ho c giúp phát hi n các d ng dư c li u sai ngu n g c
và dư c li u gi .
1.3.2. Ch th ADN – Ch th RAPD-PCR
Các phương pháp ki m nh dư c li u ang s d ng hi n nay có nhi u h n
ch . Các ch th c m quan v hình thái, m u s c, mùi, v ... ã ư c s d ng t lâu
theo kinh nghi m dân gian ki m nh dư c li u, song phương pháp này l i ph
thu c nhi u vào tính ch quan c a t ng ngư i nên d gây nh m l n. Vì th mà trên
th trư ng, nhi u lo i dư c li u quý hi m ho c có giá tr kinh t cao có th b làm
gi ho c ư c thay b ng các dư c li u có hình thái tương t . Vi c phân tích dư c
li u b ng các phương pháp hóa phân tích (như k thu t s c ký l p m ng, s c ký
l ng cao áp, s c ký c t, phương pháp kh i ph ...) l i ph thu c nhi u vào các i u
ki n ngo i c nh (th i i m thu hái, i u ki n canh tác...), có chi phí cao và òi h i
i u ki n phân tích nghiêm ng t nên ch phù h p trong các phòng thí nghi m. V i
s phát tri n m nh m c a ngành công ngh sinh h c, c bi t là lĩnh v c sinh h c
phân t , trên th gi i cũng như Vi t Nam, các ch th phân t - trong ó có các
ch th ADN - ngày càng ư c áp d ng r ng rãi trong các nghiên c u phân lo i,
phân tích a d ng sinh h c, xác nh c trưng cá th và kho ng cách di truy n
gi a các cá th ho c qu n th th c v t nh m m c ích nh hư ng b o t n và ch n
t o gi ng cây tr ng.
Ch th phân t ADN là nh ng ch th d a trên b n ch t a hình ADN, ư c
s d ng xác nh m i quan h gi a các cá th trong cùng m t loài ho c gi a
các loài, phát hi n loài m i và m i quan h ti n hoá gi a các loài (Ahn và cs,
1995; Zhang và cs, 1995).
Trong ó ch th RAPD-PCR ã ư c s d ng nhi u trong các nghiên c u v
tính a d ng di truy n nhi u loài khác nhau trên th gi i như: Yu-ping-feng san
(Cheng và cs, 1998), Taxusbrevifolia (Gocmen và cs, 1996), Scutellaria
(Hosokawa và cs, 2000), Pelargonium graveolens (Shasany và cs, 2002)...
RAPD là m t k thu t d a trên ph n ng PCR. Phương pháp này d a trên s
nhân b n nh ng phân o n ADN ích ho c ng u nhiên v i các m i ng u nhiên.

20
Vào năm 1991, Welsh và McClellan ã phát tri n nên m t phép phân tích di
truy n d a trên ph n ng PCR t tên là a hình các o n ADN ư c nhân b n
ng u nhiên (RAPD). Quy trình này s tìm ra s a hình trình t nucleotide trong
phân t ADN b ng vi c s d ng m t m i ơn có trình t nucleotide ng u nhiên.
Trong ph n ng này, m t m i ơn s g n v i ADN h gen hai v trí khác nhau
n m trên các chu i b sung c a ADN m u. N u như nh ng v trí b t c p v i nhau
n m trong kho ng có th nhân b n v i t ng v trí, thì s có m t o n ADN riêng
bi t ư c t o thành thông qua s nhân b n c a chu trình nhi t. Trung bình, m i
m t m i s xác nh s nhân b n m t vài v trí khác nhau trong h gen, qua ó
làm cho các phân tích tr nên có ích trong vi c sàng l c hi u qu s a hình trong
trình t nucleotide gi a các cá th v i nhau (William và cs. 1993). Tuy nhiên, d a
vào tính ch t ng u nhiên trong s nhân b n ADN v i các m i có trình t ng u
nhiên, cho nên i u quan tr ng là c n ph i t i ưu hóa và duy trì các i u ki n ph n
ng m t cách nh t quán m b o s nhân b n ADN. Nh ng trình t
oligonucleotide này óng vai trò v a là m i xuôi v a là m i ngư c, ng th i
chúng thư ng có kh năng nhân b n các phân m nh t 1 - 10 v trí c a h gen m t
cách ng th i. Các s n ph m ư c nhân b n (thư ng có kích thư c n m trong
kho ng t 0,5 - 5 kb) phân tách ư c trên gel agarose v i s có m t c a ethidium
bromide và quan sát ư c dư i ánh sáng c c tím (Jones và cs, 1997) và s có hay
không có m t c a băng s có th quan sát th y. Nh ng băng a hình này ư c xác
nh u tiên thông qua nh ng khác bi t các v trí g n m i, tuy nhiêu chúng
cũng có th ư c hình thành t s khác bi t v chi u dài trong các trình t ư c
nhân b n gi a các v trí g n m i. M i m t s n ph m thu ư c t m t vùng c a h
gen u ch a hai phân o n ng n có trình t có hư ng ngư c nhau, n m trên các
chu i i di n b sung v i m i. Keseli và cs. (1994) ã so sánh m c a hình
c a 2 lo i ch th phân t , ó là ch th RFLP và RAPD, b ng vi c xác nh gi a
hai gi ng cây rau di p trong c u trúc c a b n liên k t gen. Ch th RFLP và
RAPD ch ra s phân b gi ng nhau d c theo h gen, và chúng th hi n s tương
ng c v m c a hình. Tuy nhiên, các locus RAPD ư c xác nh nhanh hơn.

21
Ưu i m
Ưu i m chính c a ch th RAPD là khi phân tích nhanh và d dàng. Do liên
quan t i ph n ng PCR, nên ch c n m t lư ng ADN m u tương i ít, thư ng là
s d ng t 5 - 50 ng trên m t ph n ng. B i vì các m i là ng u nhiên, nên trình t
c u trúc h gen không c n bi t trư c. Chúng là các ch th ng tr i và do ó
chúng có nh ng gi i h n trong vi c s d ng là m t ch th l p b n , i u này
ã ư c kh c ph c có th m r ng hơn b ng cách l a ch n nh ng ch th này
ư c liên k t thành c p v i nhau (Williams và cs, 1993).
Tóm l i so v i các ch th truy n th ng (ch th hình thái, ch th hóa h c,...)
các ch th RAPD-PCR có các ưu i m n i b t như sau:
- D th c hi n trong i u ki n phòng thí nghi m (phép phân tích nhanh,
ơn gi n) v i chi phí tương i th p.
- Có ph m vi ánh giá toàn b h gen c a i tư ng nghiên c u.
- Không ph thu c vào các y u t môi trư ng (các y u t môi trư ng ít
nhi u có nh hư ng n s bi u hi n c a gen).
- Không ph thu c vào hi n tư ng tương tác gi a các gen.
- Không ph thu c hi u qu bi u hi n ki u hình c a các gen (ch ng h n như
các gen t bi n, gen gây ch t, gen l n thư ng không ư c bi u hi n ki u hình
trong t nhiên).
- Có th phát hi n các d ng bi n d ADN trong các giai o n khác nhau
ho c gi a các b ph n khác nhau th c v t.
H n ch c a k thu t RAPD-PCR
Khó khăn chính c a ch th RAPD chính là kh năng l p l i th p
(Schierwater và Ender, 1993), và do quy trình v m t thí nghi m r t c n thi t ph i
có tiêu chu n hóa cao, b i vì nh y c a ch th RAPD i v i các i u ki n
ph n ng. h n ch như c i m này, ta c n tuân th nghiêm ng t các i u ki n
thí nghi m, ti n hành ng b gi a các l n thí nghi m, ho c s d ng s lư ng m i
RAPD-PCR l n trong nghiên c u gi m sai s thí nghi m.

22
Phân tích RAPD thư ng c n ư c tinh s ch, phân t ADN có tr ng lư ng
phân t cao, và c n có s phòng ng a kh năng lây nhi m c a các m u ADN. Nhìn
chung, v i nh ng t n t i v n có v kh năng l p l i c a mình, ch th RAPD không
ph i là ch th phù h p i v i vi c chuy n giao hay so sánh các k t qu gi a các
nhóm nghiên c u cùng m t loài ho c m t i tư ng nào ó. Cũng gi ng như h u
h t các k thu t a locus khác, ch th RAPD không ph i là m t ch th c hi u
locus, các thông tin thu ư c t các băng không th làm sáng t nh nghĩa v các
locus và alen (s ng tr i c a các ch th ) ng th i nh ng phân o n có kích
thư c gi ng nhau có th không ph i là ng h p. Ch th RAPD ư c cho r ng d
dàng ti n hành b i nhi u phòng thí nghi m khác nhau, tuy nhiên tính l p l i
không t ư c m c như ý (Jones và cs. 1997).
V i nh ng c i m như trên, k thu t RAPD -PCR có tri n v ng l n không
nh ng có th áp d ng hi u qu ánh giá a d ng di truy n, mà còn là công c
h u hi u giúp b o t n, phát tri n ngu n gen cây dư c li u và ki m nh nhanh dư c
li u, c bi t là các dư c li u d nh m l n trong quá trình thu hái ho c sau khi sơ
ch , t các loài th o dư c Vi t Nam trong tương lai.
1.3.3. M c tiêu c a tài
V i nh ng ưu i m n i b t c a ch th ADN (c th là ch th RAPD-PCR) k
trên ã g i ý cho chúng tôi th c hi n tài “Phân tích a d ng di truy n ngu n tài
nguyên m t s loài cây dư c li u Vi t Nam b ng ch th ADN”. T vai trò th c
ti n c a các loài dư c li u trong n n y h c c truy n và hi n i, cùng v i th c
tr ng phân b , khai thác chúng hi n nay chính là nguyên nhân g i ý chúng tôi ã
l a ch n các loài dư c li u dư i ây làm i tư ng trong nghiên c u này:
- 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A.
gracilistylus) thu c chi Acanthopanax;
- Loài cây thu c H i hương (Illicium verum Hook.f) và m t s loài h i núi;
- Cây Ba kích (Morinda officinalis How) v i các ki u hình thái ph bi n hi n
nay;

23
- Loài sâm Vi t Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), sâm Vũ Di p
(Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam th t hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et
K.M. Feng), và d ng hình thái trung gian gi a sâm Vũ Di p-Tam th t hoang (thu c
chi Panax).
Ch th ADN chúng tôi s d ng ây chính là ch th RAPD-PCR. V i nhóm
i tư ng và phương pháp c th như trên, chúng tôi th c hi n tài này nh m:
- ánh giá m c a d ng di truy n m t s loài cây thu c: các m u hai loài
Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus);
các m u thu c t p h p y nh t v cây H i hương (Illicium verum) v i m t s
loài h i núi; các d ng hình thái khác nhau c a cây Ba kích; và các m u thu c loài
Sâm Vi t Nam, Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang nh m nh hư ng b o t n và phát
tri n ngu n gen c a các loài cây thu c này.
- Bên c nh ó, s d ng phương pháp RAPD-PCR, chúng tôi hi v ng bư c u
có th xác nh ư c m t s t p h p ch th ADN giúp phân bi t nhanh các loài cây
thu c có hình thái tương t như ã trình bày trên. T ó, cung c p m t công c b
sung cho công tác ki m nh dư c li u Vi t Nam trong tương lai.

Chng 2. V t li u - Phng pháp NCD LU N VĂN TH C SĨ
24
Chương 2. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. V T LI U TH C V T
Các m u th c v t ư c s d ng trong nghiên c u u ư c thu th p và cung
c p b i Khoa Tài nguyên dư c li u, Vi n Dư c li u (B Y t ) cung c p. B ng 4 li t
kê danh sách các loài, các m u và a i m thu th p m u trong nghiên c u. T p h p
m u trong nghiên c u thu c các loài có c i m hình thái tương i a d ng (t
thân b i, thân th o n thân g ). Các m u th c v t sau khi ưa v phòng thí nghi m
ư c r a s ch dư i vòi nư c máy và phân lo i riêng r thành các ph n lá, thân và
r . Các ph n mô d p nát ho c có bi u hi n nhi m b nh ư c c t b . Sau ó, các
m u ư c lau s ch b ng ethanol 70%; r i nghi n trong nitơ l ng b ng chày và c i
ư c kh trùng t trư c thành d ng b t m n có kích thư c h t nh hơn 1 mm. M u
nghi n ư c b o qu n trong ng Falcon i u ki n nhi t -80о
C làm nguyên
li u tách chi t ADN t ng s .
2.1.1. Chi Acanthopanax
Các m u th c v t thu c chi Acanthopanax ư c s d ng trong nghiên c u là
hai loài cây thu c Acanthopanax trifoliatus (ký hi u ch cái u tiên là G) và A.
gracilistylus (ký hi u là H) ư c thu th p t i 4 t nh mi n B c nư c ta, g m Lào Cai,
Hà Giang, Cao B ng và L ng Sơn (Hình 1).
Ngũ gia bì gai
Ngũ gia bì gai là loài cây b i nh , cao 1 - 7 m, m c d a, cành vươn dài, có
gai (hình 1a). Lá kép chân v t, m c so le, g m 3 - 5 lá chét, thư ng là 3, hình b u
d c ho c thuôn, g c tròn, u nh n, dài 5 - 8 cm, r ng 2 - 4 cm, lá chét gi a l n
hơn, mép khía răng to, gân lá có gai, hai m t nh n, m t trên s m bóng. Cu ng lá kép
dài 4 - 7 cm, có gai. C m hoa m c u cành, g m 3 - 10 tán, có cu ng dài 3 -4
cm. Hoa nh , m u 5, màu tr ng l c, lá ài không rõ, cánh hoa hình tam giác, nh 5,
ch nh m nh, b u h , 2 ô (Hình 1b). Qu m ng, hình c u d t, khi chín có màu en,
có 2 h t. Toàn cây có tinh d u thơm [2].

25
B ng 4. Danh sách m u cây dư c li u ư c thu th p và phân tích trong nghiên c u (các m u ư c
cung c p và phân lo i b i các cán b c a Phòng Tài nguyên, Vi n Dư c li u, B Y t ).
Lo i m u
a i m thu m u
S
lư ng
Ký hi uChi
(h )
Loài
(d ng c i m hình thái)
Acanthopanax
(Araliaceae)
Ngũ gia bì gai
Th tr n Sapa, Lào Cai 4 GLC1-GLC4
B n Khoang, Sapa, Lào Cai 2 GLC5-GLC6
Th ch An, Cao B ng 3 GCB1-GCB3
Tràng nh, L ng Sơn 3 GLS1-GLS3
Văn Lãng, L ng Sơn 2 GLS4-GLS5
Ngũ gia bì hương
Th tr n Sapa, Lào Cai 3 HLC1-HLC3
B n Khoang, Sapa, Lào Cai 5 HLC4-HLC8
Phó B ng, Hà Giang 4 HHG1-HHG4
Illicium(Illiaceae)
H i hương
Na Rì, B c K n 16 IB1 – IB16
Th ch An, Cao B ng 4 IC1 – IC4
Văn Quan, L ng Sơn 10 IL1 – IL10
Bình Liêu, Qu ng Ninh 10 IQ1 – IQ10
H i núi
Bát Xát, Lào Cai 9 N1 – N9
Hoàng Liên Sơn, Lào Cai 7 N10 – N16
Morinda(Rubiaceae)
Ba Kích
(lo i thân có lông, qu t )
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 3 BLT1-BLT3
Ba Kích
(lo i thân có lông, qu r i)
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 4 BLR1-BLR4
Ba Kích
(lo i thân không lông, qu t )
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 3 BKT1-BKT3
Lâm trư ng Tân L c, Hòa Bình 2 BKT4-BKT5
Ba Kích
(lo i thân không lông, qu r i)
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 3 BKR1-BKR3
Lâm trư ng Tân L c, Hòa Bình 2 BKR5-BKR6
Quân Chu, i T , Thái Nguyên 4 BKR7-BKR10
Ba Kích
(lo i thân có lông, ng th i có c
qu t và qu r i)
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 2 BL1-BL2
Ba Kích
(lo i thân không lông, ng th i
có c qu t và qu r i)
Chân M ng, oan Hùng, Phú Th 1 BK1
PanaxL.(Araliaceae)
Sâm Vi t Nam
Trà Linh, Nam Trà My, Qu ng Nam 9 S1 – S9
Ng c Lây, Tumơrông, Kon tum 3 S10 – S12
B n Khoang, Sapa, Lào Cai 2 S13 – S14
Sâm Vũ Di p B n Khoang, Sapa, Lào Cai 8 V1 – V8
D ng trung gian c a Sâm Vũ
Di p và Tam th t hoang
B n Khoang, Sapa, Lào Cai 4 VT1 – VT4
Tam th t hoang B n Khoang, Sapa, Lào Cai 8 T1 – T8
Ngũ gia bì hương là loài cây b i, m c d a, cao vài mét (hình 1c). V thân và
cành có màu xám nh t, có gai thưa. Lá kép chân v t, m c so le ho c t t p thành 2 - 3

26
lá, g m 5 lá chét hình tr ng ho c thuôn, dài 2 - 6 cm, r ng 1 - 3 cm, lá chét gi a to,
nh ng lá chét bên nh d n v phía cu ng, mép có răng cưa và lông c ng, hai m t
nh n, s m bóng m t trên. Cu ng lá dài 2 - 6 cm, nh n. C m hoa thư ng m c ơn
c k lá thành tán, cu ng tán dài 2 - 3,5 cm, hoa nh màu vàng l c (hình 1d). Qu
hình c u d t, khi chín màu en, ch a hai h t.
Hình 1. nh các loài th c v t thu c chi Acanthopanax trong nghiên c u: a-b) B i cây, lá và hoa cây
Ngũ gia bì gai; c-d) B i cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương.
2.1.2. Chi Illicium
ph c v cho nghiên c u chúng tôi ti n hành i u tra và thu th p các m u
th c v t thu c loài H i hương (Illicium verum Hook.f) cùng v i các loài H i núi t i
m t s t nh mi n b c Vi t Nam như B c K n, Cao B ng, L ng Sơn và Qu ng Ninh
(các m u H i hương) và t i Lào Cai (v i các m u H i núi).
Cây H i hương (Illicium verum Hook.f)
Cây H i hương là loài cây thân g , thư ng xanh, cao trung bình t 6 - 8 m.
Cành th ng, nh n, lúc non màu l c nh t, sau chuy n sang nâu xám. Lá m c so le,
nhưng thư ng t nh ng m u trông như m c vòng, hình mác ho c tr ng thuôn [2,
28]. Hoa h i m c riêng l ho c 2 - 3 cái k lá, dài 5 răng, d r ng, mép là vi n
h ng, cánh hoa 5 - 6 u nhau, màu h ng s m d n v phía gi a; nh th t, nh n, ch
nh r ng m p, trung i dày. Hoa h i thu c lo i hoa lư ng tính [28].
Qu c u t o b i 8 i u và r i nhau. Các i hình thoi x p t a tròn thành
hình sao hay hình nan hoa xung quanh m t tr c, khi non màu xanh l c sau chuy n
màu nâu s m, ph n ính cu ng r ng b n và d t, u có mũi nh n ng n, th ng, khi
chín n t m t trên. M i m t i mang m t h t. H t h i thư ng có hình tr ng nh n
bóng, màu nâu ho c nh t [2, 28].
a b c d

27
H i núi
Theo Huy Bích và c ng s (2003), H i núi Vi t Nam là nh ng cây thân
g nh ho c to, cao trung bình t 7 - 14 m, tán lá tròn. Cây H i núi có cành non
m m có v màu l c nh t cành khi già có màu xám tro. Hoa H i núi thư ng m c ơn
c k lá, màu h ng như I. griffithii [2], hay vàng nh t như I. anasitum, có
cu ng thư ng dài hơn cu ng lá. Qu H i núi thư ng có nhi u cánh kho ng t 10
n 13 cánh m c t a tròn, thư ng m ng và không u nhau. Lá H i núi thư ng m c
so le, thư ng t t p 4 - 5 cái, hình mác, dai và nh n, u nh n.
Hình 2. a-b) Hình thái lá và qu cây H i hương (Illicium verum Hook.f); c-d) Hình thái lá và qu
c a cây H i núi (I. anasitum).
2.1.3. Chi Morinda
Cây Ba kích có c i m hình thái cơ b n như sau ( Huy Bích và cs, 2003): d ng
cây th o, s ng lâu năm, thân leo dài hàng mét, ư ng kính thân t 3 - 5 mm và
có nhi u lóng. Lá m c i hình mác ho c b u d c, thuôn nh n, dày và c ng, dài
6 - 14 cm, r ng 2,5 - 6 cm, cu ng ng n, lúc non có lông dày m t dư i, thư ng
t p trung các gân lá và mép lá, m u xanh l c, sau già ít lông hơn m u tr ng
m c; lá kèm m ng, ôm sát vào thân.
T p h p m u cây Ba kích ư c thu th p t i các t nh Phú Th , Thái Nguyên,
Hòa Bình và ư c phân lo i d a trên 2 c i m hình thái chính (hình thái thân có
lông và thân không có lông; hình thái ba kích qu t và qu r i) do các chuyên gia
c a Vi n Dư c Li u xác nh. Kí hi u các m u bao g m hai ch cái th hi n hai c
i m hình thái thân có (không có) lông (L ho c K) và qu t (r i) (T ho c R) kèm
theo s th t c a m u (kí hi u c th B ng 4). Trong s các m u thu th p ư c
có nh ng m u có c c i m hình thái qu t và qu r i trên cùng m t chùm qu .
ti n theo dõi, chúng tôi kí hi u là L và K (B ng 4).
a b c d

28
Hình 3. Hình thái các lo i ki u hình c a cây ba kích s d ng trong nghiên c u: a) qu t ; b) qu
r i; c) thân có lông; d) thân không có lông.
2.1.4. Chi Panax
T ng c ng 34 m u th c v t ã ư c thu th p ho c t các i m tr ng b o t n
ho c m c t nhiên vùng Sapa thu c t nh Lào Cai và Ng c Linh thu c a ph n hai
t nh Qu ng Nam và Kon tum (B ng 4). c bi t, trong s các m u cây thu c thu
th p ư c có m t s cây có ki u hình lá x nông, hi n t i v m t hình thái chưa
th ng nh t x p vào loài Sâm Vũ Di p (có ki u hình thái lá x sâu i n hình) hay
loài Tam th t hoang (có ki u hình thái lá không x ). Trong nghiên c u này, chúng
tôi t m g i nh ng m u th c v t ó là D ng trung gian (TG) Sâm Vũ Di p – Tam
th t hoang.
Sâm Vi t Nam (Sâm Ng c Linh, Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
V m t hình thái, Sâm Vi t Nam là loài cây thân th o, cao t 40 n 80 cm, có
thân r n c m c bò ngang. Thân r phân thành nhi u t nhưng không phân nhánh,
dài ch ng 30 n 40 cm, trên b m t có nhi u v t s o do thân khí sinh l i hàng năm
l i, m t ngoài màu nâu nh t, ru t tr ng ngà, phía cu i ôi khi có c hình c u.
Thân khí sinh c a cây Sâm Vi t Nam m nh, m c th ng, l i hàng năm, mang
t 2 n 4 lá kép chân v t m c vòng. M i lá kép có 5 lá chét hình mác v i mép có
khía răng nh , dài kho ng 10 n 14 cm, r ng t 3 n 5 cm. Ng n thân có c m hoa
m c thành tán ơn, cu ng dài màu l c vàng. Qu Sâm Vi t Nam hình tr ng, màu
sau en, h t màu tr ng hình th n, có vân ( Huy Bích, 2003).
Sâm Vũ Di p (Panax bipinnatifidus Seem.)
V hình thái, Sâm Vũ Di p là cây thân th o, cao t 30 n 50 cm, có thân r
dài và v n v o, phân nhi u t, u r có hình con quay. Thân khí sinh m nh, có
a b c d

29
v ch d c, thư ng ơn c, m c th ng và r ng gi a. Lá kép chân v t g m 2 n 3 lá
m c vòng. Lá chét t 5 n 7, thuôn, dài t 2,5 n 14 cm, r ng t 1,5 n 4 cm,
m t trên có lông. Lá chét x thùy hình lông chim rõ r t, mép khía răng. C m hoa
m c ng n thân thành tán ơn, hoa màu tr ng l c có 5 cánh, 5 nh , b u 2 n 3 ô.
Qu m ng, hình c u hơi d t, màu , có ch m en u, ch a t 2 n 3 h t hình
c u.
Tam th t hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng)
V c i m hình thái, Tam th t hoang là cây thân th o, cao t 25 n 75 cm.
Thân r m p, n m ngang, ít khi phân nhánh, ư ng kính t 1,5 n 3 cm, có nhi u u
l i dính k t nhau. B m t thân r có nhi u s o lõm do các v t thân l i l i. Thân
khí sinh m c th ng, nh n, mang t 1 n 3 lá kép chân v t m c vòng ng n, cu ng
lá t 5 n 10 cm. Lá chét có 5 cái, cu ng ng n, g c cu ng ôi khi có ph n ph hình
tai ho c hình ch , phi n lá chét hình thuôn hay mác, không x thuỳ, dài t 5 n 13
cm, r ng t 2 n 4 cm. Mép lá chét có răng cưa, thư ng có lông gân lá m t trên.
M t s cây non có th có lá chét x thuỳ nông hình lông chim. C m hoa là tán ơn,
m c ng n, hoa màu vàng xanh, 5 lá ài, 5 cánh hoa, 5 nh , b u 2 ô. Qu m ng,
hình c u d t, ư ng kính t 0,6 n 1,2 cm, khi chín có màu . H t l n, dài t 5
n 6 mm, hình g n gi ng h t u tròn, màu xám tr ng, v c ng, có r n h t
(Nguy n T p, 2005).
Hình 4. Các loài th c v t thu c chi Panax trong nghiên c u: a) Sâm Vi t Nam (P. vietnamensis);
b) Sâm Vũ Di p (P. bipinnatididus); c) d ng trung gian gi a Sâm Vũ Di p-Tam th t hoang; d) Tam
th t hoang (P.stipulenatus).
a b c d

30
Hình 5. B n các a phương thu m u dư c li u trong nghiên c u (theo i u tra c a các cán b
Phòng tài nguyên, Vi n Dư c li u, B Y t ).
Trà Linh, Trà My,Qu ng Nam
Ngok Lây, Tumorong, Kon
Tum
B n Khoang, Sapa, Lào Cai
Th tr n Sapa, Lào Cai
Th ch An, Cao B ng
Tràng nh, L ng Sơn
Văn Lãng, L ng Sơn
Bát Xát, Lào Cai
Hoàng Liên Sơn, Lào Cai
Na Rì, B c C n
Văn Quan, L ng Sơn
Bình Liêu, Qu ng Ninh
Tân L c, Hòa Bình
oan Hùng, Phú Th
i T , Thái Nguyên
SƠ THU M U
a i m thu m u chi Acanthopanax
a i m thu m u chi Illicium
a i m thu m u chi Morinda
a i m thu m u chi Panax
Thái Nguyên
Phú Th
Hòa Bình
Qu ng Nam
Kon Tum
Cao B ng
B c C n
L ng Sơn
Qu ng NinhHÀ N I
Lào Cai

31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.2.1. Tách chi t ADN t ng s b ng phương pháp mini-CTAB c i ti n
thu ADN t ng s (ADNts), chúng tôi ã ti n hành tách chi t ADNts t các
m u th c v t theo phương pháp mini-CTAB (do Saghai-Maroof và c ng s ưa ra
năm 1984) có c i ti n.
Cơ s lý thuy t
Phương pháp này s d ng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) –
m t ch t t y cation hình thành ph c h p v i nh ng polysaccharide, protein,
polyphenol, …Ph c h p này sau ó ư c tách ra kh i dung d ch tách chi t b ng
h n h p chloroform – isoamyl alcohol, b ng cách hình thành 2 pha: pha th nh t là
dung d ch s ch phía trên có ch a ADN, pha th hai c hơn dư i ch a
chloroform và t t c nh ng thành ph n c n lo i b khác (polysaccharide,
protein,…). Sau khi ly tâm, thu ư c ADN. Thông thư ng quy trình ly trích ADN
th c v t g m 3 giai o n:
• Giai o n 1: Phá v màng t bào và màng nhân. T bào lá ư c nghi n v i
d ch trích EB (extraction buffer) phá v màng t bào, gi i phóng các thành ph n
có trong t bào ra ngoài môi trư ng d ch trích.
• Giai o n 2: Làm bi n tính protein, lo i b protein và các thành ph n h u
cơ khác (polysaccharide, polyphenol, lipid,…).
• Giai o n 3: T a ADN b ng isopropanol hay ethanol 100 %, thư ng t a
b ng isopropanol l nh trư c, sau ó ti p t c t a b ng ethanol 100 % k t h p v i
mu i.
Quy trình th c hi n
Quy trình tách chi t ư c mô t ng n g n như sau:
1. Cân 200 mg m u ã nghi n thành d ng b t m n trong nitơ l ng vào ng
Eppendorf 1,5 ml
2. B sung 900 µl dung d ch CTAB 2%, tr n u b ng cách o ng nh nhàng
và 65о
C trong 90 phút
3. Làm ngu i v nhi t phòng, b sung 450 µl chloroform/isoamylalcohol (t

32
l 24:1 v/v), o nh hai u ng tr n u và nhi t phòng trong 10
phút
4. Ly tâm 4о
C trong 10 phút v i t c 13.000 – 14.000 vòng/phút
5. Dùng pipet hút ph n d ch n i bên trên chuy n sang m t ng Eppendorf s ch
6. B sung 600 µl iso-propanol, tr n u b ng cách o u ng nh nhàng,
trong t l nh t 3 - 12 gi .
7. Ly tâm nhi t phòng trong 10 phút v i t c 13.000 - 14.000 vòng/phút
8. b ph n d ch phía trên và r a ADN t a b ng 800 µl dung d ch Wash I
trong 5 phút
9. Ly tâm thu l i t a 13.000 vòng/phút trong 5 phút nhi t phòng
10. R a ADN t a b ng 100 µl dung d ch Wash II (ethanol 70%) trong 5 phút
11. Ly tâm thu l i t a 10.000 vòng/phút trong 5 phút nhi t phòng, t a
khô t nhiên
12. Hoà tan ADN k t t a trong 100 µl m TE, b o qu n 4о
C
Ki m tra ch t lư ng ADNts b ng phương pháp i n di và quang ph
V t li u tách chi t ADNts là thân, r và lá c a các m u ã ư c nghi n
m n. Chúng tôi ã ti n hành tách chi t riêng r các ph n c a m u th c v t và so
sánh hàm lư ng ADN thu ư c b ng phương pháp i n di trên gel agarose 0,8%
(0,8 g agarose + 100 ml TBE 1X) 60 - 80 V trong 30 phút xác nh b ph n
cho hi u su t thu ADN cao nh t s d ng cho các thí nghi m tách chi t ti p theo.
N ng và kích thư c tương i c a s n ph m ADNts ư c xác nh b ng cách so
sánh v i marker Lambda/HindIII.
Ti p ó, s n ph m ADNts ư c pha loãng 100 l n (10 µl ADNts + 990 µl
ddH2O) cho thí nghi m o m t quang ph (OD – Optical Density) b ng máy o
quang ph Biomate các bư c sóng 260 và 280 nm. M c tinh s ch c a s n ph m
(m c l n ARN và protein) ư c xác nh b ng t s quang ph h p th
OD260/OD280. N ng ADN c a dung d ch g c ư c tính theo công th c 1,0 OD260
= 50 ng/µl.

33
2.2.2. Phân tích di truy n b ng k thu t RAPD-PCR
Cơ s lý thuy t
PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp t ng h p lư ng l n ADN
in vitro trên cơ s m u khuôn. Quá trình t ng h p ADN kéo dài m i d a trên
nguyên t c b t c p c hi u c a các o n ADN có trình t b sung và kh năng kéo
dài chu i c a enzym b n nhi t (ph bi n là Taq polymerase - phân l p t vi khu n
ch u nhi t Thermus aquaticus). PCR g m m t chu i nhi u chu kỳ, m i chu kỳ có ba
bư c: bi n tính, g n m i và kéo dài chu i. K t qu , sau kho ng 2 - 3 gi , lư ng
ADN s ư c nhân b n lên kho ng 200 - 500 l n.
K thu t RAPD-PCR ra i ngay sau khi ph n ng PCR ư c phát tri n, là
k thu t nhân b n ADN h gen s d ng các m i t ng h p ng n (ph bi n nh t là 10
nucleotide) có trình t ng u nhiên trong i u ki n nhi t g n m i th p. i m khác
bi t rõ nét nh t c a k thu t RAPD-PCR so v i các k thu t PCR truy n th ng là
ch có m t trình t oligonucleotide ư c s d ng làm m i trong m t ph n ng, và
nh ng hi u bi t v các o n gen ư c nhân lên là không c n thi t.
V i nhi t g n m i phù h p, các m i oligonucleotide trình t ng u nhiên
s g n vào m t vài v trí có trình t b sung trên s i khuôn ADN và cho s n ph m
nhân b n n u các v trí g n m i n m trong ph m vi có th nhân b n ư c. S khác
bi t v trình t nucleotide c a các khuôn ADN khác nhau ư c th hi n s có m t
hay v ng m t c a các băng nhân b n.
Quy trình th c hi n
Ph n ng RAPD-PCR ư c ti n hành trên t t c các m u v i t ng c ng 40
m i ng u nhiêu 10 nucleotide (Operon Technologies, M ) bao g m OPA-1 n
OPA-20; OPC-1 n OPC-20. Thành ph n và quy trình nhi t c a ph n ng RAPD-
PCR ư c trình bày trong B ng 5.

34
B ng 5. Thành ph n (B ng bên trái) và quy trình nhi t (B ng bên ph i) c a ph n ng RAPD-
PCR
2.2.3. i n di ADN trên gel agarose
S n ph m nhân b n ư c phân tích trên gel i n di agarose 1 – 1,5% ch y
hi u i n th 60 – 80 V trong 45 phút b ng phương pháp nhu m hi n hình v i
ethidium bromide. Kích thư c tương i c a các băng nhân b n ư c so sánh v i
marker 1 kb (Fermentas, 1 kb ADN Ladder).
Cơ s lý thuy t
Trong môi trư ng có pH trung tính, ADN mang i n tích âm. Do ó, khi ư c
t trong m t i n trư ng u, ADN s di chuy n t c c âm sang c c dương. Trên
môi trư ng ch t giá agarose, các o n ADN có kích thư c khác nhau s di chuy n
v i t c khác nhau ( o n ADN có kích thư c l n hơn s di chuy n ch m hơn
o n ADN có kích thư c nh hơn) và s tách bi t nhau trong quá trình ch y.
Quy trình
Chu n b gel agarose
- Cân b t agarose r i hoà tan vào m TBE 1X sao cho ư c n ng 0,8%.
- un sôi d ch agarose cho n khi tan h t và d ch ngu i n kho ng 50o
C
thì vào khuôn có cài s n răng lư c.
- Gel s ông và n nh hoàn toàn trong kho ng 30 phút.
- Rút lư c nh nhàng ra kh i khuôn, t gel vào b i n di, m TBE 1X
t i khi ng p m t gel.
Tra m u ADN vào gi ng
Thành ph n ph n ng Th tích (µl)
ddH2O 16,3
ADN khuôn 1,0
10x Taq buffer 2,5
2 mM dNTPs 2,5
M i (10-mer Operon) 2,0
5 u/µl Taq polymerase 0,7
T ng th tích ph n ng: 25 µl
Nhi t (о
C) Th i gian S chu kỳ
94 4’ 1
94 1’
4037 1’
72 2’
72 7’ 1
4 ∞ 1

35
- Tùy thu c vào m c ích i n di khác nhau mà ta có th s d ng n ng
ADN cao ho c th p.
- Tra m u sau khi ã m TBE 1X vào khuôn i n di cho ng p gel. M u
ư c tr n v i loading dye 6X v i t l m u: loading dye là 5:1 và ư c ưa vào
gi ng. Ch y i n di b ng dòng i n m t chi u v i hi u i n th 75 V trong kho ng
45 phút.
- Trong quá trình ch y, c n quan sát s di chuy n c a bromophenol bi t
lúc nào c n d ng i n di.
Nhu m ADN b ng ethidium bromide: Quá trình i n di k t thúc khi băng màu
bromopenol ch y ư c 2/3 b n gel agarose, b n gel ư c l y ra kh i khuôn và
ngâm vào dung d ch ethidium bromide n ng 0,5 µg/ml trong kho ng 15 phút r i
r a l i b ng nư c.
Quan sát và ch p nh: B n gel sau khi nhu m ethidium bromide ư c quan sát
dư i ánh sáng t ngo i v i bư c sóng λ = 302 nm.
2.2.4. D ng cây quan h di truy n b ng ph n m m NTSYSpc 2.02h
V i s phát tri n c a sinh h c phân t , ngư i ta có xu hư ng phân nhóm a
d ng di truy n m c phân t . Như v y, s chính xác s cao hơn r t nhi u so v i
phương pháp truy n th ng d a trên tính tr ng hình thái h c. Ngư i ta khai thác
nh ng kh năng phân tích r t nhanh nh y c a máy tính (computer) v i nhi u ph n
m m chuyên dùng, trong ó NTSYS là ph n m m tương i ph bi n. Trong
nghiên c u này chúng tôi s d ng phiên b n ph n m m NTSYSpc 2.02h
(Numerical Taxonomy System Applied Biotstatistics, Setauket, New York).
Các k t qu i n di s n ph m RAPD-PCR ư c chuy n thành d ng ma tr n
nh phân. T ma tr n nh phân nói trên, s d ng h s tương quan DICE (SD), ma
tr n tương ng theo t ng c p ư c xây d ng. H s SD ư c tính b ng hai l n s
băng chung c a hai m u chia cho t ng s băng thu ư c c a hai m u ó (S = 2NAB /
(NA + NB)). Như v y, h s thu ư c là 1 có nghĩa là hai m u hoàn toàn gi ng nhau,
trong khi 0 có nghĩa là hai m u không có i m chung nào. Cu i cùng, cây quan h

36
di truy n gi a các m u ư c xây d ng theo phương pháp UPGMA (Unweighted
Pair-Group Method with Arithmetical Averages).
Theo n i dung này, chúng ta cho i m 1 khi có băng th hi n, và i m 0 khi
băng không th hi n trong i n di.
Phân tích ma tr n tương ng, ma tr n kho ng cách (similarity / distance matrix)
Các giá tr tương ng và kho ng cách là nh ng giá tr ư c oán v m t s
lư ng nh m mô t s g n gũi và kho ng cách di truy n gi a hai c p ơn v m c
tiêu. Giá tr tương ng bi n thiên t 0 n 1. Kho ng cách gi m khi giá tr tương
ng tăng. Kho ng cách (distances) còn ư c dùng v i thu t ng “dissimilarities”
Sokal và Sneath (1963) mô t nhi u cách tính toán kho ng cách và m c gi ng
nhau gi a hai ơn v m c tiêu. Khi giá tr d ng nh phân (binary), nghĩa là 1 (có)
và 0 (không có), chúng ta ưa chúng v B ng hai chi u như sau v i 2 ơn v m c
tiêu là i và j.
ơn v m c tiêu i
1 0
ơn v
m c tiêu j
1 a b m = a + d
u = b+ c
n = m + u0 c d
Trong ó, m là s d li u tương ng, u là s d li u không tương ng, n là t ng s
băng ghi nh n ư c.
Giá tr kho ng cách
Giá tr kho ng cách là l ch c a nh ng ch s bi u th m c gi ng nhau.
Ch s tương ng S (similarity) bi n thiên t 0 n 1 có th ư c chuy n i thành
giá tr d (distance) theo công th c
d = 1 - S
Chúng ta có th tính toán b ng tay chuy n i ch s Dice thành ch s
kho ng cách, nhưng v i ph n m m chuyên dùng NTSYSpc 2.02h, chúng ta s d
dàng hơn r t nhi u có k t qu v i nhi u c p ơn v m c tiêu.

37
X p nhóm b ng phương pháp UPGMA
Phân tích nhóm (cluster analysis) th c s là phương pháp s p x p các gi ng
thành nh ng c m nhóm khác nhau trên cơ s m c gi ng nhau theo qui ư c
(ngư i ta còn g i v i thu t ng agglomerative clustering). Nó ư c th c hi n theo
qui trình tiêu chu n, nên ngư i ta còn g i ó là “greedy algorithm”. Qui trình theo
các bư c ti n hành như sau:
• Tìm các c p (i, j) có giá tr kho ng cách nh nh t (ho c gi ng nhau nh t)
• Nh p các c p này l i thành m t nhóm (cluster)
• T o ra nhóm l n hơn tương ng v i nhóm m i sao cho các c p (i, j) m i
tương thích v i giá tr m c gi ng nhau
• L p l i qui trình
M t trong nh ng phương pháp ơn gi n nh t là phương pháp tính kho ng
cách trung bình v i giá tr s i s UPGMA ( ư c vi t t t t ch unweighted pair-
group method with arithmetic mean)
Cách tính b ng tay
• Tìm giá tr kho ng cách nh nh t trong ma tr n kho ng cách
• X p nhóm 2 ơn v m c tiêu (isolate) này l i v i nhau, theo giá tr kho ng
cách c th , ghi gi a hai i m
• Xây d ng ma tr n kho ng cách m i ph i h p gi a hai isolate g n nh t trong
m t nhóm riêng. Kho ng cách gi a hai nhóm m i này và m t isolate khác s ư c
ghi nh n v i giá tr kho ng cách trung bình c a isolate m i v i nh ng isolate trong
cluster
• L p l i qui trình cho n h t.

Chng 3. K t qu - Th o lu n NCD LU N VĂN TH C SĨ
38
Chương 3. K T QU VÀ TH O LU N
3.1. K T QU TÁCH CHI T ADN T NG S
ADN t ng s ư c tách chi t theo phương pháp mini-CTAB có x lý v i
RNAse lo i b ARN theo quy trình c a Saghai-Maroof và cs (1997) có c i ti n.
ti n hành các ph n ng phân tích tính a d ng di truy n gi a các qu n th m u
nghiên c u, m c nguyên v n c a ADN khuôn dùng cho ph n ng nhân b n có
vai trò quan tr ng. S t, gãy ADN khuôn có th gây ra hi n tư ng a hình gi ,
d n n s sai l ch trong k t qu phân tích a hình. Do v y, t t c các m u ADNts
u ư c ki m tra b ng phương pháp i n di như ã mô t trong ph n Phương pháp
nghiên c u trên.
ki m tra tinh s ch c a các m u ADN thu ư c, chúng tôi ã ti n hành
o m t quang ph (OD) c a t t c các m u. Hai bư c sóng ư c l a ch n là 260
nm và 280 nm, tương ng v i hai vùng h p th c c i c a ADN s i ôi và ARN
ho c protein.
3.1.1. K t qu tách chi t ADNts t các m u th c v t thu c chi Acanthopanax
T các mô lá non c a t p h p m u th c v t thu c chi Acanthopanax (g m 2
loài: Ngũ gia bì gai và Ngũ già bì hương), chúng tôi ã tách chi t thành công ADN
t ng s . ADNts ã thu ư c t 26 m u th c v t này (trong ó 14 m u thu c loài A.
trifoliatus và 12 m u thu c loài A. gracilistylus) u m b o m c nguyên v n
và tinh s ch, áp ng ư c các yêu c u dành cho vi c phân tích tính a hình di
truy n trong nh ng thí nghi m ti p theo.
3.1.2. K t qu tách chi t ADNts t các m u th c v t thu c chi Illicium
T t p h p y nh t các m u H i hương hi n có Vi t Nam hi n cùng các
m u H i núi thu th p trong nghiên c u, chúng tôi ti n hành tách chi t ADNts c a
các m u th c v t thu c chi Illicium t các b ph n lá, thân, qu , h t và ch i non
theo phương pháp mini-CTAB có c i ti n. K t qu chúng tôi thu ư c ADNts duy
nh t t các ch i non (Hình 6). Các thí nghi m tách chi t ADNts t các b ph n khác
c a cây u không t yêu c u do g p ph i khó khăn trong quá trình lo i b các t p

39
ch t. Nhìn chung, d ch chi t ADN m u H i hương t các ph n mô khác thư ng có
nh t cao.
Trong t ng s 56 m u th c v t thu c chi h i thu th p ư c ch có 50 m u cho
s n ph m ADNts tinh s ch ( t t l 89,29%) trong ó có 39 m u thu c loài
H i hương (tr m u IB1) và 11 m u thu c loài H i núi (tr các m u N-7, -8, -9, -
13, và -15). 50 m u ã tách chi t thành công ADNts k trên ư c s d ng trong
nh ng thí nghi m ti p theo.
3.1.3. K t qu tách chi t ADNts t cây Ba kích (Morinda officinalis How)
Khi s d ng phương pháp mini-CTAB trên m u r c và các r nh c a cây
Ba kích, chúng tôi nh n th y r ng không còn hi n tư ng l n ch t nh y trong quá
trình tách chi t. Chúng tôi quy t nh s d ng phương pháp mini-CTAB có c i
ti n trên m u v t là r nh và r c c a cây Ba kích. K t qu chúng tôi ã thu
ư c ADN t ng s 25 m u ADN thu th p ư c v i hàm lư ng ADN t
tinh s ch cho các nghiên c u ti p theo. Khi tách chi t ADN các ph n mô khác
nhau c a m u r , hàm lư ng ADN thu ư c các m u r c th p hơn và ch t
ư c kho ng b ng 1/10 so v i hàm lư ng ADN t m u r nh . Song do s lư ng
các r nh thu nh n ư c các m u ít (có m u không có) nên chúng tôi s d ng
c hai ph n r nh và r c thu ADN t ng s . i v i các m u r c , chúng
tôi ti n hành tách chi t nhi u l n sau ó g p chung l i thu ư c hàm lư ng
ADN cao hơn cho các phân tích ti p theo.
3.1.4. K t qu tách chi t ADNts các m u th c v t thu c chi Panax
Chúng tôi ã tách chi t thành công ADNts t t t c 34 m u thu th p ư c c a
ba loài Sâm Vi t Nam, Sâm Vũ Di p và Tam th t hoang. Trong thí nghi m xác nh
ph n mô t t nh t tách chi t ADNts, chúng tôi thu ư c k t qu là so v i thân hay
r , mô lá là ph n cho hi u su t tách chi t ADN cao nh t trong khi hàm lư ng ARN
tăng không áng k (Hình 6). Do v y, trong t t c các thí nghi m tách chi t ADN
ti p theo, chúng tôi ã quy t nh s d ng mô lá làm v t li u th c v t.
Dư i ây là hình nh minh h a nh i n di ADN t ng s c a m t s m u dư c
li u ư c thu th p và phân tích trong nghiên c u này (Hình 7). T p h p ADNts thu

40
ư c t các b ph n mô thích h p c a các m u cây dư c li u trong nghiên c u u
th hi n tinh s ch áp ng cho các k thu t phân tích a hình di truy n ti p
theo.
Hình 6. ADNts tách chi t t các ph n mô khác nhau: hình bên trái - ADNts t các m u cây H i
hương (I); hình bên ph i - ADNts t các ph n mô khác nhau cây sâm (V). M: thang ADN chu n.
Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng 4.
Hình 7. nh i n di ADN t ng s các m u dư c li u ư c thu th p trong nghiên c u: a) m u
các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) m u các loài H i hương (I) và H i núi
(N); c) m u các loài Ba kích (K); d) m u các loài Sâm Vi t Nam (S), Sâm Vũ Di p (V), Tam
th t hoang (T) và d ng trung gian Sâm Vũ Di p-Tam th t hoang (VT). M: thang ADN chu n.
Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng 4.
M IB2 IB4 IC1 IC4 IL1 IL4 IQ1 IQ4 N1 N2 N3 N4 N10 N12 N14 N16 M
M LT1 LT2 LT3 LR1 LR2 LR3 L1 K1 KT1 KT2 KT3 KR1 KR2 KR3 KR4 M
M S1 S5 S10 S14 V1 V3 V5 V7 VT1 VT4 T1 T3 T5 T7 M
d
c
b
a

41
ã có nhi u quy trình ư c công b tách chi t ADN t th c v t (bao g m
trong ó là các loài dư c li u), tuy nhiên nh ng quy trình này thư ng không
ư c ti n hành m t cách nh t quán các lo i mô th c v t khác nhau, ó là do
nh ng b ph n mô ch a nhi u các h p ch t th sinh như polysaccharide và các
h p ch t phenol. Chính nh ng ch t này có th gây nh hư ng tr c ti p t i ch t
lư ng cũng như hi u su t thu axit nucleic (bao g m ADN và ARN) ư c tách
chi t. Th c ch t là các loài khác nhau có xu hư ng ch a thành ph n các h p ch t
th c p khác nhau nên có th nh hư ng n hi u su t tách chi t ADN h gen.
T nh ng k t qu trên ây, chúng tôi nh n th y r ng, quy trình mini-CTAB
có c i ti n ư c áp d ng thành công trong vi c tách chi t ADNts t t t c các
m u dư c li u trong nghiên c u này. Nh ng k t qu thu ư c t nh ng thí
nghi m xác nh ph n mô t t nh t tách chi t ADNts các loài dư c li u trong
nghiên c u là nh ng k t qu r t có ý nghĩa. ây là nh ng k t qu g i m cho
nh ng nghiên c u v sau này có th l a ch n úng b ph n phù h p nh t có th
thu ư c hàm lư ng ADNts có hi u su t cao nh t ph c v cho các nghiên c u v
ADN trên các i tư ng dư c li u này.
3.2. K T QU PHÂN TÍCH TÍNH A D NG DI TRUY N C A CÁC LOÀI
CÂY THU C TRONG NGHIÊN C U
Trong s 40 m i RAPD-PCR ư c s d ng trong nghiên c u, s m i cho s n
ph m ADN nhân b n khác nhau các nhóm loài khác nhau. i v i nhóm loài
thu c chi Panax, có 13 m i cho s n ph m ADN nhân b n rõ nét nh t, g m có OPA-
1, -2, -3, -7, -8, -12, -14 và OPC-1, -6, -12, -15, -16, -17. i v i các loài thu c chi
Acanthopanax có 16 m i, g m OPA-1, -4, -5, -9, -10, -12, -13, -15, -17 và OPC-1, -
3, -5, -7, -9, -19, -20. Trong khi ó, v i các loài thu c chi Illicium, có 15 m i cho
s n ph m ADN nhân b n rõ nét, bao g m OPA-6, -7, -10, -14, 16, -17, -19 và OPC-
1, - 2, -4, -7, -9, -10, -11, -12, -18, -20. i v i loài Ba kích (chi Morinda), có 12
m i cho s n ph m ADN nhân b n rõ nét nh t ư c l a ch n phân tích g m
OPA-1, -7, -12, -13, -15, -17, -19, -20 và OPC-1, -3, -12, -20.

42
3.2.1. S a d ng di truy n gi a các loài cây thu c thu c chi Acanthopanax
K t qu phân tích RAPD-PCR trên 14 m u Acanthopanax trifoliatus và 12
m u A. gracilistylus phân tích v i 16 m i ng u nhiên k trên cho th y các t p h p
cá th c a hai loài A. trifoliatus và A. gracilistylus Vi t Nam có m c a hình di
truy n tương i cao. T ng s băng RAPD nhân b n ư c là 157 băng, trong ó có
126 băng xu t hi n loài A. trifoliatus và 125 băng xu t hi n loài A. gracilistylus,
trung bình m i m i nhân b n ư c 7 - 8 băng i v i m i m i khi phân tích c hai
loài.
Trong 16 m i ng u nhiên s d ng phân tích, a s các m i cho k t qu th
hi n tính a hình cao, c bi t là các m i OPC9, OPC20, OPA17, OPA10, OPC19.
Riêng v i m i OPC9, toàn b 14 m u thu c loài A. trifoliatus và 12 m u thu c loài
A. gracilistylus u cho ph i n di s n ph m PCR khác nhau, th hi n s a hình
cao c a các m u, và ây cũng là m i cho s băng a hình cao nh t (19 băng xét trên
c 2 loài). S li u v các băng a hình thu ư c t m i m i B ng 6 và ph i n di
ư c minh h a trên hình 8a.
B ng 6. S băng RAPD a hình thu ư c t các m u qu n th loài Acanthopanax trifoliatus và A.
gracilistylus phân tích v i 16 m i ng u nhiên.
M i
S băng a hình/T ng s băng m i loài
M i
S băng a hình/T ng s băng m i loài
Ngũ gia bì gai
(A. trifoliatus)
(A. gracilistylus)
Ngũ gia bì gai
(A. trifoliatus)
(A. gracilistylus)
A1 4/8 6/10 A17 13/14 14/15
A4 6/9 2/6 C1 1/2 4/6
A5 0/2 0/2 C3 1/3 4/6
A9 7/8 3/6 C5 5/8 7/8
A10 7/8 7/9 C7 3/5 7/9
A12 3/6 5/8 C9 17/17 10/10
A13 7/8 4/7 C19 9/11 6/8
A15 5/10 7/10 C20 7/7 4/5
Tuy nhiên có m t s m i th hi n a hình không cao. Ch ng h n như m i
OPA5 bi u hi n tính ng hình 100% t t c các m u nghiên c u thu c c hai loài.
ây cũng là m i cho s băng RAPD-PCR ít nh t trong s 16 m i phân tích. V i t t
c các m u ch thu ư c 2 băng ng hình (hình 8b).

43
Hình 8. Hình nh i n di m t s s n ph m RAPD-PCR các m u Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì
hương (H) trong nghiên c u. Hình bên ph i) S n ph m i n di v i m i OPC9; Hình bên trái) S n
ph m i n di v i m i OPA5. Ngu n g c và c i m các m u nêu B ng 4. M: thang ADN chu n.
T nh ng s li u thu ư c qua x lý b ng ph n m m NTSYSpc 2.02h, chúng
tôi ã xác nh ư c h s tương ng di truy n và xây d ng ư c sơ hình cây
v quan h di truy n gi a 14 m u qu n th loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) và 12
m u còn l i thu c loài Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus). S li u và k t qu phân
tích chi ti t ư c trình bày trên hình 9.
T sơ hình cây v quan h di truy n gi a các m u thu c hai loài (hình 9),
chúng ta có th d dàng nh n th y s khác bi t khá rõ r t v c u trúc di truy n gi a
hai loài Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai. K t qu là, các m u thu c hai loài tách
thành hai nhóm rõ r t, v i h s kho ng cách di truy n gi a chúng là kho ng 0,5.
3.2.1.1. Phân tích a hình loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus)
Phân tích s băng a hình
Phân tích v i 16 m i ng u nhiên 14 m u A. trifoliatus, chúng tôi thu ư c
95 băng a hình trong t ng s 126 băng nhân b n ư c. T c là s băng a hình
chi m 75,4% t ng s băng (chi ti t s băng a hình thu ư c v i m i m i ư c
trình bày t i B ng 6).

44
Hình9.SơhìnhcâyvquanhditruyngiacácmuthuchailoàicâythucNgũgiabìgai(Acanthopanaxtrifoliatus)vàNgũgiabì
hương(A.gracilistylus)thuthpưcVitNamtrêncơsphântíchchthRAPD-PCR.Ngũgiabìgai(G),Ngũgiabìhương(H).Ngun
gcvàcimcacácmunêuBng4.

Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu

Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu

Similar to Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu (20)

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn: Phân tích đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu