LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN XUÂN THÀNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH
HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG
SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên, 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN XUÂN THÀNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH
HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG
SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số : 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. Đỗ Hữu Nghị
2.TS. Nguyễn Xuân Vũ
Thái Nguyên 2019

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu.
Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày
trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng
được ai công bố trước đây.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Xuân Thành

ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học
các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) và có liên quan đến nội dung
nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh
quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá các hợp chất có hoạt tính chống ung
thư mức độ tế bào và hướng đích phân tử" (VAST 04.05/18-19). Để hoàn thành
được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá
nhân và tập thể.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Đỗ Hữu Nghị và
TS. Nguyễn Xuân Vũ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong
quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận
văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán bộ tại phòng Sinh
học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm
KHCNVN) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực
phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang
bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ
động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
MỤC LỤC..................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH.........................................................................................vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu. ..........................................................................................2
3. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. ..............................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 1
1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu....................................1
1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu...............................................................2
1.2.1. Tổng quan về ung thư...............................................................................2
1.2.2. Ung thư cổ tử cung ...................................................................................7
1.2.3. Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học..........................9
1.2.4. Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle).........................................11
1.2.5. Hoạt tính điều hòa yếu tố nhân kappa B (NF-B) .................................12
1.2.6. Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh
quang tế bào và đích phân tử............................................................................15
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 22
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ................................................................22
2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................22
2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật
huỳnh quang tế bào...........................................................................................22
2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín
hiệu huỳnh quang đặc trưng. ............................................................................22
2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB. ......................22
2.3. Vật liệu...........................................................................................................22
2.3.1.Dòng tế bào..............................................................................................22
2.3.2.Mẫu thử nghiệm.......................................................................................22

iv
2.3.3. Môi trường nuôi cấy tế bào ....................................................................23
2.3.4. Hóa chất và thiết bị.................................................................................24
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................24
2.4.1. Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào ...................................................................24
2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT .....25
2.4.3. Kích hoạt yếu tố NF-κB .........................................................................27
2.4.4. Cố định tế bào.........................................................................................27
2.4.5. Nhuộm huỳnh quang tế bào và đích phân tử..........................................28
2.4.6. Thu nhận và phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trên hệ Olympus
scanR.................................................................................................................28
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 30
3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư .......................................30
3.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào
HeLa......................................................................................................................32
3.2.1. Kích thích chuyển vị NF-κB...................................................................32
3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang ............................................................33
3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh ....................................................35
3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB .....................................................37
3.2.5. Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB trên tế bào HeLa .........42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................................... 43
1. Kết luận.............................................................................................................43
2. Đề nghị..............................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44

v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CHLB: Công hòa liên bang
CTC: Cổ tử cung
DMEM:
Dulbecco’s modified Eagle medium – Môi trường nuôi cấy tế bào
DMEM
DMSO: Dimethyl Sunfoxide
EMEM: Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM
GFP: Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh
HBV: Hepatitis B virus – Viêm gan B
HCTN: Hợp chất tự nhiên
HCV: Hepatitis C virus – Viêm gan C
Hela: Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung
Hep-G2: Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan
HPV: Human papilloma virus – Virus u nhú ở người
IC50: Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể
KHCNVN: Khoa học và công nghệ Việt Nam
MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
NF-κB:
Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu
tố nhân kappa B
OD: Optical density – Mật độ quang học
PBS: Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate
TB: Tế bào
Tp: Thành phố
UTCTC: Ung thư cổ tử cung
UTG: Ung thư gan

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số
hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.................................................. 23
Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên
dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa.......................................................... 30

vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư ......................................................... 3
Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế
giới năm 2018 cả hai giới ............................................................................ 5
Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư ........................................................... 6
Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm. ........................... 13
Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang.................................... 21
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan ......................................... 26
Hình 3.1: Biểu đồ khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các
nồng độ khác nhau của các mẫu tinh sạch có biểu hiện hoạt tính ............. 32
Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế
bào HeLa. Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) và TNF (--▲--) ......... 33
Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak
chỉnh tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z ................................... 34
Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65
(GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang
(MERGE). Hình ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang
Olympus scanˆR. ......................................................................................... 35
Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng
phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2................... 36
Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích
chính Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng
vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đường viền phân
tách tốt với khoảng cách (distance) = -1.................................................... 37
Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis
ver.2.7.2. Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-110 ng/mL trong 30 phút......... 38
Hình 3.9: Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein
p65 vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm
Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2........................................................... 39

viii
Hình 3.10: Xác định hệ số Z' đối với nhóm đối chứng (control) và tế bào HeLa
kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên). Biểu đồ phân tán cường độ tín
hiệu vùng tế bào chất và trong nhân với đối chứng Control (-) và kích
hoạt với IL-1 (hình dưới)............................................................................. 41
Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB)
của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự
chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP). Nhân được xác định đồng thời với
nhuộm DAPI. ............................................................................................. 42

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan
tâm lớn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm mới có ích cho con người từ xa
xưa tới nay. Sự đa dạng sinh học và hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò
quan trọng trong lĩnh vực này. Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để
phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên này một
cách có hiệu quả. Qua quá trình phát triển với việc áp dụng những công nghệ tiên
tiến, ngày nay nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học đã trở thành cơ sở
chính của sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening -HTS) ở nhiều nước
trên thế giới nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng. Các phương pháp thử nghiệm
sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các
hợp chất tiềm năng cho nhiều mục đích sinh học khác nhau. Trong đó lĩnh vực mà
các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc
chống ung thư. Điển hình như gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã
có nhiều thành công trong lĩnh vực này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi
FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư.
Công nghệ ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được
phát triển nhằm truy suất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích
khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước
thực nghiệm. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có
thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình tế bào từ
đó đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân
tay sinh học” (fingerprint). Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong
quá trình sống và phân chia của tế bào. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi
huỳnh quang tế bào có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu tế bào (yếu tố
NF-κB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor...), sinh lý tế bào (sự tăng sinh TB,
phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương
trình của TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh

2
(miễn dịch, tim mạch, các bệnh truyền nhiễm...) và đánh giá chức năng phân tử
đích. Sử dụng kỹ thuật này trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học,
nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời
gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung
cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc hiệu
năng cao dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đang là nhân tố cốt lõi
trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại.
Nhằm tiếp cận và bước đầu ứng dụng kỹ thuật hiện đại trong sàng lọc đánh
giá các chất có hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào
trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học".
2. Mục tiêu nghiên cứu.
Mục tiêu đề tài luận văn là nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích
hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào trong sàng lọc các chất có hoạt tính chống ung
thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) ở điều kiện trong nước.
3. Đối tượng nghiên cứu.
* Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào
ung thư cổ tử cung HeLa
* Đánh giá hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích chuyển vị protein nội
bào (yếu tố nhân NF-κB) sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào
với kính hiển vi huỳnh quang tự động.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.
Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử
nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào
xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA
(electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc
hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các yếu
điểm của phương pháp này là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu
phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan sát giảm 50 % độ
mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50 % trong 100 %

3
quần thể đó. Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào flow cytometry có thể cung cấp
nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này
không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang.
Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào
và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang. Do vậy chúng tôi nghiên
cứu kết hợp phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh nội hàm
cao trên hệ thiết bị hiển vi tự dộng Olympus scanˆR với quy trình đơn giản hơn và
chi phí thấp, phù hợp với điều kiện trong nước. Hơn nữa, quy trình này đồng thời có
thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính
tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear
factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy
hóa, ung thư và quá trình viêm.

1
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu
Ung thư là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước có nền kinh tế phát
triển và thứ hai ở các nước đang phát triển. Gánh nặng ung thư ở các nước đang
phát triển tăng lên do hậu quả của lối sống không lành mạnh như hút thuốc lá, uống
rượu bia, ít vận động hay ô nhiễm thực phẩm và môi trường. Chúng ta đã biết thực
phẩm lành mạnh đóng vai trò quan trọng trong phòng và điều trị bệnh mãn tính
không lây trong đó có ung thư. Chính vì vậy, hiện nay các nhà khoa học không
ngừng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt các hợp chất
thiên nhiên có nguồn gốc thực vật, góp phần tích cực hỗ trợ điều trị bệnh ung thư.
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có
một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Với nguồn thực vật phong phú
không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa
bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói
chung. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có
sẵn ở nước ta để hỗ trợ điều trị ung thư đã và đang được nhiều nhà khoa học và thầy
thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay [1].
Trong khoa học đã khám phá và sử dụng được nhiều hợp chất thiên nhiên
(HCTN) có hoạt tính sinh học quý từ động, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, thế
giới sinh vật rất phong phú và đa dạng, vẫn còn nhiều loài sinh vật chưa được
nghiên cứu khai thác, đặc biệt là các sinh vật ở biển sâu [3]. Do vậy, nguồn HCTN
(sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát
triển dược phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay. Việc sàng lọc các hoạt
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để xác định các chất tiềm năng là vấn đề cần
quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc. Trong đó, lĩnh vực
mà các HCTN và bán tổng hợp vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các
thuốc chống ung thư.

2
Công nghệ ghi hình ảnh tế bào (TB) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự
động được phát triển nhằm truy xuất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các
mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được
các bước thực nghiệm ngày nay đang được các nhà khoa học quan tâm và được
nhiều phòng thí nghiệm trong điểm quốc gia đầu tư bài bản và hiện đại. Bằng việc
sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh
hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình TB từ đó đưa ra các chẩn đoán
về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint).
Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong chu trình sống và phân chia
của TB. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang TB có thể được
ứng dụng trong phân tích các tín hiệu TB (yếu tố NF-KB, Wnd/fzd, akt,
glucocorticoid receptor,…), sinh lý TB (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể,
chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương trình của TB - apoptosis),
đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh (miễn dịch, tim mạch, các
bệnh truyền nhiễm,…) và đánh giá chức năng giúp các nhà hóa học, các nhà dược
học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh
phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung cấp các
thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng
Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN) – là đơn vị đầu tiên được trang bị
hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus
scan’R (Heidelberg, CHLB Đức) sử dụng cho mục đích sàng lọc, đánh giá các chất
hoạt tính sinh học. Do vậy, đề tài này xuất phát từ yêu cầu và tính cấp thiết của việc
phát triển các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học đạt trình độ tiên tiến, có
độ chính xác cao, mặt khác nội dung thực hiện của đề tài này bao gồm sàng lọc,
phân tích hoạt tính chống ung thư của một số mẫu hợp chất thiên nhiên ứng dụng kỹ
thuật sàng lọc/phân tích hình ảnh huỳnh quang TB.
1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu
1.2.1. Tổng quan về ung thư
Ung thư là một thuật ngữ được sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất thường
phân chia không kiểm soát và các thể xâm nhập vào các mô khác. Các TB ung thư
có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống máu và hạch bạch
huyết. Có hơn 100 loại ung thư khác nhau đã được biết đến trong y văn thế giới, hầu

3
hết chúng được đặt tên dựa vào mô hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh [11]. Mỗi loại
ung thư đều trải qua nhiều giai đoạn thứ tự thời gian: giai đoạn khởi phát, giai đoạn
tăng trưởng và thúc đẩy, giai đoạn lan tràn, giai đoạn tiến triển – xâm lấn - di căn. Từ
một tế bào, qua quá trình khởi phát dẫn đến những biến đổi mà không thể khồi phục kết
quả là hình thành ung thư. Nếu không có sự sửa chữa hoặc có nhưng không kết quả thì
cuối cùng ung thư sẽ có biểu hiện trên lâm sàng và dẫn đến tử vong.
Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư
Ngày nay, ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng và
đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới. Nguyên nhân ung thư có thể gây ra theo
một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền và các
yếu tố môi trường. Người ta ước tính khoảng 95% các loại ung thư là do lối sống và
có thể mất khoảng 20 - 30 năm để phát triển thành ung thư. Con người hiện tại đang
phải đối mặt với tỷ lệ ung thư và tử vong do ung thư ngày càng tăng [20]. Trong
năm 2018, đã có khoảng 9,6 triệu người tử vong và hơn 18 triệu người bị ảnh hưởng
trực tiếp bởi các loại ung thư khác nhau trên quy mô thế giới theo số liệu
GLOBOCAN toàn cầu gần đây nhất của cơ cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế
[28]. Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, gan, ruột kết,
trực tràng và ung thư tuyến tiền liệt, trong khi phụ nữ thường bị ung thư vú, ruột
già, trực tràng và ung thư dạ dày [6].
Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thư, bệnh tim
mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa,
cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khỏe con
người mỗi ngày [7]. Theo thống kê của một số bệnh viện ung bướu ở Hà Nội, Hồ
Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000

4
người mắc phải các loại ung thư khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000
bệnh nhân) tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hướng tăng trong
tương lai gần. Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thư mới và
100.000 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam [31].
Những bệnh ung thư phổ biến nhất thế giới

5
Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới
năm 2018 cả hai giới .

6
Ung thư là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thư phát sinh từ sự thay đổi
(đột biến) trong ADN (deoxyribonucleic acid) của TB bình thường. Ung thư bắt đầu
gây tổn hại tới một hoặc nhiều gen trong một TB đơn lẻ. Tổn thương này làm cho các
TB tăng sinh không kiểm soát được và tạo ra những TB bất thường. Ở giai đoạn này,
nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những TB bất thường
này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành TB ung thư. Các đặc tính của
TB ung thư là chúng phân chia nhanh hơn các TB bình thường và hình thành khối u ác
tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe mạnh. Quá trình của một TB bình
thường trở thành khối ung thư thường mất nhiều năm để phát triển.
Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư

7
Trong nghiên cứu in vitro cũng đã phân lập được hơn 200 dòng tế bào ung thư
ở người và ngày càng được các phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm ứng dụng
cho việc sàng lọc để tìm kiếm các thuốc tiềm năng chống ung thư trong tương lai.
Trong đó có thể kể đến hai dòng ung thư phổ biến là dòng tế bào ung thư gan người
(HepG2) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (HeLa). Ngày nay, việc nghiên
cứu sàng lọc để tìm kiếm các hoạt chất chống lại ung thư đã và đang được quan tâm
hàng đầu từ các nhà khoa học theo hướng ức chế biểu hiện hoạt tính của một
enzyme tham gia vào quá trình phát triển và di căn khối u, hoặc ức chế sự hình
thành mạch và sự xâm nhập của các khối u nguyên phát ở mức độ tế bào, do đó có
thể được sử dụng để ức chế sự di căn của khối mô ung thư.
1.2.2. Ung thư cổ tử cung
Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là ung thư hình thành trong mô cổ tử cung
(CTC) được gây ra bởi việc nhiễm virus sinh nhú ở người (HPV). Hầu hết các
trường hợp UTCTC đều bắt đầu trong vùng chuyển tiếp giữa cổ trong và cổ ngoài,
các TB vùng chuyển tiếp bị tổn thương, nhiễm HPV và biến đổi dẫn dần, phát triển
thành các tổn thương tiền ung thư rồi UTCTC. UTCTC là bệnh ung thư tiến triền
chậm, giai đoạn đầu thường không có triệu chứng và có thể phát hiện thông qua các
phương pháp sàng lọc UTCTC [2].
UTCTC gồm hai loại chính là ung thư TB biểu mô vảy và ung thư TB tuyến,
khoảng 80% đến 90% UTCTC là ung thư TB biểu mô vảy phát triển trong TB vảy
bao phủ bề mặt vùng cổ ngoài CTC, thường bắt đầu ở vùng chuyển tiếp. Ung thư
TB tuyến CTC phát triển từ các TB trụ vùng cổ trong CTC. Có tỷ lệ rất nhỏ UTCTC
có các tổn thương của cả hai loại ung thư biểu mô TB vảy và TB tuyến gọi là ung
thư hỗn hợp [2].
1.2.2.1. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên Thế giới
UTCTC là loại ung thư hay gặp ở nữ giới. Bệnh tiến triển qua nhiều năm, ước
tính trên thế giới có khoảng 1,4 triệu phụ nữ mắc UTCTC và nhiều hơn gấp 2 - 5
lần (khoảng 7 triệu) phụ nữ có triệu chứng tiền lâm sàng cần được phát hiện và điều
trị. Theo kết quả của các ghi nhận ung thư trên thế giới, UTCTC đứng hàng thứ ba
trong các loại ung thư chung, đứng thứ hai trong các ung thư ở nữ giới sau ung thư

8
vú và đứng thứ tư trong số các nguyên nhân gây tử vong ở phụ nữ trên toàn thế giới.
Tỷ lệ mắc UTCTC có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây, đặc biệt tại các
nước nghèo và nếu không có biện pháp can thiệp thì tỷ lệ tử vong do UTCTC sẽ
tăng 25% trong vòng vài năm tới. Theo báo cáo của IARC (Hiệp hội nghiên cứu
ung thư Quốc tế), năm 2008 thế giới có khoảng 529.828 trường hợp mắc trong đó
trên 85% các trường hợp ung thư và tử vong xảy ra ở các nước đang phát triển [2].
Cũng như các nước trong khu vực Đông Nam Á, tại Việt Nam UTCTC là một
trong những loại ung thư phổ biến nhất ở nữ giới và là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu do ung thư đối với phụ nữ. Theo thống kê, năm 2008 Việt Nam có khoảng
5.174 trường hợp mới mắc với tỷ suất là 11,7/100.000, chiếm 11,65% số trường hợp
mới mắc của các nước Đông Nam Á (44.404 trường hợp). Ước tính đến năm 2025
tỷ lệ tử vong do UTCTC tăng lên từ 62% (ở nhóm dưới 65 tuổi) hoặc 75% (ở nhóm
trên 65 tuổi) so với năm 2008 [2].
1.2.2.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung
UTCTC là kết quả từ sự phát triển và phân chia bất thường TB vùng ranh giới
CTC, nguyên nhân chính là do nhiễm HPV - vi rút lây truyền chủ yếu qua đường
tình dục khi người phụ nữ còn trẻ. Thông thường, các lớp trên cùng của biểu mô
CTC chết đi và bong ra, và các TB mới lại tiếp tục được sản sinh nên hầu hết viêm
nhiễm đều tự biến mất mà không hề có triệu chứng. Tuy nhiên, trong trường hợp
viêm nhiễm HPV kéo dài (chiếm khoảng 5 - 10% các trường hợp nhiễm HPV),
người phụ nữ nhiễm HPV và phối hợp với các yếu tố nguy cơ khác, tiến trình này bị
ngắt quãng, các TB có xu hướng tiếp tục sản sinh, trước tiên sẽ trở thành bất thường
(tiền ung thư) và sau đó sẽ xâm lấn tới các biếu mô phía dưới (ung thư xâm lấn). Sự
tiến triển từ nhiễm HPV đến ung thư xâm lấn rất chậm, thường từ 10 đến 15 năm,
có thể kéo dài đến 30 năm, do đó thường gặp UTCTC ở phụ nữ tuổi 40 - 50 [2].
Quá trình tiến triển từ tổn thương tiền ung thư đến UTCTC phụ thuộc rất
nhiều vào độ tuổi có tổn thương tiền ung thư, mức độ tổn thương tiền ung thư, mức
độ tổn thương và kết quả điều trị UTCTC [2].
Thời gian tiến triển từ loạn sản đến ung thư biểu mô tại chỗ khác nhau tùy vào
từng giai đoạn: đối với loạn sản nhẹ là 85 tháng, đối với loạn sản nhẹ và vừa là 58

9
tháng, 38 tháng đối với loạn sản vừa và 12 tháng đối với loạn sản nặng. Tuổi trung
bình của các bệnh nhân loạn sản trẻ hơn 5 – 10 năm so với bệnh nhân ung thư biểu
mô tại chỗ và trẻ hơn 10 – 15 năm so với bệnh nhân UTCTC xâm nhập [2].
1.2.2.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thư cổ tử cung
Mối liên hệ giữ HPV và UTCTC đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu tại
các nước khác nhau trên thế giới. Bên cạnh UTCTC, HPV còn có mối liên quan với
các ung thư đường sinh dục khác như ung thư âm đạo (hơn 64% ung thư âm đạo có
HPV dương tính), ung thư trực tràng (hơn 88% có HPV dương tính) và ung thư
dương vật (hơn 80% có HPV dương tính). Bênh ngoài cơ quan sinh dục, các nghiên
cứu cũng chỉ ra rằng HPV cũng có thể là yếu tố nguy cơ của một số loại ung thư
khác như ung thư da, ung thư tổ chức liên kết, ung thư vòm họng. Gần đây, các nhà
khoa học đã tìm thấy sự hiện diện của HPV trong 93 - 100% các trường hợp ung thư
TB biểu mô vảy ở CTC, khảo sát vi thể cho thấy các hình ảnh đặc trưng của TB
nhiễm HPV là lớp TB bề mặt có hình ảnh loạn sừng, á sừng và những TB rỗng có
nhân to, đa nhân, tăng sắc [2].
Mặc dù nguyên nhân gây tổn thương tiền ung thư và UTCTC là vi rút HPV đã
được thừa nhận nhưng có nhiều yếu tố nguy cơ có liên quan chặt chẽ đến sự suất
hiện bệnh như các yếu tố liên quan đến hành vi tình dục không an toàn, yếu tố liên
quan đến sinh đẻ (có thai lần đầu sớm, khoảng cách mang thai giữa hai lần ngắn,
sẩy thai,…), sử dụng thuốc tránh thai đường uống trong thời gian dài, tiền sử gia
đình mắc UTCTC, hệ thống miễn dịch yếu, chế độ dinh dưỡng, tuổi, chủng tộc và
hút thuốc lá cũng được biết đến là yếu tố nguy cơ gây UTCTC [2].
1.2.3. Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
Trong khi các lĩnh vực y học chẩn đoán, xác định căn nguyên gây các bệnh lý
khác nhau đã phát triển theo thời gian cùng với những hiểu biết ngày càng sâu và
rộng hơn của con người về các nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh, chẳng hạn
việc xác định nguồn gốc của nhiều bệnh truyền nhiễm gắn liền với sự phát minh và
phát triển của kính hiển vi. Nền công nghiệp hóa dược là một lĩnh vực quan trọng
nhưng ra đời sau này và phát triển chủ yếu trong vòng 100 năm gần đây. Nghiên
cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loại cây cỏ (ban đầu

10
phần lớn là các loại alkaloid) được chiết xuất thành công vào đầu thế kỷ 20 là điểm
khởi đầu cho công nghiệp hóa dược, trong đó có thể xem morphin và papaverine
chiết xuất từ cây Anh túc (Papaver somniferum) như những ví dụ điển hình. Nửa
cuối thế kỷ thứ 19 được đánh dấu bằng các nghiên cứu dược lý đầu tiên nhằm làm
sáng tỏ cơ chế tác dụng của các thuốc đã biết trên các mô hình động vật thí nghiệm.
Theo những mô hình này, các dịch chiết hay các hợp chất từ dược liệu đã được thử
nghiệm trên các mô hình cơ quan động vật (ex vivo) và mô hình động vật in vivo.
Phương pháp nghiên cứu dược lý mà ngày nay đã trở thành “kinh điển” này thực tế
đã trở thành một phương pháp hiệu quả để phát hiện ra nhiều dược phẩm mới trong
suốt thế kỷ 20 vừa qua [24]. Nhờ những phát minh mới của các nhà khoa học,
ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã cung cấp cho con người nhiều loại thuốc
quý có tác dụng phòng và điều trị nhiều loại bệnh nguy hiểm như các chất kháng
sinh điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm, các corticosteroid chống viêm,
chống dị ứng, các thuốc điều trị ung thư như vincaleucoblastin, vincaleucocristin từ
lá dừa cạn, taxol từ thông đỏ. Các HCTN có hoạt tính sinh học không những được
sử dụng rộng rãi trong y học mà còn được sử dụng trong sản xuất các loại thực
phẩm chức năng là các sản phẩm nâng cao sinh lực, sức khỏe, tăng cường miễn dịch
cho con người, chống oxy hóa, chống lão hóa, phòng và hỗ trợ điều trị bệnh như các
Carotenoid, các flavonoid, các vitamin, các acid amin và các enzyme [3]. Đã có
nhiều nghiên cứu chứng minh HCTN có tác dụng rất cao trong việc hỗ trợ và điều
trị bệnh nhưng lại rất an toàn đối với sức khỏe con người. Do vậy việc tận dụng
HCTN sẵn có và tiêu chuẩn hóa các sản phẩm dược có nguồn gốc tự nhiên đang là
một đòi hỏi cấp bách trong quá trình hiện đại hóa, công nghiệp hóa dược kết hợp
giữa đông – tây y ở nước ta. Muốn vậy, các nghiên cứu nhằm xác định các cơ chế
tác dụng, phát hiện các mục tiêu phân tử, xác định các thành phần có hoạt tính sinh
học và độc tính của dược liệu cần được triển khai một cách toàn diện và hệ thống.
Các phương pháp sàng lọc nhanh hiện nay không những cho phép đánh giá hoạt
tính sinh học của các hợp chất mới mà còn cho biết các số liệu về dược động học và
chuyển hóa của các dược chất có tiềm năng mới [25], [27]. Việc tự động hóa quá
trình sàng lọc, hiện nay cho phép sàng lọc hàng nghìn chất một ngày trên một đích
phân tử riêng biệt [4], [16], [29]. Mặc dù vậy, sự phát hiện và phát triển các thuốc

11
mới dường như ngày càng trở nên khó khăn hơn. Có nhiều nguyên nhân giải thích
cho hiện tượng này, nhưng một nguyên nhân bắt nguồn từ thực tế hiện nay là y học
đã có thuốc tương đối tốt cho nhiều bệnh phổ biến, việc đầu tư phát hiện và phát
triển một thuốc mới có tác động cùng đích và hiệu quả hơn thuốc đã biết sẽ ngày
càng hiếm hơn.
Dễ nhận thấy rằng việc sàng lọc hoạt tính để xác định các chất tiềm năng là
vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc. Nhiều
hoạt tính sinh học được sàng lọc, giúp rút ngắn thời gian và chi phí cho quá trình
phát triển thuốc và số lượng lớn các thuốc mới đã được chuyển giao từ các chất
tiềm năng này. Các phương pháp thử nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở
thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các hợp chất tiềm năng cho nhiều mục
đích sinh học khác nhau. Trong đó các HCTN vẫn giữ vai trò quan trọng trong việc
khai thác thuốc ứng dụng để phòng và hỗ trợ điều trị ung thư. Điển hình như gần
đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã có nhiều thành công trong lĩnh vực
này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng
điều trị ung thư. Để có thành công đó, việc ứng dụng kỹ thuật phân tích tế bào và
đích phân tử trong sàng lọc hoạt tính của nó đóng vai trò quan trọng.
1.2.4. Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle)
Mật độ và kích thước nhân là các đặc điểm đặc trưng cho các giai đoạn của
chu kỳ TB. Điểm kiểm soát chu kỳ TB được sử dụng nhằm giám sát và điều tiết
diễn biến chu trình TB. Điểm kiểm soát có vai trò ngăn chặn chu kỳ TB tại một số
điểm nhất định, nhờ đó TB có thể kiểm định lại một số diễn biến và quá trình cần
thiết cũng như sửa chữa những chỗ sai hỏng của ADN. TB không thể thực hiện pha
kế tiếp của chu kỳ cho đến khi nó thỏa mãn các yêu cầu mà điểm kiểm soát đặt ra.
Một số điểm kiểm soát được thiết kế để đảm bảo các ADN bị sai hỏng hay thiếu sót
sẽ không được truyền cho các TB con cháu. Hai điểm kiểm soát nhưu vậy tồn tại là
điềm kiểm soát G1/S và điểm kiểm soát G2/M. Trong các khối u tỷ lệ TB trong trạng
thái sẵn sàng phân bào so với các TB ở trạng thái pha G0 cao hơn nhiều so với các

12
TB bình thường; trong khi đó các TB bị chết rụng hay già lão vẫn không thay đổi.
Do vậy tính tổng cộng thì số TB khối u sẽ từ từ tăng dần lên. Những TB đang trải
qua chu kỳ một cách tích cực là mục tiêu trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư vì
các ADN của chúng bộc lộ tương đối rõ rệt trong quá trình phân bào và vì vậy trong
việc điều trị ung thư (phương pháp debulking), lúc này một số lớn các TB khối u bị
loại bỏ và khiến một số lớn TB khối u còn trong pha G0 bị chuyển sang G1. Các TB
này nhanh chóng bị tiêu diệt bởi thuốc ngay khi mới chớm thực thi chu kỳ TB [21].
1.2.5. Hoạt tính điều hòa yếu tố nhân kappa B (NF-B)
Được phát hiện đầu tiên bởi Sen & Baltimore vào năm 1986, NF-κB (Nuclear
factor-kappa B) lúc đầu được xem như là yếu tố nhân (yếu tố phiên mã) của riêng tế
bào B (tế bào lympho B có chức năng sản xuất kháng thể liên kết tác nhân gây
bệnh), sau này chúng không chỉ được tìm thấy trong tế bào B mà còn trong rất nhiều
loại tế bào khác nhau. Hiện nay đã có 5 thành viên của họ NF-κB được xác định:
p105/p50 (nfkb1), p100/p52 (nfkb2), p65 (RelA), RelB và c-Rel. Một đặc trưng
quan trọng của NF-κB là tất cả các thành viên của họ này đều bảo tồn được một
vùng (domain) Rel giống nhau. Domain này chứa khoảng 300 amino acid chịu trách
nhiệm chính cho quá trình gắn với DNA, nhị phân hóa và tương tác với IκB - chất
ức chế nội bào của NF-κB [15].
Vai trò của yếu tố nhân NF-κB bao gồm:
(i) Điều hòa quá trình sao mã của rất nhiều loại tế bào khác nhau trong đáp
ứng với các kích thích như viêm và miễn dịch;
(ii) Hoạt hóa NF-κB cũng đóng vai trò quan trọng trọng quá trình chống virus
của tế bào thông qua điều hòa hoạt động của gene mã hóa cho interferon;
(iii)Trong hầu hết các loại tế bào thì NF-κB điều hòa các tín hiệu sống sót của
tế bào. Tuy nhiên trong một số trường hợp, yếu tố này lại gây nên chết tế bào theo
chương trình apoptosis;
(iv)Quá trình điều hòa bất hợp lý của NF-κB là nguyên nhân gây nên nhiều
bệnh lý khác nhau như ung thư, thoái hóa thần kinh, viêm khớp, hen phế quản…..

13
(v) NF-κB cũng đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình phát triển bình thường
của phôi thai. Rối loạn điều hòa NF-κB là nguyên nhân của nhiều dị tật bẩm sinh [15].
Yếu tố nhân kappa B, NF-κB, là một yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá
trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh
viêm và ung thư. Khi tế bào ở trạng thái nghỉ, NF-κB tồn tại trong bào tương ở dạng
tương tác không đồng hóa trị với các protein IκB (IκB-, IκB-, IκB-𝛾, IκB-ε, Bcl-3,
p100 và p105). Tất cả các IκB này đều chứa các đoạn lặp lại là ankyrin. Các ankyrin
này điều hòa quá trình gắn kết giữa IκB - NF-κB và tương tác với một vùng trên RHD
của NF-kB do đó che mất phần NLS (nuclear localization sequence) nên phân tử NF-
κB không thể di chuyển từ bào tương vào nhân được. Những tác nhân hoạt hóa NF-κB
gây nên quá trình phosphoryl hóa các IκB. Kết quả là IκB bị giáng hóa bởi quá trình
thủy phân protein hoặc bị phân hủy do các proteasome hay các protease khác. Khi đó
các NF-κB sẽ được giải phóng, đi vào nhân tế bào và kích hoạt quá trình sao mã tại đây
[23]. Sự kích hoạt sai lệch tín hiệu NF-κB có liên quan đến các bệnh viêm như viêm
khớp dạng thấp và hen suyễn và một số bệnh chuyển hóa.
Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm.

14
Tín hiệu NF-κB được biết là có liên quan đến nhiều bệnh viêm khác nhau; do
vậy, có nhiều phương thức điều trị đối với các bệnh viêm hướng đích là blocking
hoạt động của NF-κB. Ví dụ như ức chế hoạt động kinase IKK: Các loại thuốc như
aspirin và salicylate có khả năng ức chế đặc hiệu IKK, do đó ngăn ngừa sự
phosphoryl hóa của IκBα. Thứ hai, ức chế hoạt động protease: Các loại thuốc như
PS-341 và lactacystin ức chế phức hợp proteasome 26S, do đó ức chế thủy phân
IκBα. Thứ ba, ức chế chuyển vị nhân tế bào: Các loại thuốc như tacrolimus ngăn
chặn các tiểu đơn vị NF-κB p65 (RelA), p50, c-Rel và các thành viên khác của
nhóm này di chuyển vào trong nhân. Cuối cùng, ức chế sự gắn kết DNA: Các loại
thuốc như glucocorticoid và chất chủ vận PPAR có khả năng ngăn chặn các tiểu
đơn vị NF-κB gắn các gen mục tiêu và do đó ức chế sự phiên mã.
Mặt khác, khi viêm không lành dễ chuyển sang giai đoạn viêm mạn tính và
nhiều nghiên cứu đã chứng minh có mối liên hệ giữa viêm mạn tính và nguy cơ ung
thư cao thông qua yếu tố NF-κB. Liên quan tới bệnh ung thư, NF-κB có vai trò là
yếu tố điều hòa biểu hiện của những gen kiểm soát sự tăng sinh và sống sót của tế
bào. Như vậy, nhiều loại khối u khác nhau của con người do sự kiểm soát sai NF-
κB: NF-κB hoạt động giúp biểu hiện của các gen giữ cho tế bào tăng sinh và bảo vệ
tế bào khỏi các điều kiện kích ứng quá trình chết theo chương trình
apoptosis. Trong ung thư, các protein kiểm soát tín hiệu NF-κB bị đột biến hoặc
biểu hiện bất thường dẫn đến sự phối hợp không hoàn thiện giữa các tế bào ác tính
và phần còn lại của cơ thể sinh vật. Điều này dẫn tới việc hệ thống miễn dịch loại
bỏ không hiệu quả khối u và những tế bào ung thư ác tính [23]. Trong TB khối u,
NF-κB hoạt động (ví dụ, trong 41 % ung thư biểu mô vòm họng [15]) do đột biến
gen mã hóa các yếu tố phiên mã NF-κB hoặc trong các gen kiểm soát hoạt động
NF-κB (như gen IκB ức chế yếu tố NF-κB); ngoài ra, một số tế bào khối u tiết ra
các yếu tố dẫn tới NF-κB trở nên hoạt động. Việc ức chế yếu tố NF-κB có thể làm
cho các tế bào khối u ngừng tăng sinh, chết hoặc trở nên nhạy cảm hơn với tác dụng
của những tác nhân chống khối u. Vì vậy, NF-κB là chủ đề của nhiều nghiên cứu
của các công ty dược phẩm… như một đích của liệu pháp kháng viêm và ung thư
[10]. Sử dụng kỹ thuật ghi hình ảnh hiển vi huỳnh quang có thể quan sát tế bào trực

15
tiếp cho phép phân tích động học quá trình di chuyển của NF-κB vào nhân hay ức
chế quá trình này thông qua cảm ứng kích hoạt IκB ứng dụng trong sàng lọc các
hợp chất kháng viêm.
Interleukin-1 (IL-1) và yếu tố hoại tử khối u (TNFα) là hai cytokine chính kích
thích đáp ứng tiền viêm, bao gồm sản sinh chemokine, các phân tử cố kết và
enzyme như cyclooxygenase, nitric-oxide synthetase và matrix metallicoproteinase.
Nhiều hiệu ứng này là kết quả của sự kích hoạt bởi cả IL-1 và TNFα lên con đường
yếu tố phiên mã NF-κB, có liên quan đến việc kích hoạt nhiều gen bảo vệ của tế
bào. Việc kích hoạt thụ thể IL-1 hoặc TNFα sẽ cảm ứng quá trình phosphoryl hóa
đặc hiệu Ser32 và Ser36 trên IκBα, sự phân hủy protein IκBα bởi proteasome và sự
chuyển vị NF-κB vào nhân. Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy Ser/Thr kinase
được kích hoạt bởi IL-1 và TNFα chứa ít nhất bốn kinase phosphoryl hóa lẫn nhau
trước khi phosphoryl hóa IκBα [8]. Sự ức chế hoạt động proteasome của các chất ức
chế đặc hiệu như LLL-H (MG132) đã ức chế cả sự thủy phân IκBα cũng như ngăn
sự kích hoạt tiếp theo của NF-κB xác định được qua việc sinh tổng hợp các protein
phụ thuộc NF-κB, ví dụ như protein bám dính bạch cầu.
1.2.6. Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh
quang tế bào và đích phân tử
Bắt đầu từ các năm 1950, các mô hình sàng lọc trực tiếp trên TB ung thư đã
được sử dụng để thay thế cho mô hình sàng lọc trên TB bình thường và vi khuẩn.
Tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ) các mô hình TB được phân lập từ các loại khối
ung thư mô liên kết (sarcoma 180), ung thư bạch cầu ác tính (L1210 leukemia) và
ung thư biểu mô (carcinama 755) của chuột đã được sử dụng để triển khai các
chương trình sàng lọc quy mô lớn.
Từ những năm 90, các mô hình sàng lọc trên các dòng TB ung thư của người
đã được sử dụng thay thế các mô hình sàng lọc trên TB ung thư nguồn gốc động
vật. Ngân hàng dữ liệu với 60 dòng TB đại diện cho các loại ung thư não, ung thư
đại tràng, ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư buồng trứng và ung thư thận, bao
gồm các dòng TB kháng thuốc đã được thành lập tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ)

16
và sử dụng để tăng hiệu quả sàng lọc thông qua các phương thức sàng lọc đơn, sàng
lọc kép và sàng lọc chéo. Những cải tiến này có ý nghĩa quan trọng đối với lĩnh vực
nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị ung thư, về cả phương diện kinh tế và phương
diện y dược. Mặc dù các dòng TB ung thư của động vật vẫn còn được sử dụng, kết
quả khảo sát về hiệu quả sàng lọc trong quá trình chuyển giao từ nghiên cứu trên
mô hình động vật sang nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng trên người cho thấy không
phải lúc nào các mô hình này cũng có khả năng đưa ra các kết luận đáng tin cậy.
Theo kết quả điều tra thống kê tới năm 2004 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm (Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Mỹ, 2004), chỉ có 8% trong số 1/3 số thuốc
dược khảo sát vượt qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I. Một trong các nguyên
nhân dẫn tới sự rơi rụng này là sự khác biệt về các đặc điểm sinh học giữa các mô
hình trên động vật và trên người ở các mức độ hoạt động di truyền phân tử, miễn
dịch và TB đã hạn chế quan trọng khả năng mô phỏng chính xác các phản ứng tiến
triển trên người
Hiện nay, sàng lọc hoạt tính chống ung thư in vitro thường được đánh giá qua
hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity), ức chế sự tăng sinh tế bào (antiproliferation),
kích thích sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) thông qua biểu hiện của
protein p53, Bax, Bcl-XL/BH3, hoạt tính enzyme caspase-3/7; hoạt tính ức chế
aurora kinase, serine/threonine kinase, DNA topoisomerase I, kháng NF-KB (liên
quan quá trình viêm và ung thư), phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội
bào,… sử dụng các kỹ thuật như MTT, Western blot, SEAP-assay, trắc lưu tế bào
(flow cytometry), miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh hiển vi tế bào,…
Trong đó, tất cả các chiến lược sàng lọc in vitro tìm kiếm các chất hoạt tính sinh học
có thể chia thành 2 nhóm phương pháp: (i) sàng lọc trên mức độ (toàn bộ) tế bào và
(ii) sàng lọc trên đích là các phân tử đặc hiệu. Mặc dù chiếm số lượng lớn so với thư
viện các chất tổng hợp, các HCTN trong mẫu chiết dường như không hoàn toàn phù
hợp cho sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening-HTS) trên đích là các
phân tử đặc hiệu. Ngược lại, có thể dễ dàng nâng cao hiệu quả sàng lọc ở mức độ tế
bào, nhưng nhóm phương pháp này không cung cấp được thông tin về phương thức

17
hay đích tác động của chất thử, do vậy sẽ khó khăn trong lựa chọn ưu tiên chất tiềm
năng cho những nghiên cứu tiếp theo (trên mô hình động vật và lâm sàng).
Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã được phát triển với mục đích phối
hợp được cả hai phương pháp trên. Một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi
hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động để quan sát ảnh hưởng
của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế bào.
Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể đưa ra các
chẩn đoán về phương thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay” (fingerprint)
kiểu hình của tế bào. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào
đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc
hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thư và độc tính thuốc).
Trong lĩnh vực tìm kiếm các thuốc chống ung thư, kỹ thuật phân tích huỳnh
quang tế bào có thể được sử dụng để đánh giá tác dụng của chất thử lên các quá
trình apoptosis, chu trình tế bào (cell cycle), chuyển vị nội bào và di căn. Presvel và
cộng sự đã phát triển kỹ thuật huỳnh quang phục vụ sàng lọc hiệu năng cao các chất
điều trị ung thư mới hướng đích là các kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent
kinases, CDKs) – enzyme có vai trò quan trọng trong điều khiển chu trình tế bào
sống và biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thư người [13]. Phương pháp huỳnh
quang được phát triển sử dụng cảm biến protein/peptide sinh học là công cụ có độ
nhạy cao để phát hiện những thay đổi về thành phần, hoạt tính và trạng thái cấu trúc
của các CDK/Cyclin trong nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư. Sử dụng kỹ
thuật huỳnh quang tế bào phân tích trên thiết bị KineticScan
HCS Reader
(ThermoFisher, USA), [26] đã chứng minh hoạt tính chống ung thư gan của
triterpene jaspolide B phân lập từ loài bọt biển Jaspis sp. trên 2 dòng tế bào ung thư
biểu mô tế bào gan người Bel-7402 và Hep-G2 (với giá trị IC50 lần lượt là 29,1 và
29,5 M) qua hoạt tính cảm ứng apoptosis (tế bào Bel-7402 lên tới 66,8% ở nồng
độ 0,5M) và đích ty thể. Trong khi đó [12] đánh giá hoạt tính chống ung thư của
các peptide dẫn xuất của Ixosin-B amide cho thấy không chỉ ức chế hiệu quả đối với
sự tăng sinh tế bào (IC50 = 61.5µM) mà còn tác động lên cấu trúc khung tế của bào
ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 25µM.

18
Hình 1.5: Ảnh hưởng của peptide dẫn xuất Ixosin-B amide (MAP-04-03; 25µM)
đến sự thay đổi cấu trúc khung và hình thái tế bào ung thư vú MCF-
7. F-actin (xanh sẫm), -tubulin (xanh lá cây), và nhân TB (màu đỏ)
được quan sát sau khi nhuộm tương ứng với phức TRITC-Phalloidin,
AlexaFluor488-IgG và propidium iodide (PI)
Trong vài thập kỷ qua, Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National
Cancer Institute, NCI) đã phát triển và thực hiện các test sàng lọc HCS/A qua quan
sát sự hình thành nhân TB, các biến đổi hình thái tế bào và chuyển vị protein. Ứng
dụng kỹ thuật HCS/A, các nhà nghiên cứu tại NCI đã xác định được các chất điều
biến phân chia tế bào mới với các cơ chế tác động lên sự phân hủy vi ống TB khác
nhau, secramine (chất ức chế polymer hóa acetin) và một số chất điều biến chuyển
vị protein NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) và FOXO1 (Forkhead box
protein O1) trong nhân TB [22]. Hơn nữa, qua phân tích chu trình tế bào (cell cycle)
và sự thay đổi cấu trúc sợi vi ống xác định được jaspolide B ức chế phase G1 của
chu trình tế bào và sự phân tách vi ống cấu trúc TB ung thư gan [26]. Trên mức độ
tế bào, các TB khối u tuần hoàn trong máu (circulating tumor cells, CTCs) là các tế
bào hiếm gặp (1 tế bào CTC/1 triệu TB máu) nên việc nghiên cứu gặp nhiều khó
khăn. Sự tồn tại của các CTCs trong máu, có thể được giải phóng vào hệ tuần hoàn
từ khối u ác tính nguyên phát hoặc di căn, đã được ghi nhận cách đây hàng trăm
năm và giá trị của của chúng trong chẩn đoán và điều trị ngày càng được đánh giá
cao trong những thập kỷ vừa qua. Một số phương pháp đã được phát triển gần đây
nhằm phát hiện các tế bào khối u CTCs cho chuẩn đoán và đánh giá hiệu quả của
các thuốc chống ung thư. Trong đó xác định CTCs từ mẫu máu bằng phương pháp
E F G E

19
miễn dịch sử dụng hệ thiết bị CellSearch®
CTC Test (Velidex, USA) đã được FDA
chứng nhận ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư từ 2004. Tuy nhiên, phương pháp
phân tích này tốn nhiều thời gian do vậy gần đây các nhà khoa học tại Đại Học
Tokyo phối hợp với Công ty Hitachi Chemical Co., Ltd. (Nhật Bản) đã xây dựng
phương pháp xác định nhanh CTCs dựa trên hình ảnh tế bào sử dụng thiết bị hiển vi
huỳnh quang trường rộng (wide-field fluorescence imaging system) với thời gian
phân tích trong vòng 1h [28].
Nhiều kỹ thuật mới vẫn đang được phát triển dựa trên công nghệ hình ảnh
huỳnh quang và HCS/A ứng dụng trong nghiên cứu dược động học và sự phân tán
thuốc in vitro. Mặc dù một số thuốc, như doxorubicin hoặc ellipticine có thể trực
tiếp quan sát hình ảnh huỳnh quang, nhưng phần lớn các hệ thống phân tán thuốc
cần ghi nhãn huỳnh quang để có thể quan sát trên thiết bị hiển vi.Ví dụ: sự vận
chuyển thuốc chống ung thư doxorubicin(Dox) bởi polymer pHPMA (phức
pHPMA-Dox) trong tế bào ung thư trực tràng DLD1 đã được xác định.
Hình 1.6: Hình ảnh huỳnh quang (quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang
Olympus IX8) của dòng tế bào ung thư trực tràng DLD1 xử lý với
doxorubicin (Dox; nồng độ 1μg/mL) hoặc phức hợp pHPMA-Dox.A-
sau 6h ủ với pHPMA-Dox;B- sau 6hủ với Dox; C- sau 24h xử lý
vớipHPMA-Dox; D- sau 24hxử lý với pHPMA-Dox. Phức hợp
pHPMA-Dox được nhuộm huỳnh quang Dyomics 676 có màu vàng
phối hợp củaDox (xanh) và polymer pHPMA (màu đỏ)

20
Sau 6h xử lý với PHPMA-Dox, tín hiệu huỳnh quang Dox yếu được phát hiện
trong màng tế bào và tế bào chất nhưng ngoài nhân. Trong khi đó, chỉ xử lý với
thuốc Dox, tín hiệu huỳnh quang mạnh được quan sát thấy trong nhân.Sau 24h xử
lý với pHPMA-Dox, Dox đã được chuyển vào nhân tế bào và tín hiệu huỳnh quang
cũng được quan sát thấy trong tế bào chất. Như vậy, khi thuốc Dox gắn với pHPMA
sẽ cần thời gian lâu hơn để phân tán trong nội bào và giải phóng khỏi chất mang [9],
[14]. Việc đánh giá phân tán thuốc in vitro trên các dòng tế bào ung thư cũng có thể
thực hiện trong trường hợp khi đánh giá in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm
không hiệu quả.
Ngoài ra, nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các
thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội
bào xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA
(electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc
hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các
nhược điểm của phương pháp EMSA và Western blot là chúng không cung cấp đầy
đủ thông tin trong mẫu phân tích phức tạp, do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan
sát giảm 50% độ mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm
50% trong 100% quần thể đó. Mặt khác các phương pháp hóa sinh-phân tử này
cũng không đủ nhạy để phát hiện các hiện tượng hiếm khi chỉ thực hiện trên số
lượng tế bào hạn chế. Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào Flow cytometry có thể
cung cấp nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ
thuật này không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh
quang. Những hạn chế kể trên có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình
ảnh tế bào và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang.

21
Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang
(A) Nuôi cấy tế bào trên phiến vi lượng,
(B) Chuẩn bị mẫu,
(C) Kit và thuốc thử,
(D) Thiết bị ghi ảnh hiển vi (tích hợp laser scanner),
(E) Phần mềm phân tích,
(F) Thiết bị lưu/xử lý dữ liệu (máy tính, server).

22
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào ung
thư cổ tử cung HeLa.
Đánh giá hoạt tính chống ung thư trên đích phân tử yếu tố nhân NF-κB ở tế
bào HeLa sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi
huỳnh quang tự động.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật
huỳnh quang tế bào.
2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín hiệu
huỳnh quang đặc trưng.
2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB.
2.3. Vật liệu.
2.3.1.Dòng tế bào
Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (ATCC®
CCL-2TM) sử dụng trong
nghiên cứu được mua từ nguồn ATCC (American Type Culture Collection,
Virginia, USA) và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các
HCTN).
2.3.2.Mẫu thử nghiệm
Mẫu sử dụng cho sàng lọc, đánh giá hoạt tính sinh học là các cao chiết từ
nguồn thực vật, sinh vật biển hoặc các chất tinh sạch và bán tổng hợp (từ HCTN)
được cung cấp bởi các đơn vị phối hợp như một số Viện nghiên cứu hóa học thuộc
Viện Hàn lâm KHCNVN, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Sản phẩm Thiên nhiên... Do các kết quả thu được trong nghiên cứu này
chưa được công bố và thuộc khuôn khổ hợp tác với các đơn vị liên quan nên các
mẫu được kí hiệu theo bảng sau:

23
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số
hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
TT Kí hiệu mẫu Loại mẫu
1 BHX-n, BHX-c, KhS-n, KhS-c, HyT-n,
HyT-c, XaC-n, XaC-c, ToT-n, ToT-c,
BCL-n, BCL-c
Mẫu cao chiết thực vật (bạch
hoa xà, khổ sâm, hy thiêm, xạ
can, tơm trơng, bán chi liên…)
2 Nitid, M1 – 7aa, M2 – 7ab, M3 – 7ac, M4 –
7ad, M5 – 7ba, M6 – 7bb, M7 – 7bc, M8 – 7bd,
M9 – 7ca, M10 – 7cb, M11 – 7cc, M12 – 7cd
Mẫu thực vật tinh sạch
3 Mori, MurA, Inoxim, Zeru, Pice, SHTN-
Zer4
Mẫu thực vật tinh sạch, dẫn
xuất và chất bán tổng hợp
4 LCN, LCH, LCC, LCE, MN, DH, HD, DE,
ME, HT, DC, MH, DN, MC
Mẫu cao chiết, phân đoạn
5 Paclitaxel (taxol), Ellipticine Thuốc chống ung thư, sử
dụng làm chứng (+)
* Các mẫu sử dụng trong luận văn này chỉ là minh chứng cho kết quả thử
nghiệm sàng lọc và lựa chọn mẫu cho nghiên cứu tiếp theo trên các đích phân tử.
Việc sử dụng kết quả về sàng lọc MTT đã được sự đồng ý của đơn vị gửi mẫu.
2.3.3. Môi trường nuôi cấy tế bào
- Môi trường nuôi cấy tế bào bao gồm: (EMEM, DMEM, Ham’s F12 medium,
RPMI 1640 medium; ThermoFisher hoặc Sigma) có bổ sung 0,1% kháng sinh và
10% huyết thanh bê FBS (ThermoFisher hoặc Sigma), dung dịch đệm PBS 0,1 M,
pH 7,8.
- 0.005 - 0.25% trypsin + 1 mM EDTA (ThermoFisher)
- Dimethylsulfloxide (DMSO, Sigma, USA)
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma)
- L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, Sigma)
- Dung dịch nhuộm DAPI (dạng bột, ThermoFisher)
- Paraformaldehyde (Sigma)

24
- Triton X-100 (Sigma)
- GFP: Green fluorescent protein (ThermoFisher)
2.3.4. Hóa chất và thiết bị.
2.3.4.1. Hóa chất
- Các loại muối: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, L-Glutamic acid
monosodium (MSG, Sigma).
- Các loại hóa chất cần thiết khác: DAPI (dạng bột, ThermoFisher), Triton X-
100 (Sigma), Paraformaldehyde, Dimethylsulfloxide (DMSO, Sigma, USA), 3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT;Sigma), Trypsin,
EDTA, GFP. (ThermoFisher)
- Nước cất.
- Tất cả dung dịch đệm và hóa chất sử dụng là tinh khiết và thích hợp trong
nghiên cứu.
2.3.4.2. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, Sanyo, Nhật)
- Tủ ấm CO2 (Esco, Indonesia)
- Máy ly tâm (Hettich rotofix 32A, CHLB Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich universal 32R, CHLB Đức)
- Tủ lạnh (Panasonic, Nhật)
- Tủ lạnh sâu (đến -86°C, Sanyo, Nhật), Bình nitơ lỏng (Chart BioMedical,
Trung Quốc).
- Kính hiển vi soi ngược (Optika, Ý)
- Bể siêu âm (Daihan scientific, Hàn Quốc)
- Máy đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)
- Hệ thống hiển vi huỳnh quang tự động Olympus scanˆR (Heidelberg, CHLB
Đức) và phần mềm phân tích scanˆR Analysis Software.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào
Tế bào ung thư được nuôi cấy ở 37 o
C ở tủ ấm cấp CO2 5 % trong môi trường
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose; Sigma-Aldrich, USA)

25
có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và
huyết thanh bê (FBS 10 %). Sau khi tế bào phát triển đạt trên 70 %, loại bỏ môi
trường cũ và rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,1 M, pH 7,8), sau đó bổ sung
Trypsin-EDTA 0,05 % để tách tế bào bám dính khỏi đáy đĩa nuôi cấy. Dịch tế bào
được chuyển sang ống falcon 15 mL có chứa 4-5 mL dịch môi trường mới và ly tâm
300 vòng/phút. Sau khi loại bỏ phần dịch, phần cặn tế bào được trộn với môi trường
dinh dưỡng và được chuyển sang bình nuôi cấy mới để sẵn sàng cho các thử nghiệm
hoạt tính.
Đây là nguồn mẫu cần thiết cho các phân tích sinh hóa của TB ung thư. Điều
này mở ra cơ hội cho các nhà khoa học có điều kiện nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn
về các đặc tinh sinh học, đồng thời xác định và mô tả đặc điểm của TB ung thư. Với
mục đích sử dụng các dòng TB này để nghiên cứu hoạt tính của các hoạt chất kháng
ung thư trong điều kiện in vitro [5].
2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT
Nguyên tắc: Việc sử dụng thuốc nhuộm tetrazolium (MTT) làm phép đo chính
xác số lượng TB đã được công bố từ đầu những năm 1980 [17]. Nguyên lý của
phương pháp MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]
dựa trên sự chuyển hóa MTT thành dạng tinh thể formazan bởi enzyme
oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của ty thể có liên quan tuyến tính với sự tăng
hoặc giảm số lượng TB. Do đó, số lượng TB sống sót có thể được xác định gián tiếp
bằng cách đo nồng độ hấp thụ MTT - formazan tại bước sóng  = 570 nm. Trong
quá trình phân chia TB, việc giảm số lượng TB phản ánh khả năng ức chế sự sinh
trưởng của TB và hoạt tính cảu thuốc/chất thử sau đó được xác định dựa trên nồng
độ của mẫu tại đó ức chế 50% sự phát triển TB so với đối chứng không xử lý với
thuốc (giá trị IC50). Quy trình này dựa trên tài liệu tham khảo và được tối ưu trên
các thử nghiệm với các chất thử và thuốc có độc tính TB để thu được kết quả phù
hợp với thực nghiệm chuẩn [18].

26
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan
Tiến hành: TB ung thư được nuôi cấy ở 37 o
C (tủ ấm CO2 5%) trên phiến 96
giếng (1,5 x 105
tế bào/giếng) trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle Medium) hoặc EMEM (Eagle’s Minimum Esential Medium, Sigma-Aldrich,
USA) bổ sung kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê
10%. Sau đó, TB được ủ với chất chuẩn Ellipticine (hoặc Paclitaxel) và các mẫu thử
ở các nồng độ từ 0,1-100 g/mL (hoặc M), mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Sau quá
trình phơi nhiễm, TB sẽ được nhuộm với chất nhuộm tetrazolium (MTT 10 ng;
Sigma-Aldrich) trong 4 giờ. Cuối cùng, sản phẩm chuyển hóa thành tinh thể
formazan sẽ được hòa tan trong Dimethyl sulfoxide (DMSO) và đo mật độ quang
(OD) ở -540/720 nm (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ).
Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư ở nồng độ nhất định của chất thử
tính theo % so với đối chứng theo công thức:
Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [1-(ODmẫu/ODđối chứng (-))] x 100%
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥ 50%) được xác định giá trị IC50
(g/mL hoặc M) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của TB.

27
2.4.3. Kích hoạt yếu tố NF-κB
Nhỏ mẫu thuốc/chất thử đã pha trong DMSO 0,25-1 % lên phiến đã có dịch tế
bào HeLa (90 µL/giếng), ủ 30 phút ở 37 o
C trước khi bổ sung 10 µL chất kích hoạt
[Interleukin-1 (IL-1) hoặc yếu tố hoại tử khối u (TNF), nồng độ cuối 0,5-15
ng/mL]. Tiếp tục ủ ở 37 o
C trong 30 phút tới khi kết thúc, rửa phiến 2 lần với PBS
0,1M lạnh cho bước cố định tế bào.
2.4.4. Cố định tế bào
Trong một số trường hợp, ví dụ như khi cần lưu mẫu trong thời gian ≥ 1 giờ,
bước cố định tế bào cần được thực hiện và có thể đảm bảo lưu giữ mẫu trong 1 tuần.
Tế bào có thể cố định bằng dung môi hữu cơ, ở đây trình bày quy trình sử dụng
paraformaldehyde theo tác giả Harlow & Lane (2006).
Xử lý tế bào với paraformaldehyde dẫn đến việc hình thành các liên kết ngang
giữa các nhóm amin tự do. Khi liên kết hóa học hình thành giữa các phân tử khác
nhau, mạng lưới các liên kết sẽ hình thành và kết nối cấu trúc tổng thể của các tế
bào với nhau.
Các bước tiến hành:
1. Chuẩn bị dung dịch paraformaldehyde 3,7 % trong đệm phosphate (PBS,
pH 7,4; pha mới khi sử dụng hoặc giữ ở -20 o
C).
2. Rửa phiến tế bào với PBS.
3. Đổ bỏ phần nước/đệm nhưng không được để mẫu bị khô.
4. Cố định tế bào với 100 µL dung dịch paraformaldehyde 4 % trong PBS ở
nhiệt độ phòng trong 10-20 phút.
5. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS.
6. Thẩm thấu các tế bào đã được cố định bằng cách ủ 5 phút trong 100 µL
dung dịch Triton X-100 0,1-0,2 % trong PBS (= PBST) ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 2 lần bằng dung dịch đệm PBS 0,1 M, pH 7,8.
8. Mẫu đã sẵn sàng cho các bước xử lý kháng thể tiếp theo.
Protein NF-κB ở tế bào HeLa có thể ổn định trong một vài ngày ở 4 o
C trước khi
nhuộm với kháng thể NF-κB và cố định với paraformaldehyde 3,7-4 %. Do vậy sau khi
nhuộm huỳnh quang cần thực hiện ghi ảnh sớm nhất có thể và không quá 2 tuần.

28
Đánh giá hiệu suất sàng lọc qua hệ số Z’
Hệ số Z’ [30] được sử dụng để đánh giá hiệu suất thử nghiệm sàng lọc hiệu
năng cao. Tế bào được xử lý với TNFα và cố định như trên. Thử nghiệm với
n=45 giếng đối chứng và mẫu có bổ sung cytokine. Hệ số Z’ được xác định theo
công thức:
Trong đó: µ là giá trị trung bình
σ- độ lệch chuẩn.
p: positive control,
n: negative control.
2.4.5. Nhuộm huỳnh quang tế bào và đích phân tử
Sau khi cố định định tế bào bằng paraformaldehyde 4%, block các kháng
nguyên không đặc hiệu bằng bổ sung 100 µL sữa bột không béo 5% trong đệm PBS
0,1 M, pH 7,8, để trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa 2 lần với Tris-HCl
0,1 M, ủ tế bào trong 1 giờ với 100 µL kháng thể sơ cấp (rabbit anti-p65 NF-κB
antibody, pha 1:250 trong PBS 0,1 M với 0,1% BSA; #SC-8008, Santa Cruz
Biotechnology, USA). Thêm dung dịch 0,01% Tween 20 và rửa phiến 2 với đệm
PBS 0,1 M trước khi ủ với 100 µL kháng thể thứ cấp (Alexa Fluor® 488 goat anti-
rabbit, IgG, 1:400; A11008, ThermoFisher) đồng thời với DAPI (nồng độ cuối 300
nM; D1306, ThermoFisher). Ủ phiến trong 1 giờ ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng. Đổ
bỏ dung dịch nhuộm và rửa 2 lần với đệm PBS. Bọc phiến và lưu giữ trong điều
kiện tối ở 40
C tới khi ghi ảnh và phân tích.
2.4.6. Thu nhận và phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trên hệ Olympus scanR
2.4.6.1. Thu nhận hình ảnh tự động
Được thiết kế bởi phòng thí nhiệm phân tử Châu Âu EMBL (Heidelberg,
Germany) và công ty Olmpus (Nhật Bản), scanR là hệ thống kính hiển vi huỳnh

29
quang dựa tên module được thiết kế để thu nhập hình ảnh hoàn toàn tự động và
phân tích dữ liệu của các mẫu sinh học. Hình ảnh được thu nhận ở các vật kính 20x
(Plan Semi-Apochromat 20x PH/0.45), 40x (Semi-Apochromat 40x PH/0.60) và
60x (Semi-Apochromat 60x PH/0.70) với bốn bộ lọc tiêu chuẩn cho các kênh
DAPI/FITC/TRICT/CY5.
Phần mềm dựa trên gradient tự động lấy nét có thể điều chỉnh thô và chỉnh
tinh được sử dụng để xác định mặt phẳng lấy nét trong kênh DAPI và Cy3/Cy5.
Hình ảnh được chụp sử dung camera lạnh sCMOS (Hamamatsu ORCA-flash 4.0,
Nhật Bản), độ phân giải ≥ 4.0 megapixel, tốc độ quét ≥ 100 hình/giây. Mỗi lần xử lý
ở mỗi giếng cũng được phân tích 6-16 vị trí.
2.4.6.2. Phân tích hình ảnh và các thông số thử nghiệm
Các hình ảnh được phân tích bằng phần mềm phân tích scanR Analysis ver
2.7.2 (Olympus).

30
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư
Để lựa chọn mẫu có hoạt tính tiềm năng cho nghiên cứu tiếp theo trên đích
phân tử, các mẫu cao chiết và chất tinh sạch được sàng lọc trước khả năng ức chế sự
tăng sinh tế bào bằng phương pháp MTT như mô tả ở phần Phương pháp nghiên
cứu ở trên. Trong đó 30 mẫu được trên dòng ung thư cổ tử cung HeLa. Kết quả thu
được như trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên
dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa
TT Kí hiệu mẫu
Nồng độ
đầu
(g/mL)
Dòng TB HeLa
Nhận xét
Khả năng
ức chế tế
bào (%)
IC50
(g/mL)
1 Chứng (-) DMSO 10% - 0,00 ± 0,0 - Âm tính
2 Chứng (+) Paclitaxel 50 83,2  3,2 3,7 Dương tính
3 M1 – 7aa 50 5,3  0,5 > 50 Âm tính
4 M2 – 7ab 50 12,6  1,2 > 50 Âm tính
5 M3 – 7ac 50 8,4  1,3 > 50 Âm tính
6 M4 – 7ad 50 4,7  0,5 > 50 Âm tính
7 M5 – 7ba 50 9,5  1,3 > 50 Âm tính
8 M6 – 7bb 50 39,8  1,1 > 50 Âm tính
9 M7 – 7bc 50 12,3  0,6 > 50 Âm tính
10 M8 – 7bd 50 7,4  0,2 > 50 Âm tính
11 M9 – 7ca 50 15,4  0,2 > 50 Âm tính
12 M10 – 7cb 50 2,7  0,3 > 50 Âm tính
13 M11 – 7cc 50 17,2  0,3 > 50 Âm tính
14 M12 – 7cd 50 4,6  0,2 > 50 Âm tính

31
TT Kí hiệu mẫu
Nồng độ
đầu
(g/mL)
Dòng TB HeLa
Nhận xét
Khả năng
ức chế tế
bào (%)
IC50
(g/mL)
15 SHTN-Zer4 50 91,3  5,3 11,5 Dương tính
16 Mori 50 41,1  0,8 > 50 Âm tính
17 MurA 50 76,1  4,2 16,8 Dương tính
18 Inoxim 50 54,7  4,3 28,7 Dương tính
19 LCN 50 11,46  0,4 > 100 Âm tính
20 LCH 100 5,54  0,5 > 100 Âm tính
21 LCC 100 6,76  0,6 > 100 Âm tính
22 LCE 100 13,58  1,3 > 100 Âm tính
23 MN 100 16,59  1,2 > 100 Âm tính
24 DH 100 67,49  2,3 61,8 Dương tính
25 HD 100 16,59  1,1 > 100 Âm tính
26 DE 100 9,52  0,7 > 100 Âm tính
27 ME 100 4,50  0,2 > 100 Âm tính
28 HT 100 13,09  0,6 > 100 Âm tính
29 PC 100 9,55  0,2 > 100 Âm tính
30 MH 100 53,04  2,2 93,1 Dương tính
31 DN 100 9,02  0,2 > 100 Âm tính
32 MC 100 2,74  0,8 > 100 Âm tính
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.1 cho thấy, 5 mẫu ký hiệu SHTN-Zer4, MurA,
Inoxim, DH và MH đều biểu hiện hoạt tính tốt với dòng tế bào ung thư cổ tử cung
HeLa. Giá trị IC50 của các mẫu thử đối với dòng tế bào trên nằm trong khoảng 11
µg/mL – 93 µg/mL. Trong đó, mẫu ký hiệu SHTN-Zer4 có hoạt tính tốt nhất tương
ứng với giá trị IC50 thấp nhất là 11,5 µg/mL. Mẫu ký hiệu MH có hoạt tính yếu thể
hiện ở giá trị IC50 cao nhất là 93,1 µg/mL. Các mẫu còn lại không kháng dòng tế
bào HeLa ở nồng độ đầu thử nghiệm đến 100 µg/mL với mẫu thô và 50 µg/mL với
mẫu tinh sạch.

32
Hình 3.1: Biểu đồ khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các nồng
độ khác nhau của các mẫu tinh sạch có biểu hiện hoạt tính
Kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy hoạt tính gây độc TB của các mẫu thử
phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ càng cao thì khả năng gây độc càng mạnh. Mẫu ký
hiệu SHTN-Zer4 có hoạt tính tốt thể hiện ở giá trị IC50 là 11,5 g/mL. Mẫu ký hiệu
Inoxim có hoạt tính yếu hơn thể hiện ở giá trị IC50 là 28,7 g/mL.
3.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào
HeLa
3.2.1. Kích thích chuyển vị NF-κB
Interleukin-1 (IL-1) và yếu tố hoại tử khối u (TNFα) là hai cytokine chính kích
thích đáp ứng tiền viêm, bao gồm sản sinh chemokine, các phân tử cố kết và các
enzyme như cyclooxygenase, nitric-oxide synthetase và matrix metallicoproteinase.
Nhiều hiệu ứng này là kết quả của sự kích hoạt bởi cả IL-1 và TNFα lên con đường yếu
tố phiên mã NF-κB, có liên quan đến việc kích hoạt nhiều gen bảo vệ của tế bào.

33
Kết quả nghiên cứu sự phụ thuộc kích thích chuyển vị NF-κB vào nồng độ
cytokine cho thấy cả hai loại cytokine tiền viêm IL-1 đều có hiệu quả cao ở nồng độ
từ 7-10 ng/mL (Hình 3.3). Ở các nồng độ cao hơn sự chuyển vị tăng NF-κB không
đáng kể, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó [15]. Sau khi ủ 30 ph với
các cytokine, lượng lớn p65 được phát hiện trong nhân (tương ứng tỷ lệ Nuc/Cyto
cao) mặc dù một lượng nhất định p65 vẫn nằm ngoài tế bào chất. Để định lượng sự
chuyển vị này, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được phát triển nhằm đo được
cường độ tín hiệu huỳnh quang cả ở tế bào chất và trong nhân đối với từng tế bào
riêng lẻ cũng như phân tích tập hợp các tế bào trên phiến đa giếng. Trong nghiên
cứu này chúng tôi nghiên cứu sử dụng hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao
Olympus scanˆR.
Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế
bào HeLa. Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) và TNF (--▲--)
3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang
Tế bào HeLa được ủ với chất cảm ứng (IL-1 10 ng/mL), cố định tế bào và xử
lý với thuốc nhuộm huỳnh quang như mô tử ở phần phương pháp ở trên. Trước khi
tiến hành thu nhận hình ảnh nhuộm DAPI và GFP-p65, các mẫu đều được quét
kiểm tra ở chế độ tự động lấy nét Autofocus ở tất cả các giếng để đảm bảo độ đồng
nhất. Kết quả Autofocus được thể hiện ở dưới những hình sau. Cần nhấn mạnh
rằng, quá trình chạy mẫu một cách tự động chỉ được thực hiện khi đường chuẩn
chỉnh tinh và chỉnh thô cho ra một đường cong rõ nét.

34
Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh
tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z
Từ những hình ảnh lấy nét Autofocus thu được như trên cho chúng ta thấy
việc thu nhận và phân tích hình ảnh tự động của kính hiển vi huỳnh quang đạt đủ
điều kiện để thực hiện những phân tích tiếp theo.
Để phát hiện NF-κB kích hoạt bởi TNF-, chúng tôi sử dụng kỹ thuật miễn
dịch huỳnh quang với kháng thể sơ cấp anti-p65 NF-κB và liên kết huỳnh quang
xanh phát hiện trên kênh GFP, kích thích ở λ=488nm. Đồng thời, nhân tế bào được
nhuộm với huỳnh quang DAPI, kích thích ở λ=405nm. Kết quả thu được hình ảnh
rõ, đủ chất lượng phân tích (Hình 3.5).

35
Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP-
p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE). Hình
ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR.
3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh
Tương tự như phương pháp được đề cập ở trên, sau khi thu nhận được hình
ảnh huỳnh quang, kết quả được phân tích off-line sử dụng phần mềm scanˆR
Analysis ver.2.7.2. Phần mềm này cho phép phân tích tự động dựa trên các thông số
thiết lập cho các đối tượng phân tử đích cần đánh giá. Để xác định và phân tích hình
ảnh huỳnh quang, đối tượng được định dạng dựa trên công thức đẳng chu:
Trong đó :
fcirc: hệ số định dạng đối tượng phân tích (dạng cầu hoặc hình sao);
A: diện tích;
P: chu vi.
Từ sổ Modify Object Boundaries trong Assay Settings đặt thông số lựa chọn
viền hình ảnh (Selectivity) theo hình ảnh thực từ tín hiệu huỳnh quang thu được.
Đồng thời xác định kích thước tối đa khung đối tượng phân tích (Max. object size)
sao cho xác định tối đa các đối tượng, mặt khác loại bỏ các nhiễu tín hiệu không đủ
chất lượng phân tích. Như thể hiện trên nếu thông số viền phù hợp (Selectivity:
0,45) nhưng kích thước tối đa <<< kích thước hình ảnh thực (Max. object size: 50)
dẫn tới vùng phân tích của đối tượng bị hạn chế ( sai số lớn khi phân tích kết
quả). Ngược lại, nếu hệ số viền không phù hợp (Vd. Selectivity: 0.20) sẽ xuất hiện
GFP-p65 DAPI MERGE

36
nhiều vùng tín hiệu nhiễu. Trong thử nghiệm này, các thông số phù hợp được xác
định với Selectivity: 0.45 và Max. object size: 100 (Hình 3.6).
Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng
phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2
Để xác định sự chuyển vị NF-κB, đối tượng phân tích chính (Main Object) được
lựa chọn là vùng DNA nhân tương ứng với kênh tín hiệu DAPI; đối tượng phụ (Sub-
Object) là phức p65-GFP phát hiện trên kênh GFP ở tín hiệu hiệu tế bào chất được đặt
là “CytoI” và Sub-Object thứ hai được lựa chọn là vùng nhân “NucCore”. Tối ưu các
Chọn viền đối tượng
theo tín hiệu huỳnh
quang (Selectivity)
Ngưỡng xác định
kích thước tối đa
(Max. object size)
Selectivity: 0.20
Max. object size: 100
Selectivity: 0.45
Selectivity: 0.45

37
thông số trên phần mềm phân tích scanˆR Analysis, đường viền giữa Sub-Object và
Main Object với khoảnh cách là -1 và độ rộng = 1 cho hình ảnh phân tách giữa các đối
tượng tốt nhất. Sub-Object thứ hai (“NucCore”, kênh GFP) là phần bên trong đối tượng
Main Object với khoảng cách mặc định -100, độ rộng = 98 (Hình 3.7).
Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích chính
Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất
“CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách
(distance) = -1.
3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB
Trước hết, vùng tín hiệu nhân tế bào được khư trú sử dụng một trong các
thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu DAPI. Nhân tế bào được xác định theo phân
vùng hình ảnh phân tích (mask) như mô tả ở trên, sau đó kỹ thuật chồng hình ảnh
thứ hai (mask overlay/merge) được tạo từ viền bao quanh toàn bộ tế bào hoặc vùng
giới hạn nằm trong tế bào chất. Nhờ đó NF-κB gắn huỳnh quang có thể được định
lượng qua phân vùng thứ hai này (nhân hoặc/và tế bào chất). Trong sàng lọc các
chất có hoạt tính, sử dụng cường độ tín hiệu vùng nhân và tế bào chất cũng có thể
phát hiện đồng thời các hợp chất có huỳnh quang trùng hoặc gần với phổ của chất
dò (kit nhuộm) tương ứng sử dụng khi phát triển phương pháp thực nghiệm. Khi đó
những hợp chất này được đưa vào nhóm mẫu "dương tính giả" (false positive) và
cần xác định mức tín hiệu "tự phát huỳnh quang" trong tế bào khi có và không có
mặt của chất dò.
distance = 1 distance = -1

LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Similar to LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC (20)

More from ssuserc1c2711

More from ssuserc1c2711 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC