Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI
KHUẨN Serratia marcescens HB
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG
Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC
MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03
TP. Hồ Chí Minh, năm 2018

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng
dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng Dụng
HUTECH, trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM).
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp
của mình.
TP.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2018
Sinh viên thực hiện
HỒ TRUNG LỘC

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy
dỗ con trong 22 năm qua, ngƣời đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong
cuộc sống và luôn quan tâm con, chăm sóc con, luôn bên cạnh con lúc khó khăn
nhất. Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại. Đặc biệt là bà nội, bà ngoại, ba, cô
bảy và cậu mợ mƣời trong suốt những năm qua đã tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất
để con đƣợc bƣớc vào giảng đƣờng đại học với tâm thế thoải mái.
Em xin cảm ơn quý thấy cô trong Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH và
những thầy cô giảng viên của trƣờng đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đầy nhiệt huyết, luôn định hƣớng
và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em
xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, ngƣời đã cho em lời khuyên
trong quá trình nuôi sâu khoang thí nghiệm và cung cấp trứng sâu cho em. Em xin
chân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi đã cho em vật liệu
thử nghiệm để em tiến hành các thí nghiệm khảo sát.
Em xin chân thành biết ơn anh Trƣơng Hoài Nguyên, anh Nguyễn Phƣớc
Sinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy đã truyền đạt cho em những
kinh nghiệm, lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Và em xin
cảm ơn tất cả các bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị
Kim Tuyền, Đào Đặng Phƣơng Dung, Đinh Ngọc Phƣơng Trinh, Võ Lan Hƣơng,
Võ Thành Lâm cùng hai em Võ Đình Chiến và Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng đã đồng
hành giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018
HỒ TRUNG LỘC

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..............................................................................vii
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................i
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu: ................................................................................. 1
3. Nhiệm vụ nghiên cứu:................................................................................. 1
4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 2
5. Kết quả cần đạt đƣợc .................................................................................. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3
1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học .......................................................... 3
1.1.1. Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học........................................................ 3
1.1.2. Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trƣờng hiện nay.
...........................................................................................................3
1.1.3. Những ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học....................... 4
1.2. Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens................................................... 5
1.2.1. Lịch sử phát hiện.................................................................................. 5
1.2.2. Phân loại............................................................................................... 6
1.2.3. Đặc điểm của Serratia marcescens...................................................... 6
1.2.3 .Đặc điểm sinh lí ................................................................................... 7

ii
1.2.4. Đặc điểm sinh hóa............................................................................... 7
1.2.5. Đặc điểm phân bố ................................................................................ 9
1.3. Giới thiệu về Prodigiosin .........................................................................10
1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin................................................................10
1.3.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ...............................................10
1.3.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin ....................................................13
1.3.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens .............13
1.4. Enzyme.....................................................................................................17
1.5.Yếu tố độc lực của Serratia marcescens...................................................17
1.6. Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens .............................18
1.7. Một số nghiên cứu trên thế giới...............................................................20
1.7.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens.......................................20
1.7.2. Tình hình nghiên cứu Prodigiosin...................................................21
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................22
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...............................................................22
2.1.1. Thời gian ............................................................................................22
2.1.2. Địa điểm.............................................................................................22
2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ........................................................................22
2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens................................................22
2.2.2. Nguồn nấm.........................................................................................22
2.2.3. Nguồn sâu khoang Spodoptera litura................................................22
2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất ......................................................22
2.2.5. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................23

iii
2.3. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................24
2.4. Nội dung nghiên cứu................................................................................24
2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm ..........................................................................24
2.5.1. Phƣơng pháp luận ..............................................................................24
2.5.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................27
2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm ...........................................29
2.6.1. Phƣơng pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng
hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất.........................30
2.6.1.1. Phƣơng pháp định tính enzyme ...................................................30
2.6.1.2. Phƣơng pháp trích ly thu Prodigiosin..........................................31
2.6.2. Khảo sát phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu
quả................................................................................................................33
2.6.2.1. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng acid............................................33
2.6.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt..............................................................33
2.6.2.3. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng Formalin....................................34
2.6.3. Phƣơng pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế
bào................................................................................................................34
2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời
đến hiêu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia......................37
2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm .........................................37
2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phƣơng pháp quét lá ....38
2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm......................................40
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................43

iv
3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và prodigiosin cao nhất...................................................................43
3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào........................................................43
3.1.2. Trích ly thu prodigiosin .....................................................................45
3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB...........................................47
3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia
marcescens hiệu quả nhất................................................................................50
3.2.1. Phƣơng pháp xử lý acid .....................................................................51
3.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt....................................................................52
3.2.3. Phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin...........54
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia
marcescens HB sau khi xử lý tế bào...............................................................57
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính protease ..........................................................57
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase.........................................................57
3.5. Khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt
sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia.....................................................59
3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi ..........................................62
3.8. Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia
marcescens HB............................................................................................…64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................66
4.1. Kết luận ....................................................................................................66
4.2. Kiến nghị..................................................................................................66
Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................67

v
Tài liệu nƣớc ngoài..........................................................................................68
PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG....................................72
PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH ..............................................................................75
PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ..................................................................................82
PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ .............................................................84

vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:
Entomopathogenic nematodes).
H-CP16 : Heterorhabditis indica CP16
A.nauplii : Artemia nauplii
S.marcescens: Serratia marcescens.
SH1 : Serratia marcescens SH1
SB :Serratia marcescens SB
HB :Serratia marcescens HB
PG :Môi trƣờng Peptone glycerol
PGA :Môi trƣờng Peptone glycerol agar
CMC :Carboxymethyl cellulose

vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens
Hình 1.3 Các chất đại diện Prodigiosin (Fursttner, 2003)
Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp Prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp Undercylprodigiosin (cụm màu đỏ từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)
Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp Prodigiosin
Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S. marcescens
đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014)
Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật phù hợp
Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học khả năng diệt sâu và độc tính của
chế phẩm
Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn ra phƣơng pháp tiêu diệt tế bào tối
ƣu.
Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi khuẩn
Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar
Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch Tween 80 agar
Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch chitin agar
Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA
Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme Protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1,
SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E.
Hình 3.2 Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB.

viii
Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB,
HB.
Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB
Hình 3.5 Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens
SH1 và HB
Hình 3.6 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng SH1
Hình 3.7 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng HB.
Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng
(A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ.
Hình 3.9 Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức
1000
C (A) và 650
C (B).
Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng Serratia marcescens HB đã xử
lý Formalin ở các nồng độ.
Hình 3.11 Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng
độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925).
Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm.
Hình 3.13 Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào.

ix
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973).
Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ Serratia
marcescens đã thực hiện.
Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức các nồng độ phụ gia.
Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4,
SH5, SB và HB.
Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích ly sắc tố
của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB.
Bảng 3.3 Bảng so sánh lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào ở các
giá trị nồng độ Formalin .
Bảng 3.4 Các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men sau xử lí Formalin
0,5%.
Bảng 3.5 Hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 của chế phẩm.
Bảng 3.6 Tỷ lệ ức chế nấm Trichoderma sp.
Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus.

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Theo thống kê của tổ chức Lƣơng – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng
hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200
loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực
lƣợng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết
vấn đề trên, con ngƣời đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân
gây hại.Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh
cho cây trồng. Tuy nhiên, ngƣời nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lƣợng quá
mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình
sâu hại trở nên nghiêm trọng và diễn biến phức tạp hơn.
Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn
Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc
tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại
Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà
chƣa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc
đã nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa hoàn thiện đƣợc sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học.
Dựa trên cơ sở đó mà ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho Đồ án tốt nghiệp là:
“Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens HB.
2. Mục đích nghiên cứu:
Hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcesces chứa hợp chất prodigiosin.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu:
Khảo sát chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens thích hợp có khả năng sinh
tổng hợp Prodigiosin với nồng độ cao và hoạt lực enzyme protease, chitinase mạnh

2
Khảo sát phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn sau lên men thích hợp và để
đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học.
Khảo sát sự ảnh hƣởng của việc phơi nắng đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở
các công thức phụ gia.
Đƣa ra quy trình hoàn thiện để tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
Serratia marcescens.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sử dụng công thức Abbott (1925) để tính toán hiệu lực diệt sâu.
Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để phân tích ANOVA từ số liệu kết quả thu đƣợc.
5. Kết quả cần đạt đƣợc
Chọn đƣợc chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào và nồng độ prodigiosin cao.
Chọn phƣơng pháp xử lý thích hợp đối với dịch nuôi cấy sau lên men để tiêu
diệt tế bào vừa đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học vừa giữ đƣợc hoạt tính, nồng độ
của hợp chất thứ cấp prodigiosin.
Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: hoạt lực enzyme, khả năng
kháng nấm.
Khảo sát khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt
sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia.
Chọn ra đƣợc tỷ lệ phụ gia thích hợp cho việc tạo chế phẩm.
Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ dịch lên men vi
khuẩn Serratia marcescens HB.

3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học
1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học là chất có khả năng kiểm soát dịch hại bằng cơ chế
không độc. Thuốc trừ sâu sinh học có thể là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chế
phẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tin đƣợc
sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật.
Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng,
mặc dù hầu hết các loại thuốc này thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với các công cụ
khác (thuốc trừ sâu hóa học) nhƣ một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằng
phƣơng pháp sinh học.
1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay
1. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox
16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các
loại sâu thuộc họ Lepidoptera.
2. Chế phẩm NPV: là chế phẩm trừ sâu hoạt lực mạnh và có tính chuyên hóa
cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dung để diệt trừ sâu xanh,
sâu xanh đốm trắng, sâu khoang, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công
nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với
các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hòa thuốc vào bình
và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0 – 1,2 kg/ha.
3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium
anisopliae (nấm xanh) đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa va cây ăn quả
đạt 70-90%, dạng nấm trắng (Beauveria sp.) đạt 50-85%. Chế phẩm
Beauveria chuyên dung để trị sâu róm thong và sâu đo nâu hại bồ đề với
hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.Tiến sĩ Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại

4
thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thong đang xảy ra tại
Nghệ An hiện nay”.
4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15-20 x106 IJs trừ sâu xám hại thuốc
lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã
đƣợc đƣa vào ứng dụng để trƣ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ
hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hóa).
5. Chế phẩm hóa sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trƣ các loại sâu hại rau
màu đạt 45-50%.
6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106
Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây
ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004).
1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học
Ƣu điểm:
- Ít độc với ngƣời và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ đƣợc sự cân
bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu), ít gây
tình trạng bùng phát dịch côn trùng.
- Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dƣ lƣợng độc
trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng
cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè…
- Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thƣờng có sẵn
và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc nhƣ ớt, tỏi, hành, gừng…Chi phí
sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ
sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho ngƣời dân mà vẫn mang lại
hiệu quả cao.
Hạn chế:
- Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm
hơn so với thuốc hóa học.
- Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣơng yêu
cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn.

5
1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens
1.2.1 Lịch sử phát hiện
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ
6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh
mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất
hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran
(1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự
cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối
và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong
Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến
nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen
và Gibbs, 2011).
Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya) là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên
Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang
màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để
ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi
sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,
theo nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên
loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này
phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta.
Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn
thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các
nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

6
1.2.2 Phân loại
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên
quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi
Serratia là Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens
1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có hình que,
đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia
marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 400
C và có thể phát triển ở
pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).
Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển
vi (Gillen và Gibbs, 2011)

7
Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc Serratia marcesens
1.2.3 Đặc điểm sinh lí
Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng Nutrient agar đƣợc mô tả
là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng là
sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ
(David, 2012).
Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng
thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều
dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
1.2.4 Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí.
Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ
có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, catalase, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi
các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác
trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và
gelatinase (Giri và cộng sự, 2004).

8
Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di
động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và hemolysin (Hejazi
và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia
marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat
và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá
vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens
STT Đặc điêm sinh hóa Kết quả
1 Di động +
2 Indole -
3 Methyl Red -
4 Voges Proskauer +
5 Citrate +
6 Dnase +
7 Catalase +
8 Oxidase -
9 Urease -
10 Gelatinase +
11 Chitinase +
12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển
sang acid, không sinh
khí và không sinh H2S
13 Hydrogen sulphide -
14 Lysine decarboxylase +

9
1.2.5 Đặc điểm phân bố
Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông
và Serratia marcescens chiếm 75%.
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối
với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau
khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm,
nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng
của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các
loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo
mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia
marcescens với Steinernema carpocapsae.
15 Ornithine
decarboxylase
+
16 Lên men glucose +
17 Lên men sucrose +
18 Lên men sorbitol +
19 Lên men fructose -
20 Lên men xylose -
21 Lên men rhaminose -
22 Lên men lactose -
23 Lên men arabinose -

10
1.3 Giới thiệu về Prodigiosin
1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi
khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này
bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI),
uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó,
khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và
cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI).
1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-
methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự,
2006;Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và
Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

11
Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã đƣợc phân lập là đặt tên là
“prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác
của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và
Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ
trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một
loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế
alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại
để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp
truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất
cả. Đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Prodigiosin nhạy
cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối
trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol,
acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu
hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện
sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.

12
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài Tên sắc tố Danh pháp Prodigiosin
Trọng lƣợng
phân tử và
công thức
Serratia
marcescens
Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
methoxy-prodigiosene
323,4 Da
C20H25N3O
Serratia
marcescens
Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
hydroxy-prodigiosene
309,4 Da
C10H23N3O
Serratia
marcescens
Dipyrrolyldipyrromelh
enr prodigiosin
2-(2-pyrryl)-4,6-
dimethoxypyprodigiosen
e
334,4 Da
C19H18N4O2
Nocardia
(Actinomadura)
Nonylprodigiosin 2-Nonly-6-
methoxyprodigiosene
363,5 Da
C23H31N3O
Nocardia
(Actinomadura)
Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6-
melhoxy-prodigiosene
265,5 Da
C23H33N3O
Nocardia
(Actinomadura)
Methylcyclode
cylprodigiosin
2,10-Nonano-6-
Methoxy-prodigiosene
391,5 Da
C25H33N3O
Streptomyces
Longisporusr
uber
Undecyl- prodigiosin 2-Undecyl-6-
Rnethoxyprodigiosene
393,6 Da
C25H35N3
O
Streplonlyces
longisporusr
uber
Metacycloprodigiosin 2,4-(9-Ethylnonano) -6-
methoxyprodigiosene
391,6 Da
C25H33N3
O

13
1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả
năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA
gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira,2009).
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni
và cộng sự, 2012).
Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của
hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất
màu có khả năng kháng một số loài nấm men nhƣ: Candida albicans, Candida
parapsilosis và Cryptococcus sp. Prodigiosin khi đƣợc đƣa vào cơ thể sâu sẽ thấm
vào tế bào và ức chế quá trình phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của
sâu Spodoptera litura (Nguyễn Hiếu Dân, 2013). Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin
còn có khả năng chống ung thƣ (Pandey và cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi as,
2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự 2007).
1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon
lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC
39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274)
đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản
xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP)
và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất

14
tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin
(Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một
chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành
prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợc
báo cáo.
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện
trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử
nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi
nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR,
SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là
việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton
(OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một
phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự,
2000).
Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và
Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene
tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở
hình 2.18.
Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia

15
marcescens ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm
màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001).
Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp.Tuy nhiên, có một protein còn lại
(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ
tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích
thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001).
Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí
tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu
trách nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp
phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp
đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng
hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm
màu đỏ.
Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản ánh
sự phức tạp hơn về các sản phẩm undercylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi
Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004).
Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia
coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia
coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi
các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004).

16
Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.

17
1.4 Enzyme
Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase,
DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...
Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải
có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát
sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự,
1989). Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme
chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding
(CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự,
1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự,
1996;Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998),
chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt
động phân giải chitin (Fuchs và cộng sự, 1986).
1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens
Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các
tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ,
tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ,
mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng
(Weiss và Hewlett, 1986).
Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm
sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose - resistant, mannose - sensitive,
LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình
tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.
Các yếu tố bám dính của vi sinh vật có bản chất là polypeptide hoặc
polysaccharide. Serratia marcescens thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khuẩn mao
nên yếu tố bám dínhla Polypeptide.
Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là Lipoglycan Saccharide, là các phân tử
lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và

18
polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội
độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3
phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần
gây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.
Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng đƣợc xem
nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cả
protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).
Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần
vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình
làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm Silkworm
larvae.
1.6 Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens
Serratia marcescens đã đƣợc khảo sát về sự tăng trƣởng và khả năng gây bệnh
của nó trong các ấu trùng sâu bƣớm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây
bệnh cho ấu trùng của G. Mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng
S.marcescens đã đƣợc chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease
serrlaiysin đƣợc xác định vai trò góp phần vào quá trình gây chết côn trùng. (J.T.
Tambong; Xu, R; Sadiku, 2014).
Serratia marcesccens đƣợc biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại
bào nhƣ chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease. Mặc dù
S.marcescens có thể sản xuất nhiều loại enzyme protease khác nhau, trong đó có
metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 199 báo cáo ràng
serralysin đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên
cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein
và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn nhƣ serralysin đóng một vai trò quan
trọng nhƣ một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007). Theo K Ishii et al. (J
Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế

19
gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành
vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm larvae).
Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S.
marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014)
Serratia marcescens còn đƣợc biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu
trùng, nhộng và sâu trƣởng thành của loài heliothines-thuộc chi bƣớm đêm gây hại
cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009). Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi
khuẩn thƣờng bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra
một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đƣờng máu của vi
khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của
Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết,
và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm
trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm
khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn
sâu trƣởng thành, nó có thể đƣợc lây nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô
nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia
marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens .
Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để
gây bệnh cho côn trùng ví dụ nhƣ: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens
gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó. Ngoài ra cũng có thể tạo đƣợc

20
mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến
trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên
cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với
S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48
giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S.marcescens cũng không ảnh hƣởng đến vi khuẩn
cộng sinh X. Nematophila.
1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới
1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens
Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của
S.marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marcescens
lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh.
Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm
Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa bằng cách sử dụng S.marcescens.
Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S.
marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria
mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng.
Các nghiên cứu trƣớc đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens
(phân lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Khi cho ăn theo
phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá khi cho ăn ở nồng độ 27,66 ng/cm2
gây chết
90% sâu khoang sau 120 giờ (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Prodigiosin trong
dịch nuôi cấy Serratia marcescens đã qua xử lý diệt tế bào sau khi phối hợp với các
chất phụ gia với tỷ lệ 0,2%, CMC, 0,2% rỉ đƣờng và 0,04% Tween 80 để tạo chế
phẩm. Chế phẩm diệt sâu tơ Plustella xylostella tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104
(OD 499 = 0,924) có nồng độ Prodigiosin 14,9 ng/cm2
. Sau 96 giờ, tỷ lệ sâu chết đã
đạt 100% theo phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá tƣơng đƣơng với thuốc trừ sâu
sinh học Reasgant 3.6EC (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017).
Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình
Downstream Processing đối với dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn. Vì vậy, ngoài việc

21
sử dụng phƣơng pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào có ƣu điểm là giữ lại phần lớn
các hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hƣởng đến Prodigiosin
trong dịch nuôi cấy vi khuẩn (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017) nhƣng khi áp dụng trên
chủng Serratia marcescens HB ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy tế bào vẫn còn khả
năng sống sót. Do vậy việc tìm ra phƣơng pháp xử lý mới có thể khắc phục đƣợc
nhƣợc điểm của phƣơng pháp này nhƣng vẫn không làm ảnh hƣởng đến Prodigiosin
sau quá trình xử lý cũng là mục đích mà đề tài hƣớng tới.
1.7.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất
prodigiosin bởi S. marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả
vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng
kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ
Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp..
Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt
côn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu
nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ
Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng
6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó,
Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên
Artemia cho thấy LD 50 khoảng 50 g/ml.

22
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1 Thời gian
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 26/12/2017 đến hết ngày 31/07/2017
2.1.2 Địa điểm
Phòng thí nghiệm Vi sinh Viện Khoa học ứng dụng HUTECH, Trƣờng Đại
học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (HUTECH).
2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị
2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens
Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH1, SH4, SH5, SB, HB đƣợc phân lập từ đồ
án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha (2014) và Lê Quốc Vũ (2015), lƣu trữ tại
phòng thí nghiệm Vi sinh trƣờng Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh
(HUTECH).
2.2.2 Nguồn nấm
Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces lilacinus do TS. Nguyễn Thị Hai, Đại
học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2.3 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura
Trứng sâu khoang Spodoptera litura đƣợc cung cấp tại phòng thí nghiệm Vi
sinh trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.4 Môi trường nuôi cấy và hóa chất
a. Môi trƣờng (Thành phần môi trƣờng xem phụ lục A)
Môi trƣờng Peptone Glycerone Agar (PGA)
Môi trƣờng Peptone Glycerone Broth (PG)
Môi trƣờng Lipid
Môi trƣờng Casein
Môi trƣờng huyền phù Chitin
b. Hóa chất sử dụng
Cồn 70, cồn 96
NaCl

23
HCl, NaOH
b. Hóa chất sử dụng
Cồn 70, cồn 96
NaCl
HCl, NaOH
Lugol
Crystal Violet
Fucshin
Nƣớc muối bão hòa
 Formalin
Xanthangum
Carboxyl Methyl Cellulose(CMC)
Sodium Alginate
2.2.5 Dụng cụ, thiết bị
a. Dụng cụ
Phễu chiết
Ống nghiệm
Đĩa petri
Erlen 50ml, 100 ml, 250ml
Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml
Pipetman 100μl, 1000μl.
Đầu típ
Đũa thủy tinh
Bao hấp, giấy gói, thun
Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng
Bông không thấm, bông thấm
Chai syrum 100ml.

24
b. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh
Tủ lạnh
Cân phân tích
Bếp từ
Máy nƣớc cất
Autoclave
Tủ hút
Máy ly tâm
Bể điều nhiệt
2.3 Mục tiêu nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia
marcescens HB
2.4 Nội dung nghiên cứu
Chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin nồng
độ cao và hoạt lực enzyme ngoại bào mạnh.
Xác định phƣơng pháp xử lý diệt tế bào vi khuẩn sau khi lên men.
Khảo sát hoạt lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm khi phối trộn tỷ
lệ phụ gia khác nhau trong điều kiện phơi nắng và không phơi nắng 5 ngày.
Khảo sát khả năng kháng nấm có lợi Trichoderma sp., Paecilomyces lilacinus.
2.5 Phƣơng pháp thí nghiệm
2.5.1 Phương pháp luận
Khảo sát chọn chủng Serratia marcescens phù hợp từ bộ sƣu tập đƣợc phân
lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP-16. Các nghiên cứu trƣớc đƣợc
thực hiện trên các chủng Serratia marcescens SH1 (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013)
và Serratia marcescens SH4 (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Nhƣng ở nghiên cứu

25
này, ngƣời nghiên cứu tiến hành khảo sát trên chủng Serratia marcescens HB đƣợc
phân lập bởi Lê Quốc Vũ (2015).
Dựa trên các kết quả nghiên cứu trƣớc đó, để hoàn thiện quy trình sản xuất
chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens bao gôm các nội
dung sau:
Từ bộ sƣu tập các chủng Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng
EPN Heterorhabditis indica CP 16 tiến hành chọn lọc chủng thể hiện khả năng sinh
tổng hợp prodigiosin cao nhất và ổn định nhất.
Xác định phƣơng pháp và chế độ xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia
marcescens sống hiệu quả không ảnh hƣởng đến nồng độ prodigiosin và hoạt tính
enzyme là hai yếu tố độc học đối với sâu.
Thiết lập công thức phụ gia thích hợp để tăng hiệu lực diệt sâu, từ đó đề nghị
quy trình sản xuất chế phẩm.
Để chứng tỏ tính an toàn của chế phẩm, đề tài có sự đánh giá ảnh hƣởng của
chế phẩm lên một số tác nhân bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học nhƣ nấm
Trichoderma sp và Paecilomyces lilacinus.

26
Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ các
chủng Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis CP 16 đã
thực hiện
Từ những nghiên cứu trên, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy:
Các chủng Serratia marcescens đã khảo sát trên thực tế có sự biến động về nồng độ
prodigiosin sau thời gian giữ giống.
Nhu cầu tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp hoạt chất diệt sâu nồng độ cao và
ổn định hơn.
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu trên chủng đó.
Năm Tác giả Chủng Kết quả đạt đƣợc
2011 Đinh Thị Minh Châu SH1 Chứng minh prodigiosin diệt sâu xanh da
láng (Spodoptera exigua)
2013 Nguyễn Hoàng Anh Kha SH1 Chứng minh prodigiosin gây chết 90%
sâu khoang (Spodoptera litura) sau 120
giờ ở nồng độ 27,66 ng/cm2
.
2015 Lê Quốc Vũ HB, SB Chứng minh hai chủng SB và HB có
hiệu lực diệt sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) rất mạnh.
2016 Lê Thị Ngọc Dung SH1 Sản xuất chế phẩm diệt sâu khoang từ
dịch nuôi cấy chủng SH1.
2017 Trƣơng Hoài Nguyên SH4 Sản xuất chế phẩm diệt sâu tơ (Plutella
xylostella) từ dịch nuôi cấy chủng SH4.

27
2.5.2 Bố trí thí nghiệm
Các bƣớc thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ:
Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật
Chủng vi sinh vật (S.marcescens
SH1, SH4, SH5, SB, HB)
Nuôi cấy lỏng lắc,
MTPG
Trích ly thu
prodigiosin
Thử nghiệm enzyme
ngoại bào protease,
chitinase.
Trích ly lỏng - rắn
Trích ly lỏng - lỏng
EtOH:HCl (95:5, [v:v])

28
Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của
chế phẩm.
Giống vi khuẩn S. marcescens
HB
Tăng sinh 48 giờ, lắc 150
vòng/phút
Xử lý Formalin 0,5 % (30 phút)
Khảo sát lại hoạt tính enzyme
Chuẩn bị dịch
Phối trộn phụ gia
Thử nghiệm khả năng
diệt sâu
Kháng nấm có lợi

29
Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn phƣơng pháp tiêu diệt
tế bào tối ƣu.
Giống vi khuẩn S. marcescens
HB
Tăng sinh 48 giờ, lắc 150
vòng/phút
Xử lý acid HCl 1N, 4 giờ,
trung hòa bằng NaOH 1N
Xử lý nhiệt
Xử lý Formalin (0,125%,
0,25%, 0,5%, 0,75%,
1%)
650
C, 1000
C trong 15
phút
Ria trên thạch PGA để kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn
Quét phổ hấp thụ UV-VIS ở 380 nm – 700 nm
Chọn ra phƣơng pháp xử lý thích
hợp

30
2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm
2.6.1 Phương pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng hợp
prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất.
2.6.1.1 Phương pháp định tính enzyme
 Định tính enzyme protease
Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn : Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong
môi trƣờng Peptone Glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút
và ủ tối trong 48 giờ.
Pha môi trƣờng Gelatin agar, hấp 1210
C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội
đến khoảng 500
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi
trƣờng, đƣờng kính giếng thạch (d) bằng 5 mm. Cho 20 µl dịch trong của canh
trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d) mm,
với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Protease thì sẽ xuất hiện vòng trong
suốt xung quanh giếng thạch.
Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme Protease thì không xuất hiện
vòng trong suốt xung quanh giếng thạch.
Khả năng phân giải Gelatin đƣợc đánh giá thông qua hiệu số (D-d) mm. Hiệu
số càng lớn , vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Protease càng nhiều.
 Định tính enzyme chitinase
Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 1210
C trong 15 phút. Để
môi trƣờng nguội đến khoảng 650
C, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi
đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm.

31
Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 µl sinh khối của chủng vi sinh vật
thử nghiệm vào đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên bề mặt môi
trƣờng.
Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh
10ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ
phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 µl ở các nồng độ pha loãng
cho vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính chitinase, nhƣ hình 2.7
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trƣờng:
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung
quanh giếng thạch.
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong
suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số
(D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid
càng lớn.
Trong đó :
D: đƣờng kính vòng phân giải (mm)
d: đƣờng kính giếng thạch (mm
2.6.1.2 Phương pháp trích ly thu Prodigiosin
Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong
môi trƣờng Peptone Glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút
và ủ tối trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH=2
trong 4 giờ: cho 450µl HCl 1N vào canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, sau đó
thêm 450 µl NaOH 1N để trung hòa đƣa về pH = 7, đem ly tâm trích ly lỏng rắn và

32
đo OD 499 nm phần dịch thô vừa thu đƣợc. Sau đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo
sơ đồ hình 2.4.
Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi khuẩn
Canh trƣờng sau nuôi cấy
Xử lý acid
Trung hòa NaOH
Ly tâm 4000 vòng/phút trong
15 phút
Đo Prodigiosin
OD 499 nm
Dịch Sinh
EtOH: HCl 1N
(95:5;[v:v])
Ly tâm 4000 vòng/phút trong
15 phút
Dịch
trong
Sắc tố thô
Trích ly lỏng
lỏng
Đo Prodigiosin sau
trích ly đo OD535 nm

33
2.6.2. Khảo sát phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả
Mục đích của việc khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào sống của vi khuẩn Serratia
marcescens là để nhằm đảm bảo tính An toàn sinh học trong nghiên cứu sản xuất và
sử dụng. Và đối tƣợng khảo sát của thử nghiệm này là chủng vi khuẩn Serratia
marcescens đã đƣợc chọn lọc từ thí nghiệm chọn chủng vừa rồi.
2.6.2.1 Phương pháp xử lý tế bào bằng acid.
Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi
trƣờng Peptone Glycerol Broth vô trùng, với tỷ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở
nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ.
Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý với
acid HCl 1N. Với mục đích đƣa môi trƣờng về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn,
dung pipetman hút 450 µl dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên
men. Lắc 150 vòng/phút, ủ trong tối trong 4 giờ sau đó trung hòa pH bằng 450 µl
dung dịch NaOH 1N (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017). Đối chứng dƣơng: vi khuẩn
khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy ria trên đĩa PGA. Ủ tối ở nhiệt độ
phòng trong 24 giờ.
2.6.2.2 Phương pháp xử lý nhiệt
Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý nhiệt
bằng cách đun cách thủy ở 2 nghiệm thức nhiệt độ 650
C và 1000
C trong vòng thời
gian 15 phút. Sau xử lý nhiệt tiến hành cấy ria dịch canh trƣờng lên thạch PGA. Ủ
tối 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy
ria trên đĩa PGA. Ủ tối nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

34
Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành quan sát khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens trên môi trƣờng Peptone Glycerol Agar
(PGA).
2.6.2.3 Phương pháp xử lý tế bào bằng Formalin
Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lý
Formalin ở các nồng độ 0,125%; 0,25%; 0,5%; 0,75%; 1% tƣơng ứng với 25, 50,
100, 150, 200 µl Formalin trong 20 ml dịch nuôi cấy.
Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48 giờ tiến hành cấy
ria trên đĩa PGA. Ủ tối nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành quan sát khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens trên môi trƣờng Peptone Glycerol Agar
(PGA).
2.6.3 Phương pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế bào
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong
môi trƣờng PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ.
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí:
Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng PG broth vô trùng, dùng
pipetman hút 100 µl Formalin cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút,
trong 30 phút.
Hút 20 µl Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã đƣợc xử lý tế
bào.
Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 µl Tween 80 cho vào lần lƣợt các dịch
pha loãng với thể tích 10 ml.

35
Thử nghiệm hoạt tính protease
Pha môi trƣờng gelatin agar, hấp 1210
C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội
đến khoảng 650
C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi
trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm.
Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20µl dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn
thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đƣờng kính vòng
phân giải.
Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí formalin, dùng pippet thủy
tinh10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các
nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 µl ở các nồng độ
pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính gelatin, nhƣ hình 2.5.
Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar.
Đọc kết quả:
Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trƣờng:
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme protease thì không xuất hiện vòng trong
suốt xung quanh giếng thạch.

36
Khả năng phân giải gelatin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số
càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí Formalin càng lớn.
Trong đó :
d: đƣờng kính giếng thạch (mm)
Thử nghiệm hoạt tính Chitinase
Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 1210
C trong 15 phút. Đểmôi
trƣờng nguội đến khoảng 650
C, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa
agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch (d) bằng 5 mm.
Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật
thửnghiệm vào đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng
trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên bề mặt môi trƣờng.
Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10ml,
tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ
phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho
vào 3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính Chintase, nhƣ hình 2.7
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Hinh 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch huyền phù Chitin
Đọc kết quả:
Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trƣờng:

37
Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung
Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong
suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số
(D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid
càng lớn. Trong đó :
d: đƣờng kính giếng thạch (mm)
2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời
đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia.
2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm
Các loại phụ gia thử nghiệm cho khảo sát này bao gồm: Carboxyl methyl
cellulose (CMC), rỉ đƣờng, Tween 80 đƣợc phối trộn với dịch lên men vi khuẩn
Serratia marcescens đã xử lý tế bào theo tỷ lệ đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức.
Nghiệm thức
CMC
(%)
Rỉ đƣờng
(%)
Tween 80
(%)
Điều kiện
bảo quản
NT1 0,2 0,2 0,04 Phơi nắng
NT2 0,2 0,4 0,04 Phơi nắng
NT3 0,2 0,2 0,08 Phơi nắng
NT4 0,2 0,4 0,08 Phơi nắng
NT5 0,2 0,2 0,04 Không phơi
nắng

38
Chuẩn bị dịch lên men: dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB đƣợc xử lý tế bào
bằng cách hút 100 µl dung dịch Formalin cho vào 20 ml thể tích dịch sau lên men
bình nuôi cấy với thời gian xử lý là 30 phút. Sau đó, tiến hành pha loãng dịch 20 lần
(OD 499 nm = 0,5) bằng môi trƣờng PG vô trùng và pha loãng tiếp đến nồng độ sử
dụng là 104
lần. Theo nhƣ kết quả của các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, hợp chất
prodigiosin không có khả năng diệt sâu cao ở nồng độ cao nhƣng khi ở nồng độ 10-4
lại thể hiện khả năng này khá mạnh (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013).
Chuẩn bị phụ gia: Ở từng nghiệm thức tiến hành cân các chất phụ gia theo tỷ
lệ khảo sát. Chẳng hạn, ở nghiệm thức 1(NT1) cân 0,2 g CMC, 0,2 g rỉ đƣờng, 0,04
g Tween 80 cho vào cốc rồi sau đó định mức lên 100 ml bằng nƣớc cất, đun cho
CMC tan hoàn toàn và mang hỗn hợp phụ gia hấp khử trùng ở 1210
C trong 15 phút,
1atm. Tƣơng tự với các nghiệm thức phụ gia còn lại.
Sau khi phụ gia đƣợc tiệt trùng, để nguội và tiến hành phối trộn với dịch lên men vi
khuẩn Serratia marcescens đã xử lý tiêu diệt tế bào bằng cách hút 1ml dịch lên men
pha loãng ở nồng độ 10-4
bổ sung thêm 9 ml phụ gia vô trùng ta đƣợc chế phẩm thử
nghiệm.
Thực hiện tạo chế phẩm tƣơng tự cho các nghiệm thức còn lại.
Chuẩn bị dung dịch đối chứng âm: 20 ml môi trƣờng PG vô trùng có bổ sung
100µl Formalin.
Chuẩn bị đối chứng dƣơng: hút 1ml thuốc trừ sâu sinh học Reasgant pha
loãng trong 100 ml nƣớc cất vô trùng. Hút tiếp 4,2 ml dịch Reasgant đã pha loãng
bổ sung thêm 5,8 ml nƣớc cất vô trùng ta đƣợc 10 ml. Hút 100 µl trong 10 ml này
để tiến hành thử nghiệm, nồng độ đối chứng dƣơng đạt 1 mg/cm2
khi thí nghiệm.
2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phương pháp quét lá
Sâu thí nghiệm – sâu khoang Spodoptera litura.
Trứng sâu khoang sau khi ấp nở đợi đến đầu tuổi 3 mới tiến hành thử nghiệm
bằng cách chọn ra 20 con và cho vào hộp nuôi sâu đã đƣợc khử trùng có thể tích

39
950 ml. Mỗi hộp tƣơng đƣơng với một nghiệm thức thử nghiệm, và đƣợc lặp lại 3
lần ở mỗi nghiệm thức.
Sâu khoang phát triển đến tuổi 3 mất khoảng 8-10 ngày từ khi trứng bắt đầu
nở. Kích thƣớc sâu ở tuôi này từ 19 - 25 mm, trọng lƣợng trung bình từ 0,3 - 0,6
mg. Ngoài ra, đặc điểm nhận dạng sâu ở đầu tuổi 3 thể hiện ở 3 vạch chính màu đen
nổi bật xuất hiên trên cơ thể, hoạt động mạnh vào lúc sáng sớm và chiều tối, ăn
thủng lá tạo thành những lỗ nhỏ. Khi có ánh sáng mặt trời, sâu ẩn phía dƣới lá hoặc
trốn vào trong đất.
Tiến hành thí nghiệm.
Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012). Phƣơng
pháp này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng
nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của
chủng HB. Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 x 10
(cm2
). Hút 100 µl dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều
dịch ở các nồng độ pha loãng lên lá thầu dầu. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo
dõi số lƣợng sâu chết trong 5 ngày. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang
đều 100 µl canh trƣờng PG vô trùng đã đƣợc bổ sung 0,5% Formalin.
Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang
đều 100 µl thuốc trừ sâu Reasgant đã đƣợc pha loãng nhƣ đã mô tả ở trên đạt nồng
độ 1 mg/cm2
.
Đọc kết quả kháng sâu:
Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian
để đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức
Abbott (1925).

40
2.6.6 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả
năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trƣờng thạch.
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces lilacinus. Pha môi trƣờng
PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng que cấy thẳng, tiến
hành cấy điểm nấm từ môi trƣờng thạch nghiêng sang môi trƣờng PDA có bổ sung
kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục thạch có đƣờng kính 5
mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng sinh. Nuôi ủ tơ nấm
trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng.
Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens
Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh và xử lý formalin nhƣ phƣơng pháp
định tính enzyme nhƣ mục 2.6.3
Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1
,10-
2
,10-3
,10-4
. Chọn nồng độ 10-4
để tiến hành thử nghiệm. Bổ sung vào 9ml dịch pha
loãng 1ml phụ gia bao gồm: CMC, Tween 80 và rỉ đƣờng với tỷ lệ 0,2%, 0,04% và
0,2%.
Đối chứng âm: Chuẩn bị 10 ml môi trƣờng PG vô trùng thêm 50 µl Formalin
và hút bỏ ra 1ml thay bằng 1ml phụ gia.
Đối chứng dƣơng : Chế phẩm Daconil hút 0,15 g pha loãng với 100 ml nƣớc
cất vô trùng.
Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị môi trƣờng PDA vô trùng. Tiến hành đục
giếng thạch 5 mm. Vô trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đƣờng kính 5
mm có sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào tâm đĩa PDA nhƣ hình 2.8.
Hút 20 µl dịch nuôi cấy đã xử lí Formanlin 0,5% ở nồng độ pha loãng 10-4
sau khi
bổ sung phụ gia cho vào giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày.

41
Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA
Đọc kết quả thí nghiệm:
Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm
sẽ bị ức chế và đƣờng kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của nấm ở
đĩa đối chứng.
Nếu không xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm
sẽ không bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng.
Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)
 Đo đƣờng kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy
 Tỷ lệ (%) ức chế đƣợc tính theo công thức:
U = x100
Trong đó:
 U: % khuẩn lạc bị ức chế.
 D: đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc đo ở nghiệm thức đối chứng.
 X: đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc đo ở nghiệm thức xử lý thuốc.
Trong đó: đƣờng kính khuẩn lạc bằng đƣờng kính sau khi đo trừ đi đƣờng
kính khối thạch.
Nấm
Nấm

42
Chỉ tiêu đánh giá ảnh hƣởng của thuốc đƣợc đánh giá theo bốn cấp độ
(Hassan, 1989):
+ Cấp 1: không ảnh hƣởng (<50% )
+ Cấp 2: ảnh hƣởng yếu (50 – 79%)
+ Cấp 3: ảnh hƣởng vừa (80 – 90%)
+ Cấp 4: ảnh hƣởng cao (>90%)

43
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại
bào và prodigiosin cao nhất.
Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcscens SH1, SH4, SH5, SB, HB đƣợc
nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát
hoạt tính enzyme ngoại bào protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng
thạch. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol : HCl
(95:5,v:v) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm (Nguyễn Hoàng Anh
Kha, 2013).
3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào.
Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng
chứa gelatin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10% đo vòng
phân giải gelatin. Phần còn lại là gelatin chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với thuốc
thử tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng
gelatin thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải gelatin là nhƣ nhau . Xung
quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – gelatin trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình
3.1 và bảng 3.1).
Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme protease của 5 chủng Serratia
marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D,
E.
A B C
D
E

44
Bảng 3.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1,
SH4, SH5, SB và HB.
Hình 3.2. Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB.
Nhƣ vậy dịch nuôi cấy các chủng S.marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN
trên môi trƣờng peptone glycerol thể hiện hoạt tính enzyme protease và riêng hoat
tính chitinase đối với chủng SB và HB, các chủng còn lại chƣa xác định đƣợc. Theo
Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng sự, 2007 và nhiều tác giả khác thì
S.marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase. Điều này cho thấy hoạt
STT Chủng
Đƣờng kính vòng phân giải
(D-d) mm
Protease Chitinase
1 SH1 6,67a
± 0,57 -
2 SH4 5,33b
± 0,57 -
3 SH5 5,33b
± 0,57 -
4 SB 5,33b
± 0,57 20,5a
± 0,5
5 HB 6ab
± 0 19,5a
± 0,5
SB HB

45
tính chitinase của các chủng SH1, SH4 và SH5 có thể không ổn định hoặc trong
thời gian bảo quản enzyme chitinase đã mất bị hoạt tính . Do đó ngƣời thực hiện đề
tài nhận thấy việc bảo quản giống và thƣờng xuyên kiểm tra hoạt tính enzyme mong
muốn là một khâu cực kỳ quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin
metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng
bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ
ấu trùng tằm (silkworm larva). Kết quả của thí nghiệm sau khi xử lý thống kê theo
cột cho thấy khả năng tổng hợp protease cao nhất thể hiện ở chủng SH1(6,67a
±
0,57) và chủng HB (6ab
± 0 ) sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê góp phần
vào hoạt tính diệt sâu của các chủng S.marcescens. Bên cạnh đó, hoạt tính chitinase
thể hiện ở chủng SB (20,5a
± 0,5) và HB (19,5a
± 0,5) cũng không có sự khác biệt
về mặt ý nghĩa thống kê.
3.1.2. Trích ly thu prodigiosin
Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đỏ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ
cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn S.marcescens và đƣợc
nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nhƣ hoạt động
ức chế miễn dịch, kháng ung thƣ, kháng khuẩn và một số nấm mốc cũng nhƣ có khả
năng diệt sâu...Những nghiên cứu trƣớc đó cho thấy prodigiosin thể hiện hiệu lực
diệt sâu khoang Spodoptera litura (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) và sâu xanh da
láng Spodoptera exigua (Lê Quốc Vũ, 2015). Để sản xuất chế phẩm diệt sâu chứa
prodigiosin ta có có hai cách là sử dụng trực tiếp dịch canh trƣờng vi khuẩn sau lên
men hoặc trích ly thu hồi prodigiosin. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài so sánh khả
năng sinh tổng hợp prodigiosin từ các chủng SH1,SH4, SH5, SB và HB trong môi
trƣờng peptone glycerol. Với mục đích tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhằm đảm bảo an
toàn sinh học ngƣời thực hiện đề tài tiến hành xử lý dịch canh trƣờng bằng acid HCl
1N và trung hòa bằng NaOH về pH trung tính. Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp
prodigiosin của các chủng nghiên cứu ngƣời thực hiện đề tài đo OD499 nm dịch canh

46
ab
bc
c
d
a
a
b
bc
c
a
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SH1 SH4 SH5 SB HB
OD
hiệu
chỉnh
Chủng vi khuẩn
OD 499nm
OD 535nm
trƣờng sau xử lý acid (Mekhael và Yuosif, 2009) và
song song đó tiến hành trích ly thu prodigiosin bằng dung môi Ethanol:HCl 1N
(95:5, v:v) để thu sắc tố đỏ. Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức
lên 10ml và pha loãng 20 lần mỗi mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5,
v:v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535nm.
Bảng 3.2. Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích
ly sắc tố của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB.
STT Chủng vi khuẩn OD499nmhiệu chỉnh OD535nmhiệu chỉnh
1 SH1 10,407 ± 0,37ab
14,073 ± 1,95a
2 SH4 9,140 ± 1,36bc
8,880 ± 1,37b
3 SH5 7,407 ± 1,26c
6,593 ± 1,58bc
4 SB 4,820 ± 1,58d
5,873 ± 1,26c
5 HB 12,413 ± 1,72a
15,487 ± 1,42a
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB,
HB.

47
A B
C D
Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng các
chủng có khả năng sinh prodigiosin cao nhất là chủng SH1 và HB thể hiện qua giá
trị OD499 nm (đo prodigiosin trực tiếp trong canh trƣờng) và kết quả OD535nm (đo
prodigiosin sau trích ly).
Tóm lại hai chủng SH1 và HB vừa có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và
enzyme protease nhƣ nhau và cao hơn so với các chủng còn lại ở cùng điều kiện
khảo sát. Do đó, sẽ chọn hai chủng này để tiếp tục khảo sát.
3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB.
Hình thái khuẩn lạc
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB
A. Hình thái khuẩn lạc chủng SH1 trên môi trƣờng PGA
B. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB trên môi trƣờng PGA
C. Hình thái tế bào chủng SH1 khi nhuộm Gram
D. Hình thái tế bào chủng HB khi nhuộm Gram

48
Dựa vào kết quả soi khuẩn lạc (hình 3.5) thì chủng SH1và HB đều tạo khuẩn lạc
tròn, lồi, đỏ sẫm, có quầng sáng bao quanh trên môi trƣờng PGA nhƣ theo mô tả
của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và
Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và
cộng sự, 2011).. Về kính thƣớc khuẩn lạc thì chủng HB lớn hơn chủng SH1.
Kết quả hình thái nhuộm Gram
Sau khi tiến hành nhuộm Gram, tế bào hai chủng Serratia marcescens SH1
và HB đều có hình que ngắn, bắt màu hồng với thuốc nhuộm Fuchsin. Điều này cho
thấy hai chủng đều là Gram âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens
(Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012).
Phổ hấp thu cực đại max hai chủng SH1 và HB
Dịch lên men của hai chủng sau khi đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng PG trên
máy lắc (150 vòng/phút, 48 giờ). Sau đó tiến hành quét phổ UV-VIS trong khoảng
700-380nm trên máy đo quang phổ JASCO V-730. Tiếp theo, dịch nuôi cấy sẽ
đƣợc tiêu diệt tế bào bằng cách xử lý nhiệt ở 1000
C trong 15 phút (Lê Thị Ngọc
Dung, 2016) và đem mẫu đi quét lại trên máy đo quang phổ.
Hình 3.5. Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens
SH1 và HB
HB
SH1

49
Hình 3.6. Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng SH1.
Hình 3.7. Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v)
của chủng HB.

50
Từ kết quả quét phổ của dịch sau lên men (hình 3.5) và dịch sau trích ly
(hình 3.6 và 3.7 ) cho thấy cả hai chủng SH1 và HB đều có bƣớc sóng hấp thu cực
đại ở 499 nm đối với dịch lên sau men và hấp thụ bƣớc sóng 535 nm đối với dịch
trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5 ; v:v). Điều này trùng khớp với kết quả
nghiên cứu của Krishna J.G (2008) và Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013).
Dựa trên các kết quả đã nghiên cứu trƣớc đây liên quan đến sản xuất chế
phẩm trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1 (Lê Thị Ngọc
Dung, 2016) và SH4 (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017) . Kết hợp với các kết quả vừa
thu đƣợc, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy Serratia marcescens HB là một chủng
tiềm năng, có thể ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu. Chính vì vậy,
ngƣời thực hiện sẽ chọn chủng HB để nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm thuốc trừ
sâu sinh học từ chủng này.
3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia
marcescens hiệu quả nhất.
Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố phần lớn gắn liền với màng ngoài tế bào
vi khuẩn Gram âm Serratia marcescens. Dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông
thƣờng cần trích ly lỏng-rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng-lỏng bằng
dung môi kém phân cực hơn để thu đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Chất này
thể hiện hoạt tính diệt sâu nhƣ đã trình bày trong phần tổng quan. Việc thu hồi
prodigiosin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu
rất tốn kém, vì vậy đề tài này muốn sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng
sau lên men) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Tuy nhiên,
Serratia marcescens đƣợc báo cáo có thể gây bệnh cơ hội, là vi khuẩn phát triển rất
mạnh trong nhiều hệ sinh thái khác nhau. Vì vậy, những thí nghiệm trong mục này
nhằm mục đích tiêu diệt tế bào mà không gây ảnh hƣởng lên hoạt tính sinh học của
prodigiosin và các hoạt tính sinh học khác của tế bào nhƣ enzyme ngoại bào có thể
hỗ trợ diệt sâu nhƣ: protease, chitinase. Ba phƣơng pháp khả thi, rẻ tiền mà ngƣời
thực hiện sẽ hƣớng đến đó là xử lý acid, xử lý nhiệt hoặc xử lý Formalin.

51
Để thực hiện mục tiêu hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm trừ sâu, bƣớc đầu
tiên phải xử lý đƣợc số tế bào sống trong canh trƣờng lên men. Vì các chủng vi
khuẩn Seratia marcescens đƣợc biết đến nhƣ là một trong những tác nhân gây bệnh
cơ hội bệnh viện. Với phƣơng thức lây truyền trực tiếp hoặc bằng ống thông, chúng
có khả năng gây hại cho cơ thể con ngƣời và động vật máu nóng. Serratia
marcescens có thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và
áp xe não, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu và nhiễm trùng mắt
(http://vi.m.wikipedia.org/wiki/serratia_marcescens). Việc tìm ra phƣơng pháp xử
lý thích hợp nhằm tiêu diệt 100% tế bào sống của vi khuẩn là một bƣớc vô cùng
quan trọng để đảm bảo tính an toàn cho chế phẩm trừ sâu.
3.2.1. Phương pháp xử lý acid
Dựa trên sự ảnh hƣởng của nồng độ ion H+
lên thành tế bào vi khuẩn, tiến
hành xử lý acid HCl 1N đƣa môi trƣờng về pH 2 để tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn
trong thời gian 4 giờ (Trƣơng Hoài Nguyên, 2017).
Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng vi khuẩn S. marcescens HB có xử lý
acid trên môi trƣờng thạch PGA sau khi ủ cho thấy: sau 4 giờ xử lý, không thấy sự
xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của chủng Serratia marcescens. Để khẳng định vi
khuẩn đã chết tại pH 2 sau 4 giờ xử lý hay pH môi trƣờng chỉ tạm thời làm chậm sự
phát triển của vi khuẩn. Tiến hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24 giờ. Kết quả cho thấy,
sau 48 giờ trong điều kiện không có ánh sáng, các đĩa môi trƣờng PGA đã có sự
xuất hiện các khuẩn lạc hình tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Nhƣ vậy do pH môi
trƣờng bị thay đổi đột ngột về pH acid (pH2) đã làm mất cân bằng ion giữa trong và
ngoài màng tế bào, do đó làm chậm sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Vì Serratia
marcescens HB thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae nên có khả năng
sống sót trong điều kiện môi trƣờng acid, nên việc xử lý acid HCl 1N trong 4 giờ
không khả thi cho việc tiêu diệt tế bào. Do đó sẽ không chọn phƣơng pháp xử lý
nhƣ Trƣơng Hoài Nguyên (2017) vì chủng S.marcescens HB vẫn có khả năng sống
sót.

52
Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối
chứng (A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ.
3.2.2. Phương pháp xử lý nhiệt
Dựa vào kết quả trên, tiến hành xử lý canh trƣờng ở nhiệt độ 650
C và 1000
C trong
vòng 15 phút (Lê Thị Ngọc Dung, 2016). Thí nghiệm này nhằm tạo tạo môi trƣờng
nghiên cứu an toàn bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt canh trƣờng sau tăng sinh chủng
Serratia marcescens HB đảm bảo vi sinh vật bị tiêu diệt hoàn toàn.
Kết quả nhận đƣợc từ đĩa môi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng Serratia
marcescens HB sau khi xử lý nhiệt 650
C/15 phút ủ tối 24 giờ cho thấy vẫn có sự
hiện diện khuẩn lạc đặc trƣng Serratia marcescens trên đĩa môi trƣờng Có thể nói
chủng Serratia marcescens HB có thể sống sót ở mức nhiệt độ khá cao 650
C, vì vậy
sử dụng phƣơng pháp xử lý nhiệt ở 650
C/15 phút đối với chủng Serratia
marcescens HB là không khả thi. Bên cạnh đó, tại nhiệt độ 1000
C sau 15 phút xử lý
thì kết quả không thấy xuất hiện khuẩn lạc trên thạch PGA sau 24 giờ ủ, kết quả xử
lý ở mức nhiệt 1000
C này trùng khớp với kết quả của Lê Thị Ngọc Dung (2016).
Tuy nhiên, tại khi nhiệt độ 1000
C trong 15 phút enzyme ngoại bào bị bất hoạt (Lê
A B

53
Thị Ngọc Dung, 2016). Do đó ngƣời thực hiện đề tài sẽ không chọn phƣơng pháp
xử lý này đối với chủng Serratia marcescens HB.
Hình 3.9. Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm
thức 1000
C (A) và 650
C (B).
A

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb

Similar to Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (18)

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb