LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-------------------------------
NGUYỄN THANH HOÀN
ĐÁNHGIÁNGUỒNGEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚCBÓNG
TẠIHUYỆN VÕ NHAITỈNH THÁINGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-------------------------------
NGUYỄN THANH HOÀN
ĐÁNHGIÁNGUỒNGEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚCBÓNG
TẠIHUYỆN VÕ NHAITỈNH THÁINGUYÊN
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành : 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường
2. TS. Trần Minh Quân
Thái Nguyên - 2019

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu.
Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày
trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng
được ai công bố trước đây.
Thái Nguyên, tháng 8 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Thanh Hoàn

ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen,
Viện khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên. Để hoàn
thành được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất
nhiều cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Dương Văn
Cường và TS. Trần Minh Quân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận
tình trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị Ma Thị Trang, Vũ Hoài Nam, Hoàng
Huyền Trang cán bộ tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, và chị Vũ Thị
Ánh cán bộ phòng phân tích hóa học Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học
Sự sống cùng các cán bộ nghiên cứu của viện đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập
và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực
phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang
bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám đốc, lãnh đạo khoa Xét nghiệm-CĐHA-
TDCN và các anh chị đồng nghiệp thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái
Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ
động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
MỤC LỤC..................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cây đậu tương............................................................................ 3
1.1.1. Phân loại học ............................................................................................. 3
1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái phân bố một số loài thuộc chi Glycine ......... 4
1.1.3. Giá trị của cây đậu tương .......................................................................... 5
1.2. Tổng quan về phân loại phân tử....................................................................... 6
1.2.1. Giới thiệu về phân loại phân tử................................................................. 6
1.2.2. Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử....................................... 8
1.2.3. Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật .............................................. 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................... 10
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................... 10
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................ 13
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 16
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 16
2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 16
2.3. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................ 17
2.3.1. Mồi phản ứng PCR.................................................................................. 17

iv
2.3.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................................. 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 18
2.4.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt...... 18
2.4.2. Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền......................................... 21
2.4.3. Đăng kí trình tự gen chỉ thị đậu tương nghiên cứu trên ngân hàng gen
quốc tế ............................................................................................................... 24
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ
Nhai tỉnh Thái Nguyên ......................................................................................... 25
3.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng................ 30
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA .......................................................................... 30
3.2.2. Kết quả khuếch đại các gen chỉ thị rbcL và ITS2 ................................... 32
3.2.3. Kết quả phân tích các gen chỉ thị ............................................................ 33
3.3. Đăng ký trình tự gen chỉ thị lên ngân hàng gen quốc tế................................ 41
KẾT LUẬN.............................................................................................................. 42
1. Kết luận............................................................................................................. 42
2. Đề nghị.............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 43

v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BP: Base pair – Cặp bazơ nitơ
DNA: Deoxirybonucleic Acid
dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphas
Kb: Kilo Base – Kilo bazơ nitơ
QV: Quality value
PCR: Polymerase Chane Reaction
rbcL: Ribulose-bisphosphate carboxylase
ITS2: The internal transcribed spacer 2
matK: Maturase K
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các mẫu đậu tương nghiên cứu ................................................................ 16
Bảng 2.2. Trình tự mồi phản ứng PCR ..................................................................... 17
Bảng 2.3. Danh mục thiết bị được sử dụng............................................................... 17
Bảng 2.4. Danh mục hóa chất sử dụng...................................................................... 18
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR....................................................................... 23
Bảng 3.1. So sánh hình thái đậu tương Cúc bóng..................................................... 28
Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng của đậu tương Cúc bóng................. 29
Bảng 3.3. Thành phần axit amin trong protein của đậu tương Cúc bóng ................. 29
Bảng 3.4. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA................................................ 31
Bảng 3.5: Hệ số tương đồng trình tự gen rbcL của mẫu đậu tương Cúc bóng
với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA ............................................... 35
Bảng 3.6: Hệ số tương đồng trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng
với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA ............................................... 39

vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR ........................................................................ 23
Hình3.1:HìnhtháicâyđậutươngCúcbóng .................................................................... 26
Hình3.2:RễvànốtsầnđậutươngCúcbóng .................................................................... 26
Hình 3.5: Quả đậu tương Cúc bóng .......................................................................... 27
Hình 3.6: Hạt đậu tương Cúc bóng ........................................................................... 27
Hình 3.7: So sánh kích thước hạt đậu tương Cúc bóng và DT 84 ............................ 28
Hình 3.8. Kết quả tách chiết DNA tổng số đậu tương .............................................. 31
Hình 3.9. Kết quả khuếch đại chỉ thị rbcL................................................................ 32
Hình 3.10. Kết quả khuếch đại chỉ thị ITS2. ............................................................ 32
Hình 3.11: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen rbcL ................... 34
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị rbcL..................................... 35
Hình 3.13: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen ITS2 ................... 36
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2..................................... 38
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 của mẫu đậu
tương Cúc bóng và các loài chi Glycine................................................... 39
Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng
dựa trên trình tự ITS2................................................................................ 41

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây đậu tương là một loại cây thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), có hàm lượng
dinh dưỡng cao, là cây thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, nguyên liệu cho công
nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt [1].
Cây đậu tương dễ trồng và thích nghi tương đối rộng ở nhiều vùng khí hậu
khác nhau. Tại Việt Nam, hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương, vùng Đông
Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, Đồng bằng sông Hồng, Đồng bằng sông Cửu Long.
Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 66,6% trong tổng diện tích cả nước, còn lại là
các vùng Đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên [2]. Các giống đậu
tương rất đa dạng phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên
liệu để chọn tạo giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với
mục tiêu chọn giống. Tuy nhiên, do tập quán canh tác phân tán, chưa có khoanh
vùng định hướng phát triển, cùng với sự phát triển của các giống đậu tương mới
đang làm mất dần nhiều giống đậu tương bản địa có chất lượng. Mặt khác, một
giống có thể có nhiều tên gọi khác nhau hoặc cùng một tên gọi nhưng là các
giống đậu tương khác nhau, điều này đã tạo ra nhưng khó khăn trong công tác
phân loại và bảo tồn các nguồn gen bản địa.
Một số nghiên cứu của Trung tâm Tài nguyên thực vật cho thấy phần lớn các
giống đậu tương địa phương đều tập trung ở vùng trung du miền núi phía Bắc. Một
số giống đậu tương ở vùng này có nhiều đặc tính nông, sinh học tốt, tuy nhiên đang
mất dần giống. Biện pháp tốt nhất để lưu giữ phát triển nguồn gen quý này là phải
làm tốt công tác bảo tồn và phục tráng để phát triển ra sản xuất.
Đậu tương Cúc bóng là một giống đặc hữu của tỉnh Thái Nguyên. Đã từ lâu
Cúc bóng được gieo trồng tại các xã Bình Long, Phương Giao…thuộc huyện Võ
Nhai. Giống cho chất lượng thơm ngon, tạo nên thương hiệu đậu phụ An Long nổi
tiếng trong vùng. Nhiều năm gần đây diện tích trồng giống đậu tương này đang bị
thu hẹp, thay thế bởi các giống mới cho năng suất cao hơn. Đậu tương Cúc bóng Võ
Nhai đang phải đối mặt với nguy cơ thoái hóa và mất dần giống. Chính vì vậy, việc

2
phân loại định danh cây đậu tương Cúc bóng là hết sức cần thiết cho công tác
nghiên cứu bảo tồn và lưu giữ nguồn gen bản địa.
Hiện nay, phương pháp phân loại phân tử DNA barcode (mã vạch DNA), là
công cụ hữu hiệu trong việc phân loại định danh loài. Bằng cách so sánh các trình
tự nucleotide của chỉ thị mã vạch DNA từ mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên thế
giới, sự khác nhau giữa các trình tự nucleotide trên đoạn DNA này là cơ sở để phân
biệt các loài với nhau. Phương pháp cho kết quả nhanh, chính xác, bổ sung cho
phương pháp phân loại học truyền thống [12].
Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài “Đánh giá nguồn gen cây
đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được hình thái giống đậu tương Cúc bóng
- Xác định được mối quan hệ di truyền giống đậu tương Cúc bóng với các
giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam.
- Đăng kí được trình tự gen chỉ thị giống đậu tương Cúc bóng lên ngân hàng
gen quốc tế.
3. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu đậu tương Cúc bóng thu thập tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Đánh giá được mối quan hệ di truyền của cây đậu tượng trên hai gen chỉ thị
rbcL, ITS2. Kết quả của đề tài góp phần bổ sung vào nguồn dữ liệu gen cây đậu
tương, là cơ sở khoa học để lựa chọn vùng gen chỉ thị hữu ích trong định danh loài
bằng phương pháp DNA mã vạch (DNA barcode).

3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây đậu tương
1.1.1. Phân loại học
Cây đậu tương có đặc điểm phân loại học như sau:
- Giới: Plantae (Thực vật)
- Bộ: Fabales (Đậu)
- Họ: Fabaceae (Đậu)
- Phân họ: Faboideae
- Tông: Phaseoleae
- Phân tông: Glycininae
- Chi: Glycine
- Phân chi: Glycine, Soya
Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu tiên
của quyển Genera Plantarum. Từ Glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp -
glykys (ngọt) và có thể đề cập đến chất ngọt của củ ăn được sản xuất ở Bắc Mỹ có
dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay là Apios americana. Đậu tương được
trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của Linnaeus, với tên
gọi Phaseolus max L. Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr., theo đề nghị của Merrill
năm 1917, đã trở thành tên gọi chính thức được công nhận của loài này.
Chi Glycine được chia thành 2 phân chi Glycine và Soja. Phân chi Glycine
bao gồm 23 loài hoang dã lâu năm. Phân chi Soja bao gồm cây đậu tương được
trồng trọt là loài Glycine max và cây đậu dại thuộc loài Glycine soja sieb và zucc.
Cả hai loài đều là các loài cây hàng năm. Glycine soja là tổ tiên hoang dại
của Glycine max, và chúng mọc hoang ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài
Loan, và Nga. Phân chi Glycine bao gồm nhiều loài cây dại lâu năm, ví dụ
như Glycine canescensvà Glycine tomentella, Glycine clandestina, Glycine
falcata...[2], [15].

4
1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố một số loài thuộc chi Glycine
* Glycine falcata
Glycine falcata được Mies và Hmowitz phân loại năm 1973. Loài này có
nguồn gốc từ Úc, thân có thể bò sát mặt đất hoặc thẳng với lông cứng. Bản lá hơi
rộng hình thuôn. Chùm hoa dài, mập với màu sắc trắng tới màu hoa cà nhạt. Quả
cong hình lưỡi liềm, rộng bản, có nhiều lông cứng, với hạt hình thuôn hoặc ô van.
Glycine falcata khác với các loài khác ở tập tính sinh trưởng, sự phân bố của dải
protein ở hạt và không có lớp màng ở vỏ hạt [2].
* Glycine latifolia
Glycine latifolia có nguồn gốc từ Úc, thân khỏe bò sát hoặc đôi khi leo. Phiến
lá rộng có răng cưa, chùm hoa dài, mảnh, màu tím, quả ngắn, nhiều lông tơ hoặc
cứng, được Newell và Hymowitz phân loại năm 1980 [2].
* Glycine tatrobeana
Glycine tatrobeana được bentham phân loại năm 1864. Loài này phân bố ở
Úc, cây nhỏ thân cứng, bò sát đất hoặc đôi khi leo, phiến lá hình bán cầu. Hoa to
hơn Glycine clandestina nhưng quả tương tự [2].
* Glycine canescens
Glycine canescens chỉ phân bố ở Úc, loài thân leo, phiến lá nhỏ dài, gân lá có
gai, thân có lông hơi cứng, màu trắng xám. Hoa màu hồng, có mùi thơm, quả thẳng.
Hạt hình chữ nhật đôi khi bẹt [2].
* Glycine tabacina
Glycine tabacina tìm thấy ở Úc, Trung Quốc, đảo Nam Thái Bình Dương của
New Caladonia, Vanuati, Fifi, Toga và Newe, vùng trung Tây Thái Bình dương,
Ruykyu, đảo Mariana...
Thân của loài này có thể bò hoặc leo, phiến lá có răng cưa. Những lá ở đốt
phía trên có hình ô van bản hẹp, những lá ở đốt phía dưới thường rộng bản hơn.
Chùm hoa thường dài hơn chùm hoa của Glycine clandestina, màu tím đậm, có mùi
thơm. Quả cứng, dài, với hạt màu nâu hoặc đen [2].
* Glycine tomentella
Glycine tomentella phân bố ở Úc, Trung Quốc, Tân Ghine, Philippines và Đài
Loan. Thân cỏ bò hoặc leo có nhiều lông tơ. Lá thường có hình ô van, có gai nhỏ.

5
Cuống hoa ngắn, hoa thường tập trung nhiều ở phía ngọn hơn các loài khác. Hoa
màu tím đậm đến tím nhạt. Quả thẳng, cứng và có vết lõm giữa các hạt. Hạt có màu
nâu hoặc đen [2].
* Glycine soja Sieb và Zucc
Glycine soja phân bố ở Trung Quốc, Liên Bang Nga, Triều Tiên, Nhật Bản và
Đài Loan. Nó có thể mọc ở ruộng, bờ rào, dọc đường, bờ sông. Là cây hàng năm,
thân bò hoặc leo, lá chét có lông cứng, màu nâu, với hình ô van dài. Hoa có màu tím
hoặc đôi khi có màu trắng. Cuống hoa mảnh và ngắn. Quả ngắn, có nhiều lông
cứng, hạt hình ô van dài. Những kết quả nghiên cứu về tế bào học, hình thái học,
chứng tỏ rằng Glycine soja là tổ tiên hoang dại của đậu tương trồng [2].
* Glycine max
Glycine max là loài đậu tương trồng hàng năm, không phát hiện thấy ở loài
hoang dại. Dựa trên những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công
nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở châu Á và được thuần hoá ở Trung Quốc qua
nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong
triềuđại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên [1], [2].
Thân cây thẳng, ít phân cành, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim. Phiến lá hình ô
van hoặc ô van - elip. Chùm hoa có cuống ngắn, hoa màu tím hoặc trắng. Quả thẳng
hoặc cong thường có nhiều lông. Mỗi quả thường có 1 tới 3 hạt, hình tròn hoặc cầu.
Vỏ hạt có màu biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh. Trọng lượng 100 hạt từ
10-20 g [1].
1.1.3. Giá trị của cây đậu tương
Từ lâu, nhiều loài thuộc chi Glycine đã được con người biết đến sử dụng trong
cuộc sống hàng ngày, như làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hay trong các bài
thuốc dân gian. Tuy nhiên, hiện nay loài Glycine max là loài đậu tương được trồng
phổ biến và cho giá trị kinh tế cao nhất.
Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương Glycine max chứa 18% dầu, 38%
protein, 12-25% lipit, 10-15% gluxit; có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S;
các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Chứa các axit
amin cơ bản: isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin.

6
Ngoài ra, còn chứa các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể và là một trong
những loài thực vật cung cấp protein hoàn chỉnh có chất lượng tương đương với
protein động vật [2], [19].
Hạt của loài này được sử dụng trong nhiều món ăn châu Á bao gồm súp, salad
và được chế biến thành các sản phẩm thực phẩm đa dạng, bao gồm sữa đậu nành,
bánh đậu nành lên men (đậu phụ và tempeh), nước tương, tương miso [19]. Bột làm
từ đậu tương được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chế biến, như một chất ổn
định và tăng hàm lượng protein. Dầu chiết xuất từ hạt (dầu đậu nành) được sử dụng
rộng rãi trong nấu ăn (margarine, shortening, salad) cũng như trong ngành dược, mỹ
phẩm và các sản phẩm phục vụ cho ngành công nghiệp (sơn, mực in, xà phòng, chất
khử trùng và linoleum). Dầu đậu tương còn được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu
sạch như xăng sinh học. Ngoài ra, bột đậu tương sau khi chiết xuất dầu được sử
dụng để làm xơ, chất kết dính, hoặc làm thức ăn chăn nuôi. Đậu tương còn là một
loại cây trồng phủ đất, phân xanh [2].
1.2. Tổng quan về phân loại phân tử
1.2.1. Giới thiệu về phân loại phân tử
Phân loại học là ngành khoa học về mô tả và sắp xếp quan hệ phát sinh loài và
các quan hệ giữa các loài, chi và họ tuân theo những quy định của các hệ thống
phân loại nhân tạo và tự nhiên và những Luật quốc tế về danh pháp.
Ðể phân loại sinh vật, phương pháp cổ điển được sử dụng phổ biến nhất là
phân loại hình thái, dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan sinh sản và
sinh dưỡng, phương pháp này đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói
chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện.
Ngoài ra còn có các phương pháp khác như: Giải phẫu so sánh, cổ thực vật
học, sinh hoá học, phương pháp miễn dịch... Hoặc có sự kết hợp giữa các phương
pháp để đưa ra kết quả chính xác, các mẫu sẽ được nhận diện bằng các đặc tính hình
thái bên ngoài và các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn
định danh có sẵn. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp rất khó để nhận biết như mẫu
vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái bên ngoài, hoặc chúng bị dập nát,
hư hỏng các bộ phận, hoặc mẫu vật bị chết, thậm chí là không thể hoặc khó nhận

7
biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài. Trong
những trường hợp này phân loại phân tử bằng mã vạch DNA sẽ là phương pháp
giúp giải quyết vấn đề trên, vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô nhỏ.
Ngoài ra nó còn được ứng dụng để kiểm tra thành phần thảo dược trong thực phẩm
chức năng hay độ tinh khiết của các sản phẩm sinh học. Hơn nữa, mã vạch DNA
còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn
giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên.
Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại đại học
Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003 [14], nhằm giúp nhận diện các
mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn (400 - 800 bp) nằm trong
bộ gen của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật
với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản
phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau. Bài báo
nghiên cứu của Hebert được coi là ví dụ đầu tiên về phân loại phân tử động vật,
dùng đoạn DNA ty thể cytochrome oxidase tiểu đơn vị 1 (CO1). Nghiên cứu thành
công này sớm được ứng dụng để xác định loài của các nhóm động vật khác như
chim, cá, động vật có vú, động vật lưỡng cư và loài bò sát, mã vạch DNA không chỉ
giúp xác định các động vật, thực vật hay các sinh vật sống khác mà nó còn được sử
dụng trong kiểm nghiệm thành phần các loại thuốc thảo dược được thương mại hóa
trên thị trường, mở ra 1 hướng ứng dụng mới của sinh học phân tử [9]. Một mã vạch
DNA cần phải đáp ứng được các yêu cầu sau :
1. Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật.
2. Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao.
3. Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [9].
Xác định loài bằng trình tự đoạn mã vạch DNA gồm năm bước chính. Đầu tiên,
mẫu được thu gom và xác định bởi các nhà phân loại. Sau đó, mẫu được tách chiết
thu DNA tổng số, trình tự DNA đích sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR và giải
trình tự để tạo ra mã vạch. Sau đó các mã vạch được nhập vào hệ thống ngân hàng dữ
liệu Barcode (BOLD). Đây là một hệ thống trực tuyến lưu giữ thông tin mã vạch
DNA chứa các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài

8
đó đã được tìm thấy, trình tự mã vạch, và các ứng dụng khác như giám sát môi
trường, an toàn thực phẩm và y học. Thông tin chuỗi DNA của tất cả các loài đã
được nghiên cứu trong nghiên cứu này có thể được truy cập miễn phí cho tất cả mọi
người. Tính đến năm 2017, BOLD bao gồm hơn 5,9 triệu chuỗi mã vạch DNA từ hơn
542.000 loài [9].
1.2.2. Các gen chỉ thị sử dụng trong phân loại phân tử
Từ các kết quả nghiên cứu DNA barcode trên thế giới cho thấy, có nhiều đoạn
gen được sử dụng làm DNA mã vạch, có thể là những đoạn gen nằm ở trong nhân
(nuclear DNA - nDNA), như vùng ITS; Cytb nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA -
mtDNA), vùng kiểm soát (control region); hay matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S nằm ở
lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA) [9], [16]. Các gen thuộc cpDNA được chia
thành 3 nhóm: Nhóm 1 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16,
rrn5...), trnA (trnH, trnK...), RNA polymerase (rpoA, rpoB...), các gen tiểu phần
ribosome (rps2, rps3...); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho những yếu tố thuộc quang
hợp như psaA, psaB, psbA, psbB (phytosystem), petA, petB (cytochrome b6f), atpA,
atpB (ATP synthase), rbcL, ndhA, ndhB...; Nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF
(ycfs) và các gen mã hóa protein như matK, cemA.
Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như:
16S, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK. Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc
trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví dụ, các
đoạn gen như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các
đoạn gen, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các
đoạn gen, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới
loài. Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn gen nào được
sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật. Vì vậy, việc lựa chọn
những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch
DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao [20], [24], [26].
1.2.3. Một số gen chỉ thị trong phân loại thực vật
Ở động vật, các gen ti thể như CO1 và Cytb được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu phân loại, nhưng khi áp dụng cho các loài thực vật lại biểu hiện tính bảo

9
thủ cao nên không phù hợp làm DNA mã vạch. Hệ thực vật vô cùng phong phú và
đa dạng. Chúng bao gồm thực vật có hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ
và các loài có quan hệ gần với dương xỉ,ước tính gần đây đã cho thấy rằng hiện có
khoảng 380.000 loài thực vật trên cạn, gồm khoảng 352.000 loài thực vật hạt kín,
1.300 loài thực vật hạt trần, 13.000 loài rêu và dương xỉ.
Bởi mức độ tiến hóa của gen mã hóa CO1 ở thực vật chậm hơn động vật rất
nhiều, tốc độ tiến hóa của các gen trên ty thể không nhanh như ở động vật, do vậy
không đủ sai khác để phân biệt được các loài. Vì vậy, các vùng trong hệ gen lục lạp
đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen
rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F). Một vùng
trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là
ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn DNA ribosome). Tính đến năm
2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực
vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp [7], [18].
Vùng gen mã hóa ribosome: rDNA là hệ thống đa gen mã hóa RNA của
ribosome. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên
bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã
hóa ITS1, ITS2. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS.
Các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng
lớn trên nhiễm sắc thể, từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập,
thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức
ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau. Như vậy,
rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt
các loài gần gũi [4].
nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những trình tự hữu ích
nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự
nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng. ITS2 một trong
những marker phát sinh loài phổ biến nhất cho sinh vật nhân chuẩn, để xác định các
loài thực vật và như một locus bổ sung cho CO1 để xác định các loài động vật. Đối
với thực vật, độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật hai lá mầm và rêu được phân bố từ

10
100 đến 700 bp, và độ dài của chuỗi ITS2 từ thực vật một lá mầm, thực vật hạt trần
và dương xỉ được phân bố từ 100 đến 480 bp. Độ dài trung bình của chuỗi ITS2 đối
với cây hai lá mầm, một lá mầm, cây hạt trần, dương xỉ và rêu tương ứng là 221,
236, 240, 224 và 260 bp. Đối với động vật, độ dài chuỗi ITS2 dao động từ 100 đến
1,209 bp (chủ yếu nằm trong khoảng 195 và 510 bp) [24], [26].
Trình tự gen rbcL: Mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose -1,5- bisphosphate
cacboxylase/ oxygenase. Gen lục lạp rbcL được sử dụng trong nhiều nghiên cứu
phát sinh loài và phân loại thực vật. Việc phân tích hơn 10.000 chuỗi rbcL từ
GenBank chứng minh rằng gen rbcL có hiệu quả phân biệt giữa các loài thực vật tới
85%. Do rbcL dễ dàng khuếch đại PCR ở một số loài thực vật, nên được công nhận
là một trong những trình tự gen có tiềm năng cho các nghiên cứu DNA barcode ở
thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp hơn, nên sử dụng kết
hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, như ITS2, matK là mã vạch được đề
xuất để xác định cho cây trồng [20], [23].
Trình tự gen matK: Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen
tiến hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase
liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA.
Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như
một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật.
CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực
vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự với một cặp mồi đơn và đề nghị sử
dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [4], [24].
Sau nhiều lần nghiên cứu mở rộng sàng lọc các vùng gen trong hệ gen thực vật
các vùng gen ITS, Maturase K (matK), trnH-psbA, tiểu đơn vị lớn của ribulose-
bisphosphate carboxylase - rbcL đã trở thành mã vạch tiêu chuẩn được lựa chọn
nhiều nhất ứng dụng trong phân loại thực vật [16], [24].
1.3. Tình hình nghiên cứu DNA barcode trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, có rất nhiều đề tài sử dụng phương pháp DNA barcode để phân
loại và giám định loài. Phương pháp cho kết quả nhanh chính xác tên loài, xác định

11
mối quan hệ di truyền giữa các loài, góp phần trong công tác bảo tồn, lưu giữ những
nguồn gen.
Năm 2009, Daniel H. Janzen và nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học
Pennsylvania, Philadelphia công bố kết quả nghiên cứu “Mã vạch DNA cho thực
vật”, với mục đích xác định mã vạch DNA tiêu chuẩn cho từng loài thực vật trên cạn.
Nhóm tác giả nghiên cứu trên 907 đối tượngthuộc 445 loài thực vật hạt kín, 38 loài
thực vật hạt trần và 67 loài chưa được phân loại. Bảy vùng gen được lựa chọn : gen
atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK-psbI và trnH-psbA. Kết quả thu được,
trong số 397 mẫu được giải trình tự thành công trên 7 chỉ thị, sự phân biệt loài đối với
từng chỉ thị riêng lẻ dao động từ 43% (rpoC1 ) đến 68% - 69 % ( psbK, psbI và trnH,
psbA ), với rbcL và matKlà61%. Nhóm nghiên cứu đã đưa ra khuyến nghị nên kết hợp
hai gen chỉ thị rbcL và matK sẽ cho kết quả phân biệt loài cao [13].
Năm 2012, Kuzmina M.L. và cộng sự sử dụng phương pháp mã vạch DNA để
phân loại 900 mẫu vật đại diện cho 312 trong số 354 loài thực vật có mạch ở Bắc Cực
gần thị trấn Churchill, Manitoba. Nhiều loài thực vật ở đây có khả năng mất đa dạng
di truyền do khả năng phân tán hạn chế do đó giảm phạm vi phân bố, và đặc biệt
chịu tác động lớn bởi biến đổi khí hậu. Phương pháp này được nhóm tác giả đánh giá
là rất hữu ích, xác định nhanh, chính xác. Kết quả nghiên cứu thu được: vùng gen rbcL
cho chất lượng kết quả giải trình tự đạt cao nhất là 95% với mẫu vật tươi và 85% đối
với mẫu khô (Herbarium). Vùng gen ITS2 cho hiệu quả như nhau đối với mẫu tươi và
khô (89% và 88%). Thành công giải trình tự thấp nhất là vùng gen matK (76% mẫu
tươi, 45% mẫu khô). Việc phân loại loài dựa trên kết hợp thông tin hai vùng gen rbcL
và matK phân biệt được 54% của 286 loài, trong khi rbcL và ITS2 phân biệt 63% của
285 loài. Mức phân loại loài cao nhất (69%) khi kết hợp thông tin trình tự từ cả ba
vùng gen. Chỉ thị ITS2 cho kết quả cao trong phân loại các loài có mối quan hệ gần
gũi nhau như cây họ cải (Brassicaceae), họ hoa hồng (Rosaceae), họ hòa thảo
(Poaceae), họ cói (Cyperaceae), tuy nhiên ở một số trường hợp lại cho hiệu quả phân
loại thấp như ở họ Phong lan (Orchidaceae) [22].
Năm 2012, Madesis và cộng sự đã sử dụng phương pháp DNA barcode để
phân loại các loài cây họ đậu thuộc vùng Địa Trung Hải, đây là vùng được đánh giá

12
là rất quan trong việc nghiên cứu về nguồn gốc của cây họ đậu, và nó cũng là một
nguồn thực phẩm chính nuôi sống người dân trong vùng. Nhóm nghiên cứu đã đánh
giá mức hiệu quả việc sử dụng hai vùng lục lạp, trnL và rpoC1, và một vùng gen
nhân ITS2 trong việc tạo mã vạch barcode cho cây họ đậu.Hai mươi lăm loài cây họ
đậu đã được nghiên cứu. DNA được chiết xuất với bộ kit mini của Qiagen Dneasy,
khuếch đại PCR được thực hiện bằng DNA polymerase Kapa Taq và các đoạn mồi
khuếch đại các vùng trnL và rpoC1 của lục lạp hay vùng gen nhân ITS2. Nhóm
nghiên cứu đưa ra kết luận: vùng gen trnL và ITS2 cho kết quả phân biệt thành công
được giữa các loài là 100%, hơn nữa, việc sử dụng vùng trnL cho phép phân biệt
được các loài rất gần gũi, như Phaseolus lunatus và P. coccineus hoặc Vicia faba
subsp Major với V. faba subsp,trong khi vùng rpoC1 chỉ xác định được 72% trong
số chúng [21].
Việc ứng dụng mã vạchDNA trong phân loại học ngày càng được sử dụng rộng
rãi. Phương pháp góp phần rút ngắn thời gian trong công tác phân loại cũng như định
danh loài mới của sinh vật,không chỉ dừng lại ở đó mã vạch DNA còn giúp phân tích
sự đa hình di truyền giữa các loài có cùng nguồn gốc. Ngoài ra, phương pháp đang
được sử dụng trong lĩnh vực kiểm nghiệm thành phần các loại thuốc thảo dược trong
điều trị bệnh,khi thực trạng hiện nay vì nhiều lý do như lợi nhuận, khan hiếm, nhiềuloại
dược liệu có thể bị pha trộn hoặc thay thế bằng các loại tương tự nhưng hoạt chất thấp
hơn hoặc không có, hay thành phần không đúng như trong thông tin công bố, làm giảm
hiệu quả của quá trình điều trị.
Cây thuốc Hoàng Cầm (với danh pháp quốc tế là Scutellaria baicalensis
GEORGI) đây là một trong 50 loài thảo dược cơ bản của y học cổ truyền nổi tiếng
Trung Quốc, thường sử dụng trong các bài thuốc chữa viêm gan, vàng da, tăng lipit
máu, chống huyết khối. Do sự khai thác quá mức đã gây ra sự suy giảm các nguồn tự
nhiên, rễ khô của các loài tương tự như S. amoena, S. Rehderiana và S. viscidula, đã
được sử dụng để pha trộn và thay thế. Việc làmnày có thể gây ra một loạt các tác dụng
điều trị không mong muốn và khókiểm soát chất lượng trong ngành công nghiệp dược
thảo. Do đó, Xiaorong và cộng sự đã giải trình tự và phân tích ba chỉ thị mã vạch DNA,
gen RNA maturase của ribosome (matK), gen tiểu đơn vị lớn ribulose-1,4-bisphosphate

13
carboxylase (rbcL) và gen psbA-trnH phân biệt loại dược liệu này và các loài cây thay
thế chúng. Các vùng gen chỉ thị được khuếch đại từ các mẫu lá thu thập từ các tỉnh có
nguồn dược liệu lớn của Trung Quốc. Dựa trên phân tích kết quả giải trình tự cho thấy,
vùng gen rbcL của loài Scutellaria baicalensis tương đồng cao với các loài S. amoena, S.
rehderiana và S. viscidula, có thể kết luận chúng cùng họ và chi, và vùng gen rbcL có tính
bảo thủ cao, không biệt được đến cấp độ loài. Trong khi đó, gen matK hoặc psbA-trnH có
thể phân biệt chính xác đến cấp độ loài, sai khác giữa các loài từ 1,46 đến 6,16%.Nhóm
nghiên cứu đề xuất sử dụng kết hợp 2 vùng genrbcL vàpsbA-trnH để xác định loài cho cây
thuốc Hoàng Cầm (S. Baicalensis) và các cây thay thế cùng một chi [25].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, có nhiều đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật DNA Barcode để
phân loại định danh loài như:
Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), bằng kỹ thuật mã vạch DNA đã đánh giá đa
dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis
sp). Tác giả đã nghiên cứu khuếch đại vùng gen ITS và matK, và phân tích đa hình
trên mỗi vùng gen. Kết quả thu được vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất
hiện 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình
cao hơn so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7%
trên toàn bộ trình tự. Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo
thủ ở loài C. javanica và C. tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu. Sau
khi phân tích trình tự DNA và cây phát sinh chủng loại tác giả đưa ra kết luận vùng
gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử
dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [7].
Phan Kế Long cùng công sự (2014), trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide
vùng matK và ITS-rDNA đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở
Lai Châu giữa một số loài trong chi Panax ở Việt Nam. Đã giải mã được 1485
nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen ITS-rDNA cho tổng số 17 cá
thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai Châu và Tam thất trắng và đăng ký
các trình tự này trên GenBank. Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK
và ITS-rDNA chỉ ra các loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa. Hai

14
thứ sâm Lai Châu và sâm Ngọc Linh của loài sâm Việt (P. vietnamensis Ha &
Grushv.) có quan hệ chị em. Sâm Lai Châu có chiều dài vùng matK là 1485
nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh 02 nucleotide. Chiều dài vùng ITS-rDNA của
sâm Lai Châu 588 nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh ( từ 4 nucleotide đến 5
nucleotide) [6].
Bùi Văn Thắng, cùng cộng sự (2014), “Giám định một số loài nưa tại Thanh
Hóa bằng các dẫn liệu hình thái và phân tử”. Nhóm tác giả đã sử dụng đoạn gen matK
và trnL phân tích 16 mẫu nưa Thanh Hóa, đối chiếu với Genbank. Kết quả cho thấy
13 mẫu (từ 1-13) là loài nưa Chuông, có chiều dài trình tự đoạn gen matK là 905
nucleotide giống tới 100%, đoạn gen trnL là 552 nucleotide giống tới 99%, có một
nucleotide sai khác ở vị trí 415 (có thêm 1A). Mẫu 14, 15, 16 là loài nưa Krausei, có
chiều đoạn gen matK là 951 nucleotide giống tới 100%, đoạn gen trnL là 444
nucleotide giống tới 99% có một nucleotide sai khác ở vị trí 318 (có thêm 1A), loài
nưa Krausei có phân bố hẹp, chỉ thấy xuất hiện ở xã Trí Nang của huyện Lang
Chánh; trong khi đó loài nưa Chuông tìm thấy phổ biến ở các huyện còn lại của tỉnh.
Kết quả cũng cho thấy việc sử dụng mã vạch DNA của 2 đoạn gen matK và trnL
trong việc giám định các mẫu nưa ở Thanh Hóa là hiệu quả và là cơ sở khoa học phục
vụ cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây nưa có giá trị cho tỉnh [8].
Hà Văn Huân, Phạm Minh Toại (2016) đã tiến hành thu mẫu, giám định và làm
tiêu bản cho loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis kurz). Tách chiết DNA tổng số và
nhân bản thành công các đoạn DNA mã vạch (matK, rbcL, trnH-psbA, ITS2, ITS) từ
DNA tổng số của loài Bách xanh bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR sau tinh sạch được
xác định trình tự nucleotide Kết quả xác định và phân tích trình tự
nucleotide của các đoạn ADN được nhân bản, đã chỉ ra như sau: đoạn matK có
chiều dài 887 nucleotide, đoạn rbcL có chiều dài 599 nucleotide, đoạn trnH-psbA
là 576 nucleotide, đoạn ITS2 là 379 nucleotide và đoạn ITS có chiều dài 971
nucleotide. Khi so sánh trình tự nucleotide của các đoạn trên với các trình tự nucleotide
tương ứng trên ngân hàng gen quốc tế, đoạn gien matK và rbcL có độ tương đồng 100%,
đoạn ITS2 tương đồng 99,37%, đoạn ITS tương đồng 99,16% và đoạn trnH-psbA tương
đồng cao nhất 99,01% so với loài Calocedrus formosana (mã số AB831010). Tác giả

15
đưa ra kết luận các đoạn trnH -psbA, ITS và ITS2 có thể sử dụng làm đoạn DNA mã
vạch cho loài Bách xanh, trong đó trnH-psbA có khả năng phân biệt tốt nhất [5].
Tuy nhiên, hiện chưa tìm thấy đề tài nào trên các trang tạp chí khoa học tại Việt
Nam sử dụng phương pháp DNA Barcode trên đối tượng đậu tương, chỉ tìm thấy duy
nhất một đề tài “Nghiên cứu nhận dạng phân tử một số nguồn gen đậu tương bằng chỉ
thị SSR” với phương pháp lập tiêu bản DNA (DNA fingerprinting) với 19 mẫu đậu
tương Việt Nam được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng quốc gia – Trung tâm Tài
nguyên thực vật.
Với tình hình nghiên cứu như trên cho thấy cần phải có nhiều đề tài nghiên cứu
về nguồn gen các loài cây bản địa tại Việt Nam.

16
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Ðối tượng nghiên cứu: 12 mẫu đậu tương Cúc bóng thu thập từ huyện Võ
Nhai tỉnh Thái Nguyên.
- Quá trình nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ
gen Viện Khoa học Sự sống – Trường Ðại học Nông Lâm - Ðại học Thái Nguyên.
Bảng 2.1. Các mẫu đậu tương nghiên cứu
STT Ký hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu
1 D1 Xóm Trại Rẽo - Xã Bình Long – Võ Nhai
2 D2 Xóm Trại Rẽo - Xã Bình Long – Võ Nhai
3 D3 Xóm Đèo Ngà - Xã Bình Long – Võ Nhai
4 D4 Xóm Đèo Ngà - Xã Bình Long – Võ Nhai
5 D5 Xóm Phương Đông – Xã Phương Giao – Võ Nhai
8 D8 Xóm Là Khoan - Xã Phương Giao – Võ Nhai
9 D9 Xóm Là Khoan - Xã Phương Giao – Võ Nhai
10 D10 Xóm Tân Tiến - Xã Dân Tiến – Võ Nhai
2.2 Nội dung nghiên cứu
1. Đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ Nhai
tỉnh Thái Nguyên.
2. Xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng
3. Đăng kí trình tự gen chỉ thị

17
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Mồi phản ứng PCR
Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gen rbcL và ITS2 được thiết kế dựa
trên nghiên cứu của tác giả Shilin Chen, Levin Kress & Erickson [18]. Thông tin
của các cặp mồi được liệt kê trong bảng sau:
Bảng 2.2. Trình tự mồi phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’)
Kích thước
dự kiến
ITS2-S2F
ITS2-S3R
ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT
GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT
500 bp
rbcL-F
rbcL-R
ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC
GTA AAA TCA AGT CCA CCR*
CG
700 bp
(R*
: A hoặc G)
2.3.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.3.2. 1. Thiết bị
Bảng 2.3. Danh mục thiết bị được sử dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK
2 Bể ổn nhiệt Techne – OSI
3 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany
4 Máy cất nước Canada Bio Water system –Pall Co.UK
5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodak – USD
6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan
7 Máy lắc S3000 – Jeotech- Korea
8 Máy ly tâm Eppendorf – CHLB Đức
9 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore
10 Máy spindown E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA
11 Máy Vortex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China
12 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan
13 Tủantoànsinhhọccấp2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA
14 Tủ lạnh -200
C, -800
C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy

18
2.3.2.2. Hóa chất sử dụng
Các hóa chất chuyên dụng sử dụng cho phân tích sinh học phân tử đều ở dạng
tinh khiết, thành phần hóa chất được liệt kê trong bảng 2.4
Bảng 2.4. Danh mục hóa chất sử dụng
STT Hóa chất Hãng
1 Proteinase K Thermo scientific
2 Rnase Thermo scientific
3 Ethanol Merck
4 Chloroform Merck
5 Isoamin alcohol Merck
6 Tris Base Merck
7 Acid Acetic Merck
8 EDTA Merck
9 Loading Dye Merck
10 Agarose Bio neer
11 Ethidium bromide Merck
12 Enzyme DdeI Thermo scientific
13 Cặp mồi nhân gen GH Thermo scientific
14 Taq polymerase 1U/µl Thermo scientific
15 Buffer Taq polymerase Thermo scientific
16 Buffer Tango Fermentas
17 dNTP: nucleotide tự do Thermo scientific
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật và phân tích sinh hóa hạt
2.4.1.1. Phương pháp phân loại hình thái thực vật
Các giống đậu tương Cúc bóng được thu thập tại các xã Bình Long, Phương
Dân Tiến, Phương Giao huyện Võ Nhai, được trồng khảo nghiệm ở cùng một điều
kiện canh tác. Phương pháp thực hiện theo QCVN 01-58:2011/BNNPTNT “Về
khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống đậu tương”. Các chỉ tiêu theo dõi bao
gồm: Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số lượng hoa, quả, hạt trên cây, trọng
lượng hạt...

19
Mô tả hình thái cây đậu tương dựa trên phương pháp của Ngô Thế Dân[1], và
Trần Văn Điền [2], các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả và hạt.
2.4.1.2. Phương pháp phân phân tích sinh hóa hạt
Phân tích các chỉ tiêu sinh hóa hạt đậu tương được thực hiện tại phòng Phân
tích hóa học – Viện Khoa học Sự sống – Đại học thái Nguyên.
* Xác định hàm lượng Protein
Phương pháp xác định: Theo TCVN 4328-1:2007
Mẫu thử nghiệm được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để
chuyển Nitơ hữu cơ ra dạng vô cơ (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi
muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước
nóng. Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình
hứng tạo ra muối borat amon có mầu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = NH3 + Na2SO4 + H2O
NH3 + H3BO3 = (NH4)3BO3
Để xác định được lượng amoniac (NH3) giải phóng ra trong quá trình chưng
cất được đem đi chuẩn độ bằng dung dich H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch
chuyển sang mầu tím nhạt.
(NH4)3BO3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 + H3BO3
Từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính
được lượng protein có trong mẫu.
* Axit amin
Phương pháp xác định: Theo TCVN 8764:2010
Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất
đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic
và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Axit amin được
tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng
detector quang đo ở bước sóng 570 nm.
* Hàm lượng lipit

20
Việc xác định chất béo dựa vào hàm lượng chất béo được rút ra khỏi mẫu
bằng các dung môi hữu cơ. Chiết xuất chất béo ra khỏi nguyên liệu bằng cách đun
trực tiếp trong dung môi hữu cơ và rửa rải cho đến hết chất béo ra khỏi nguyên liệu.
Cân khoảng 2-3 g mẫu (m1) đã được nghiền nhỏ cho vào túi giấy lọc, gấp kín
mép túi sao cho mẫu không bị rơi vãi, sấy lại túi giấy có chứa mẫu ở nhiệt độ 1050
C
đến khi khối lượng không đổi (m2). Đặt bình cầu lên bếp điện và cho ether petro vào
1/2 thể tích bình, lắp trụ chiết đã có sẵn các túi mẫu vào bình cầu, cho ether petro
vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu và ngâm qua đêm.
Thời gian chiết xuất lipid kéo dài khoảng 6-8 giờ cho đến khi hết lipit trong
mẫu (thử bằng cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết nhỏ lên mặt kính đồng hồ
sạch, cho bay hết ete nếu không có vết lipid trên mặt kính thì lipid đã được chiết
hoàn toàn).
Sau khi đã chiết hết chất béo ta lấy túi giấy lọc đựng mẫu ra cho vào sấy, đến
khối lượng không đổi, ghi lại khối lượng bao để tính toán kết quả (m3).
Hàm lượng chất béo trong mẫu khô được tính theo công thức sau:
W =
(m2-m0) - (m3 – m0)
x 100
(m2 – m0)
* Hàm lượng khoáng
Phương pháp xác định: TCVN 8124 : 2009
Cân khoảng 0,5 -2g mẫu đã nghiền cho vào chén đã được chuẩn bị. Sấy phần
mẫu thử trong chén ở nhiệt độ gần 100o
C cho đến khi hết ẩm. Chuyển chén vào lò
nung và nung ở 525o
C ± 25o
C cho đến khi tro hoá hoàn toàn. Để nguội, và làm ẩm
tro bằng nước cất, làm khô trên nồi hơi, sau đó trên bếp điện. Đưa chén trở lại lò
nung và nung trong 60 phút, làm nguội trong bình hút ẩm và cân. Nung tiếp trong lò
nung 30 phút, để nguội và cân.
* Hàm lượng Gluxit

21
Cân 5 - 20g mẫu, chuyển toàn bộ vào bình tam giác dung tích 250ml, tráng kỹ
cốc cân bằng nước cất, lượng nước cho vào bình khoảng 100 - 150ml. Thêm 5ml
axit clohydric đặc vào bình khoảng 100 - 150ml. Thêm 50ml axit clohydric đặc vào
bình mẫu, đậy nút cao su có cắm ống sinh hàn ngược và đun trên bếp cách thủy sôi
trong 2 giờ. Lấy bình ra làm nguội, trung hòa mẫu bằng natri hydroxit 30%, khử
protit, lọc, định mức. Hút 5 - 25ml dịch lọc, chuyển vào bình tam giác dung tích
250ml, thêm vào bình 50ml hỗn hợp pheling A, B và tiếp tục đun, lọc, hòa tan và
chuẩn độ. Ghi số ml kali pemanganat 0,1N đã dùng.
2.4.2. Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền
2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA đậu tương Cúc bóng được tách chiết DNA từ mô lá, dựa trên phương pháp
tách chiết của Dellaporta cùng các cộng sự (1983) [10] và Doyle (1990) [11].
Quy trình thực hiện như sau:
+ Bước 1: Nghiền 0,02g mẫu (lá cây) với 500 µl đệm CTAB, chuyển hỗn hợp
vào ống effendorf và ủ ở 65ºC trong 1 giờ.
+ Bước 2: Bổ sung 500 µl dung dịch CIAA (24 Chloroform: 1 Isoamyl
alcohol), đảo trộn nhẹ nhàng trong 1 phút.
+ Bước 3: Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút với tốc độ 15000 xg, chuyển pha trên
sang một ống effendorf mới.
+ Bước 4: Ước tính khối lượng của pha lỏng. Kết tủa DNA bằng cách thêm
0,08 khối lượng Kali Acetate và 0,54 khối lượng của Isopropanol lạnh.
+ Bước 5: Ủ hỗn hợp ở -20o
C trong 1 giờ.
+ Bước 6: Ly tâm với tốc độ 15000 xg trong 6 phút và loại bỏ dịch nổi để thu
hồi kết tủa DNA.
+ Bước 7: Rửa tủa với 700 µl ethanol 70% lạnh và ly tâm trong 3 phút.
+ Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại kết tủa DNA
+ Bước 9: Rửa kết tủa DNA lại lần thứ 2 với 700 µl ethanol 95% lạnh và ly
tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút.
+ Bước 10: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại kết tủa DNA. Để khô kết tủa.
+ Bước 11: Hòa tan kết tủa bằng 50µl đệm TE 1X.

22
2.4.2.2. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose
Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại
phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và
cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương
pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel,
nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về
phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
Chuẩn bị gel:
+ Cân 1 gam agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi
sóng sao cho agarose tan hoàn toàn.
+ Để gel nguội đến 60o
C, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và chờ gel đông
+ Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
+ Đổ dung dịch đệm TAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Tra mẫu điện di:
+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 1 µl loading dye với 5 µl mẫu.
+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 80-110 V, 100 mA, trong 35
phút (khi vị trí vạch mầu chạy được khoảng 2/3 bản gel).
Nhuộm gel:
+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide (nồng
độ 30 µl/l) trong 15 phút.
+ Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.
2.4.2.3. Phương pháp khuếch đại các gen chỉ thị ITS2, rbcL từ DNA tổng số của các
mẫu đậu tương thu thập (PCR)
Thành phần phản ứng được liệt kê trong bảng 2.5

23
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR
STT Hóa chất Thể tích (µl)
1 H2O 14,7
2 PCR Buffer 10X 2
3 dNTP 10mM 0,4
4 Mồi phản ứng PCR 0,8
5 Taq polymerase 0,1
6 DNA khuôn 2
Tổng thể tích 20
DNA tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng
khuếch đại đoạn gen rbcL và ITS2.
Các thành phần phản ứng được trộn đều, sau đó đặt vào máy PCR với chu
trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ chu trình nhiệt PCR
Sản phẩm sau phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước
của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn
(Fermentas).
2.4.2.4. Phương pháp xác định trình tự gen chỉ thị ITS2, rbcL của mẫu nghiên cứu
- Giải trình tự là phương pháp để xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide
(adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với sự phát triển
của phương pháp giải trình tự và phân tích tự động việc xác định trình tự DNA đã

24
trở nên dễ dàng hơn. Các thông tin về trình tự DNA hệ gene của sinh vật đã trở nên
không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các
lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y.
- Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được gửi đi giải trình tự. Sản
phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification
(Invitrogen) và giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer
theo nguyên lý của Sanger với bộ kit BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing
(công ty 1st BASE tại Singapore), sử dụng cặp mồi ITS2R/ ITS2F và cặp mồi
rbcLR/ rbcLF.
 Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương
nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới và Việt Nam
- Tổng hợp dữ liệu về các chỉ thị phân tử của đậu tương đã công bố. Trình tự
gene rbcL và ITS2 của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với
trình tự các trình tự rbcL và ITS2 đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và
NCBI thông qua phần mềm Bioedit,Seqscanner v1.0.
- Xây dựng sơ đồ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương
nghiên cứu với các giống đậu tương khác trên thế giới bằng phần mềm chuyên dụng
DNAstar 2.0.
2.4.3. Đăng kí trình tự gen chỉ thị đậu tương nghiên cứu trên ngân hàng gen
quốc tế
Trình tự gen chỉ chị rbcL và ITS2 được đăng ký trực tuyến trên ngân hàng gen
NCBIdựa trên các thông tin của đề tài nghiên cứu.

25
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái của đậu tương Cúc bóng tại huyện Võ
Nhai tỉnh Thái Nguyên
Sau khi thu thập mẫu và gieo trồng đánh giá hình thái cây đậu tương Cúc bóng
chúng tôi thu được kết quả như sau:
Thân cây thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ mọc dày
bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá. Thân khi còn non có màu xanh khi về
già chuyển sang màu nâu nhạt. Thân có trung bình 13-14 lóng (đốt), các lóng ở phía
dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài, có chiều cao từ gốc tới ngọn là
35-55 cm. Thân dạng bán đứng, trong điều kiện nghèo dinh dưỡng thân có kích
thước nhỏ hơn và cho dạng thân leo.
Rễ cây có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 25-50 cm. Trên rễ chính
mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 8-9 cm. Trên rễ
chính và rễ phụ có nhiều nốt sần, nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất
0-20 cm. Từ trên 20 nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt
sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho
cây, khi mới hình thành kích thước nhỏ và có màu trắng sữa, khi phát triển tốt cho
màu hồng.
Cây có 3 loại lá: Lá mầm (lá tử diệp): Lá mầm mới mọc có màu xanh lục, khi
tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên
xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối
xứng nhau. Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét; Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu
xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. Trên lá có nhiều lông tơ. Lá có hình
dạng trứng nhọn, số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ.

26
Hình3.1:HìnhtháicâyđậutươngCúcbóng Hình3.2:RễvànốtsầnđậutươngCúcbóng
Hoa đậu tương Cúc bóng nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của
hoa có màu tím nhạt, hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng
chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và
nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Đài hoa có màu xanh, nhiều
bông; cánh hoa: một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bướm và 2 cánh thìa; nhị đực: 9 nhị
đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhuỵ cái và 1 nhị riêng lẻ; nhụy cái: Bầu thượng, tử
phòng một ngăn có 1-4 tâm bì (noãn) nên thường quả đậu tương có 2-3 hạt.
Hình3.3:Hìnhtháiláđậutương
Cúcbóng
Hình 3.4: Hoa đậu tương Cúc bóng

27
Các bộ phận hoa hình thành như sau: trước tiên là vòi đài, trong đó có cánh
đài phía trước hình thành đầu tiên sau đó là 2 cánh đài bên và cuối cùng là 2 cánh
sau. Sau khi đài hoa hình thành, tiếp đến là tràng hoa. Ở tràng hoa có 2 cánh thìa
hình thành trước sau đó đến 2 cánh bên cạnh và cuối cùng là cánh cờ, mầm cánh
hoa phát triển chậm sau đó nhụy vượt lên. Các nhị ra trước xen kẽ với nhị ra sau
bao quanh nhụy đang phát triển. Chiếc nhị tự do là cái xuất hiện sau cùng, nằm giữa
cánh hoa cờ và đường nối của phần bụng của nhụy. Khi nhị phát triển, trên đầu của
nó hình thành một bao phấn xẻ bốn thùy và một sợi ngắn.
Quả đậu tương Cúc bóng hơi cong, có chiều dài từ 2 tới 7 cm. Quả có màu sắc
biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen. Lúc quả non có màu xanh
nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi chín có màu nâu vàng. Số
quả biến động từ 31 - 40 quả trên một cây. Vỏ của lớp quả non gồm nhiều lông dần
dần những lông dạng chùy tiêu biến, những lông có ria cứng tồn tại tới lúc
quả già. Trước khi quả mở ra, ở trên hai đường nối xuất hiện vết nứt, sau đó 2 nửa
quả bong ra và xoăn lại theo đường trục của nó.
Hạt: Một quả chứa từ 1- 3 hạt, hạt có hình dạng tròn (hình bầu dục, hoặc tròn
dẹt), vỏ hạt đậu tương Cúc bóng có 3 lớp rõ ràng: biểu bì, hạ bì và lớp nhu mô bên
trong, màu vỏ hạt màu vàng bóng, khối lượng trung bình 100 hạt l2g - 13,5g. Rốn
hạt có màu nâu sậm.
Hình 3.5: Quả đậu tương Cúc bóng Hình 3.6: Hạt đậu tương Cúc bóng

28
Hình 3.7: So sánh kích thước hạt đậu tương Cúc bóng và DT 84
Bảng 3.1. So sánh hình thái đậu tương Cúc bóng
STT
Tên
giống
Màu
hoa
Màu
lông
trên
thân
chính
Màu
vỏ
quả
khô
Màu
vỏ
hạt
Màu
rốn
hạt
Hình
dạng
lá
Dạng
cây
Thời
gian
sinh
trưởng
(ngày)
Chiều
cao
cây
(cm)
KL
1000
hạt
(gram)
1
Cúc
bóng
Tím Nâu
Vàng
xám
Vàng
Nâu
sậm
Trứng
nhọn
Bán
đứng
80-85 35-55 120-135
2 DT84 Tím Nâu Vàng Vàng Nâu
Trứng
nhọn
Bán
đứng
85-90 35-60 160-200
3 DT2008 Tím Nâu Vàng Vàng Đen
Trứng
nhọn
Bán
đứng
95-110 50-80 180-220
4 DT90 Trắng Nâu Xám Vàng Vàng
Trứng
nhọn
Bán
đứng
90-95 35-50 180-220
5 DT96 Tím Nâu Vàng Vàng Vàng
Trứng
nhọn
Bán
đứng
95-100 45-60 180-220
6 DT99 Trắng Trắng Xám Vàng Nâu
Trứng
nhọn
Bán
đứng
70-80 30-50 150-170
(DT84, DT2008, DT90, DT96, DT99: 05 giống đậu tương đối chứng do Viện di
truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp)
Qua phân tích hình thái và bảng so sánh 3.1 cho thấy; Giống đậu tương Cúc
bóng Võ Nhai - Thái nguyên mang những đặc điểm hình thái chung của cây đậu
tương như màu vỏ hạt, hình dạng lá, dáng cây, bên cạnh đó cũng có những điểm

29
khác biệt với các giống khác về màu sắc hoa, màu vỏ quả khô khác với DT90,
DT99, màu rốn hạt khác với DT2008, DT90, DT96; có mức tương đồng cao về hình
thái với giống đậu tương DT84, tuy nhiên kích thước hạt trung bình của đậu tương
Cúc bóng nhỏ hơn (hạt DT84 dài 0,9cmrộng 0,72cm; Hạt Cúc bóng
dài 0,82cmrộng 0,64cmkhối lượng 1000 hạt dao động trong khoảng
120-135g thấp hơn giống đậu tương DT84 từ 40-65g. Các chỉ tiêu về thời gian sinh
trưởng, chiều cao cây không có sự khác biệt lớn.
Chúng tôi tiến hành phân tích thêm các chỉ tiêu hóa sinh: hàm lượng lipit, hàm
lượng protein, khoáng tổng số, gluxit, xác định thành phần axit amin trong hạt đậu
tương Cúc bóng. Kết quả tổng hợp tại bảng 3.2 và bảng 3.3.
Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng của đậu tương Cúc bóng
TT Giống Protein (%) Lipit thô (%)
Khoáng
tổng số (%)
Gluxit (%)
1 Cúc bóng 36,57 21,38 4,74 24,37
Bảng 3.3. Thành phần axit amin trong protein của đậu tương Cúc bóng
TT Tên axit amin
Hàm lượng
g/100g
% axit amin
trong Protein
1 Aspartic acid 3,71 10,15
2 Serine 2,16 5,89
3 Glutamic acid 3,38 9,24
4 Glycine 1,50 4,10
5 Histidine 0,71 1,95
6 Threonine 0,75 2,04
7 Arginine 2,75 7,51
8 Alanine 1,52 4,15
9 Proline 1,71 4,68
10 Cystine 0,61 1,67
11 Tyrocine 0,97 2,66
12 Valine 1,53 4,18
13 Methionine 0,48 1,30
14 Lysine 2,29 6,27
15 IsoLeucine 1,68 4,58
16 Leucine 2,83 7,72

30
17 Phenyl alanine 1,82 4,99
Tổng axit amin 30,39 83,11
Bảng 3.2 và 3.3 cho thấy hàm lượng protein và lipit của đậu tương Cúc bóng khá
cao. Kết quả trên được so sánh với nghiên cứu của Lê Phương Dung, Chu Hoàng Mậu [3]
trên 5 giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La (Bóng Phù Yên, Mắt Cua Phù Yên, Yên
Châu, Mai Sơn, Lào và giống DT84 (Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam). Hàm lượng
protein dao động trong khoảng 34,97% - 47,74%. Trong đó giống có hàm lượng protein
cao nhất là giống Mắt Cua Phù Yên (47,74%) và giống có hàm lượng protein thấp nhất là
DT84 (34,97%). Hàm lượng lipit của các giống khá đồng đều, dao động trong khoảng
16,70% - 22,84%, giống đậu tương Bóng Phù Yên có hàm lượng lipit thấp nhất (16,70%),
cao nhất là giống DT84 (22,84%). Như vậy hàm lượng protein và lipit của đậu tương Cúc
bóng đạt mức trung bình so với mẫu so sánh.
Kết quả thành phần axit amin cho thấy đậu tương giống Cúc bóng có 17 loại
axit amin, với tổng axit amin trong protein là 83,11%; có chứa 8 loại axit amin
không thay thế như isoleucine, leucine, lysine, valine, threonine, methionine, phenyl
alanine, histidine.
3.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền của đậu tương Cúc bóng
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Yêu cầu của kỹ thuật tách chiết DNA là thu nhận các phân tử ở trạng thái
nguyên vẹn không bị phân hủy hay đứt gãy bởi các tác nhân cơ học, đây là điều kiện
đầu tiên quyết định cho sự thành công của quá trình nghiên cứu. Kết quả tách chiết
DNA tổng số từ các mẫu lá của cây đậu tương Cúc bóng được thể hiện trên hình 3.8.
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12

31
Hình 3.8. Kết quả tách chiết DNA tổng số đậu tương
(Giếng D1 đến D12 lần lượt là 12 mẫu đậu tương Cúc bóng nghiên cứu)
Từ hình ảnh điện di cho thấy các band sáng đều, DNA ít bị đứt gãy, các mẫu
DNA tổng số thu được có chất lượng tương đối tốt. Tuy nhiên, phương pháp điện di
kiểm tra DNA tổng số chỉ có thể xác định được độ nguyên vẹn của DNA mà chưa
xác định được độ tinh sạch cũng như hàm lượng DNA. Chính vì vậy bước tiếp theo
chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ kế Biomate 3 để tiến hành xác định nồng độ
và độ tinh sạch các mẫu DNA thu được. Kết quả được thể hiện như bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA
STT Mẫu nghiên cứu Tỉ số OD260/OD280 Nồng độ DNA (ng/µl)
1 D1 1,83 36,4
2 D2 1,85 37,0
3 D3 1,92 36,5
4 D4 1,86 37,2
5 D5 1,94 36,6
6 D6 1,88 35,7
7 D7 1,91 39,6
8 D8 1,84 35,8
9 D9 1,93 37,3
10 D10 1,81 40,4
11 D11 1,82 39,1
12 D12 1,87 41,6
Từ bảng kết quả cho thấy các mẫu DNA thu được ít lẫn tạp protein hay
RNA hoàn toàn đủ điều kiện cho phản ứng PCR.
Tỉ số OD260/OD280 các mẫu nghiên cứu tương đối đồng đều, kết quả dao
động từ 1,82 đến 1,94 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2 được coi là tinh sạch (tỷ
số OD260/OD280 < 1,8 sản phẩm tách chiết chứa nhiều Protein, OD260/OD280 >
2,2 trong sản phẩm chứa nhiều RNA).
Bảng số liệu cũng cho thấy sự tương quan giữa nồng độ DNA với kết quả
điện di sản phẩm DNA: Những mẫu có băng sáng đậm rõ có nồng độ DNA cao

32
hơn (mẫu D7, D9, D10, D11, D12) so với những mẫu có băng sáng mờ (mẫu
D6 và D8).
3.2.2. Kết quả khuếch đại các gen chỉ thị rbcL và ITS2
Từ kết quả trên cho thấy các gen chỉ thị đều được khuếch đại thành công.
Sản phẩm PCR cho một băng duy nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ. Đối
chiếu với thang DNA chuẩn của hãng Thermo Scientific, kích thước sản phẩm
Hình 3.9. Kết quả khuếch đại chỉ thị rbcL (Giếng L: Ladder GenRuler 1 kb
(Thermo Scientific), giếng D1-D12 lần lượt là 12 mẫu đậu tương nghiên cứu.
Hình 3.10. Kết quả khuếch đại chỉ thị ITS2 (Giếng L: Ladder GenRuler 1 kb
(Thermo Scientific), giếng D1-D12 lần lượt là 12 mẫu đậu tương nghiên cứu.

33
khuếch đại các gen chỉ thị đều có kích thước đúng như dự kiến chỉ thị rbcL
khoảng 700 bp và ITS2 khoảng 500 bp. Như vậy, sản phẩm PCR đủ điều kiện
để có thể giải trình tự.
3.2.3. Kết quả phân tích các gen chỉ thị
Sản phẩm PCR đạt tiêu chuẩn được gửi tới công ty 1st
BASE tại Singapore.
Trước khi giải trình tự, các sản phẩm PCR được làm tinh sạch, sau đó trình tự được
xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger.
3.2.3.1. Kết quả phân tích trình tự chỉ thị rbcL
 Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự
Chất lượng kết quả giải trình tự được phân tích dựa trên phần mềm Seqscanner
v2.0. Chỉ số QV (Quality Value) được chia theo ba cấp độ: Chất lượng thấp, QV
nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ); chất lượng trung bình, QV nằm trong
khoảng 20 - 30 (biểu thị màu vàng) và chất lượng cao với giá trị QV trên 30 (biểu
thị bằng màu xanh lam). Giá trị của QV phụ thuộc vào cường độ tín hiệu giải trình
tự. Chất lượng giải trình tự của các mẫu thu được như sau:

34
Hình 3.11: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen rbcL
(1, 3, 5: lần lượt tương ứng với mẫu đậu tương D1, D3, D5)
Kết quả giải trình tự cho thấy đoạn 20 bp đầu tiên và các bp cuối (màu đỏ,
vàng) của chỉ thị chất lượng thấp, phần màu xanh cho chất lượng tín hiệu giải trình
tự cao. Kết quả này phù hợp với lý thuyết giải trình tự, do đoạn đầu và cuối phản
ứng giải trình tự không ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ứng ổn định cường
độ tín hiệu cao và chính xác.
12 trình tự chỉ thị rbcL thu được có chất lượng tương đối tốt, đủ điều kiện cho
việc so sánh đa hình gen.
 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rbcL
Trình tự gen rbcL của 12 mẫu đậu tương sau khi loại bỏ các nucleotide ở hai
đầu phản ứng giải trình tự do tín hiệu nhiễu được so sánh với nhau bằng phần mềm
Bioedit. Kết quả thu được như sau:

35
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị rbcL
(1-12: 12 mẫu đậu tương Cúc bóng nghiên cứu)
Kết quả cho thấy không có sự sai khác trong trình tự vùng gen rbcL của 12
mẫu đậu tương Cúc bóng.
Trình tự chỉ thị rbcL của mẫu nghiên cứu tiếp tục được tiến hành chạy BLAST
trên NCBI và được tổng hợp trong bảng 4.3 bằng phần mềm DNAstar phiên bản 2.0
Bảng 3.5: Hệ số tương đồng trình tự gen rbcL của mẫu đậu tương Cúc bóng với
trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA
Bảng 3.3 cho thấy, mẫu đậu tương nghiên cứu có sự tương đồng cao tới 100%
với các mã trình tự KY241814.1 (loài Glycine soja), LT576825.1 (loài Glycine
max), KR073289.1, KR073297.1, KR073301.1, KR073305.1, KR073306.1 (5

36
giống đậu tương Việt Nam thuộc loài Glycine max), tương đồng trên 99% với các
loài Glycine stenophita, Glycine falcata, Glycine tabacina, Glycine canescens,
Glycine dolichocarpa, Glycine gracilis.
Theo tổ chức BOLD (ngân hàng mã vạch): Những phát sinh sai khác lớn hơn
2% thì có khả năng hình thành loài mới. Như vậy đối với vùng gen khuếch đại từ
chỉ thị rbcL của đề tài chưa đủ cơ sở để định danh đến cấp độ loài. Tuy nhiên, dữ
liệu trình tự rbcL đã cung cấp căn cứ để xác định mẫu đậu tương Cúc bóng thuộc
chi Glycine, đây cũng là cơ sở để khẳng định vùng gen rbcL có tính bảo thủ cao, vì
vậy trong một số trường hợp nghiên cứu chỉ thị này chỉ phân biệt được đến cấp độ
chi, khó phân biệt được ở các loài có mối quan hệ gần gũi, điều này có thể thấy qua
các kết quả nghiên cứu củaMaria L Kuzmina[22] và Xiaorong [25].
3.2.3.2. Kết quả phân tích trình tự chỉ thị ITS2
 Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự
Chất lượng kết quả giải trình tự ITS2 được phân tích dựa trên phần mềm
Seqscanner v2.0 tương tự như đối với chỉ thị rbcL thu được như sau:
Hình 3.13: Kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự gen ITS2
(1, 2, 8: lần lượt tương ứng với mẫu đậu tương D1, D2, D8)

37
Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự cho thấy, trong 12 mẫu đậu tương có
02 mẫu (mẫu số 6, 8) có chất lượng giải trình tự không đạt yêu cầu, các tín hiệu có
chỉ số QV đa phần nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ) và 20 - 30 (biểu
thị màu vàng); Nguyên nhân có thể do lượng DNA không đủ cho phản ứng giải
trình tự, do đó chất lượng đọc không chính xác, chúng tôi tiến hành loại bỏ hai mẫu
trên, vì khi so sánh sai khác sẽ không có ý nghĩa.
10 mẫu (mẫu số D1, D2, D3, D4, D5, D7, D9, D10, D11, D12) chất lượng tín
hiệu giải trình tự tốt, tín hiệu ở giữa đều có chỉ số QV đạt chất lượng cao, tín hiệu
đầu và cuối có chỉ số QV thấp, xuất hiện tín hiệu nhiễu do phản ứng giải trình tự
không ổn định, có thể loại bỏ. Kết quả này không ảnh hưởng tới sự phân tích trình
tự ITS2 do cặp mồi đã được thiết kế để nhân được đoạn gen chứa vùng ITS2. Độ dài
của trình tự ITS2 của các loài đậu tương dao động khoảng 205 đến 222 nucleotide
điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kollipara và cộng sự năm
1997 [17]. Như vậy sau phân tích chất lượng giải trình chúng tôi chọn ra 10 mẫucó
chỉ số QV cao để thực hiện các bước so sánh tiếp theo.
 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS2
Trình tự gen ITS2 của 10 mẫu đậu tương sau khi loại bỏ các nucleotide ở hai
đầu phản ứng giải trình tự do có tín hiệu nhiễu được so sánh với nhau bằng phần
mềm Bioedit. Kết quả thu được như sau:

38
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2
(D1-D12: 10 mẫu đậu tương Cúc bóng nghiên cứu)
Kết quả cho thấy, vùng gen khuếch đại không có sự sai khác giữa các trình tự
ITS2 trong nội bộ các mẫu đậu tương Cúc bóng phân tích. Không có sự biến dị, mất
nucleotide hay đột biến. Trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng được so
sánh với với các dữ liệu đã được công bố tại ngân hàng mã vạch DNA (NCBI) bằng
ứng dụng BLAST. Kết quả được tổng hợp trên hình 3.8 và bảng 3.4 bằng phần mềm
Bioedit, DNAstar phiên bản 2.0.

39
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự nucleotide chỉ thị ITS2 của mẫu đậu tương
Cúc bóng và các loài chi Glycine
Bảng 3.6: Hệ số tương đồng trình tự gen ITS2 của mẫu đậu tương Cúc bóng với
trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA
Chúng tôi lựa chọn các mã số trình tự lần lượt là JX546295.1, JX546294.1,
U60548.1, U60547.1, U60537.1, U60533.1, U60546.1, U60543.1, U60534.1,
U60550.1 đại diện cho các loài Glycine tomentella, Glycine tabacina, Glycine
cyrtoloba, Glycine curvata, Glycine microphylla, Glycine canescens, Glycine
pindanica, Glycine arenaria, Glycine clandestina, Glycine soja. 3 mã số EU288921.1,

40
JN617195.1, MH688901.1 thuộc loài Glycine max của Đài Loan, vùng Địa Trung Hải
và Canada có mức tương đồng cao với mẫu đậu tương nghiên cứu để tiến hành phân
tích (không tìm thấy dữ liệu trình tự ITS2 của các giống đậu tương Việt Nam được
công bố trên ngân hàng gen NCBI hay ngân hàng mã vạch Boldsystems).
Kết quả cho thấy mẫu đậu tương Cúc bóng có mức tương đồng tới 100% với
cả 3 mã số trình tự thuộc loài Glycine max, 99,7% với loài Glycine soja với mức sai
khác là 0,3% (một nucleotide) và từ 4%-7% với các loài còn lại. Kết quả này tương
đồng với kết quả nghiên cứu của Kollipara và cộng sự, khi ông so sánh 18 loài
thuộc chi đậu tương Glycine trong vùng gen nhân ITS sự sai khác giữa loài Glycine
max với Glycine Soja dao động trong khoảng 0,2% (sai khác một nucleotide) và đến
8,6% với các loài như Glycine hirticaulis và Glycine falcata[15].
Theo tổ chức BOLD: Những phát sinh sai khác lớn hơn 2% thì có khả năng
hình thành loài mới. Kết quả cho thấy giống đậu tương Cúc bóng, có mối quan hệ họ
hàng gần gũi với các giống đậu tương của Đài Loan, vùng Địa Trung Hải và Canada,
và có thể thuộc loài Glycine max (sai khác 0%) hoặc Glycine soja (sai khác 0,3%).
Kết hợp với kết quả phân tích hình thái cho thấy cây đậu tương Cúc bóng có một số
đặc điểm chung với loài Glycine max, khác với loài đậu tương hoang dã Glycine soja,
điển hình nhưhình dáng cây loài Glycine max là thẳng hoặc bán đứng, trong khi loài
Glycine soja dạng bò hoặc leo. Như vậy có thể kết luận giống đậu tương Cúc bóng
thuộc loài Glycine max.
So sánh trình tự với 3 giống đậu tương trên thế giới cho thấy mặc dù vị trí địa lý
khác nhau nhưng vùng gen ITS2 không có sự khác biệt giữa các giống (tương đồng
100%), mức đa hình thấp, mức bảo thủ trong loài cao, chỉ thị ITS2 phù hợp để giúp
định danh các loài thuộc chi Glycine. Kết quả này cũng thấy trong nghiên cứu của
Madesis và cộng sự khi tiến hành phân loại 25 loài thuộc chi Glycine bằng chỉ thị
ITS2, cho kết quả phân biệt thành công được giữa các loài là 100% [21]. Nhiều
nghiên cứu cũng đưa ra, đây là vùng gen rất hữu hiệu trong việc phân loại đến cấp độ
loài, đặc biệt các loài có mối quan hệ gần gũi như các loài thuộc cây họ cải, họ hoa
hồng, họ hòa thảo, họ cói,...Tuy nhiên ở một số trường hợp lại cho hiệu quả thấp như
ở họ phong lan [22], [24], [26].
 Xây dựng sơ đồ cây phát sinh chủng loại

41
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự vùng gen ITS2 của 12
loài thuộc chi Glycine bằng phần mềm DNAstar phiên bản 2.0.
Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa
trên trình tự ITS2
Kết quả phân tích được thể hiện trên hình 4.7 cho thấy các mẫu nghiên cứu
đều xuất phát chung một nguồn gốc (họ đậu Fabaceae, chi Glycine) và được chia
thành 2 nhóm lớn.
+ Nhóm I gồm các giống đậu tương thuộc loài Glycine max: đậu tương Cúc
bóng, đậu tương Đài loan (EU288921.1), giống đậu tương Địa Trung Hải
(JN617195.1) và giống đậu tương Canada (MH688901.1), chúng có mối quan hệ
gần gũi với loài Glycine soja.
+ Nhóm II gồm 10 mẫu, được chia thành hai phân nhóm
Phân nhóm II.a gồm 2 loài Glycine curvata và Glycine cyrtoloba (có mức
tương đồng là 98,7%).
Phân nhóm II.b được chia thành 2 phân nhóm phụ nhỏ hơn. Một nhóm gồm
các loài Glycine tomentella, Glycine tabacina, Glycine clandestina, Glycine
canescens. Phân nhóm phụ còn lại gồm: Glycine arenaria, Glycine pindanica,
Glycine albicans, Glycine microphylla.
3.3. Đăng ký trình tự gen chỉ thị lên ngân hàng gen quốc tế
Trình tự gen rbcL và ITS2 của giống đậu tương Cúc bóng được đăng ký trên
ngân hàng gen NCBI với mã số lần lượt là MN625739 và MN224216.

42
KẾT LUẬN
1. Kết luận
- Giống đậu tương Cúc bóng Võ Nhai - Thái nguyên mang những đặc điểm
hình thái chung của cây đậu tương, có những điểm khác biệt với các giống đối
chứng về màu sắc hoa, màu vỏ quả khô khác, có mức tương đồng cao về hình thái
với giống đậu tương DT84. Tuy nhiên kích thước hạt trung bình của đậu tương Cúc
bóng nhỏ hơn, khối lượng 1000 hạt dao động trong khoảng 120-135g thấp hơn
giống đậu tương DT84 từ 40-65g. Các chỉ tiêu về thời gian sinh trưởng, chiều cao
cây không có sự khác biệt lớn.
- Hàm lượng protein trong đậu tương Cúc bóng là 36,57%, lipit 21,38%,
khoáng 4,74%, gluxit 24,37%, chứa tới 17 loại axit amin, có chứa 8 loại axit amin
không thay thế: isoleucine, leucine, lysine, valine, threonine, methionine, phenyl
alanine, histidine.
- Khuếch đại thành công hai vùng gen chỉ thị rbcL và ITS2. Dựa trên sự phân
tích vùng chỉ thị rbcL cho thấy đây là vùng gen có tính bảo thủ cao, có ý nghĩa
trong việc xác định đậu tương Cúc bóng thuộc chi Glycine. Chỉ thị ITS2 cho thấy
giống đậu tương Cúc bóng thuộc loài Glycine max với mức tương đồng là 100% với
các giống đậu tương vùng Địa Trung Hải, Đài Loan, Canada, có mối quan hệ gần
gũi với loài Glycine soja, mức tương đồng là 99,7% với mức sai khác là 0,3% (một
nucleotide) và từ 4% - 7% với 10 loài còn lại thuộc chi Glycine.
- Trình tự gen rbcL và ITS2 của đậu tương Cúc bóng được đăng ký trên ngân
hàng gen quốc tế NCBI có mã số là: MN625739 và MN224216.
2. Đề nghị
Kết hợp một số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác như SSR, AFLP,
PCR-RAPD để đánh giá tính đa hình trong nguồn gen cây đậu tương Cúc bóng
ngoài vùng gen ITS2 và rbcL.

LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN

Similar to LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN (20)

More from ssuserc1c2711

More from ssuserc1c2711 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG CÚC BÓNG TẠI HUYỆN VÕ NHAI TỈNH THÁI NGUYÊN