PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Nhận file miễn phí vui lòng nhắn tin zalo 0777.149.703 Wed VietthueOntime

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
---------------------------
NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 6042020
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
---------------------------
NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 6042020
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017

3. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày … tháng … năm …
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)
TT Họ và tên Chức danh Hội đồng
1 GS.TSKH.Nguyễn Trọng Cẩn Chủ tịch
2 PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng Phản biện 1
3 TS. Nguyễn Hoàng Dũng Phản biện 2
4 TS. Trịnh Thị Lan Anh Ủy viên
5 TS.Nguyễn Ngọc Hồng Ủy viên, Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được
sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

4. TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Trần Thiện Đức Giới tính:Nam
Ngày, tháng, năm sinh:13/07/1992 Nơi sinh:TP.HCM
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV:1541880003
I- Tên đề tài:
Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin
deacetylase và đánh giá khả năng ứng dụng trong sản xuất chitosan từ chitin của các
chủng vi sinh vật.
II- Nhiệm vụ và nội dung:
- Thu thập mẫu phân lập
- Tăng sinh chọn lọc VSV
- Phân lập chủng VSV thuần khiết từ các nguồn mẫu
- Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập
- Khảo sát VSV sàng lọc và định danh
- Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men cơ
bản nuối cấy các chủng sàng lọc
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan và
chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan)
- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.
- Tăng hiệu suất thu hồi chitosan bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.

5. - Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với
chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại
- Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2016
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2016
V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS. Nguyễn Hoài Hương
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN
NGÀNH
(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

6. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
TP.HCM, ngày……tháng……năm 2017
Học viên thực hiện Luận văn

7. ii
LỜI CÁM ƠN
Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô trong trường Đại học Công
Nghệ TP.HCM, thầy cô ngành Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt
kinh nghiệm kiến thức, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và tạo
điều kiện thực hiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt tôi xin cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành tốt luận văn.
Xin được gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến – Trung tâm phân tích kỹ
thuật cao Sài Gòn STC cùng sinh viên Đỗ Thị Phương Trinh đã giúp tôi hoàn thành
kết quả chạy điện di các mẫu enzyme.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng phản biện đã
dành thời gian đọc và nhận xét cho luận văn này để tôi có thể hoàn thiện nó tốt hơn.
Tôi xin chúc các thầy cô được nhiều sức khỏe và luôn thành công trong
cuộc sống.
Học viên thực hiện Luận văn
Nguyễn Trần Thiện Đức

8. iii
TÓM TẮT
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
CÁC CHỦNG NÀY TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN
Trong nghiên cứu này, 26 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất
thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Vũng Tàu, Cần Giờ, trong đó chỉ có 3 chủng
(CD1, CD5, CD10) cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase
được định danh là Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens và B. siamensis.
Môi trường sử dụng lên men các chủng trên chuyển hóa chitin huyền phù
thành chitosan chứa nguồn C là tinh bột 2%, nguồn N là cao nấm men 1%, nguồn
khoáng là MgSO4 0,04% được bổ sung NaCl 0,1%. Hiệu suất thu hồi chitosan khi
sử dụng acid acetic 2% hòa tan chitosan lần lượt là 73%, 52%, 49% tương ứng với
các chủng CD1, CD5 và CD10. Độ hòa tan, độ nhớt, độ deacetyl hóa và khối lượng
phân tử, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với
chitosan hóa học và chitosan thương mại.

9. iv
ABSTRACT
ISOLATION AND SCREENING OF CHITIN DEACETYLASE PRODUCING
MICROORGANISMS AND APPLICATION POTENTIAL IN CHITOSAN
PRODUCTION FROM CHITIN.
In this study, 26 bacterial strains were isolated from soil samples, collected
from different locations in Ba Ria Vung Tau Province, among which only three
strains namely CD1, CD5 and CD10 showed their chitin deacetylase activity and
were identified as Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens and B. siamensis,
respectively.
The culture medium for above – mentioned strains to convert colloidal chitin
to chitosan contained 2% soluble starch as the carbon source, 1% yeast extract as
the nitrogen source and several minerals such as 0,04% MgSO4 and 0,1% NaCl.
Chitosan recovery yields by using 2% acetic acid to dissolve chitosan were 73%,
52%, 49% for CD1, CD5 and CD10 respectively. Chitosan obtained by biological
method displayed solubility, viscosity, deacetylation degree, molecular weight and
antibacterial activity in the same range as this obtained by chemical method as well
as the commercial one.

10. v
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN......................................................................................................................ii
TÓM TẮT............................................................................................................................iii
ABSTRACT .......................................................................................................................iv
MỤC LỤC........................................................................................... .......................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......... ..............................................................ix
DANH MỤC CÁC BẢNG................... ......................................................................x
DANH MỤC CÁC HÌNH..........................................................................................xi
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1
2. Tính cấp thiết của đề tài.................... .............................................................1
3. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu.................. ...................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu................................................................................3
6. Các kết quả đạt được của đề tài......................................................................3
7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ....... ....................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................5
1.1. Tổng quan về chitin..............................................................................................5
1.1.1. Giới thiệu..................................................................................................5
1.1.2. Tính chất vật lý.........................................................................................5
1.1.3. Tính chất hóa học........... ..........................................................................6
1.1.4. Tính chất sinh học.......... ..........................................................................6
1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận.......... ..........................................................7
1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới. ............7
1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam ...............................7
1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới.................................8
1.1.7. Ứng dụng..................................................................................................9
1.2. Tổng quan về chitosan........... ..............................................................................9

11. vi
1.2.1. Giới thiệu..................................................................................................9
1.2.2. Tính chất hóa lý......................................................................................10
1.2.3. Tính chất sinh học.................. ................................................................10
1.2.4. Các tính chất của chitosan......................................................................14
1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa.......................................................................14
1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan........................................................14
1.2.4.3. Độ nhớt..................... ......................................................................11
1.2.4.4. Tính tan........................ ...................................................................11
1.2.4.5. Tỷ trọng...........................................................................................12
1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo.......12
1.2.4.7. Khả năng tạo màng............. ............................................................12
1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan......... .............................................12
1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận...... ............................................................14
1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan..................................................................14
1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa học..15
1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học.........16
1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới.... .......18
1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam.......... ...................18
1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới...............................19
1.2.8. Ứng dụng................................................................................................19
1.3. Tổng quan về enzyme chitin deacetylase...........................................................20
1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase.....................................................20
1.3.2. Cơ chế xúc tác................ ........................................................................20
1.3.3. Phướng pháp xác định hoạt tính.............................................................22
1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme...... .....................................................22
1.3.5. Ứng dụng................................................................................................23
1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylas........................................23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................25
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài...............................................................25
2.1.1. Thời gian............. ...................................................................................25

12. vii
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu............. .................................................................25
2.2. Vật liệu nghiên cứu.................. ..........................................................................25
2.2.1. Nguồn mẫu.......... ...................................................................................25
2.2.2. Hóa chất..................................................................................................27
2.2.3. Thiết bị – dụng cụ...................................................................................27
2.2.3.1. Thiết bị............................................................................................27
2.2.3.2. Dụng cụ...........................................................................................28
2.3. Phương pháp luận...............................................................................................28
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................28
2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase30
2.4.1.1. Thu thập mẫu................... ...............................................................30
2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết................... ........................31
2.4.1.3. Sàng lọc...........................................................................................31
2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc....................... .................................32
2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng
sàng lọc.............................................................................................................36
2.5. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................48
3.1. Phân lập và sang lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin
deacetylase....... .........................................................................................................48
3.1.1. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết...................................................48
3.1.2. Sàng lọc........... .......................................................................................48
3.1.3. Định danh sơ bộ các chủng sàng lọc............ ..........................................49
3.1.3.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................49
3.1.3.2. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi
khuẩn............................................................................................................49
3.1.4. Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân
tử.......................................................................................................................53
3.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng
lọc................................... ..........................................................................................53

13. viii
3.2.1. Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên
men chọn cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc.................................................53
3.2.1.1. Định tính sự hiện diện của chitosan................................................54
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến hiệu suất thu hồi chitosan............55
3.2.2.1. Nguồn Carbon.................................................................................56
3.2.2.2. Nguồn Nitơ........................ .............................................................57
3.2.2.3. Thành phần khoáng.........................................................................58
3.2.3. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan
chitosan.............................................................................................................60
3.2.4. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi cơ chất cảm ứng..................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............. .....................................................................72
Kết luận................. ....................................................................................................72
Kiến nghị...................................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................74

14. ix
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CDA : Chitin deacetylase
CS :Chitinase
DDA : Độ deacetyl
LMWC : Low molecular weight chitosan
VSV : Vi sinh vật

15. x
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Tổng kết các đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi sinh vật khảo sát........52
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến hiệu suất thu hồi và chất lượng
chitosan tạo thành......................................................................................................56
Bảng 3.3. Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV
CD1, CD5, CD10........ ..............................................................................................57
Bảng 3.4. Ảnh hưởng nguồn Muối đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng
VSV CD1, CD5, CD10.............................................................................................58
Bảng 3.5. Khảo sát enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn nhằm chuyển
hóa chitin thành chitosan...........................................................................................59
Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến khả năng sản xuất chitosan của 3
chủng VSV CD1, CD5, CD10......... .........................................................................60
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến khả năng sản xuất chitosan của 3
chủng VSV CD1, CD5, CD10.......... ........................................................................61
Bảng 3.8. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men sinh học, chitosan hóa
học, chitosan thương phẩm......... ..............................................................................62
Bảng 3.9. Độ deacetyl hóa chitosan chuyển hóa sinh học sơ với chitosan hóa học và
chitosan thương mại..................................................................................................63

16. xi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin.......................................................................5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối
β-(1,4)-glucoside.... .....................................................................................................6
Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan........ ...................................................10
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan.................................................................10
Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm..14
Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng
phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998).......15
Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu
công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010......... ................................................................17
Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase.....................................21
Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập............ .......................................26
Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật.............................33
Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm..............36
Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald............. ..........................................................................44
Hình 3.1. Kết quả định tính enzyme chitin deacetylase............................................48
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc............................49
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột.....................................50
Hình 3.4. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme chitinase...........................................50
Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự phân giải protein của chủng vi sinh vật.....................51
Hình 3.6. Chitosan được tạo thành từ các vi sinh vật............ ...................................54
Hình 3.7. Định tính chitosan bằng phương pháp Lugol/H2SO4................................55
Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn .Coli... ...65
Hình 3.9. Ống vi khuẩn E.Coli sau 24h nuôi cấy không bổ sung chitosan...............66
Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD1............. .......................66
Hình 3.11. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD5.....................................67
Hình 3.12. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD10............. .....................68

17. 1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Như chúng ta đã biết về chitin – chitosan, đây là một loại polysaccharide tự
nhiên và chiếm tỉ lệ rất lớn, chỉ sau cellulose. Bên cạnh đó chitosan cũng có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau rất hiệu quả và thân thiện với môi trường.
Tuy nhiên để có được nguồn nguyên liệu chitin – chitosan thì đòi hỏi phải có một
quy trình xử lý hiệu quả, bản chất chung của việc sản xuất chitin – chitosan là khử
các thành phần khoáng và hàm lượng protein còn dư thừa trong phế liệu vỏ tôm sẽ
cho ra chitin từ đó tiếp tục sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao để cắt các gốc acetyl
nhằm chuyển chitin thành chitosan. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp hóa
học để xử lý, quá trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài,
mang tới những nhược điểm như tiêu thụ nhiều năng lượng, lãng phí lượng lớn
kềm, khó xử lý, ăn mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường,…
Do đó, việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng vi sinh vật vào quy trình
sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân thiện với môi
trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng vi sinh vật sẽ giúp
hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay đang mắc
phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Chitosan, N-deacetylase dẫn xuất của chitin, hòa tan trong dung dịch acid, và
có một phạm vi sử dụng rộng, như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên (Thome & Văn
Daele, 1986), một tác nhân kháng khuẩn (Liu et al., 2004; Liu et al., 2004), một
polymer sinh học cho kim loại (Wan et al., 2004), chất xử lý môi trường như một
tác nhân kết bông, hoặc kết tủa chất bẩn. Hiện nay, deacetylation của chitin để tạo
thành chitosan thường đạt được bằng nhiệt hóa học để loại bỏ các nhóm acetyl. Quá
trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tuy nhiên, phương
pháp này có năm nhược điểm quan trọng bao gồm:
(1) Tiêu thụ một lượng đáng kể năng lượng;
(2) Lãng phí một lượng lớn kiềm, dẫn đến sự gia tăng về mức độ ô nhiễm môi
trường và làm tăng giá thành sản phẩm;

18. 2
(3) Các sản phẩm có một loạt các khối lượng phân tử và không đồng nhất mức
độ deacetylation;
(4) Vấn đề thu hồi và xử lý hoá chất;
(5) Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn
mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức –
NH2.
Do đó việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng enzyme chitin deacetylase
vào quy trình sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân
thiện với môi trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng enzyme
sẽ giúp hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay
đang mắc phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chitin deacetylase.
Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng
lọc.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Thu thập mẫu phân lập.
- Tăng sinh chọn lọc vi sinh vật.
- Phân lập chủng vi sinh vật thuần khiết từ các nguồn mẫu.
- Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập.
- Khảo sát vi sinh vật sàng lọc và định danh.
- Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men
cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan
và chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan).
- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.
- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.
- Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với
chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại
- Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.

19. 3
5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp tổng hợp tài liệu
- Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên
quan đến đề tài.
- Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.
 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh
chitin deacetylase
 Phương pháp định tính chitin deacetylase
 Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất chitosan của các chủng vi sinh vật
 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
- Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
- Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) 9.4 và
Microsoft Excell 2010.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin
deacetylase ứng dụng sản xuất chitosan.
- Thiết lập được quy trình công nghệ chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng
vi sinh vật tuyển chọn.
- Chất lượng chitosan thu được bằng phương pháp chuyển hóa sinh học tương
đương chitosan hóa học và chitosan thương mại.
7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ
Phần mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
Phần Kết luận và đề nghị.

20. 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về chitin
1.1.1. Giới thiệu
Chitin là một chuỗi dài polymer của một N-acetylglucosamine, một dẫn xuất
của glucose. Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là
poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc N-
acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1,4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-
glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin
1.1.2. Tính chất vật lý
Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi,
phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận.
Trong dạng tinh khiết, không biến đổi của nó, chitin có tính mềm dẻo, đàn hồi,
và khá cứng rắn. Tuy nhiên, ở hầu hết các động vật chân đốt, nó thường bị thay đổi,
xảy ra phần lớn như là một thành phần của vật liệu composite, chẳng hạn như trong
sclerotin, tạo thành nhiều bộ xương ngoài của côn trùng. Kết hợp với canxi
cacbonat, như trong vỏ động vật giáp xác và nhuyễn thể, chitin tạo ra một hỗn hợp
mạnh hơn nhiều. Vật liệu composite này cứng hơn nhiều so với chitin nguyên chất,
ít giòn hơn canxi cacbonat tinh khiết.

21. 5
1.1.3. Tính chất hóa học
Chitin là một polysaccharide có chứa nitơ, nó được tổng hợp từ các đơn vị của
N-acetyl-D-glucosamine. Các đơn vị này hình thành liên kết cộng hóa trị β-(1,4)
(tương tự như mối liên kết giữa các đơn vị glucose tạo thành cellulose). Vì vậy,
chitin có thể được mô tả như là cellulose với một nhóm hydroxyl trên mỗi monome
được thay thế bằng một nhóm acetyl amine. Điều này cho phép tăng liên kết hydro
giữa các polyme liền kề.
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau
bằng cầu nối β-(1,4)-glucoside
1.1.4. Tính chất sinh học
Là một vật thể màu trắng vô định hình không mùi. Trong tự nhiên chitin tồn
tại phổ biến trong vỏ ngoài của các loại nấm khuẩn, thực vật cấp thấp, các loại động
vật giáp xác như tôm, cua, côn trùng và trong màng tế bào của các động vật cao
cấp,…
Đây là một loại polymer mạch thẳng, trung tính, không tạo phản ứng hóa học,
không thay đổi trong dịch cơ thể, không phản ứng đào thải với cơ thể, không độc tố,
có tính kháng huyết khối.

22. 6
1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận
Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác ở biển là nguồn cung
cấp chitin tốt nhất.
1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới
1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam
Việc nghiên cứu, sản xuất chitin và các ứng dụng của chúng trong sản xuất,
phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Vào những năm 1978 đến
1980, Trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin –
chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất.
Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách,
trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị
trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào việc
nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng
thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp.
Hiện nay, Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin –
chitosan như: Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên
cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam; Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản
– viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản.
Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới.
Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là
phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành công
nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản

23. 7
1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới
Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn
nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc
từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà
lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường.
Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đưa vào sản xuất
chitin.
Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của
chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu
sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia
súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất
có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp.
Sản lượng chitin năm 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nước sử dụng hàng đầu
là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra các nước như Trung Quốc,
Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất quy mô 50 kg
chitin/ngày với giá bán là 200 – 300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các
chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc
ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu
cầu chitin – chitosan có thể lên tới 36.700 tấn/năm trong thập kỷ tới.
Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nước biển đã
thành lập công ty liên doanh Seafresh chitosan để khai thác khả năng cung cấp
thương phẩm các dẫn xuất của vỏ tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với chitin và
polysaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hướng hoạt động chính vào các thị trường xuất
khẩu.
Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar – giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất
khoảng 150 – 180 triệu sản phẩm chitin – chitosan/năm góp phần cùng các nước sản
xuất chính khác như Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga.
Ngày nay, người ta tập trung vào các dẫn xuất của chitin và khả năng ứng
dụng của các dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A.
Muzzarelli (Đại học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào chitin và dẫn xuất của nó.

24. 8
Cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều quy trình sản xuất chitin, với nhiều nguồn
nguyên liệu khác nhau, nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ.
1.1.7. Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm
năng to lớn đặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực
phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm. Chitin có thể ứng dụng làm
chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất
không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất mang trong cố định enzyme hay
cố định tế bào, làm chất mang tạo các giá thể trồng cây cảnh.
Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối u, kháng
nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan
trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác
1.2. Sơ lược về chitosan
1.2.1. Giới thiệu
Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các D-
glucosamine (đơn vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-glucosamine (đơn vị chứa
nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1,4). Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các
loài giáp xác (ví dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH.
Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan
1.2.2. Tính chất hóa lý
Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ
khác nhau. Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung

25. 9
dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH 6,0 – 6,6) tạo dung dịch
keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309ºC – 311ºC.Trọng
lượng phân tử trung bình: 100.000 – 1.200.000 dalton tùy loại
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan
1.2.3. Tính chất sinh học
Vật liệu chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người.
Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học.
Chitosan có nhiều ứng dụng đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng
nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh
của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác
dụng cầm máu, chống sưng u.
Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm, mà cả nấm
men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn phụ thuộc vào một vài yếu tố như loại
chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có
mặt của một số thành phần thực phẩm.
1.2.4. Các tính chất của chitosan (MargueriteRinaudo, 2006; Li et al., 1997;
Onsoyen E et al., 1990)
1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa
Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất
chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của
chitosan sau này. Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56 – 99% (nhìn
chung là 80%).
1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan
Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao. Khối lượng chitin
thường lớn hơn 1 triệu Dalton trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có
khối lượng khoảng 100.000 – 1.200.000 Dalton.
1.2.4.3. Độ nhớt

26. 10
Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của
chitosan. Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao.
1.2.4.4. Tính tan
Chitin tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tan trong
các dung dịch acid pH dưới 6,0. Các acid hữu cơ như acetic, formic và lactic thường
được sử dụng để hòa tan chitosan. Thường sử dụng nhất là dung dịch chitosan 1%
tại pH 4,0. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl 1% nhưng không tan trong
H2SO4 và H3PO4.
1.2.4.5. Tỷ trọng
Trong một số nghiên cứu cho thấy tỷ trọng của chitin và chitosan từ giáp xác
rất cao (0,39 g/cm3
). Mức độ deacetyl hóa cũng làm tăng tỷ trọng của chitosan.
1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo
Sự hấp thụ nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin.
Thông thường, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 – 1150% (trung bình là
702%), khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 31% – 170%,
chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều so với chitin.
1.2.4.7. Khả năng tạo màng
Chitosan còn có khả năng tạo màng. Màng chitosan được sử dụng nhiều trong
bảo quản thực phẩm. Màng chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương
với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói.
Theo nghiên cứu của Mi và cộng sự (2001, 2003) thì màng chitosan được tạo
theo phương pháp sau: tạo dung dịch chứa hàm lượng chitosan lớn hơn 3%, sau đó
sấy để giảm bớt nước trong dung dịch. Sau khi sấy cho dung dịch trao đổi ion vào
ngâm trong 24 giờ. Cuối cùng sấy cho đến khi màng khô hoàn toàn.
Cũng theo nghiên cứu này cho thấy màng chitosan tạo thành có độ hấp thu
dung dịch đệm phosphate pH = 7,4 (tương tự với dung dịch nội bào) và tốc độ
truyền hơi nước rất cao (Mi et al., 2001; Mi et al., 2003).
1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan
Chitosan là polymer chứa nhóm chức mang điện tích dương cho phép gắn kết
với các thành phần sinh học mang điện tích âm và có thể tái sinh theo con đường
sinh học trên trái đất, có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể,

27. 11
tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào động thực vật, kích thích quá
trình đông máu và làm lành vết thương, tương tác chuyên biệt với các thành phần
của chất nền ngoại bào và các nhân tố tăng trưởng. Ngoài ra, chitosan còn có tác
dụng giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo, không gây độc do
các sản phẩm sau thủy phân đều là các chất chuyển hoá tự nhiên, không gây đáp
ứng miễn dịch trong mô và cơ quan động vật, có tác dụng hỗ trợ trong điều hòa
miễn dịch. Chitosan có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng,
tấm xốp, sợi, hạt, bột mịn, bông và gel (Antoni, 2005).
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đã nhận được sự
quan tâm đáng kể trong những năm gần đây. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan là
nhờ một số cơ chế sau (Hang et al., 2012):
 Chitosan là một polymer mang điện dương, chúng tương tác với thành phần
polyanion vách tế bào (polysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết quả là sự rò
rỉ thành phần nội bào do các thay đổi trong tính thấm của hàng rào (barrier), ngăn
cản chất dinh dưỡng đi vào tế bào (đặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp
LMWC).
 Chitosan có khả năng kết hợp với DNA nên chitosan có khả năng ức chế
tổng hợp RNA và protein.
 Chitosan có khả năng gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn đến
chết tế bào. Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng kháng cả nấm, vi khuẩn
gram dương và gram âm.
Hoạt tính trong điều trị vết thương, chitosan có tác dụng cầm máu, đẩy nhanh
quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị thương, tăng cường hoạt động của
chitinase và lysozyme, dẫn đến mau lành vết thương và giảm nhiễm trùng. Chitosan
được báo cáo là bền với dịch mật, dịch tuỵ và nước tiểu nên được dùng trong chỉ
khâu phẫu thuật thay thế cho các loại vật liệu khác có thể bị chất dịch trong cơ thể
tấn công và đứt trước khi vết thương lành hẳn (Alemdaroğlu et al., 2006). Trong các
trường hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo thành ở dạng màng xốp hút nước mạnh và
giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thương rất dễ dàng, tạo điều kiện cho
các mô này bình phục nhanh chóng (Trần Thị Nguyệt, 2015).
1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận

28. 12
Hàm lượng chitosan của nấm tiếp hợp như A.coerulea, R.delemar,
C.blackesleeana, M.rouxii, B.poitrasii, dao động từ 6,1 – 11% trọng lượng khô của
tế bào. Nấm của nhóm này có thể dễ dàng phát triển trong phòng thí nghiệm về các
chất dinh dưỡng rẻ tiền và vật liệu thường có thể được sản xuất bằng các quy trình
hóa học đơn giản.
Hiện nay, chitosan đang được sản xuất từ vỏ cua và tôm bằng quá trình nhiệt
hóa học. Tuy nhiên nó có một số nhược điểm như sử dụng dung dịch kiềm ở nồng
độ cao, làm tăng mức độ ô nhiễm môi trường và hình thành sản phẩm không đồng
nhất. Để khắc phục những hạn chế này, chitosan tự nhiên từ một số loại nấm tiếp
hợp có thể được phân lập từ sinh khối sợi. Một số nấm có chitosan trọng lượng phân
tử thấp rất hữu ích cho các ứng dụng y tế và trong nông nghiệp.
1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan
Vỏ, đầu tôm chứa 3 thành phần chủ yếu chitin, protein và khoáng, chủ yếu là
CaCO3. Để thu nhận chitin, phải khử khoáng, khử protein và khử màu. Để được
chitosan cần loại bỏ gốc acetyl (deacetyl hóa). Sơ đồ tổng quát công nghệ thu hồi
chitin từ vỏ, đầu tôm và sản xuất chitosan được trình bày trên hình:
Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm

29. 13
1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa
học
Trong phương pháp hóa học người ta tiến hành khử protein bằng NaOH và
khử khoáng bằng acid vô cơ. Nồng độ hóa chất và điều kiện thay đổi tùy quy trình,
cũng như thứ tự hai quá trình trên có thể đảo ngược.
 Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu:
- Quy trình sản xuất chitin từ tôm song nước ngọt của Mayer và Lee, đại học
Louisiana, Hoa kỳ (1989).
- Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh
(1998).
- Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang.
- Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước Ấn Độ, Nhật Bản,
Anh, Pháp, Thái Lan,…
Hình 1.6 trình bày một quy trình sản xuất chitin, chitosan bằng phương pháp
hóa học tiêu biểu.
Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng

30. 14
phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998)
Nhận xét:
Trong phương pháp hóa học người ta tiến hành khử protein bằng NaOH và
khử khoáng bằng acid vô cơ để thu hồi chitin sau đó tiếp tục dùng NaOH đặc nồng
độ 35 – 50% ở nhiệt độ cao trong thời gian dài để deacetyl hóa chitin thu được, thu
hồi chitosan. Nồng độ hóa chất và điều kiện thay đổi tùy từng quy trình. Một trong
những hạn chế của phương pháp này là sử dụng kiềm đặc ở nhiệt độ cao trong thời
gian dài có thể gây ăn mòn thiết bị. Mặt khác, việc xử lý hóa chất sau khi sử dụng
xong khó trung hòa, có thể gây ô nhiễm môi trường.
1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học
Thay vì sử dụng các hóa chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng
dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại thành công trong vấn đề này.
Đối với phương pháp bán sinh học thì tác nhân khử khoáng là acid lactic sinh
ra do lên men lactic. Tác nhân khử protein thì nhiều tác giả sử dụng enzyme
protease từ Aspergillus oryzae, chế phẩm thương mại Alcalase hay sử dụng trực tiếp
Bacillus spp.
Sau khi khử khoáng và khử protein thì vẫn còn giai đoạn deacetyl hóa vẫn
chưa tìm ra được biện pháp tối ưu.
Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện
nghiên cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010

31. 15
Nhận xét:
Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ
tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho
các vi sinh vật gây hôi thối phát triển. Đồng thời, các vi sinh vật này sẽ phân hủy
một phần protein còn lại trong nguyên liệu.
Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) cũng nghiên cứu và tìm được quy
trình thu nhận chitin từ đầu – vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp enzyme sử dụng
dịch ép vỏ dứa phế thải chứa proteinase bromelain và giàu các acid hữu cơ, có tác
dụng loại các chất khoáng và protein trong đầu – vỏ tôm. Phương pháp này có ưu
điểm không cần acid để loại khoáng tiêu tốn ít xút cho việc loại bỏ protein, hiệu quả
thu hồi chitin cao ít gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi
phải có nguồn nguyên liệu là vỏ chồi dứa cạnh nơi xử lý vỏ đầu tôm, nếu không chi
phí lớn cho thu nhận enzyme từ vỏ dứa.
So sánh hiệu quả quy trình xử lý hóa học và sinh học: chất lượng chitin sản
xuất bằng phương pháp hóa học có hiệu quả khử khoáng và protein thấp hơn nhiều
so với xử lý bằng phương pháp sinh học.
Theo Bhaskar (2010) thì phương pháp sinh học cho hiệu quả khử protein là
92% khử khoáng 78%. Theo Rao (2000) thì hiệu quả khử khoáng có thể đạt 65% và
hiệu quả khử protein cao nhất có thể đạt 86%.
Bước tiếp theo trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ nghiên cứu cải tiến quy
trình thu hồi chitosan từ chitin để đạt được hiệu suất thu hồi tốt nhất nhưng vẫn thân
thiện với môi trường và đạt được mức độ đồng nhất trong sản phẩm thu được.
1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới
1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam
Là nước có nền khoa học kỹ thuật chưa phát triển, việc nghiên cứu và sản xuất
chitin – chitosan còn khá mới mẻ. Công trình vào năm 1978 – 1982 của Đỗ Minh
Phụng tại Đại học Thủy sản là bước đầu về lĩnh vực này, tuy nhiên bước đầu còn
gặp nhiều khó khăn.
Mỗi năm, Việt Nam thải ra gần 70.000 tấn vỏ tôm nhưng vẫn chưa tận dụng
triệt để, gây lãng phí. Đã có nhiều những nghiên cứu để tận dụng nguồn phế liệu

32. 16
này. Tuy nhiên chỉ dừng lại ở việc sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học từ
nguồn phế liệu vỏ tôm. Chưa hoàn toàn có thể chuyển vỏ tôm thành chitosan bằng
phương pháp sinh học.
Những năm gần đây, trước yêu cầu cấp bách về xử lý tận thu nguồn phế liệu
và những thông tin về kỹ thuật, các nhà khoa học của nước ta bắt đầu nghiên cứu và
hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan cũng như các ứng dụng của nó. Đã
có nhiều trường đại học và cơ quan nghiên cứu như Đại học Tổng hợp, Đại học Y
Dược TPHCM, phân viện khoa học Việt Nam, cùng nhiều nghiên cứu ở các cơ sở
sản xuất như ở TP HCM, Cà Mau.
1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới
Sản lượng chitosan trên thế giới vào thập niên cuối của thế kỷ 20 là khoảng
2000 tấn/năm. Hiện nay đi đầu trong lĩnh vực ứng dụng và sản xuất chitosan của
Nhật Bản là 600 tấn/năm, Hoa Kỳ là 400 tấn/năm. Ngoài ra còn các nước khác như
Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp,…
Ở Hoa Kỳ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là
425 triệu USD, trong đó 210 triệu USD thuộc về ngành y tế, sau đó là ngành nông
nghiệp và mỹ phẩm. Một số công ty ở Hoa Kỳ đã nghiên cứu chiết rút chitin –
chitosan từ sự lên men nấm.
Hiện nay có rất nhiều công ty lớn trên thế giới tham gia vào lĩnh vực sản xuất
chitin – chitosan và họ đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ chitosan
ứng dụng trong việc xử lý nước, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và các ứng dụng
trong nông nghiệp.
1.2.8. Ứng dụng
Chitosan có nhiều ứng dụng trong thương mại và y sinh. Nó có thể được dùng
trong nông nghiệp với vai trò xử lý hạt giống và thuốc trừ dịch hại sinh học, giúp
cây trồng chống lại các loại bệnh do nấm. Trong sản xuất rượu vang, nó có thể được
sử dụng như là tác nhân lọc cặn và bảo quản. Trong công nghiệp, nó có thể được sử
dụng trong sơn tự làm liền vết trầy xước polyurethane (PUR). Trong y học, nó có
thể được ứng dụng trong băng gạc y tế để làm giảm chảy máu và chống nhiễm
khuẩn; truyền tải thuốc qua da.

33. 17
1.3. Sơ lược về enzyme chitin deacetylase
1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase
Mã số của enzyme chitin deacetylase EC 3.5.1.41
Chitin deacetylase có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 25 – 80 kDa cả
trên điện di gel natri cacbonlamide natri dodecyl sulfate và sắc ký lọc gel, cho thấy
rằng enzyme tồn tại như một monomer [32].
Chitin deacetylase (CDA) là một enzyme đã được tách ra chủ yếu từ nấm hoặc
từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Chitin deacetylase (CDA, E.C. 3.5.1.41) là một
enzyme thuộc về họ hydrolase xúc tác sự thủy phân của các nhóm acetamide của N-
acetylglucosamine trong chitin, thúc đẩy chuyển đổi thành chitosan, một
glucosamin polymer. Trong các loại nấm tiếp hợp, CDA có vai trò quan trọng trong
sự phát triển của nấm, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp chitosan của vách tế
bào song song với sự tổng hợp chitinase (CS, EC 2.4.1.16) và cũng có thể liên quan
đến phản ứng deacetyl hóa các oligosaccharide chitin trong quá trình tự hủy sau
hoạt động của endo-chitinase trên thành tế bào.
1.3.2. Cơ chế xúc tác
Enzyme chitin deacetylase tham gia vào sự trao đổi chất đường amino.
Enzyme chitin deacetylase xúc tác theo phương trình:
Chitin + H2O → Chitosan + acetate
Vì vậy, hai cơ chất của enzyme chitin deacetylase là chitin và H2O, trong khi
hai sản phẩm của nó là chitosan và acetate.
Từ các nguồn khác nhau của chitin deacetylase cho thấy các mô hình hoạt
động enzyme khác nhau trên cơ chất chitin. Hai cơ chế chính được mô tả là cơ chế
tấn công nhiều vị trí trên một sợi cơ chất (multiple attack mechanism) và cơ chế tấn
công nhiều sợi cùng lúc (multiple chain mechanism).
Hình 1.8 biểu diễn cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase

34. 18
Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase
(A) – cơ chế deacetyl hóa của (GlcNAc)4 bằng một enzyme exo-chitin
deacetylase từ M.rouxii,
(B) cơ chế xúc tác của một endo-chitin deacetylase từ C. lindemuthianum.
(GlcNAc: vòng tròn màu xám, GlcN vòng tròn màu trắng, đầu không khử được
đánh dấu X. Mũi tên chỉ vị trí cắt của CDA).
Trong cơ chế tấn công nhiều vị trí trên một sợi cơ chất CDA liên kết với sợi
chitin, một chuỗi phản ứng deacetyl hóa diễn ra, sau đó enzyme mới liên kết với sợi
chitin khác (Hình 1.8A). Khi nghiên cứu cơ chế hoạt động của CDA từ nấm M.
rouxii, người ta sử dụng cơ chất là chitosan được deacetyl hóa một phần. Enzyme
CDA chỉ có thể deacetyl hóa hữu hiệu khi chitin oligomer có DP (độ polymer hóa)
lớn hơn 2. Phản ứng deacetyl hóa bắt đầu ở đầu không khử của oligomer. Mức độ
deacetyl hóa còn phụ thuộc vào độ dài cơ chất. Oligomer DP 5 có thể được deacetyl
hóa hoàn toàn, trong khi đầu khử của (GlcNAc)3, (GlcNAc)6 và (GlcNAc)7 luôn
luôn được bảo toàn mà chưa rõ tại sao.
Trong hình (B), (GlcNAc)4 được deacetyl hóa bằng CDA từ C.
lindemuthianum theo cơ chế tấn công nhiều chuỗi chitin (cơ chế 2). Người ta gọi 4
vị trí cắt của CDA này là -2, -1, 0 và +1. Enzyme nhận biết sợi chitin gồm 4 đơn
phân và nhóm N-acetyl group của đơn phân ở vị trí 0 luôn được deacetyl hóa. Các
phản ứng deacetyl hóa tiếp theo có thể xảy ra theo nhiều thứ tự khác nhau (hình
1.8B).
1.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính
Các cơ chất khác nhau có mức deacety hóa khác nhau được sử dụng để đo
hoạt tính CDA. Chúng bao gồm chitin glycol, chitin keo, bột chitin, chitin cua,

35. 19
chitin Katakura, Sigma α-chitin, chitin CHA-2, γ-chitin, carboxymethyl chitin, α-
1→3,1→6-N-acetylgalactosamine galactan, N-acetylglucosamine và (GlcNAc)2-6
Một nghiên cứu phóng xạ sử dụng O-hydroxyethylchitin (glycol chitin), chất
phóng xạ được gắn vào nhóm N-acetyl làm cơ chất để xác định hoạt tính của chitin
deacetylase trong M. rouxii. Phương pháp này rất nhạy, tuy nhiên đòi hỏi phải gắn
đồng vị phóng xạ, được sử dụng chủ yếu theo dõi sự phân bố nhóm nhóm O-
hydroxyethyl trong chitin glycol thương mại mà không thể dùng để theo dõi quá
trình deacetyl hóa cơ chất không được gắn phóng xạ. Kauss và Bausch đã sử dụng
acid nitrous và 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH) (Ghormade1 et al.)
để polymer hóa glycol ethylene chitin với NaNO2 và phát hiện màu sắc của
glucosamine thoát ra với MBTH. Hoạt tính của CDA cũng được đo bằng acetate
phóng thích từ hexa-N-acetylchitohexaose bằng phương pháp enzyme của
Bergmeyer thông qua phản ứng enzyme kết hợp.
1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme
Theo kết quả báo cáo, độ pH tối ưu của hầu hết các enzyme chitin deacetylase
ngoại bào là trung tính hoặc trong khoảng kiềm từ 7 – 12, trong khi hầu hết các
enzyme chitin deacetylase nội bào có các giá trị pH tối ưu trong khoảng 4,5 – 6.
Nhiệt độ tối ưu là 50 – 60o
C đối với hầu hết các enzyme.
Để xác định nhiệt độ tối ưu, phản ứng enzyme được kiểm soát ở nhiệt độ khác
nhau (20 – 70o
C) trong 1 giờ. Để ổn định nhiệt độ, enzyme được ủ sẵn ở nhiệt độ
khác nhau (20 – 70ºC) trong 1 giờ mà không có chất nền. Để xác định độ pH tối ưu,
phản ứng enzyme được tiến hành trong dung dịch muối glutamat natri 50 mM (pH
3,5 – 5,5), dung dịch đệm phosphate 50 mM (pH 5,0 – 8,5), dung dịch Tris-HCl 50
mM (pH 7,0 – 9,5) và 50 mM Na2CO3 đệm (pH 9,0 – 11,5) trong 1 giờ. Để ổn định
độ pH, enzyme được ủ trong các bộ đệm pH khác nhau ở nhiệt độ 4ºC qua đêm. Các
nồng độ khác nhau của ion acetate và kim loại đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng
enzyme để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của enzyme.
Hoạt tính CDA bị ức chế mạnh bởi các ion kim loại Hg2+
, Zn2+
, và EDTA,
nhưng được kích hoạt bởi Ca2+
và Co2+
ở 10 mM. Trước đây, đã có báo cáo rằng
hoạt động CDA từ C. lindemuthanum ATCC 56676 được thúc đẩy nhẹ bởi Co2+
ở 1

36. 20
mM, nhưng nó bị ức chế mạnh ở 10 mM .Tuy nhiên, Mortierella sp hoạt động CDA
DY-52 đã được tăng lên rất nhiều bởi Co2+
trong phạm vi từ 0,01 – 10 mM. Kết quả
này chưa được báo cáo cho các enzyme CDA từ các chủng sinh vật khác.
1.3.5. Ứng dụng
CDA cũng có thể là một công cụ đa năng trong việc kiểm soát sinh vật gây hại
như côn trùng. CDA có thể được sử dụng kết hợp với các enzyme thủy phân khác
để kiểm soát sâu bệnh và các mầm bệnh.
Trong kiểm soát côn trùng bằng biện pháp sinh học, chitin deacetylase đã
được chứng minh là mục tiêu tiềm năng cho sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Chitin
deacetylase là một protein tổng hợp và tiết ra trong ruột côn trùng trong quá trình
cho ăn; nhờ đó thay đổi thành phần chitin trong ruột để bảo vệ ruột khỏi sự xâm
nhập của vật ký sinh, cũng như ngăn chặn độc tố như lectins. Do đó, sự ức chế
enzyme này là một cơ chế kiểm soát côn trùng gây côn trùng.
Vi khuẩn biển Vibrio vulnificus gây ra nhiễm khuẩn huyết nặng và nhiễm
trùng vết thương với tiến trình bệnh lý nhanh chóng ở tôm cua. Lee và cộng sự cho
thấy một phần phân đoạn chitosan đã ngăn ngừa và điều trị nhiễm trùng do V.
vulnificus.
Ngoài ra, biểu hiện gene mã hóa enzyme chitin synthase và CDA gene trong
cây trồng cũng làm thay đổi cấu trúc vách tế bào thực vật, từ đó cải thiện được khả
năng kháng bệnh của cây và ứng dụng của chúng trong công nghiệp.
1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylase
Một số công trình nghiên cứu về chitin deacetylase trên thế giới:
Con đường hình thành chitosan trong Mucor rouxii nhờ enzyme chitin
deacetylase (Araki, Ito,1975). Sự phát hiện ra enzyme chitin deacetylase trong phần
nổi của nấm Mucor rouxii, enzyme này giải phóng khoảng 30% các nhóm acetyl
glycol chitin, tạo ra một sản phẩm có độ nhạy cảm giảm với lysozyme. Enzyme này
cho thấy pH tối ưu là 5,5. Giá trị Km của glycol chitin là 0,87 g/l hoặc 2,6 mM đối
với lượng monosaccharide. Sự xuất hiện của enzyme chitin deacetylase tạo thành
chitosan trong nấm.

37. 21
Tinh sạch và mô tả đặc tính của chitin deacetylase từ Absidia coerulea của
Gao và cộng sự (1995). Bài viết này nói về sự tinh sạch bằng cách chạy sắc ký trên
Butyl Toyopearl-650M, Gigapite (hydroxyapatite), và DEAE Toyopearl-650M và
những đặc trưng về nhiệt độ, pH của chitin deacetylase trong nấm Absidia coerulea.
Enzyme này cũng có thể chuyển hóa chitin thành chitosan.
Enzyme deacetyl hóa của chitin bằng chitin deacetylase ngoại bào từ
Mortierella sp. DY-52 (Kim et al.,2008). Tìm ra được mẫu khuẩn nấm DY-52 từ
hàng trăm khuẩn nấm phân lập từ các mẫu đất khác nhau, cho thấy có sự xuất hiện
enzyme chitin deacetylase ngoại bào (CDA), khảo sát yếu tố tăng trưởng trên môi
trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH, cơ chất, ion kim loại ảnh hưởng đến sự phát triển của
enzyme này.
Đặc tính và ứng dụng của chitin deacetylase của Yong và cộng sự (2010). Sự
phát hiện enzyme chitin deacetylase từ vi khuẩn biển, ở đề tài này cũng tiến hành
khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh enzyme chitin deacetylase, cơ chế
hoạt động, một cách tổng quan về chitin deacetylase.

38. 22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
2.1.1. Thời gian
Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Công Nghệ Sinh
Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí
Minh.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguồn mẫu
Nguồn mẫu: có tổng cộng 5 mẫu đã được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau.
Các mẫu được cho vào túi PE vô trùng và được bảo quản lạnh để chuyển về phòng
thí nghiệm ngay trong ngày phục vụ cho việc phân lập
Mẫu 1: Bãi vỏ tôm Làng bè Long Sơn – Vũng Tàu
Mẫu 2: Mẫu đất gần nhà máy chế biến hải sản – Đường Trường Sa – Vũng
Tàu
Mẫu 3: Khu bãi rác làng bè sông Chà Và – Vũng Tàu
Mẫu 4: Mẫu đất ở vùng gần biển Suối O – Bình Châu
Mẫu 5: Mẫu đất ven biển Cần Giờ

39. 23
Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập

40. 24
2.2.2. Hóa chất
- Chitin và chitosan được cung cấp bởi công ty TNHH MTV Chitosan VN
(Kiên Giang). Chitosan có độ deacetyl hóa 75%.
- p-nitroacetanilide độ tinh khiết 98% được cung cấp bởi Sigmaaldrich phân
phối bởi công ty BCE Việt Nam.
- Các hóa chất vi sinh dùng cho việc phân lập và lên men được cung cấp bởi
Himedia Ấn Độ. Có độ tinh khiết 99%.
- E. coli được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại
học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM.
2.2.3. Thiết bị – dụng cụ
2.2.3.1. Thiết bị
Nồi hấp Autoclave

41. 25
2.2.3.2. Dụng cụ
2.3. Phương pháp luận
Để đạt mục đích chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh học
tôi đưa ra mục tiêu luận văn là phân lập vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitin
deacetylase, với hy vọng tìm được các chủng có khả năng tăng sinh khối tốt và khả
năng tổng hợp chitin deacetylase ngoại bào.
Tiếp theo là chúng tôi sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật tuyển chọn
chuyển hóa chitin thành chitosan, xác định các thông số kỹ thuật cho quá trình
chuyển hóa và đánh giá hiệu quả của việc thu hồi chitosan cũng như các tính chất
chitosan thu được bằng phương pháp sinh học, so sánh với chitosan thu được bằng
phương pháp hóa học và chitosan thương mại.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
 Bố trí thí nghiệm
Mục tiêu Nội dung Phương pháp
Phân lập, sàng lọc
VSV sinh tổng hợp
enzyme CDA
Thu thập mẫu

42. 26
Tăng sinh, phân lập
chủng thuần khiết
- Hình thái khuẩn lạc
Sàng lọc chủng sinh
tổng hợp CDA
- Định tính enzyme CDA
bằng thuốc thử p-
nitroacetanilide
Định danh các chủng
sàng lọc
- Hình thái tế bào
- Một số chỉ tiêu sinh lý,
sinh hóa
- Khảo sát khả năng sinh
enzyme ngoại bào
- Giải trình tự 16S rDNA,
so sánh trên Genbank
Khảo sát khả năng
chuyển hóa chitin
thành chitosan bằng
các chủng sàng lọc
Thử nghiệm chuyển
hóa chitin thành
chitosan, sử dụng môi
trường lên men cơ bản
nuối cấy các chủng
sàng lọc
- Định tính chitosan tạo
thành sử dụng
- Lugol/H2SO4
Khảo sát ảnh hưởng
của nguồn C
- Hiệu suất thu hồi
chitosan, độ hòa tan, độ
deacetyl
Khảo sát ảnh hưởng
của nguồn N
- Hiệu suất thu hồi
chitosan, độ hòa tan, độ
deacetyl
Khảo sát ảnh hưởng
của tỉ lệ khoáng
- Hiệu suất thu hồi
chitosan, độ hòa tan, độ
deacetyl
- Xác định hoạt tính
enzyme chitin deacetylase

43. 27
Tăng hiệu suất thu hồi
bằng cách tăng nồng độ
acid acetic hòa tan
chitosan
- Hiệu suất thu hồi, Hiệu
suất thu hồi chitosan, độ
hòa tan, độ deacetyl
Tăng hiệu suất thu hồi
bằng cách thay đổi
nguồn cơ chất cảm ứng
- Hiệu suất thu hồi
chitosan, độ hòa tan, độ
deacetyl
So sánh chitosan tạo
thành với chitosan
thương mại và chitosan
hóa học
- Độ nhớt
- Độ deacetyl hóa
- Khối lượng phân tử
(MW) của chitosan
- Khả năng kháng khuẩn
xác định MIC
- Điện di protein
2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin
deacetylase
2.4.1.1. Thu thập mẫu
Sử dụng dụng cụ lấy mẫu vô trùng lấy 50 g mỗi mẫu cho vào bọc nilon, ghi
chú và bảo quản trong thùng lạnh trong quá trình chuyển mẫu về Phòng thí nghiệm
để phân lập.
Những nguồn mẫu được chọn đều có nguồn phế liệu vỏ tôm, cua lớn,… đây
cũng là nguồn chitin dồi dào là cơ chất cảm cảm ứng cho quá trình sinh enzyme
chitinase hoặc chitin deacetylase của các chủng vi sinh vật. Từ đó, ta có thể tiến
hành sàng lọc được tất cả các chủng có hoạt tính 1 trong 2 enzyme này. Trong các
bước tiếp theo, tiếp tục chọn lọc lại các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
chitin deacetylase.
2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết
Phương pháp: Các mẫu thu thập từ các bãi thải vỏ tôm ở các vùng biển, mẫu
đất thu thập từ nhà máy sản xuất chitin được pha loãng và cấy trang tăng sinh trên

44. 28
môi trường chitin nhằm làm tăng số lượng quần thể vi sinh vật có trong mẫu.
Mẫu đất sau khi được thu thập sẽ tiến hành tăng sinh chọn lọc trên môi trường
NB có bổ sung 2% huyền phù chitin. Nhằm tạo môi trường dinh dưỡng thích hợp
cho các loại vi khuẩn có thể sử dụng nguồn cơ chất chitin.
Sau khi ủ 37o
C trong 24 giờ. Pha loãng bằng nước muối sinh lý thành các
nồng độ 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
, 10-6
. Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-3
, 10-
4
, 10-5
, 10-6
cho vào các đĩa petri chứa môi trường NA bổ sung 2% huyền phù chitin.
Trang đều mẫu. Ủ 37o
C trong 24 giờ.
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng và kích thước) trên
đĩa petri, lựa chọn các khuẩn lạc riêng lẻ tiến hành cấy chuyền nhiều lần trên môi
trường NA có bổ sung 2% huyền phù chitin để tiến hành làm thuần.
Các chủng thuần khiết sẽ được cấy sang 2 đĩa môi trường NA bổ sung 2%
huyền phù chitin lần lượt được kiểm tra khả năng sinh enzyme chitin deacetylase.
2.4.1.3. Sàng lọc
Phương pháp: Các chủng thuần khiết sẽ được lần lượt kiểm tra khả năng sinh
enzyme chitin deacetylase. Sự hiện diện chitin deacetylase được định tính bằng cách
sử dụng dải thử nghiệm có tẩm p-nitroacetanilide. Sau thời gian ủ với dịch môi
trường nuôi cấy, sự phát triển của màu vàng trong dải chỉ ra sự hiện diện của vi
khuẩn deacetylase tương ứng được cô lập (Kuldeep et al., 2012).
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách tẩm giấy lọc có chứa p-nitroacetanilide
(đã được tiến hành tẩm và sấy khô 2 – 3 lần ở nhiệt độ 50ºC/30 phút).
Các ống nghiệm chứa 5 ml môi trường đã được hấp tiệt trùng thành phần gồm:
1 g yeast extract; 0,4 g (NH4)2SO4 và 0,15 g KH2PO4 (pH 7,0). Cấy khuẩn lạc riêng
lẻ của các chủng phân lập được vào các ống nghiệm. Các ống nghiệm được ủ ở
37°C trong hai ngày. Sau khi ủ, 2 ml dung dịch từ các ống nuôi cấy đã được chuyển
sang các ống nghiệm vô trùng tương ứng chứa các dải thử nghiệm p-
nitroacetanilide. Các ống này tiếp tục được ủ ở 37° C trong 12 – 24 giờ. Sau khi ủ,
sự xuất hiện của màu vàng trong dải cho thấy sự hiện diện của enzyme deacetylase
trong chủng vi khuẩn tương ứng. Các chủng dương tính với thử nghiệm sẽ được sử
dụng cho quá trình khảo sát tiếp theo.

45. 29
Tiến hành tương tự cho mẫu đối chứng có môi trường lên men không chứa vi
sinh vật.
Quan sát kết quả đạt được trên mẫu đối chứng và mẫu chứa vi sinh vật.
2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc
Các bước định danh sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa được trình bày
qua sơ đồ sau đây:
Deacetylase
p - nitroacetanilide
4 – Nitroaniline
(Màu vàng)

46. 30
Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật
Chủng VSV
Tăng sinh trên môi trường
nuôi cấy chứa 2% chitin
Test thử nghiệm, sinh
lý sinh hóa
Các đĩa được sử dụng thực
hiện các thử nghiệm sinh hóa
Nhuộm gram
Nhuộm bào tử
Định danh sơ bộ
Methyl Red
Simmon Citrate
Catalase
Indol
TSI
Định tính hoạt tính enzyme
Amylase
Chitinase
Protease
Chitin
deacetylase
Voges Proskauer
Làm tan chảy
Gelatin
Giải trình tự 16S rDNA, so
sánh trên Genbank

47. 31
 Các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa
Thuyết minh quy trình: Chủng vi sinh vật sau làm thuần tiến hành cấy ria trên
môi trường NA bổ sung 2% huyền phù chitin để ta tiến hành các thử nghiệm sinh lý
sinh hóa như: hình thái tế bào, nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm methyl red,
simmon citrate, indol, catalase, TSI, Gelatin để khảo sát sơ bộ chủng vi sinh vật
nhận được.
 Định tính hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật
- Enzyme amylase
Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.
Đĩa 1 (TN): cấy ria chủng trên môi trường NA có chứa 2% tinh bột. Ủ nhiệt độ
phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả.
Đĩa 2 (ĐC): cấy ria chủng trên môi trường đối chứng không chứa tinh bột. Ủ
nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả.
- Enzyme chitinase
Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.
Đĩa 1 (TN): cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường NA có chứa 2% huyền
phù chitin + 2% agar. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả
Đĩa 2 (ĐC): cấy điểm chủng trên môi trường đối chứng không chứa chitin. Ủ
nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả
- Enzyme protease
Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.
Đĩa 1 (TN): hút 0,1 ml dịch chứa vi sinh vật vào trong lỗ thạch đã được đục
sẵn trên môi trường phân lập PCA có chứa 2% casein. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ.
Đĩa 2 (ĐC): hút 0,1 ml dịch chứa vi sinh vật vào trong lỗ thạch đã được đục
sẵn trên môi trường đối chứng PCA không chứa casein. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ.
Sau thời gian ủ, ta tiến hành nhỏ lugol vào quan sát và đo vòng trong suốt
chính là vòng phân giải casein.
Nếu chủng vi khuẩn thử nghiệm có kết quả sinh protease dương tính khi nhỏ
lugol vào đĩa thạch sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch.

48. 32
Nếu chủng vi khuẩn không có khả năng sinh protease sẽ không hình thành
vòng trong suốt khi nhỏ lugol vào đĩa thạch.
Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm.
Trong đó: D – d có hiệu số càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao
D: đường kính vòng phân giải lớn (mm)
d: đường kính vòng đục lỗ hay đường kính khuẩn lạc (mm)
 Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân tử
Thuyết minh quy trình:
Chủng chọn lọc được định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S và so
sánh với GENBANK (do công ty Nam Khoa Biotek thực hiện).
Tách chiết bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit của QIAgen, khuếch đại trình tự 16S
rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự như sau:
27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)
Sản phẩm PCR được tinh chế và giải trình tự. Các trình tự nucleotide hoàn
chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ
BLAST.

49. 33
2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các
chủng sàng lọc.
Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm
Thuyết minh quy trình
NaOH 0,1N
NaOH 1N
Chitosan
to
=105o
C/4h
Dịch
Dịch
Tủa
Chủng vi sinh
vật
Nhân giống
Chuẩn bị/tiệt
trùng môi trường
lỏng
Lên men vi sinh vật
Ly tâm thu tủa 12000 v/p x 15p
Hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N
Hấp tiệt trùng 20p
Ly tâm thu tủa 12000 v/p x 15p
Hòa tan tủa bằng CH3COOH 1%, lắc 150 v/p trong 24h
Ly tâm thu dịch 4000 v/p x 15p
Trung hòa dịch
Ly tâm thu tủa 4000 v/p x 15p
Sấy khô tủa
Kiểm tra sự hiện diện
chitosan còn sót lại
hay không bằng
Lugol/H2SO4

50. 34
- Nhân giống: sau khi chủng vi sinh vật đã được làm thuần, tiến hành cấy
chuyền sang các đĩa môi trường phân lập chứa 2% huyền phù chitin để nhân giống.
- Giống vi khuẩn sẽ được tiến hành tăng sinh trong 25 ml môi trường NB. Ủ ở
37o
C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, điều chỉnh dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường
NB sao cho dịch vi khuẩn phải có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 –
tương đương 1,5 x 108
vi khuẩn/ml (Phụ lục G). Dịch này sẽ được sử dụng cho quá
trình lên men sản xuất chitosan.
- Lên men vi khuẩn: nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh enzyme chitin
deacetylase sản xuất chitosan từ chitin.
- Thành phần môi trường lên men cơ bản (Phụ lục E).
- Pha môi trường lên men cơ bản có bổ sung 0,05 g huyền phù chitin. Chuẩn
bị bình lên men 100 ml, dùng pipette hút 20 ml môi trường lên men cơ bản cho vào
mỗi bình, hấp tiệt trùng 121o
C trong 20 phút, sau khi hấp xong dùng micropipette
hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn (tỉ lệ cấy giống 10%) mật độ cấy giống đạt 1,5 x
108
vi khuẩn/ml vào mỗi bình lên men. Lên men 5 bình môi trường. Các bình lên
men được đem vào lắc tốc độ 150 vòng/phút trong 48 giờ.
- Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút x 15 phút: cho môi trường lên men đã được
cấy khuẩn lạc của chủng vi sinh vật vào mỗi ống eppendorf 2 ml để đem đi ly tâm
(12000 vòng/phút x 15 phút) để đổ dịch thu tủa, tủa gồm có xác vi sinh vật, chitin
và chitosan.
- Hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N: nhằm hòa tan xác vi sinh vật trong tủa.
- Hấp tiệt trùng: dịch thu được sau khi hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N được cho
vào các ống nghiệm và đem đi hấp tiệt trùng ở 121o
C trong 20 phút.
- Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút x 15 phút: Cho dịch vào các ống eppendorf
2 ml rồi đem đi ly tâm 12000 vòng/phút x 15 phút, đổ dịch thu tủa, tủa lúc này chỉ
còn chitin và chitosan.
- Hòa tan tủa bằng acid acetic 1%: nhằm hòa tan chitosan trong tủa. Tủa thu
được hòa tan bằng acid acetic 1% và đem đi lắc tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau khi lắc, tủa chỉ còn lại chitin không tan, chitosan sẽ hòa tan vào acid acetic 1%.

51. 35
- Ly tâm thu dịch 4000 vòng/phút x 15 phút: Đem các ống falcon chứa dịch
thu được đem ly tâm (4000 vòng/phút x 15 phút) để bỏ tủa thu dịch (tủa lúc này
chứa chitin không tan còn chitosan đã hòa tan vào dung dịch). Kiểm tra tủa xem có
còn lượng chitosan sót lại sau ly tâm hay không bằng phương pháp định tính
chitosan sử dụng Lugol/H2SO4.
- Phục hồi Chitosan: Cho dịch thu được vào các ống falcon mới và hút một
lượng NaOH 1N bằng với lượng acid acetic có trong mỗi ống falcon (tỉ lệ 1:1) để
trung hòa dịch chứa acid acetic. Lúc này, ta thấy có tủa trắng xuất hiện trong dung
dịch.
- Ly tâm (4000 vòng/phút x 15 phút): để bỏ dịch thu tủa, tủa lúc này chính là
chitosan.
- Tủa đã được rửa hai lần bằng nước cất để đạt pH trung tính (pH = 7).
- Sấy khô tủa: chuẩn bị cốc sấy và cân cốc, tiếp theo cho tủa thu được vào mỗi
cốc và đem đi sấy ở 105o
C/4 giờ. Tủa khô thu được sẽ cho vào đĩa mẫu để định tính
sự hiện diện của chitosan.
 Định tính sự hiện diện của chitosan
Sự hiện diện của chitosan được định tính theo phản ứng:
Kết tủa trắng thu được sau khi phục hồi chitosan được ly tâm ở 4000
vòng/phút x 15 phút. Tủa đã được rửa hai lần bằng nước cất (pH=7). Chuẩn bị cốc
sấy và cân cốc, tiếp theo cho tủa thu được vào mỗi cốc và đem đi sấy ở 105o
C/4 giờ.
Tủa khô thu được sẽ cho vào đĩa mẫu để định tính sự hiện diện của chitosan. Kết tủa
khô được sử dụng cho các xét nghiệm khẳng định:
- Trên tủa khô nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch iốt/kali iốt
- Hỗn hợp được acid hóa với 2 – 3 giọt H2SO4 1%.
 Dựa vào kết quả phản ứng của nhóm oligomers (chitosan) với KI trong điều kiện
acid Phản ứng dương tính thể hiện sau khi bổ sung Iod/KI màu vàng, kết tủa thay
đổi màu sắc thành màu nâu sẫm và việc bổ sung H2SO4 kết tủa màu nâu sẫm chuyển
sang màu tím sẫm trong dung dịch không màu.
 Phương pháp khảo sát hiệu quả của các cơ chất khác nhau đến việc sản xuất
enzyme

52. 36
Phương pháp: lên men chuyển hóa chitin thành chitosan: môi trường lên men
cơ bản bao gồm glucose 2%, cao thịt (meat extract) 1%, K2HPO4 0,04%, NaCl
0,1%. Thay đổi các thành phần môi trường lên men khác nhau (nguồn C, nguồn N,
nguồn muối) để sản xuất chitosan. Đánh giá hiệu quả sản xuất chitosan dựa vào chất
lượng chitosan tạo thành (độ hòa tan, mức độ deacetyl hóa) và hiệu suất thu hồi
chitosan.
Chitosan thu được sau quá trình lên men được sử dụng để xác định các thông
số:
 Hiệu suất thu hồi chitosan
Hiệu suất thu hồi chitosan được xác định bằng mức độ chuyển đổi chitin thành
chitosan. Ta bố trí thí nghiệm như sau:
- Cốc sứ được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105ºC trong 30 phút, đậy nắp cho vào
bình hút ẩm trong 15 phút. Cốc sứ được lấy ra cân ta có khối lượng m0.
- Chitosan thu hồi ở các mẫu được cho vào cốc sứ. Sấy ở nhiệt độ 105ºC trong
4h đến khi khối lượng không đổi. Khi đó lượng nước tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi
hết. Đậy nắp, cho cốc vào bình hút ẩm trong 15 phút. Sau đó tiến hành đem cân ta
được khối lượng m1
H (%) = Mchitosan/Mchitin *100
Trong đó: Mchitosan: khối lượng chitosan sau sấy
Mchitin: khối lượng chitin ban đầu sử dụng trong 20 ml môi trường lên
men
 Độ hòa tan chitosan
Độ hòa tan của chitosan được xác định bằng cách hòa tan một lượng mẫu
chitosan trong dung dịch acid acetic 1%. Ly tâm thu tủa, sấy và cân khối lượng tủa.
Độ hòa tan của chitosan là phần trăm chitosan tan trong acid acetic 1%.
Cân 0,25 g chitosan hoà tan trong 50 ml acid acetic 1%, khuấy đều trong 15
phút, lọc thu cặn (nếu còn), rửa bằng nước cất, sấy khô và cân lại. Độ hòa tan:
Trong đó: M là khối lượng của chitosan trước hòa tan (g)
%: X (%) = [(M – m) x 100]/M

53. 37
m là khối lượng chitosan còn dư sau phản ứng hoà tan (g).
 Xác định độ deacetyl hóa bằng phương pháp chưng cất với acid phosphoric
(H3PO4) (Li et al., 1997)
Nguyên lý: Khi chitosan tác dụng H3PO4 đặc ở nhiệt độ cao, gốc acetyl có
trong chitosan sẽ bị tách ra dưới dạng acetic acid và định lượng bằng NaOH 0,1N
theo phương pháp phân tích thể tích.
Cho 0,3 g chitosan vào dung dịch chứa 50 ml H2O và 50 ml H3PO4 85%, tiến
hành chưng cất với nhiệt độ tăng dần 1ºC trong một phút cho đến 160ºC, duy trì
nhiệt độ này trong 60 phút, định lượng dịch chưng cất bằng dung dịch NaOH 0,1 N
với chất chỉ thị màu phenolphtalein.
Độ deacetyl được tính theo công thức:
Trong đó: k = 2,03: hệ số liên quan đến phân tử lượng của chitin tính theo
lý thuyết.
V: thể tích thực chuẩn độ mẫu.
m: khối lượng phân tử đã dùng.
- Kết quả được đối chiếu với phân tích phổ FT-IR tại Trung tâm phân tích dịch
vụ thí nghiệm Thành phố
Phương pháp thực hiện:
Bột chitosan đã sấy khô được nghiền mịn sau đó ép viên với KBr. Phổ FT-IR
được ghi nhận trên máy FT-IR Vertex 70.
Phổ của mẫu chitosan dưới dạng đĩa KBr được thu bằng dụng cụ quét phổ IR
với dải tần số 4000 – 400 cm-1
. Mức độ deacetyl hóa (DDA) được đánh giá bằng
cách ghi lại độ hấp thụ ở 1655 cm-1
đối với nhóm amide-I và ở 3450 cm-1
đối với
nhóm OH trong chitosan. Độ hấp thụ của chitosan được sử dụng để tính mức độ
deacetyl hóa (DDA) bằng phương trình sau (Domszy and Roberts, 1985):
DDA(%) = [1- (A1655/ A3450)/1.33 × 100]
Hệ số 1,33: Tỷ lệ A1655 / A3450 đối với N-acetyl hóa hoàn toàn chitosan
DD (%) = 100 – k.V/m

54. 38
Môi trường lên men cơ bản bao gồm glucose 2%, cao thịt (meat extract) 1%,
K2HPO4 0,04%, NaCl 0,1%. Lần lượt khảo sát ảnh hưởng của các nguồn Carbon,
Nitơ, muối vô cơ đến hiệu quả sản xuất Chitosan. Điều kiện lên men được tiến hành
theo Guoying Zhou và cộng sự (2010) bao gồm nhiệt độ 37o
C, pH=6 và tốc độ lắc
150 vòng/phút.
 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon
Ảnh hưởng của nguồn carbon vào sản xuất CDA đã được thử nghiệm sử dụng
các nguồn carbon sau đây: glucose, sucrose, tinh bột. Mỗi nguồn khác nhau đã được
thử nghiệm riêng bằng cách thêm vào môi trường lên men cơ bản ở nồng độ 2%.
Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ
deacetyl hoá).
 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ
Để kiểm tra tác động của nguồn nitơ vào sản xuất CDA, các nguồn nitơ sau
đây đã được thử nghiệm: meat extract, casein, yeast extract. Mỗi nguồn khác nhau
đã được thử nghiệm riêng bằng cách thêm nó vào môi trường lên men cơ bản ở
nồng độ 1%. Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ
hoà tan, độ deacetyl hoá).
 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng
Tác dụng của muối vô cơ vào sản xuất CDA đã được thử nghiệm. Các muối
được khảo sát bao gồm: MgSO4, FeSO4 và K2HPO4. Mỗi muối đã được thử nghiệm
riêng trong môi trường lên men ở nồng độ 0,04%. Xác định hiệu suất thu hồi
chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá) và hoạt độ
enzyme chitin deacetylase.
 Hoạt độ enzyme chitin deacetylase: sử dụng phương pháp của Li (2007).
 Xây dựng phương trình đường chuẩn p-nitroaniline.
Cân 100 mg p-nitroaniline pha trong bình định mức 100 ml, ta có dung dịch p-
nitroaniline 0,1 mg/ml = 100 ug/ml

55. 39
Quét phổ UV/VIS tìm bước sóng hấp thụ cực đại λ max
DD
Ống 0
(blank)
Ống 1
Ống
2
Ống
3
Ống
4
Ống
5
Ống
6
Ống
7
Ống
8
Ống
9
Ống
10
Chuẩn p-
nitroaniline
100 ug/ml,
ml
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
H2O 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
50 mM
sodium
phosphate
buffer (pH
7.4)
3 3 3 3 3 3
Nồng độ p-
nitroaaniline,
ug/ml
0
=100*0,2/2,0
= 10
20 30 40 50 60 70 80 90 100
OD400
- Thiết lập phương trình đường chuẩn y = ax+b, trong đó y = Aλmax-A(0), x =
nồng độ p-nitroaniline Các thử nghiệm đã được thực hiện sử dụng một ống ly tâm
10 ml trong tổng số 5 ml mẫu. Đầu tiên, 3 ml đệm sodium phosphate (pH 7,4) 50
mM đã được ủ trong 15 phút ở 50°C, sau đó 1 ml dung dịch p-nitroacetanilide 200
mg/l và 1 ml mẫu enzym đã được thêm vào hỗn hợp. Phản ứng được ủ ở 50°C trong
15 phút trong một cốc nước. Sau khi ủ, phản ứng đã được kết thúc trong một cốc
nước sôi và protein đã được gỡ bỏ bằng cách ly tâm tốc độ 4000 rpm trong 10 phút.
Các dịch nổi được phân tích bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng Aλmax bằng máy
quang phổ. Các enzyme bất hoạt đã được sử dụng như mẫu trắng.
- Một đơn vị hoạt lực CDA được định nghĩa như là một lượng enzyme cần
thiết để chuyển hóa p-nitroanilide tạo ra 1 μg p-nitroaniline trong 1 giờ.
Hoạt lực CDA:
HL CDA (µg/ml/giờ) = ((Aƛ max-Ao)-b)*F*60 phút/(a*T phút)
Trong đó:
Aλmax = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng enzyme sau thời gian phản ứng
đo tại bước sóng hấp thụ cực đại.
A(0) = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng với enzyme bất hoạt đo tại bước
sóng hấp thụ cực đại.

56. 40
F = hệ số pha loãng
T là thời gian phản ứng enzyme (phút)
60 = 60 phút trong 1 giờ
 Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan
chitosan
Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến việc thu hồi chitosan được thay đổi
trong phạm vi 1% và 2%. Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan
tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá).
 Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi nguồn cơ chất cảm ứng
Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hiệu quả thu hồi chitosan được khảo sát
trên 2 nguồn cơ chất cảm ứng: Huyền phù chitin (Phụ lục B) và chitin thương phẩm
(được cung cấp bởi công ty VN Chitosan Kiên Giang). Xác định hiệu suất thu hồi
chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá).
 So sánh chitosan tạo thành với chitosan thương mại và chitosan hóa học
Sử dụng các điều kiện tối ưu đã được khảo sát tại phòng thí nghiệm: môi
trường lên men, nồng độ acid acetic, cơ chất cảm ứng. Cùng các thông số kỹ thuật
của môi trường lên men đã được báo cáo bởi (Guoying et al., 2010): nhiệt độ 37o
C,
pH = 6 và tốc độ lắc 150 vòng/phút. So sánh chitosan tạo thành của 3 chủng vi sinh
vật với chitosan thương phẩm (cung cấp bởi công ty VNChitosan Kiên Giang, độ
deacetyl đạt 85%) và chitosan hóa học sản xuất tại Phòng thí nghiệm (phụ lục D).
Đánh giá dựa trên các yếu tố:độ deacetyl, độ nhớt, MW, độ hòa tan, phổ IR, khả
năng kháng khuẩn.
 Độ deacetyl (theo phương pháp trên)
 Khối lượng phân tử MW
Độ nhớt và phân tử lượng trung bình

57. 41
Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald
Cân 0,25 g chitosan hòa tan trong 50 ml acid acetic 5%. Lấy 25 ml hỗn hợp
dung dịch trên cho vào nhớt kế Ostwald, đo thời gian dung dịch chitosan chạy từ
vạch A xuống vạch B. Thực hiện tương tự với nước cất.
Đo độ nhớt động học: v/t = vH2O / t H2O
Do đó:
Độ nhớt đặc trưng và phân tử lượng trung bình của chitosan có mối liên hệ
theo công thức mô tả của Chang (1997) [30]:
Trong đó: η’: Độ nhớt đặc trưng của polyme
η’ = η/C
C: nồng độ chitosan (g/100 ml )
K= 3,04 x 10-5
η’(cp) = K * Ma
η(cp) = ( vH2O / t H2O ) * t (vH2O ở 30ºC = 0,798 cp)

58. 42
 Độ hòa tan (theo phương pháp trên)
 Đánh giá khả năng kháng khuẩn chitosan
Khả năng kháng khuẩn của chitosan của 3 chủng CD1, CD5, CD10 trên đối
tượng vi khuẩn gây bệnh E.coli (Gram dương) được đánh giá theo 2 cách:Định tính
bằng phương pháp đục lỗ thạch và định lượng bằng phương pháp MIC.
Các bước thực hiện:
- Chuẩn bị dịch chitosan: Mẫu chitosan của các chủng CD1, CD5, CD10 được
chuẩn bị cho các thử nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn.
- Cân 2 g chitosan mỗi mẫu pha trong 100 ml acid acetic 2% ta được chitosan
nồng độ 20,000 ppm.
- Dung dịch chitosan nồng độ 20,000 ppm được pha loãng sử dụng dung dịch
NB thành các dãy nồng độ 10000 ppm; 5000 ppm; 2500 ppm; 1250 ppm; 625 ppm;
312,5 ppm; 156,25 ppm; 78,125 ppm.
- Các dung dịch chitosan này được sử dụng cho các thử nghiệm khả năng
kháng khuẩn tiếp theo.
Định tính: Phương pháp đục lỗ thạch
- Tăng sinh vi khuẩn trước 24 giờ trong ống nghiệm chứa môi trường Nutrient
Broth.
- Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý sao cho dịch vi
khuẩn phải có độ đục bằng độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0,5 – tương đương 1,5
x 108
vi khuẩn/ml (Phụ lục G).
- Trang 0,1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Nutrient Agar.
- Dùng cây đục thạch đục lỗ có đường kính 6 mm. Đục 5 lỗ giếng thạch tương
đương 5 nồng độ chitosan.
- Dùng micropipette nhỏ dịch chitosan vào các giếng thạch tương ứng với 5
nồng độ chitosan 1250 ppm; 625 ppm; 312,5 ppm; 156,25 ppm; 78,125 ppm.
- Sử dụng đĩa đối chứng dương là chitosan 2% và đối chứng âm là chitin.
- Ủ ở 37C trong 24 giờ sau đó đọc kết quả.
- Mục tiêu: khảo sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn của màng trên đĩa thạch.
Định lượng: Phương pháp MIC (Minimum Inhibitory Concentration)