Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CELLULASE CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY GIẤY
Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN. Nguyễn Hoàng Mỹ
Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Trang
MSSV: 107111189 : Lớp: 07DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2011

i
SVTH: BÙI THỊ TRANG
MỤC LỤC
Nội dung Trang
Mục lục............................................................................................................................i
Danh mục các chữ viết tắt..............................................................................................iii
Danh mục các bảng .........................................................................................................iv
Danh mục hình ảnh ..........................................................................................................v
LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................vi
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..............................................................................................3
1.1 Tổng quan về công nghiệp sản xuất giấy ...........................................................3
1.1.1 Giới thiệu .....................................................................................................3
1.1.2 Công nghệ sản xuất bột giấy........................................................................4
1.1.3 Công nghệ sản xuất giấy..............................................................................6
1.2 Tổng quan về nước thải nhà máy giấy ...............................................................7
1.2.1 Giới thiệu về nước thải nhà máy giấy..........................................................7
1.2.2 Thành phần tính chất ...................................................................................7
1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải nhà máy giấy....................................................10
1.2.4 Phương pháp xử lý nước thải ........................................................................11
1.3 Tổng quan về cellulose.....................................................................................13
1.3.1 Thành phần cấu tạo....................................................................................13
1.3.2 Tính chất ....................................................................................................15
1.3.3 Enzyme cellulase .......................................................................................16
1.3.4 Cơ chế phân hủy ........................................................................................18
1.4 Tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose ...................................................21
1.4.1 Giới thiệu chung ........................................................................................21
1.4.2 Vi khuẩn.....................................................................................................22
1.4.3 Xạ khuẩn ...................................................................................................22

ii
1.4.4 Nấm mốc....................................................................................................26
1.5 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của vi khuẩn ................................................................................................27
1.6 Các nghiên cứu liên quan ở Việt Nam và trên thế giới ....................................31
1.6.1 Trên thế giới...............................................................................................31
1.6.2 Ở Việt Nam................................................................................................31
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP...........................................................34
2.1 Thời gian và địa điểm...........................................................................................34
2.2 Vật liệu ................................................................................................................34
2.2.1 Đối tượng.......................................................................................................34
2.2.2 Cơ chất...........................................................................................................34
2.3 Thiết bị và hóa chất ..........................................................................................34
2.3.1 Thiết bị.......................................................................................................34
2.3.2 Hóa chất .....................................................................................................35
2.4 Các phương pháp nghiên cứu...........................................................................35
2.4.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật...............................................35
2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase
(CMCase)................................................................................................................38
2.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của các chủng vi khuẩn............................................................................42
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................44
3.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn .................................................................44
3.1.1 Kết quả tuyển chọn trên môi trường A ......................................................44
3.1.2 Kết quả xác định hình thái.........................................................................44
3.2 Kết quả khảo sát theo thời gian ........................................................................47
3.2.1 Kết quả hoạt tính cellulase.........................................................................47
3.2.2 Kết quả xác định mật độ tế bào .................................................................51
3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH .........................................53

iii
3.4 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo nồng độ CMC .......................56
3.4.1 Xác định hoạt tính theo nồng độ CMC......................................................56
3.4.2 Xác định đường kính vòng phân giải theo nồng độ CMC.........................59

iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BOD : Biochemical oxygen Demand
COD : Chemical Oxygen Demand
CMCase : Carboxymethyl cellulase
CMC : Carboxymethyl cellulose
CBH hay C1 : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase
DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic
Dal : Dalton
ĐC : Đối chứng
EG hay Cx : Endoglucanase
IU : International Unit, đơn vị quốc tế.
OD : Optical Density
TN : Thí nghiệm
UV : Ultraviolet

v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các thông số của nguồn nước thải nhà máy giấy .................................. 10
Bảng 1.2. Thành phần và số lượng vi sinh vật trên một số loại đất chính ............ 25
Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................ 35
Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn gluose ..................................................................... 40
Bảng 2.3. Xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl cellulase........................... 41
Bảng 3.1. Hình thái đại thể và hình thái vi thể của 10 chủng vi khuẩn................. 45
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 10 chủng theo thời gian ................................... 48
Bảng 3.3 Hoạt tính và mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn............................... 51
Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng pH khác nhau............................ 53
Bảng 3.5. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng nồng độ CMC........................... 56
Bảng 3.6. Đường kính vòng phân hủy cellulose theo từng nồng độ CMC. .......... 59

vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Công nghệ sản xuất bột giấy. ......................................................................4
Hình 1.2 Công nghệ sản xuất giấy..............................................................................6
Hình 1.3. Công nghệ xử lý nước thải nhà máy giấy................................................... 12
Hình 1.4 Công thức hóa học của cellulose.................................................................14
Hình 1.5 Endoglucanase.............................................................................................16
Hình 1.6 Exoglucanase...............................................................................................17
Hình 1.7 β-glucosidase ...............................................................................................17
Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulose..........................................................................19
Hình 1.9.Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vi trí cắt của enzyme exoglucanase,
endoglucanase và β-glucosidase .................................................................................20
Hình 1.10 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulose của các enzyme
thuộc phức hệ cellulase. ..............................................................................................21
Hình 1.11 Vi khuẩn Bacillus subtilis..........................................................................22
Hình 1.12 Xạ khuẩn Streptomyces ............................................................................23
Hình 1.13 Nấm Trichoderma .....................................................................................26
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của CMC .......................................................................34
Hình 2.2 Quy trình tuyển chọn chủng vi khuẩn. ........................................................36
Hình 2.3 Quy trình khảo sát các yếu tố môi trường lên hoạt tính enzyme của các chủng
vi khuẩn.......................................................................................................................42
Hình 3.1. Hình ảnh vi thể của 10 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm Gram ...................46
Hình 3.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo Miller........................................47
Hình 3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian...........................49
Hình 3.4 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn. .......................................................52
Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH. ................................... 54
Hình 3.6 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cơ chất......................................57

vii
Hình 3.7 Một số hình ảnh đường kính vòng phân hủy của các chủng vi khuẩn........60

1
LỜI MỞ ĐẦU
Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó
là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác
nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản
xuất công nghiệp.
Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1, endoglucanase hay
Cx và β-glucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành
glucose. Cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi;
trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình trích ly các chất
từ thực vật, ngày nay người ta còn ứng dụng cellulase vào xử lý môi trường.
Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt
Nam, lượng chất thải của các nhà máy thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ
ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp sinh học trong xử lý
nước thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh
vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý nước thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình
trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý triệt để hơn, giảm
giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát
triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính
phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào nước thải là một trong những
hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Công nghiệp sản xuất giấy là một ngành công nghiệp chiếm vị trí quan trọng
trong xã hội. Giấy đáp ứng được những nhu cầu thiết yếu trong cuộc sống của con
người. Tuy nhiên, hằng năm nguồn nước thải do ngành công nghiệp này thải ra không
qua xử lý đã ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường. Trong nguồn nước thải này có sự
hiện diện của lignin, cellulose… là các chất hữu cơ khó phân hủy.

2
Đối với nước thải nhà máy giấy, người ta đã áp dụng nhiều phương pháp xử lý
như vật lý, hóa học...nhưng vẫn chưa phân hủy hoàn toàn lượng cellulose hiện diện
trong nguồn nước thải này. Vì vậy, các biện pháp sinh học với việc ứng dụng enzyme
cellulase do vi khuẩn sinh tổng hợp để xử lý nguồn nước thải là một vấn đề cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi
đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính
cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải nhà máy giấy” với các mục
tiêu:
1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp hoạt tính enzyme celullase cao.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn
đã tuyển chọn.

3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về công nghiệp sản xuất giấy
1.1.1 Giới thiệu
Công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền
kinh tế nước ta. Công nghiệp giấy phát triển cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội,
nhu cầu về các sản phẩm giấy ngày càng tăng, thu hút nhiều lao động tham gia cũng
như kéo theo sự phát triển của một số ngành liên quan như: lâm nghiệp, xuất nhập
khẩu, vận tải,…Chính vì vậy, ngành công nghiệp này không thể thiếu được trong đời
sống của người dân.
Công nghiệp sản xuất giấy ra đời vừa đáp ứng được nhu cầu trong nước vừa giải
quyết việc làm cho bộ phận đáng kể nhân dân. Giấy đáp ứng các nhu cầu bức thiết
trong cuộc sống của con người để phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: giấy viết,
giấy in, giấy bao bì, vàng mã, giấy sinh hoạt... Giấy và bột giấy được sản xuất từ
nguyên liệu thô chính là gỗ, tre, nứa, lồ ô, giấy tái sinh. Tuy nhiên, hằng năm lượng
nước thải do ngành công nghiệp này thải ra mà không qua xử lý đã ảnh hưởng trực tiếp
đến môi trường nước. Độc tính của các dòng nước thải từ các nhà máy sản xuất bột
giấy và giấy là do sự hiện diện một hỗn hợp phức tạp các dịch chiết trong thân cây bao
gồm: nhựa cây, các acid béo, ligno-cellulose…Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc
chính của cây gỗ và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose, lignin.
Mà thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật là cellulose . Cellulose chiếm
đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ.[1,11,14]
Hiện nay, có khoảng 90 nhà máy giấy hoạt động trong cả nước, sản lượng giấy
các tỉnh phía Nam gần 90000 tấn/năm, trong đó Thành phố Hồ Chí Minh chiếm hơn
12000 tấn/năm. Tổng sản lượng bột giấy ở miền Nam đạt đến 92500 tấn/năm, trong đó
Tp Hồ Chí Minh chiếm hơn 18000 tấn/năm. [11]

4
Công nghệ sản xuất giấy có thể chia làm 2 giai đoạn: sản xuất bột giấy và xeo
giấy.
1.1.2 Công nghệ sản xuất bột giấy
Bột giấy được sản xuất từ những nguyên liệu thô như: tre, nứa, gỗ…Thành phần
và nồng độ chất thải từ quá trình sản xuất bột giấy lớn hơn rất nhiều so với giai đoạn
xeo giấy.
 Quy trình công nghệ:
Hình 1.1 Công nghệ sản xuất bột giấy.
(Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy)
Nước thải rửa nấu
Nguyên liệu thô
( lồ ô, gỗ, dăm)
Chặt, băm nhỏ thành dăm
Nước, NaOH Dịch đen
Nấu
Rửa
Nghiền nhão
Khuấy trộn, rửa
Tách nước
Nước
Nước thải
Nước thải rửa
Nước
Nước, bột giấy
Bột giấy thành phẩm

5
 Thuyết minh quy trình:
 Nghiền bột
 Nghiền bột từ sợi tái chế
Máy nghiền bột cơ học được sử dụng để nghiền giấy, trộn nước và chuyển hóa
thành một hỗn hợp đồng nhất. Các chất nhiễm bẩn nặng như cát, sỏi,…được thải bỏ khi
chảy lơ lửng trong hệ thống máng. Tại đây các chất nặng sẽ lắng xuống và lấy ra khỏi
hệ thống theo định kỳ. Sợi được phân loại riêng dưới dạng huyền phù nhẹ, sau đó được
chảy qua một loạt các sàng lọc có lớp tấm đục lỗ. Ở đây các chất nhiễm bẩn nhẹ hơn,
nhưng lớn hơn sợi sẽ bị loại ra. Ở công đoạn này, phải sử dụng một máy lọc tinh cơ
học hoặc khử mảnh vụn nhằm đảm bảo sao cho các sợi tách rời nhau và có thể tạo ra
đủ độ bền liên kết giữa các sợi trong giấy. Cách sản xuất này rất phù hợp trong việc sản
xuất các loại bao gói.
 Nghiền bột cơ học
Trong nghiền bột cơ học, các sợi chủ yếu bị tách rời nhau do lực cơ học trong
máy nghiền hoặc trong thiết bị tinh chế. Quy trình công nghệ nguyên thủy là gia công
gỗ tròn bằng đá – gỗ được ép bằng đá nghiền quay tròn. Công nghệ này làm ra bột giấy
có độ dai tương đối thấp. Ở các máy tinh chế và các máy nghiền áp lực sản phẩm cho
độ dai tốt hơn.
 Nghiền bột hóa học và bán hóa học
Trong nghiền bột hóa học và bán hóa học, nguyên liệu sợi được xử lý với hóa
chất ở nhiệt độ và áp lực cao. Mục đích của quá trình này là nhằm hòa tan hoặc làm
mềm thành phần chính của chất lignin liên kết các sợi trong nguyên liệu với nhau, đồng
thời lại gây ra sự phá hủy càng ít càng tốt đối với thành phần cellulose.
 Sau khi chưng cất, hóa chất chuẩn bị cho quá trình tạo bột giấy được chuyển
vào và đóng nắp lại. Ở đó những chất thải dịch đen sẽ xả bỏ bởi những ống tháo nước.
Bột giấy được cô cạn sau đó rửa, nước rửa này có thể xả bỏ, tái sử dụng hay cho quay
trở lại quá trình phân tách tái tạo ban đầu. Trong đó quá trình rửa bột giấy, do đi qua

6
các máy lọc sạch nên những mác gỗ và các chất không bị phân hủy sẽ bị loại bỏ. Sau
đó được dẫn vào bộ phận khử nước bao gồm một lưới chắn hình trụ xoay quanh đường
dẫn bột giấy vào. Sau khi khử nước hỗn hợp được chuyển sang bể tẩy trắng, ở đây hỗn
hợp được xáo trộn trong nước ấm hòa tan dung dịch canxi hypochlorite (Ca(OCl)2) hay
hydrogen peroxide (H2O2). Sản phẩn sau quá trình này là sản phẩm bột giấy có thể bán
hay tái tạo trong công nghệ làm giấy.[11]
1.1.3 Công nghệ sản xuất giấy
Giai đoạn làm giấy là giai đoạn tiếp theo của giai đoạn làm bột giấy, sản phẩm
của giai đoạn này là bột giấy. Bột giấy được nghiền và phối liệu theo sơ đồ sau:
 Quy trình công nghệ:
Hình 1.2 Công nghệ sản xuất giấy
Nguyên liệu thô
( giấy vụn và bột giấy)
Thành phẩm
Cắt cuộn
Xeo giấy
Hòa trộn
Nghiền tinh
Lắng lọc
Phối liệu
Cán ép (tạo hình giấy)
Nước
Phèn, nhựa thông,
màu
Nước thải

7
 Thuyết minh quy trình:
Quá trình làm giấy bao gồm trước tiên là sự chọn lựa sự xáo trộn thích hợp của
bột giấy (gỗ, vỏ cây, rơm…). Hỗn hợp bột giấy bị phân hủy và xáo trộn trong máy
nhào trộn hay những loại thiết bị nhồi với thuốc nhuộm, để chất lượng sản phẩm giấy
sau cùng đạt kết quả tốt, người ta cho hồ vào để lấp đầy những lỗ rỗng do bột khí có
trong bột giấy. Bột giấy được tinh chế trong phễu hình nõn lõm cố định, bên trong và
bên ngoài mặt hình nón gắn những con dao cùn, máy có tốc độ quay điều chỉnh được
với mục đích xáo trộn và điều chỉnh đồng dạng quá trình làm giấy. Cuối cùng bột giấy
được lọc qua lưới chắn để loại bỏ những dạng vón cục và những bùn tạo vết làm giảm
chất lượng của giấy. Kế tiếp, bột giấy được chuyển qua những dây đai của những lưới
chắn và mang vào máy cán. Nước loại bỏ trong giai đoạn này là nước thải xeo. Khuôn
in giấy bao gồm những máy cán sau: máy cán gạn lọc để loại bỏ những giấy không
chất lượng, cán hút để loại bỏ nước, ép và cán khô khử phần nước còn lại trước khi cho
ra giấy, và cuối cùng là cán hoàn tất để định hình cuối cùng là sản phẩm giấy. [11]
1.2 Tổng quan về nƣớc thải nhà máy giấy
1.2.1 Giới thiệu về nước thải nhà máy giấy
Theo thống kê, các nhà máy giấy trên thế giới nhờ công nghệ tiên tiến nên chỉ
dùng từ 7-15m3
nước/tấn giấy. Ở Việt Nam do thiết bị sản xuất, công nghệ lạc hậu nên
vẫn dùng từ 30-100m3
nước/tấn giấy. Sự lạc hậu này không chỉ gây lãng phí nguồn
nước ngọt, tăng chi phí xử lý nước thải mà còn gia tăng lượng nước thải đưa ra sông
rạch.
Hiện nay, doanh nghiệp sản xuất giấy tại Việt Nam chủ yếu là thuộc thành phần
doanh nghiệp vừa và nhỏ, sản xuất tới 75% lượng giấy cả nước. Các doanh nghiệp này
nằm rải rác tại các địa phương, do đó có nguy cơ gây ô nhiễm tại các cơ sở này rất cao.
1.2.2 Thành phần tính chất
Nước thải của ngành công nghiệp giấy có hàm lượng COD khá cao 22000-
46500 mg/l, BOD chiếm từ 40-60% COD .

8
Thành phần chủ yếu trong nước thải ở giai đoạn sản xuất bột giấy là cellulose,
hemicellulose, lignin, extractive. Các dòng nước thải được thải ra ngoài qua nhiều công
đoạn khác nhau như:
 Dòng thải rửa nguyên liệu bao gồm chất hữu cơ hòa tan, đất đá, thuốc bảo
vệ thực vật, vỏ cây,..
 Dòng thải của quá trình nấu và rửa sau nấu chứa phần lớn các chất hữu cơ
hòa tan, các hóa chất nấu và một phần xơ sợi. Dòng thải có màu tối nên thường gọi là
dịch đen. Dịch đen có nồng độ chất khô khoảng 25 đến 35%, tỷ lệ giữa chất hữu cơ và
vô cơ là 70:30. Cũng vì thế, mức độ ô nhiễm từ nước thải công nghiệp xeo giấy tỷ lệ
nghịch với khả năng thu hồi dịch đen.
Thành phần chất hữu cơ chủ yếu là dịch đen lignin hòa tan vào dịch kiềm (30-
35% khối lượng chất khô), ngoài ra là những sản phẩm phân hủy hydratcacbon và acid
hữu cơ. Thành phần hữu cơ bao gồm những chất nấu, một phần nhỏ là Na2SO4, Na2S,
Na2CO3 còn phần nhiều là kiềm natrisunfat liên kết với các chất hữu cơ trong kiềm. Ở
những nhà máy lớn, dòng thải này được xử lý để thu hồi tái sinh sử dụng lại kiềm bằng
phương pháp cô đặc – đốt cháy các chất hữu cơ – xút hóa. Đối với những nhà máy nhỏ
thường không có hệ thống thu hồi dịch đen, dòng thải này được thải thẳng cùng các
dòng thải khác của nhà máy, gây tác động xấu tới môi trường.
 Dòng thải từ công đoạn tẩy của các nhà máy sản xuất bột giấy bằng phương
pháp hóa học và bán hóa học chứa các hợp chất hữu cơ, lignin hòa tan và hợp chất tạo
thành của những chất đó với chất tẩy rửa ở dạng độc hại, có khả năng tích tụ sinh học
trong cơ thể sống như các hợp chất clo hữu cơ. Dòng này có độ màu, giá trị BOD5 và
COD cao.
 Dòng thải từ quá trình nghiền bột và xeo giấy chủ yếu chứa xơ sợi mịn, bột
giấy ở dạng lơ lửng và các chất phụ gia như nhựa thông, phẩm màu, cao lanh.
 Dòng thải từ khâu rửa thiết bị, rửa sàn, dòng chảy tràn có hàm lượng các
chất lơ lửng và các chất rơi vãi. Dòng này không liên tục.

9
Nước ngưng của quá trình cô đặc trong hệ thống xử lý thu hồi hóa chất từ dịch
đen. Mức độ ô nhiễm của nước ngưng phụ thuộc vào loại gỗ, công nghệ sản xuất.
Những chất ô nhiễm chủ yếu của ngành tạo bột xeo giấy đối với các nguồn nước
bao gồm:
- Vật huyền phù: là những hạt chất rắn không chìm trong nước, bao gồm chất
vô cơ, cát, bụi, quặng…hoặc những chất hữu cơ như dầu, cặn hữu cơ. Nhiều vật huyền
phù xả xuống nguồn nước dần dần sẽ hình thành các “bãi sợi” và tạo ra quá trình lên
men, từ đó tiêu hao oxy hòa tan trong nước, tác động tới sự sống còn của các sinh vật
trong nước, phủ lấp không gian sinh tồn, gây cản trở các hoạt động bình thường…
- Vật hóa hợp dễ sinh hóa phân giải: là những thành phần nguyên liệu với số
lượng tương đương đã tan trong quá trình tạo bột xeo giấy dễ sinh hóa phân giải, bao
gồm các vật có lượng phân tử thấp (chất bán sợi, metanol, axit, loại đường…) Những
chất này sẽ bị oxy hóa, do đó cũng tiêu hao oxy hòa tan trong nước, gây tác hại đối với
các sinh vật.
- Vật hóa hợp khó sinh hóa phân giải: bắt nguồn chủ yếu từ chất đường phân
tử lớn và lignin trong nguyên liệu sợi. Những chất này thường có màu, do đó ảnh
hưởng đến sự chiếu rọi của ánh sáng vào nguồn nước. Những vật chất này cũng có thể
gây biến dị trong cơ thể sinh vật nếu bị hấp thu.
- Các vật chất có độc: rất nhiều vật chất có độc đối với sinh vật hiện diện
trong nước thải của công nghiệp giấy như colophan và axit béo không bão hòa trong
dịch đen, dịch thải của đoạn tẩy trắng, dịch thải đoạn rút xút.[11]
Bên cạnh các vật chất độc hại trên, nước thải của ngành công nghiệp giấy có thể
làm ảnh hưởng trầm trọng đến trị số pH của nguồn nước, hoặc làm ngăn cản ánh sáng,
tác động đến quá trình quang hợp, từ đó làm mất sự cân bằng sinh thái trong môi
trường nước. Đặc tính của nước thải trong quá trình xeo giấy chiếm lượng lớn chất thải
có hàm lượng ô nhiễm rất lớn như ở bảng 1.1.

10
Bảng 1.1 Các thông số của nguồn nước thải nhà máy giấy
Thông số Đầu vào
Tiêu chuẩn xử lý nước thải
(TCVN 5945 : 1995, loại B)
pH 6,3 – 7,2 6,0 – 8,5
BOD5 tổng (mg/l) 500 ≤ 50
COD (mg/l) 1100 ≤ 100
SS (mg/l) 653 ≤ 100
Độ màu (Pt-Co) 450
N-NH3 (mg/l) 1,15 ≤ 35
P-PO4
3-
( mg/l) 1,21 ≤ 4
1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải nhà máy giấy
Độc tính của các dòng nước thải từ các nhà máy sản xuất giấy và bột giấy là do
sự hiện diện của một hỗn hợp phức tạp các dịch chiết trong thân cây bao gồm: nhựa
cây, các acid béo, cellulose, lignin... và một số sản phẩm phân hủy của lignin đã bị
phân hóa có trọng lượng phân tử thấp. Nồng độ của một số chất từ dịch chiết có khả
năng gây ức chế đối với thủy sản. Khi xả trực tiếp nguồn nước thải này ra kênh rạch sẽ
hình thành từng mảng giấy nổi trên mặt nước, làm cho nước có độ màu khá cao và hàm
lượng OD trong nước hầu như bằng không. Điều này không những ảnh hưởng trực tiếp
đến môi trường sống của sinh vật mà còn gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe của con
người
Trong các cơ sở công nghiệp giấy và bột giấy, nước thải thường có độ pH trung
bình 9 - 11, chỉ số nhu cầu ôxy sinh hoá (BOD), nhu cầu oxy hoá học (COD) cao, có
thể lên đến 700mg/l và 2,500mg/l. Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gấp nhiều lần giới
hạn cho phép.

11
Đặc biệt nước có chứa cả kim loại nặng, lignin, phẩm màu, xút, các chất đa
vòng thơm Clo hoá là những hợp chất có độc tính sinh thái cao và có nguy cơ gây ung
thư, rất khó phân huỷ trong môi trường. Có những nhà máy giấy, lượng nước thải lên
tới 4.000 - 5.000m3
/ngày, các chỉ tiêu BOD, COD gấp 10 – 18 lần tiêu chuẩn cho phép;
lượng nước thải này không được xử lý mà đổ trực tiếp vào sông.
Ngoài ra, trong công nghiệp xeo giấy, để tạo nên một sản phẩm đặc thù hoặc
những tính năng đặc thù cho sản phẩm, người ta còn sử dụng nhiều hóa chất và chất
xúc tác. [2]
1.2.4 Phương pháp xử lý nước thải
Đối với nước thải nhà máy giấy, người ta có nhiều phương pháp xử lý như vật
lý, hóa học...nhưng vẫn chưa phân hủy hoàn toàn lượng cellulose hiện diện trong
nguồn nước thải này. Những chất này nếu không được thu hồi hoặc xử lý mà xả thẳng
ra sông ngòi thì vấn đề ô nhiễm là không tránh khỏi, làm mất cân bằng sinh thái trong
môi trường nước. Do đó, xử lý bằng phương pháp sinh học làm tăng khả năng phân
hủy cellulose trong nước thải.
Dựa vào các chỉ tiêu của nước thải nhà máy giấy mà người ta có nhiều biện
pháp xử lý như xử lý cơ học, hóa lý, hóa học, sinh học.
Xử lý cơ học, xử lý hóa lý nhằm mục đích loại bỏ các chất cặn, các chất lơ lững,
các chất hữu cơ để làm sạch nguồn nước. Nhưng những biện pháp trên vẫn chưa xử lý
triệt để nguồn hữu cơ trong nước thải. Do đó, các biện pháp xử lý sinh học được áp
dụng nhằm loại bỏ hoàn toàn các nguồn hữu cơ không mong muốn.
Phương pháp sinh học được ứng dụng để xử lý các chất hữu cơ hòa tan có trong
nước thải dựa trên cơ sở hoạt động của các vi sinh vật. Vi sinh vật sử dụng các chất
hữu cơ và một số khoáng chất làm thức ăn để sinh trưởng và phát triển. Phương pháp
xử lý sinh học có thể phân thành 2 loại:
- Phương pháp kỵ khí: Sử dụng nhóm vi sinh vật kỵ khí, hoạt động trong điều
kiện không có ôxy.

12
- Phương pháp hiếu khí: sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí, hoạt động trong
điều kiện cung cấp ôxy liên tục.
Các vi sinh vật được được bổ sung vào từng giai đoạn theo từng liều lượng và
nồng độ cho phép.
Ở Việt Nam có khá nhiều tác giả đã thiết kế thành công về công trình xử lý
nguồn nước thải nhà máy giấy bằng phương pháp sinh học. Tiêu biểu như thiết kế dây
chuyền công nghệ xử lý nước thải xeo giấy của tác giả Nguyễn Đức Ban với đề tài thiết
kế bể Aerotank xử lý nước thải xeo giấy công suất 1000m3
/ngày đêm.
 Dây chuyền công nghệ
Hình 1.3. Công nghệ xử lý nước thải nhà máy giấy.
NT xeo
Bãi chôn lấp
Nguồn thải
Song chắn rác
Bể nén bùn
Bể chứa bùn
Máy ép bùn
Bể khử trùng
Bể lẳng II
Bể Aerotank
Bể tuyển nổi
Bể điều hòa
Bể thu gom
Bể
chứa
bột
giấy
Nước
tách
ra
sau
nén,
ép
bùn.

13
 Thuyết minh công nghệ
Nước thải xeo từ phân xưởng chảy qua song chắn rác, song chắn rác có nhiệm
vụ giữ lại các tạp chất thô (giấy vụn, sợi …) có kích thước ≥ 16mm, đi vào bể thu gom,
nước thải được bơm liên tục vào bể điều hòa, bể điều hòa có quá trình khuấy trộn và
cấp khí, nước thải được điều hòa về lưu lượng và nồng độ, các chất ô nhiễm như:
COD, BOD, SS, pH…xử lý một phần. Nước thải chảy qua bể tuyển nổi, nhằm thu hồi
bột giấy dưới dạng các hạt nhỏ lơ lửng khó lắng, vào bể Aerotank. Tại bể Aerotank
diễn ra quá trình sinh học hiếu khí được duy trì nhờ không khí cấp từ các máy thổi khí.
Tại đây, các vi sinh vật ở dạng hiếu khí (bùn hoạt tính) sẽ phân hủy các chất hữu cơ
còn lại trong nước thải thành các chất vô cơ ở dạng đơn giản như: CO2, H2O…Theo
phản ứng sau:
- Sự oxy hóa tổng hợp
CxHyOzNtSn + O2 + dinh dưỡng CO2 + NH3 + C5H7NO2 + các sản phẩm khác
- Phân hủy nội bào
C5H7NO2 + 5O2 5CO2 + NH3 + H2O + năng lượng
Hiệu quả xử lý BOD của bể Aerotank đạt từ 90-95% [11]
1.3 Tổng quan về cellulose
1.3.1 Thành phần cấu tạo
Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ
quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60 tỷ
tấn được tạo thành ở các đại dương. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật
mà thành phần chủ yếu là cellulose. [1]
Cellulose là hợp chất cao phân tử có công thức là (C6H10O5)n hay
[C6H7O2(OH)3]n , trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, được cấu tạo từ các
mắt xích β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1.4 glucocid, do vậy liên kết này
thường không bền trong các phản ứng thủy phân.[20]
Vi khuẩn
Vi khuẩn

14
Phân tử cellulose có cấu trúc dạng mạch thẳng. Cấu trúc này tạo điều kiện hình
thành các liên kết hyđro giữa các phân tử cellulose nằm song song với nhau, tạo nên
cấu trúc màng cellulose và vi sợi trong cấu trúc màng cellulose của tế bào thực vật.[21]
Các sợi này không tan trong nước, rất bền về cơ học nên tạo nên lớp màng
cellulose bền chắc, thành phần hóa học của màng khá phức tạp, gồm 60% là nước
chứa trong các khoảng tự do của màng, 30% cellulose. Các sợi cellulose liên kết với
nhau tạo thành các mixen, với kích thước khoảng 10-20 nm, và cứ 250 sợi bé lại tạo
nên 1 sợi lớn.
Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng làm cho màng cellulose rất bền
vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Ở giữa các sợi là khối không gian chứa các chất
vô định hình gồm gồm hemicellulose, pectin và nước.[5]
Hình 1.4 Công thức hóa học của cellulose[21]
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20-
40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như
galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất không
kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ
với lignin (10-25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự
thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông)
cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết.[1,14]
Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của
chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học, ví dụ như metyl (-CH3), hoặc các
gốc acetyl (-CH3CO) hình thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose.[5]

15
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất
này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu,
thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy...[14]
1.3.2 Tính chất
1.3.2.1 Tính chất vật lý
Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước
(chỉ phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có
trạng thái nóng chảy. Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose.
Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40-500
C do sự thủy
phân cellulose bởi enzyme cellulase.[5]
Tỷ trọng lúc khô là 1.45, khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi.
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có
enzyme phân giải cellulose nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không
có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, cellulose lại có vai trò điều hòa hoạt động của hệ
thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật
nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có
thể phân hủy cellulose.[22]
1.3.2.2 Tính chất hóa học
- Phản ứng thủy phân:
Đun nóng cellulose trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose
Phương trình phản ứng :
( C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6
- Phản ứng với acid vô cơ: đun nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và
acid sunfuric đặc thu được cellulose nitrat.
- Phương trình phản ứng:
H+
, t0

16
[C6H7O2(OH)3]n+3nHNO3(đặc) [C6H7O2(ONO2)3]n+3nH2O
1.3.3 Enzyme cellulase
1.3.3.1 Phân loại
Cellulase là một nhóm enzyme hoạt động phối hợp trong việc thủy phân
cellulose thành glucose [5].
Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan
điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các
nhóm khác nhau. Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và
nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có
tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo β-1,4-
glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của
chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho
phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose [2].
Hiện nay, cellulase được chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4-β-
D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4),
dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là
cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase)
(EC 3.2.1.91), dạng 3 là β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử
cellulose.
 Endoglucanase-EC.3.2.1.4
Tên thường gọi: cellulase
Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-
glucannohydrolase
Đôi khi người ta gọi enzyme này với tên khác:
H2SO4(đặc),t0
Hình 1.5 Endoglucanase

17
endo-1,4-β-D-glucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A...
Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và
các β-D-glucan của các loại ngũ cốc.
 Exoglucanase-EC.3.2.1.91
Tên thường gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase
Tên hệ thống: 1,4-β-glucan cellobiohydrolase.
Các tên khác exo-cellobiohydrolase, exoglucanase,
cellulase C1, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase...
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu
không khử của phân tử cellulose.[15]
 β-glucosidase- EC.3.2.1.21
Tên thường gọi: β-glucosidase
Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase
Một số tên gọi khác: β-D-galactosidase, β-
D-fucoside, β-D-xyloside, α-L-arabinoside.
β-glucosidase thủy phân các phân tử
cellodextrin và cellobiose thành glucose. [16]
Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được
sắp xếp thành các họ.Trước đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme,
cellulase được chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F. Sau đó, cellulase được chia thành 9
họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác .
Hiện nay, các cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45,
48, 61 và 74 [17].
Các enzyme có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Mỗi loại
enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp
hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành
các sản phẩm đơn giản nhất. [6]
Hình 1.6 Exoglucanase
Hình 1.7 β-glucosidase

18
1.3.3.2 Cấu tạo của enzyme cellulase
Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-110 Kdal. Cấu trúc không gian
khoảng 280-600 amino acid nhưng chiều dài cellulose thường khoảng 300-400 amino
acid và trung tâm xúc tác có khoảng 250 amino acid. Sự khác nhau về cấu trúc của các
enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung
tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không
gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng.
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc
khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử,
thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide.
Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn
cellulose qua một vùng liên kết. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B. Cả hai chuỗi
đều có 434 amino acid nhưng giữa chúng đều có sự khác biệt.
Cellulose bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose. Thủy ngân
ức chế cellulose hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.[5]
1.3.4 Cơ chế phân hủy
Quá trình thủy phân cellulase tự nhiên được thực hiện dưới sự tác động của một
phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu là các enzyme C1, Cx và β-glucosidase.
Enzyme C1 là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác động của enzyme này các
loại cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc...) bị trương lên và chuẩn bị cho tác động của
enzyme khác tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzyme C1 không phải là
một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C1, có tác dụng làm biến đổi cellulose,
nhưng khi tách riêng ra thì tác dụng này không còn nữa.
Để xác định hoạt tính enzyme C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự
nhiên nhất là sợi bông thấm nước.
Enzyme Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này thủy phân các
cellulose thành cellobiose. Chữ x cho ta biết đây là loại enzyme có nhiều thành phần

19
khác nhau. Người ta thường chia Cx thành 2 loại: (i) Exo-β-1,4-glucanase : có khả
năng xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử các chuỗi
cellulose; (ii) Edo-β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất
kỳ chỗ nào bên trong chuỗi cellulose phân tử.
Theo Ogawa và Toyama (1967) cho rằng một số enzyme khác có tác dụng trung
gian giữ C1 và Cx đó là C2. Enzyme C2 có tác động vào các cellulose đã bị C1 làm
trương lên và thủy phân chúng thành những loại cellulosedextrin hòa tan. Enzyme Cx
sẽ tiếp tục thủy phân các loại này thành cellobiose.
Enzyme β-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu, enzyme này thủy phân
cellobiose thành cellohexose (D-glucose )
Reese (1950) đã làm sáng tỏ các bước hoạt động thủy phân cellulose của
cellulase.
Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulose
( Nguồn: Reese, 1950)
Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết hydrogene trong phân tử cellulose, sau
đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng
β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.[5]

20
Hình 1.9. Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vi trí cắt của enzyme exoglucanase,
endoglucanase và β-glucosidase
Theo Miller G (1959), Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-
1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự
khác. Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các liên kết
ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosaccharide,
cellobiose và glucose. β-Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose
tạo thành các phân tử glucose.

21
Hình 1.10 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của
các enzyme thuộc phức hệ cellulase.
(Nguồn: Lee , 2002)
1.4 Tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose
1.4.1 Giới thiệu chung
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất được sinh tổng hợp
chủ yếu từ thực vật với tốc độ ước tính là 4.109
tấn/năm. Dựa vào số liệu trên, người ta
cho rằng cellulase là enzyme chiếm ưu thế nhất trong tự nhiên và được sinh ra chủ yếu
từ vi sinh vật .
Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi. Ngoài
ra, cellulase còn có mặt trong các hạt của thực vật bật cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu
róm, và ốc sên [5].

22
Hình 1.11 Vi khuẩn Bacillus subtilis
1.4.2 Vi khuẩn
Là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất từ trước đến nay. Bên cạnh các
loài vi khuẩn gây hại, còn có hàng loạt các vi
khuẩn có ích được sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm, công nghệ chế tạo hoá chất, dược phẩm, các
chế phẩm lên men, làm sạch môi trường. Vi khuẩn
phân huỷ cellulose là nhóm vi sinh vật đáng quan
tâm. Chúng sinh ra chủ yếu endoglucanase và β-
glucosidase, chúng gần như không tạo ra
exoglucanase. Đặc biệt là chủng Bacillus
subtilis được nghiên cứu nhiều.
Vi khuẩn dạ cỏ: Ruminococcus albus.
Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. nov và Cellulomonas iranensis sp.
nov .
Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans
(Murashima, 2002), Clostridium celluloliticus [5].
G.V.Iterson (1903) đã phát hiện ra khả năng phân huỷ cellulose của nhóm vi
khuẩn phân giải hiếu khí. Sau đó nhiều nghiên cứu về các nhóm vi khuẩn và niêm vi
khuẩn hiếu khí được nghiên cứu, đặc biệt là chi Cytophaga. Popov (1857) là người đầu
tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của nhóm vi khuẩn kị khí và về sau được
Omelianxkii (1985) tiếp tục nghiên cứu.[12]
1.4.3 Xạ khuẩn
Theo hệ thống phân loại của Cracxilnhicop, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn
bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, trong nước và trong các hợp chất hữu
cơ khác. Xạ khuẩn là một trong những vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự
nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá các hợp chất trong đất.

23
Hình 1.12 Xạ khuẩn Streptomyces
Đặc điểm quan trọng nhất là khả năng hình thành
chất kháng sinh, hơn 70% xạ khuẩn phân lập
được trong tự nhiên có khả năng này.
Về điều kiện sống, xạ khuẩn phân thành 2
loại: xạ khuẩn ưa ấm với nhiệt độ thích hợp từ
28-300
C; xạ khuẩn ưa nhiệt với nhiệt độ thích
hợp 50-600
C.
Xạ khuẩn ưa nhiệt lần đầu tiên tìm
thấy trong nước sông, hồ bẩn và trong đất. Rabinowitch (1895) và Tsiklinsky (1903) đã
phân lập được các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân. Noack (1912) cũng đã phân lập
được xạ khuẩn ưa nhiệt từ cỏ khô. Năm 1904, Gilbert đã phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt từ
nhiều nguồn gốc khác nhau: đất cát, sa mạc, than bùn và đặc biệt là trong ruột người và
nước cống thải.
Phân đang lên men nóng, cỏ khô và đất mùn là những môi trường phát triển tốt
nhất của xạ khuẩn ưa nhiệt. Miehen (1907) đã mô tả mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn
ưa nhiệt là gần như tạo lớp vỏ màu trắng, bao phủ toàn bộ các đống phân, cỏ khô đang
lên men nóng.
Tendle (1959) và Burkholder (1960) đã phân lập được hơn 100 chủng xạ khuẩn
ưa nhiệt thuộc giống Thermo actiniomyces và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau
của Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Pêru và Chilê. Kosmatcher (1953, 1956, 1962) đã phân
lập được một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt từ các vùng núi cao như: Crimê, Capcazơ,
Palmia, Tiansan và các vùng có nguồn nước nóng. Như vậy xạ khuẩn được phân bố
rộng khắp mọi nơi và từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau.
Xạ khuẩn ưa nhiệt cũng được tìm thấy ở cả 4 mùa trong năm. Ngay cả vùng ôn
đới nhiều loại đất cũng thường có tới 10.000-15.000 khuẩn lạc hoặc bào tử xạ khuẩn

24
trong 1g đất. Trong các mẫu đất chỉ bón phân vô cơ thì số lượng xạ khuẩn khoảng
200.000 khuẩn lạc trong 1g đất. Mùa đông số lượng xạ khuẩn chỉ chiếm 10-15% so với
toàn bộ tổng số vi sinh vật ưa nhiệt. Vào mùa hè tỷ lệ này tăng lên 70- 90%. Như vậy,
độ biến động về số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ và thời
tiết.[12]

25
Theo nghiên cứu của Agre (1962, 1964) cho rằng: trong đất đồng cỏ và đất xám
số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt không nhiều lắm, nhưng trong các vùng đất rừng, thảo
nguyên số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt lại nhiều hơn. Trong đất canh tác số lượng xạ
khuẩn ưa nhiệt chiếm tới vài chục nghìn/1g đất tươi, số liệu được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần và số lượng vi sinh vật trên một số loại đất chính
Loại đất Cây trồng
Vi khuẩn
(%)
Xạ khuẩn
(%)
Nấm mốc
(%)
Đất đỏ bazan (Đồng Nai) Cao su 95,5 2,7 1,8
Đất phù sa sông Cửu Long
(Cần Thơ)
Lúa - Rau
màu
90,3 6,1 3,6
Đất đỏ vàng trên đá sét
(Vĩnh Phúc)
Chuyên màu 76,8 11,0 12,2
Đất cát biển (Nghệ An) Chuyên màu 83,5 5,5 11,0
Đất phèn ngoại ô TPHCM Chuyên màu 59,6 15,9 24,5
Đất phù sa sông Hồng
(Hà Nội)
Lúa 96,9 1,7 1,4
Đất phù sa Tiền Hải
(Sông Thái Bình)
Lúa 97,6 1,7 1,4
Đất bạc màu (Bắc Giang)
Lúa - Rau
màu
92,6 4,2 3,4
Đất đồi pheralit trên đá vôi
(Thanh Hoá)
Chuyên màu 92,0 3,2 4,8
Đất cát biển Hậu Lộc
(Thanh Hoá)
Chuyên màu 85,6 3,9 10,5
Đất vàng trên đá biến chất
(Hà Giang)
Sắn 87,9 5,0 5,9
(Nguồn: Agre, 1962, 1964)

26
Hình 1.13 Nấm Trichoderma
fertile
1.4.4 Nấm mốc
Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy
nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá
trình tạo bào tử. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát
triển là từ 2o
C đến 5o
C, tối ưu từ 22o
C đến 27o
C
và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng
được là 35o
C đến 40o
C, cá biệt có một số ít loài có
thể sống sót ở 0o
C và ở 60o
C. Nói chung, nấm
mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH =
6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát
triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH >
9.[22]
Nấm mốc thường tập trung phát triển ở vùng đất canh tác giàu dinh dưỡng, tơi
xốp, thoáng khí… Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng,
nhiệt độ thích hợp… Nấm mốc phát triển mạnh ở vùng rễ cây vì rễ cây thường xuyên
tiết chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho nấm mốc; hơn nữa rễ cây làm cho đất
thoáng khí, giữ được đổ ẩm. Tuy nhiên, sự phát triển của nấm mốc cũng phụ thuộc vào
loại hệ rễ cây vì mỗi loại hệ rễ khác nhau nó sẽ tiết ra các hợp chất khác nhau.
Là vi sinh vật hiếu khí nên số lượng nấm mốc giảm dần theo tầng đất.
Tiêu biểu nhiều loại nấm có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulose thuộc
giống Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium,
Cladosporum...Trong đó hai giống nấm là Trichoderma, Aspergillus đã được nhiều
nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulose.
Giống Trichoderma sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và
exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase, trong khi các chủng thuộc giống

27
Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và β-glucosidase nhưng chỉ
một lượng ít exoglucanase.[6]
1.5 Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase của vi khuẩn
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn
hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá
trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như
khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như:
nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitơ.
 Nguồn carbon
Các loài vi sinh vật có thể sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc
điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài
thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau.
Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như
glucan, tinh bột, cellulose.Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzyme cảm ứng, trong môi
trường nuôi cấy các vi sinh vật sinh cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm
ứng và nguồn carbon.
Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, cám bổi,
mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn...Trichoderma lignorum và Trichoderma koningii
được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất.
Kết quả cũng tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có
giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải.
Chất cảm ứng enzyme cellulase còn là cellobiozooctaacetat, cám mì, lactose,
salixyl. Đối với Stachybotris atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là
tinh bột (1%).
Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalate, succinat và
những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp

28
cellulase. Song, trong môi trường với nồng độ glucose rất thấp có tác dụng kích thích
vi sinh vật phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme.
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cộng sự (1999) cho thấy, nguồn carbon
thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt
phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh
trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng
CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose; các chủng Actinomyces
griseus là bã mía hoặc mùn cưa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn
ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm .
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng
hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các
phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cộng sự (2008), nguồn carbon thích hợp
nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa. Còn theo kết quả
nghiên cứu của Ojumu và cộng sự (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có
khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn
cơ chất, trong đó mùn cưa đuợc xem là nguồn cơ chất tối ưu.
Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. Brasilianum sinh tổng hợp
cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon xylan
hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [19]. Theo kết quả nghiên
cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium
sp. DTQ-HK1 là rơm.
 Nguồn nitơ
Các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitơ. Nhìn
chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ
đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp
cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là peptone và cao nấm men
[14].

29
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là
muối nitrate. Đối với các giống của bộ nấm bông (Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất
lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme
này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy, các muối
này làm acid hóa môi trường. Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme, và thậm
chí có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.
Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase. Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và
cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật; nhưng với cao
ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn so với cao nấm
men.
Nguồn nitơ urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng hợp
cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến 76
IU/g . Nghiên cứu của Narasimha và cộng sự (2006) cho thấy, các chủng A. niger có
thể sử dụng nhiều nguồn nitơ khác nhau như: urea, peptone, ammonium nitrate. Trong
đó, urea là nguồn nitơ tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng
nấm này.
 Những nguyên tố khoáng
Như Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase
của vi sinh vật. Trong đó, Zn, Mn, Fe, có tác dụng kích thích sự tạo thành enzyme này
ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11-2,2mg/l, Fe là 2-10mg/l, Mn là 3,4-
27,2mg/l.
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme.
Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không
thuận nghịch enzyme. Sharma (1995) nhận thấy, Ca2+
làm tăng hoạt tính cellulase của
Bacillus sp. lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+
làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%)

30
và Zn2+
ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối
chứng). Theo nghiên cứu của Gao (2008), endoglucanase từ Aspergillus terreus bị
giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+
, 59% khi ủ với Cu2+
.
 Nhiệt độ nuôi cấy
Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm
3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài
ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 150
C, các loài ưa ấm thường sinh
trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-370
C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng
sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 500
C.
Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác
thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ
45-550
C và có thể chịu được nhiệt độ 65-800
C [7]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương
và cộng sự (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng
hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 500
C. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả
năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 580
C [8]. Trong khi đó, các chủng nấm
mốc N1và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ưu là 31 và 340
C [9]. Acharya và
cộng sự (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men
trong điều kiện 280
C, pH 4,0-4,5.[4]
 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi
trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn
chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 8,0 [9]; còn
chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,7[16].
Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở môi trường có
pH ban đầu là 4,5 và 5,5; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong
khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0-7,0 [9].

31
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại
enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian
nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu.
1.6 Các nghiên cứu liên quan ở Việt Nam và trên thế giới
1.6.1 Trên thế giới
Nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật phân giải cellulose có lẽ là công trình nghiên
cứu về nấm mốc của A.de Bary (1886). Tiếp đó là những nghiên cứu nhằm xác nhận
vai trò phân giải cellulose mạnh mẽ của nấm mốc trong đất (Ap.pel 1906, Scales 1915,
Walsman 1924) và Imsem hatski (1984), Zlochevski (1986) xác định độ ẩm tối ưu của
loài Aspergillus repens. [12]
Một số loài nấm có khả năng phân giải cellulose được chú ý nhiều:
+ Aspergillus fumigatus (Loginova, 1965)
+ Aspergillus flavus (Reese, 1950)
+ Aspergillusniger (Su – guira và đồng sự 1966)
+ Aspergillus oryzae [12]
Ở Nhật người ta sử dụng loại nấm Trichoderma viride và loài Trichoderma
koningin nuôi cấy theo phương pháp bề mặt.
Ở Mỹ người ta sử dụng chủng đột biến Trichoderma viride để tạo cellulase.
Một loại chế phẩm cellulase được sản xuất tại Liên Xô (cũ) có tên gọi là chế
phẩm thô được chiết rút qua quá trình nuôi cấy nấm Trichoderma lignorum theo
phương pháp bề mặt, sau đó sấy khô đến độ ẩm 13% trở xuống. Chế phẩm này chứa
enzyme C1 và Cx, ngoài ra còn hemicellulase, pectinase, xylase... [13]
1.6.2 Ở Việt Nam
Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase. Các
nghiên cứu được tiến hành trên nhiều phương diện khác nhau liên quan đến loại
enzyme này.

32
Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện
lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều
kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải
chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng
chịu được nhiệt độ 800
C, nhiệt độ lên men tối ưu từ 450
C đến 550
C, pH môi trường ban
đầu thích hợp nhất là 8. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là
peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh
tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men.
Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh
tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy rằng khả năng
sinh tổng hợp cellulase của A. griseus là cao và khả năng này đạt tối ưu ở 580
C, pH ban
đầu là 6.7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Qua nghiên cứu tác
giả cũng thấy rằng nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa. Cũng trong
năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được
một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải
cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân
lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và
CMC mạnh nhất .
Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khả năng
sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy
cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề được
nhiều tác giả quan tâm.
Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm
sợi có khả năng phân giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra được
một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này .

33
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng
hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu, tác giả
đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của
chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải công nghiệp như mật rỉ đường .
Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao,
Lý Kim Bảng và cộng sự (1999) đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế
phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này
được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thời
gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lượng mùn tạo thành
của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn
10% so với bể đối chứng .
Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh với đề tài sàng lọc chủng vi
sinh vật sinh cellulose sử dụng trong thủy phân bã thải agar đã chọn lọc được 17 chủng
vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao.
Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật phân hủy
cellulose từ các nhà máy sản xuất giấy và nghiên cứu về hoạt tính enzyme của các hệ vi
sinh vật này. Chính vì vậy, đây cũng là hướng nghiên cứu của đề tài chúng tôi.

34
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Thời gian và địa điểm
Thực hiện đề tài từ ngày 7/4 đến 30/6/2011 tại PTN Khoa MT & CNSH trường
ĐH Kỹ thuật Công nghệ TpHCM.
2.2 Vật liệu
2.2.1 Đối tượng
Các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose phân lập được từ nước
thải nhà máy giấy trên địa bàn TpHCM.
2.2.2 Cơ chất
Nguồn cơ chất sử dụng ở đây là Carboxymethylcellulose (CMC).
Là một dẫn xuất của cellulose, được tạo thành sau phản ứng với kiềm và acid
chloroacetic.
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của CMC
2.3 Thiết bị và hóa chất
2.3.1 Thiết bị
Máy quang phổ kế
Kính hiển vi quang học
Cân phân tích
Máy ly tâm

35
Nồi hấp
2.3.2 Hóa chất
Hóa chất dùng để pha dung dịch đệm : CH3COONa.3H2O, CH3COOH.
Hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme cellulase : glucose, lactose, 2-
hydro-3,5-dinitrobenzoic acid (DNS).
Môi trường nuôi cấy (A) :
Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần Hàm lƣợng Đơn vị
CMC 1% 100 ml
Tinh bột 1 g
MgSO4 0,2 g
NaHCO3 0,2 g
K2HPO4 5 g
CaCl2 0,2 g
NaCl 0,2 g
Peptone 0,2 g
Nước cất 1000 ml
2.4Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh nhất từ các chủng vi
khuẩn phân lập được từ Đề tài “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính
enzyme cellulase từ nước thải nhà máy giấy” của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng đã
thực hiện vào tháng 4 năm 2011.

36
Hình 2.2 Quy trình tuyển chọn chủng vi khuẩn.
2.4.1.1 Phương pháp xác định đường kính vòng phân giải
Giống vi khuẩn sau khi tăng sinh trên môi trường A trong 24h, ủ ở 370
C được ly
trích thu dịch enzyme ngoại bào bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút.
Hoạt tính enzyme cellulase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch
tán enzyme trên môi trường A có bổ sung 2% agar. Đĩa thạch chứa cơ chất CMC tùy
theo nồng độ trong đệm acetate 50mM pH 7, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ đường
kính 0,5 cm. Cho 100 μl dịch enzyme vào lỗ thạch rồi ủ 2 giờ ở 40
C cho enzyme
khuếch tán đều xung quanh và sau đó ủ 24 giờ ở 370
C. Nhuộm bằng dung dịch 1%
7000 vòng/phút, 15 phút
Chủng vi khuẩn
Thu dịch
Xác định đường kính vòng phân hủy
( môi trường A bổ sung 2% agar)
Ly trích enzyme
24h, 370
C Tăng sinh
(môi trường A)
Chọn các chủng có
đường kính lớn nhất
24h, 370
C
Nhuộm Gram
Xác định hình thái

37
Lugol và đo đường kính vòng phân giải cơ chất. Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ
thuận với kích thước đường kính vòng phân giải cơ chất: Đường kính = D - d (với D là
đường kính vòng ngoài và d là đường kính lỗ) [2].
2.4.1.2 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái
Sau khi chọn lựa được 10 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose cao,
tiến hành xác định đặc điểm hình thái.
 Quan sát hình thái khuẩn lạc
- Nguyên tắc
Quan sát hình thái khuẩn lạc giúp nhận diện được những khuẩn lạc đặc trưng
trên những môi trường riêng biệt.
- Phƣơng pháp thực hiện
Từ môi trường phân lập, lấy các khuẩn lạc đã mọc sau 24h đặt lên phiến kính và
quan sát hình thái trên kính hiển vi.
 Phƣơng pháp nhuộm Gram
- Nguyên tắc
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi
khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của
thành tế bào.
- Phƣơng pháp
Dùng que cấy ria lấy ít khuẩn lạc dàn mỏng trên phiến kính rồi hơ nhanh trên
ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
Nhuộm bằng thuốc nhuộm crystal violet trong 1 phút, rửa nước.
Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, rửa cồn 96.
Nhuộm lại bằng dung dịch fushin trong 1 phút, rửa nước.
Soi kính 100.

38
2.4.1.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào
- Nguyên tắc
Phương pháp xác định mật độ tế bào cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh
vật còn sống hiện diện trong mẫu.
- Phƣơng pháp thực hiện
Bước pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy
các nồng độ thập phân 10-1
, 10-2
, 10-3
...Mỗi bậc pha loãng là 10-1
được thực hiện bằng
cách dùng 1ml mẫu ( hoặc dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước
hoặc môi trường trong một ống nghiệm. Thực hiện dãy nhiều nồng độ pha loãng bậc 10
liên tiếp để được nồng độ pha loãng thích hợp.
Cấy trang 1ml mẫu đã pha loãng trên môi trường A có bổ sung 2% agar. Mỗi độ
pha loãng lặp lại 2 lần.
2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase
(CMCase)
2.4.2.1 Nguyên tắc
 Định nghĩa đơn vị hoạt tính
Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose
khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzyme
carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 400
C .
Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic
acid, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy
quang phổ ở bước sóng 540nm.
Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme mà giải phóng đường khử (như
glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.

39
2.4.2.2 Các dung dịch chuẩn bị
- Pha dung dịch đệm acetat
1000ml nước cất + 4.1g CH3COOH chuẩn độ tới pH mong muốn
(dùng NaOH 0.1N và HCl 0.1N để chuẩn độ) dung dịch đệm CH3COONa
50mM.
- Pha dung dịch cơ chất CMC 1%
Cân 1g CMC +100ml dung dịch đệm CH3COONa 50mM đun lên sau
khi CMC tan hết chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm cho đến vạch
và lắc đều ta được dung dịch đệm CMC 1% .
- Pha dung dịch DNS
Cân 10g DNS, cho vào becher 1000ml, thêm khoảng 400ml nước cất, đun
becher ở 800
C và khuấy đều.
Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150ml nước cất) từ từ vào dung dịch
DNS, khuấy ở nhiệt độ 800
C.
Tiếp tục thêm 300g postassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS
và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800
C.
Làm lạnh dung dich DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định
mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai
màu nâu có nắp.

40
2.4.1.1 Dựng đường chuẩn glucose
Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình
định mức100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều .
Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng 2.2:
Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn gluose
Ống số 0 1 2 3 4 5 6
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
ml dung dịch glucose ( mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
ml dung dịch CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1
ml dung dịch DNS – lactose 2 2 2 2 2 2 2
ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ ở
bước sóng 540 nm. Từ các giá trị OD, dựng đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ
glucose và giá trị OD.

41
2.4.1.2 Thực hiện thí nghiệm
Xác định hoạt tính phân hủy cellulose của enzyme cellulase đối với cơ chất
CMC bằng cách so sánh ống đối chứng mẫu (bất hoạt enzyme bằng nhiệt độ) và ống
thí nghiệm (ủ enzyme ở nhiệt độ thích hợp) như bảng sau:
Bảng 2.3. Xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl cellulase
Đối chứng Đối chứng mẫu Thí nghiệm
1ml H2O
1ml enzyme
(đun sôi 5 phút)
1ml enzyme
2ml DNS -
lactose
2ml DNS - lactose 1ml CMC ( ủ 400
C, 10 phút)
1ml CMC 1ml CMC 2ml DNS - lactose
Đun sôi cách thủy 15 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm
2.4.1.3 Công thức tính
Từ phương trình đường chuẩn tính giá trị F theo công thức:
Giá tri F = ( 0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 + …+ 0,6/AG0,6)/ 6
Hoạt tính CMCase được tính dựa vào giá trị F và giá trị OD:
CMCase (U/g) = (AT – AB)*F*(1000/180)*(1/10phút)*(1/1,0ml)*(1/C)
Trong đó:
AT: độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzyme ( mẫu TN)
AB: độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzyme ( mẫu ĐC)
F : yếu tố glucose ( mg/ml)
1000: chuyển mg thành µg
180: phân tử lượng của glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol
10: thời gian phản ứng (phút)
1.0: thể tích dung dịch enzyme (ml)
C : nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)[5]

42
2.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của các chủng vi khuẩn
Hình 2.3 Quy trình khảo sát các yếu tố môi trường lên hoạt tính enzyme của các
chủng vi khuẩn.
2.4.1.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo thời gian
Các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trên môi trường A, sau các khoảng thời
gian 12h, 24h và 48h, tiến hành ly trích ở 7000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch.
Xác định hoạt tính enzyme của các chủng đã tuyển chọn. Chọn thời gian các chủng có
hoạt tính cao nhất.
Chủng vi khuẩn đã
tuyển chọn
Ly tâm 7000
vòng/phút trong 15
phút
Nuôi cấy trên môi
trường A ở nồng độ
CMC 0.5%, 1%, 1.5%,
2%
Xác định hoạt tính
Xác định mật
độ tế bào
Thu dịch enzyme
Xác định
đường kính
vòng phân
giải
trường A ở pH3, 5,
7 và 9
trường A ở 12h, 24h
và 48h

43
Tiến hành song song với phương pháp xác định hoạt tính enzyme là phương pháp
xác định mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn trên môi trường A có bổ sung 2% agar.
2.4.1.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo pH
Môi trường A được điều chỉnh pH bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M để được môi
trường có pH thích hợp tăng dần từ 3, 5, 7, và 9. Sau đó, ủ các chủng vi khuẩn đã tuyển
chọn ở 370
C theo thời gian tối ưu đã chọn ở trên. Tiến hành ly trích lấy dịch enzyme ở
7000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính enzyme cellulase. Chọn giá trị pH
của môi trường mà enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất.
2.4.1.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo nồng độ cơ chất
CMC
Các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trên môi trường A đã được điều chỉnh
nồng độ cơ chất CMC tăng dần từ 0.5%, 1%, 1.5%, 2% và điều chỉnh pH tối ưu như
đã khảo sát bên trên. Sau đó, tiến hành ly trích ở 7000 vòng/phút trong 15 phút để thu
lấy dịch. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng đã tuyển chọn. Chọn nồng độ cơ
chất mà tại đó enzyme có hoạt tính cao.
Tiến hành song song với phương pháp xác định hoạt tính enzyme là phương
pháp xác định đường kính vòng phân giải của các chủng vi khuẩn trên môi trường A có
bổ sung 2% agar.

44
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn
3.1.1 Kết quả tuyển chọn trên môi trường A
Từ đề tài “ Nghiên cứu phân lập chủng VK có hoạt tính cellulase cao từ nước
thải nhà máy giấy” của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng, chúng tôi có 15 chủng vi khuẩn
có khả năng phân giải cellulose. Sau khi tăng sinh 24h, ủ ở 370
C trên môi trường A,
dịch ly trích enzyme được cấy vào các giếng thạch trên môi trường A có bổ sung 2%
agar.
Dựa vào đường kính vòng phân giải lớn nhất, chúng tôi chọn lựa được 10 chủng
VK, ký hiệu từ T1 đến T10.
Các chủng VK này được phân lập từ nguồn nước thải của các cơ sở sản xuất
giấy, bột giấy, bao bì trên địa bàn TpHCM. Trên môi trường A, chúng tôi sử dụng
khoáng đa lượng, vi lượng và 1%CMC làm nguồn C và N. Đây là dẫn xuất của
cellulose sau phản ứng với kiềm và acid chloroacetic. Chỉ các chủng VK có hệ enzyme
cellulase, phân hủy được cellulose mới có thể phát triển được trên môi trường này. Quá
trình phân hủy CMC sẽ tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose, sản phẩm này không bắt
màu thuốc thử Lugol.
Đường kính vòng phân giải của 10 chủng T1 đến T10 thay đổi từ 0,9 cm đến 2,7
cm. Trong đó, chủng có đường kính vòng phân giải lớn nhất là chủng T6 và chủng có
đường kính vòng phân giải nhỏ nhất là chủng T10.
Để xác định về hình thái vi thể, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram 10 chủng này.
3.1.2 Kết quả xác định hình thái
Từ 15 chủng vi sinh vật, tuyển chọn trong môi trường A có bổ sung 2% agar và
ủ ở 370
C. Sau đó, chọn lọc 10 chủng VK có hoạt tính cellulase cao nhất để quan sát
hình thái đại thể và vi thể .

45
Kết quả quan sát hình thái đại thể và nhuộm Gram được trình bày ở bảng 3.1 và
hình 3.1.
Bảng 3.1. Hình thái đại thể và hình thái vi thể của 10 chủng vi khuẩn.
Chủng Hình thái đại thể Hình thái vi thể
T1 Khuẩn lạc trơn, trong, nhỏ li ti.
Vi khuẩn Gr(+), tụm lại
từng đám, có dạng hình
que.
T2 Tròn, đục, lan.
Vi khuẩn Gr(+), hình
que.
T3 Trắng, trong, trơn.
que.
T4 Đục, lan, nhăn.
Vi khuẩn Gr(+), hình cầu.
T5 Lan, nhăn.
T6 Tròn, trắng, lồi.
que.
T7 Đục, trơn. Vi khuẩn Gr(+), hình que
T8 Đục, tròn li ti, nhăn.
Vi khuẩn Gr(+), hình que
T9
Vàng, trơn, lan.
que.
T10 Tròn, trơn, nhăn.

46
Chủng Hình ảnh minh họa Chủng
T1 T6
T2 T7
T3 T8
T4 T9
T5 T10
Hình 3.1. Hình ảnh vi thể của 10 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm Gram.

47
Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn chúng tôi
tuyển chọn đều là Gram (+) và là trực khuẩn. Còn chủng T4, T5 và T10 thì cho kết quả
là cầu khuẩn.
Theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học như nghiên cứu của Nguyễn Đức
Lượng (1999) về chủng Actinomyces griseus và Hoàng Quốc Khánh (2003) về chủng
A. niger đã khẳng định chủng vi sinh vật có hệ enzyme celullase cao nhất là nấm mốc.
Tuy nhiên, kết quả phân lập của chúng tôi lại thu được chủ yếu là vi khuẩn. Có thể do
đặc điểm nguồn lấy mẫu là nước thải và môi trường phân lập là ở pH 6,5 – 7 phù hợp
với điều kiện phát triển của vi khuẩn hơn.
Như vậy, bước đầu chúng tôi đã tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn có khả
năng phân hủy cellulose mạnh nhất cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo thời gian
3.2.1 Kết quả hoạt tính cellulase
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong
môi trường chứa CMC 1%, pH 7, ở nhiệt độ 370
C.
Sau thời gian 12h, 24h và 48h xác định hoạt tính
CMCase để chọn ra thời gian tối ưu vi khuẩn sinh
tổng hợp enzyme và xác định mật độ tế bào của các
chủng vi khuẩn trong khoảng thời gian tối ưu đó.
Hình 3.2 Xác định hoạt tính
enzyme cellulase theo Miller

48
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 10 chủng theo thời gian.
Chủng
Hoạt tính (U/g)
12h 24h 48h
T1 0,0273 0,0302 0,0261
T2 0,0563 0,0651 0,0401
T3 0,0973 0,1926 0,0083
T4 0,1861 0,2075 0,0033
T5 0,0327 0,0385 0,0576
T6 0,1820 0,2635 0,0264
T7 0,1697 0,2250 0,0461
T8 0,0359 0,0394 0,0348
T9 0,0834 0,1989 0,0157
T10 0,0097 0,0112 0,0228
Trung bình 0,0881 0,1272 0,0281
Kết quả cho thấy 10 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase trong thời gian 12h, 24h và 48h. Các chủng tăng từ lên 0,0881 (U/g) sau 12h
lên 0,1272 (U/g) sau 24h, sau đó giảm dần xuống 0,0281 (U/g) sau 48h. Trong đó, tại
thời điểm 24h, chủng cao nhất là T6 (0,2635 U/g) và chủng thấp nhất là T10 (0,0112
U/g). Riêng 2 chủng T5 và T10 hoạt tính cao sau 48h nuôi cấy. Tuy nhiên, điều kiện thí
nghiệm không cho phép nên không thể quan sát thời gian tiếp theo nên 2 chủng này
chúng tôi kết luận là cho hoạt tính cao nhất ở 48h. Bên cạnh đó 2 chủng T1 và T8 vẫn
cho hoạt tính cao nhất ở 24h, tuy nhiên sự chênh lệch ở các khoảng thời gian 12h, 24h
và 48h vẫn không cao.

49
Hình 3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian.
0.02
0.025
0.03
0.035
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T1
0
0.2
0.4
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T4
0
0.1
0.2
0.3
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T3
0
0.05
0.1
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T2
0
0.05
0.1
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T5
0
0.1
0.2
0.3
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T6
0
0.1
0.2
0.3
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T7
0.03
0.035
0.04
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T8
0
0.1
0.2
0.3
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T9
0
0.01
0.02
0.03
12h 24h 48h
U/g
Thời gian
T10

50
Nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010) với đề tài khảo
sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn
Bacillus Subtilis cho thấy, khả năng tại thời điểm 32h và 34h hoạt tính enzyme sinh ra
là lớn nhất.
Đối với 10 chủng của chúng tôi, hoạt tính lại cao nhất sau 24h. Đây là các chủng
phân lập trực tiếp từ nước thải nhà máy giấy, bột giấy nên có thể khả năng thích nghi
của các chủng đối với cơ chất cellulose cao hơn. Do vậy, chỉ sau 24h nuôi cấy hoạt tính
enzyme thu được là tối đa.

51
3.2.2 Kết quả xác định mật độ tế bào
Để xác định sự phát triển của quần thể vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy,
cặn tế bào thu được sau khi ly tâm được cấy trang trên môi trường A và đếm mật độ tế
bào. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Hoạt tính và mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn
Khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn cơ chất thích hợp, các chủng vi sinh
vật sẽ phân hủy cơ chất cung cấp vật chất và năng lượng cho quá trình phát triển. Về
mặt lý thuyết, sự gia tăng số lượng tế bào tương quan với hoạt tính enzyme. Tuy nhiên,
chúng tôi không có điều kiện xác định mật độ tế bào ở các thời điểm tương ứng khi đo
hoạt tính. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành xác định mật độ sau 24h.
Chủng
Mật độ tế bào
(CFU/ml)
T1 19x1010
T2 24x1010
T3 11x1010
T4 7,7x1010
T5 1,6x1010
T6 5,9x1010
T7 2,4x1010
T8 11x1010
T9 4,6x1010
T10 3,8x1010

52
Hình 3.4 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn.
Kết quả ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.4 cho thấy, tất cả các chủng đều có mật độ tế
bào khá cao. Riêng chủng T6 khi nuôi cấy ở 24h cho hoạt tính cao nhất (0,2635U/g)
nhưng mật độ tương đối thấp (5,9x1010
CFU/ml), điều này chúng tôi có thể khẳng định
rằng, do chủng vi khuẩn này có hệ enzyme cellulase mạnh nên khi ứng dụng vào xử lý
nước thải cần số lượng vi khuẩn không nhiều. Bên cạnh đó, chủng T2 có mật độ tế bào
cao nhất (24x1010
CFU/ml) nhưng hoạt tính tương đối thấp (0,0651 U/g), vì vậy cần
các nghiên cứu tiếp theo để xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng vi khuẩn này
sinh hoạt tính cao nhất.
0
5
10
15
20
25
30
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Mật độ tế bào * 10 (CFU/ml)

53
3.3Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường chứa CMC 1%, ở nhiệt độ
370
C và ở 4 khoảng pH khác nhau. Sau thời gian 24h, ly trích và xác định hoạt tính
CMCase. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng pH khác nhau.
Chủng
Hoạt tính (U/g)
pH3 pH5 pH7 pH9
T1 0,0422 0,0211 0,0302 0,0285
T2 0,0273 0,0004 0,0651 0,0033
T3 0,0236 0,0149 0,1926 0,0319
T4 0,1702 0,0252 0,2075 0,0261
T5 0,1951 0,0238 0,0385 0,0227
T6 0,1818 0,0348 0,2635 0,0120
T7 0,0227 0,0261 0,2250 0,0082
T8 0,0066 0,0198 0,0394 0,0157
T9 0,0372 0,0484 0,1989 0,0430
T10 0,0339 0,0253 0,0112 0,0219
Trung
bình
0,0741 0,0239 0,1272 0,0213

54
Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH.
0
0.02
0.04
0.06
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T1
0
0.05
0.1
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T2
0
0.2
0.4
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T3
0
0.1
0.2
0.3
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T4
0
0.2
0.4
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T5
0
0.2
0.4
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T6
0
0.1
0.2
0.3
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T7
0
0.02
0.04
0.06
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T8
0
0.1
0.2
0.3
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T9
0
0.01
0.02
0.03
0.04
pH3 pH5 pH7 pH9
U/g
pH
T10

55
Từ đồ thị trên, cho thấy 10 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase trong 4 khoảng pH. Tuy nhiên hoạt tính thay đổi khác nhau. Hầu hết
các chủng có hoạt tính trung bình giảm từ 0,0741 (U/g) ở pH3 giảm xuống 0,0239
(U/g) ở pH5, sau đó tăng lên 0,1272 (U/g) ở pH7 rồi giảm xuống 0,0213 (U/g) ở pH9.
Trong đó, 7 chủng vi khuẩn T2, T3, T4, T7, T8, T9 có hoạt tính cao nhất ở pH7. 3
chủng vi khuẩn T1, T5, T10 có hoạt tính cao ở pH3. Riêng chủng T10 hoạt tính thấp
nhất ở pH7.
Các chủng vi khuẩn này được phân lập trực tiếp từ nước thải nhà máy giấy, pH
đầu vào của nước thải phân lập là 6,3 - 7,2.
Nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy(2010) với đề tài khảo sát
các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn
Bacillus Subtilis cho thấy, ở pH7 chủng vi khuẩn này cho hoạt tính enzyme là tối ưu.
Mặt khác, trong các công trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học hoặc
chế phẩm vi sinh sử dụng cho xử lý nước thải được đưa về pH trung tính là 6,5 – 7,5
trước khi bổ sung chủng vi sinh vật.
Do đó, các chủng tuyển chọn của chúng tôi có hoạt tính cao nhất ở pH là 7 phù
hợp khi ứng dụng xử lý trong thực tế.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

Similar to Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy (20)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy