Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA DỊCH CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH
(LACTUCA INDICA L)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện : Trịnh Thị Phƣơng Thảo
MSSV: 1311100687 Lớp: 13DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2017

2. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở
lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh
Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố
trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan
này.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017.
Sinh viên
Trịnh Thị Phƣơng Thảo

3. Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học -
Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý
báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,
ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở
Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh
chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề
tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con
những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong
cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017
Sinh viên
Trịnh Thị Phƣơng Thảo

4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC.........................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG......................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... viii
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề..................................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................3
4. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................................3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................4
1.1.Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý ..................................................4
1.1.1. Phân loại................................................................................................................4
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố...........................................................................................4
1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh.........................................................................5
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý...................................................................................................5
1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh ...................................................................6
1.1.5.1. Flavonoid ............................................................................................................6
1.1.5.2. Alkaloid ...............................................................................................................8
1.1.5.3. Carbohydrate ....................................................................................................10
1.1.5.4. Glycoside...........................................................................................................11
1.1.5.5. Saponin..............................................................................................................12
1.1.5.6. Tannin ...............................................................................................................13
1.1.5.7. Amino acid ........................................................................................................14
1.1.5.8. Isoprenoid .........................................................................................................15
1.2.Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật............................16
1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn...................................................................16

5. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn............................................................................................16
1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật.......................................19
1.2.3.1. Hợp chất phenolic.............................................................................................19
1.2.3.2. Nhóm alkaloid...................................................................................................21
1.3.Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh.......................................................23
1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli.........................................................................23
1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. .........................................................................24
1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. ..............................................................................26
1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp................................................................................27
1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. .................................................................................28
1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. ..................................................29
1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp....................................................30
1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus ..............................................................31
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................33
2.1.Địa điểm và thời gian ..............................................................................................33
2.1.1. Địa điểm ..............................................................................................................33
2.1.2. Thời gian .............................................................................................................33
2.2.Vật liệu ....................................................................................................................33
2.2.1. Nguồn mẫu ..........................................................................................................33
2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị...................................................................................................33
2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng .........................................................................33
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................34
2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................................35
2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu ................................................................35
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật...............................................35
2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật.................................................36
2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị.....................36

6. Đồ án tốt nghiệp
iii
2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu...............................................................................37
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ....................................................38
2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết...........................38
2.3.7.1. Định tính carbohydrate.....................................................................................39
2.3.7.2. Định tính alkaloids............................................................................................39
2.3.7.3. Định tính saponin..............................................................................................39
2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside..............................................................................39
2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside...................................................................40
2.3.7.6. Định tính flavonoid ...........................................................................................40
2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol..........................................................................41
2.3.7.8. Định tính tannin ................................................................................................41
2.3.7.9. Định tính steroid ...............................................................................................41
2.3.7.10.Định tính amino acid........................................................................................41
2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH .....................................42
2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học.....................................................42
2.3.9.1. Định lượng vitamin C........................................................................................42
2.3.9.2. Định lương Alkaloid..........................................................................................43
2.3.9.3. Định lượng Flavonoid.......................................................................................44
2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu.............................................................................44
2.4.Bố trí thí nghiệm......................................................................................................44
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi
cao chiết từ Bồ công anh................................................................................................46
2.4.1.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................46
2.4.1.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................47
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công
anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh......................................................................48
2.4.2.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................48

7. Đồ án tốt nghiệp
iv
2.4.2.2. Thuyết minh quy trình ......................................................................................50
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây Bồ
công anh. ........................................................................................................................50
2.4.3.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................50
2.4.3.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................51
2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc
từ cây Bồ công anh.........................................................................................................51
2.4.4.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................51
2.4.4.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................53
2.4.5. Thí nghiệm 5: Định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ cây
Bồ công anh....................................................................................................................53
2.4.5.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................53
2.4.5.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................55
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................56
3.1.Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc........56
3.2.Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh trên các
chủng vi khuẩn gây bệnh................................................................................................56
3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn Escherichia coli...............................................................................................56
3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn Listeria Spp. ....................................................................................................58
3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn Samonella Spp.................................................................................................58
3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn Shigella Spp.....................................................................................................60
3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn Vibrio spp. .......................................................................................................61

8. Đồ án tốt nghiệp
v
3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm
vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. ..................................................................................62
3.3.Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh đối với
20 vi khuẩn gây bệnh .....................................................................................................63
3.4.Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc Bồ công
anh 64
3.5.Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc Bồ công anh..66
3.6.Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh....................67
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................71
4.1.Kết luận....................................................................................................................71
4.2.Đề nghị ....................................................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................72
PHỤ LỤC.........................................................................................................................1

9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DMSO: Dimethyl sulfoxide
RNA: Ribonucleic acid
TSA: Trypton Soya Agar
TSB: Trypton Soya Broth
LiWE: Lactuca indica Water extract
NA: Non Activity
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

10. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,
1999)...............................................................................................................................18
Bảng 3.1 Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết nƣớc Bồ công anh trên
20 chủng vi khuẩn gây bệnh...........................................................................................63
Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ Bồ công
anh..................................................................................................................................65
Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của Bồ công anh.................67
Bảng 3.4. Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C............................................69

11. Đồ án tốt nghiệp
viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid,
(C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid................................................................................7
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid ........................................9
Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate..............................................................10
Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside..............................................................................12
Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin ......................................................................13
Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)
........................................................................................................................................17
Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi...................................................................23
Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp................................................................25
Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp..............................................................26
Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. ..................................................................27
Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. ....................................................................28
Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas...............................................................................30
Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp.........................................................................31
Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus.................................................................32
Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu .........................................................................37
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..................................................................45
Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây bồ công anh................................46
Hình 2.4. Mẫu Bồ công anh sau khi sấy khô................................................................47
Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh 49
Hình 2.6. Quy trình khảo sát kháng oxy hóa của cao chiết...........................................51
Hình 2.7. Sơ đồ định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc...............................52
Hình 2.8. Sơ đồ định lƣợng vitamin C, alkaloid và flavonoid ......................................54
Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ........................................................................57

12. Đồ án tốt nghiệp
ix
Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp...............................................................................58
Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp..........................................................................59
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp...............................................................................60
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp..................................................................................61
Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin
đối với vi khuẩn E. feacalis............................................................................................62
Hình 3.7. Hiệu quả kháng oxy hóa của vitamin C ........................................................68
Hình 3.8. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh.......................68

13. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo các nhà phân loại thực vật, nƣớc ta có
khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài đƣợc dùng làm dƣợc
liệu (Viện dƣợc liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên
thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Trong
tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu
trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10% là cây thuốc trồng.
Tác dụng chữa bệnh của cây cỏ là do các hợp chất tự nhiên có ở trong chúng quyết
định. Do đó, nói tới nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú trên đất nƣớc ta
cũng là nói tới khả năng sinh tổng hợp, chuyển hóa và tích lũy các hợp chất tự nhiên có
hoạt tính sinh học của nguồn gen thực vật. Ngày nay, các hợp chất có nguồn gốc thiên
nhiên đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh đã và đang đƣợc các nhà khoa học trong và
ngoài nƣớc quan tâm do tính ít độc và khả năng dung nạp tốt của chúng với cơ thể
sống. các hợp chất thiên nhiên từ thực vật cũng nhƣ các sinh vật khác rất phong phú về
mặt cấu trúc hóa học và thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: kháng sinh, kháng
viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, kìm hãm HIV, điều hòa miễn dịch, chống sốt rét.
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2009 đến nay, số lƣợng bán thuốc
kháng sinh ở Việt Nam ra ngoài cộng đồng đã tăng gấp 2 lần so với thời điểm hiện tại.
Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh của
ngƣời dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên tới 91%, tỉ lệ sử
dụng kháng sinh ở các bệnh viện tuyến trung ƣơng chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị
trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%. Việc lạm dụng kháng
sinh trong điều trị bệnh đã khiến quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn đẩy mạnh
làm mất đi vai trò của kháng sinh trong điều trị bệnh. Vấn đề về thực trạng kháng
kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nƣớc đang phát triển. Các

14. Đồ án tốt nghiệp
2
bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa, đƣờng hô hấp, các bệnh lây truyền qua đƣờng tình
dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử
vong cao ở các nƣớc đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu
sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi
khuẩn.
Bồ công anh còn có tên gọi khác là rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi
mác, diếp trời, rau mũi cày. Là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae), sống
một năm hoặc hai năm, không lông. Thân cao 60-200 cm, đơn hoặc chẻ nhánh ở phần
trên. Lá dài 30cm rộng 5 – 6cm, mép có răng cƣa thƣa. Bấm vào lá và thân đều thấy
tiết ra nhũ dịch màu trắng đục nhƣ sữa. Bồ công anh mọc hoang nhiều ở các tỉnh phía
Bắc. Thƣờng dùng lá bồ công anh, thu hoạch lá về dùng tƣơi hay phơi hoặc sấy khô,
dùng tƣơi tốt hơn. Cũng có thể dùng rễ, toàn cây phơi khô. Dùng để chữa một số bệnh
nhƣ: chữa sung vú, tắc tia sữa, chữa đau, viêm loét dạ dày, tá tràng, mắt đau sung đỏ,
mụn nhọt, viêm họng, viêm phổi, phế quản…
Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật để thay thế các loại
thuốc kháng sinh hóa học là một giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh. Tuy nhiên,
loại cây này đƣợc con ngƣời sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền
miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính vẫn chƣa đƣợc xác
định cụ thể. Vì thế việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây
thuốc là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh
giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nƣớc từ Bồ công anh (Lactuca indica
L)”. Đề tài này đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh.

15. Đồ án tốt nghiệp
3
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá một số hoạt tính sinh học từ cao chiết nƣớc của cây bồ công anh.
- Xác định một số thành phần hóa học hiện diện trong cao nƣớc.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bồ công anh đối với các
chủng vi khuẩn gây bệnh.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây bồ công anh.
- Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết bồ công anh.
- Định lƣợng các chất vitamin C, alkaloid, flavonoid.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Mẫu cây bồ công anh đƣợc tách chiết cao từ dung môi nƣớc và khảo sát hoạt
tính kháng khuẩn trên các nhóm vi khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp.,
Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp.,
Staphylococcus spp.
- Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac
glycoside, antharaqinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin,
steroid, amino acid.
- Định lƣợng các chất: vitamin C, alkaloid, flavonoid.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thuốc thử DPPH.

16. Đồ án tốt nghiệp
4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý
1.1.1. Phân loại
Bồ công anh hay rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp trời,
rau mũi cày, là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae).
Bộ (ordo): Asterales (Cúc)
Họ (familia): Asteraceae (Cúc)
Chi (genus): Lactuca
Loài (species): L.indica
Tên tiếng Anh: The common dandelion (thƣờng gọi là "dandelion")
Tên khoa học: Lactuca indica L
Tên đồng nghĩa:
Brachyramphus sinicus Miq.
Chondrilla squarrosa (Thunb.) Poir.
Lactuca amurensis Regel & Maxim.
Lactuca amurensis Regel
Lactuca bialata Griff.
Lactuca brevirostris Champ.
Lactuca brevirostris Champ. ex Benth.
Lactuca brevirostris var. brevirostris
Lactuca brevirostris var. foliis laciniatis Hemsl.
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Nguồn gốc: Cây bồ công anh (Lactuca indica L) có nguồn gốc từ đại lục Á – Âu,
và ngày nay đƣợc trồng khắp Châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á), Bắc Mỹ,
Nam Phi, Nam Mỹ, New Zealand, Australia, và Ấn Độ.
Phân bố: cây mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các vùng ẩm thuộc các nƣớc Châu Á
nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và các nƣớc Đông Dƣơng. Ở

17. Đồ án tốt nghiệp
5
Việt Nam, Bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi (thƣờng ở độ cao dƣới 1000 mét)
đến trung du và đồng bằng. Cây thƣờng mọc ở nơi đất ẩm, trong vƣờn, ven đƣờng đi,
bãi sông hoặc trên các thửa ruộng, nƣơng rẫy đã bỏ hoang. Thu hái vào khoảng tháng 5
– 7, lúc câu chƣa ra hoa hoặc bắt đầu ra hoa, loại bỏ lá già, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô.
1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh
Cây bồ công anh sống một năm hoặc hai năm. Thân không lông, cao 60 – 200 cm,
thân thƣờng đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên. Các lá phía dƣới không lông, lá đơn mọc
cách. Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thƣớc phiến lá dài từ 13 – 25
cm, rộng từ 1,5 – 11 cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá
thƣờng ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá. Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng
cƣa thô to. Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dƣới xanh xám. Các lá mọc ở phía trên
gần đỉnh ngọn sinh hoa thƣờng trên nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn, đầu cành.
Hoa tựa hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng.
Tổng bao hình trụ, kích thƣớc chùm hoa thƣờng cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá
bắc không lông, màu tía, các lá ngoài hình trứng, dài 2 – 3 mm, các lá trong hình trứng
– mũi mác, các lá bắc tận trong cùng khoảng 8, hình mũi mác. Hoa tự thƣờng có 21 –
27 bông, màu vàng nhạt, kích thƣớc hoa 12 – 13 mm, rộng mm. Quả bế hình elip,
phẳng, màu đen, kích thƣớc quả dài 4 – 4,5 mm, rộng 2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm.
Mào lông màu trắng gắn liền quả dài 7 – 8 mm. Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n =
18 (Peng & Hsu, 1978).
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý
Flavonoid của Bồ công anh đã đƣợc nghiên cứu tác dụng sinh học thấy có tác dụng
ức chế men oxy hóa khử peroxydase và catalase máu chuột cống trắng. Những thí
nghiệm tiến hành với huyết thanh ngƣời cũng cho những kết quả ức chế men oxy hóa
khử rõ rệt.
Bồ công anh (Đông y cho là thuộc về hàn lƣơng) đƣợc áp dụng phƣơng pháp lồng
cử động đã thể hiện tác dụng an thần. Theo tài liệu nƣớc ngoài, tại một số nƣớc, ngƣời

18. Đồ án tốt nghiệp
6
ta có sử dụng và nghiên cứu những loài Lactuca khác nhƣ L.virosa, L. sativa (rau diếp
ăn của Việt Nam), thấy những cây này không độc và có tác dụng trên hệ thần kinh
trung ƣơng gây ngủ nhẹ.
Tác dụng tiêu độc, chữa bệnh sƣng vú, tắc tia sữa, mụn nhọt đang sƣng mủ. Còn
dùng uống để chữa bệnh đau dạ dày, ăn kém tiêu.
Theo Y học cổ truyền, Bồ công anh có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thấp thông
lâm, chủ trị các chứng ung nhọt, sang lở, nhũ ung (viêm vú), trƣờng ung (viêm ruột),
đau họng (hầu tý), mắt sƣng đỏ đau, chứng thấp nhiệt hoàng đản (viêm gan vàng da),
nhiệt lâm (viêm tiết niệu).
1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh
1.1.5.1. Flavonoid
a. Khái niệm: Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây
còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng
benzen A và B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid
có màu vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong
thực vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ
carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011).
Chúng thƣờng đƣợc cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3) và
thƣờng ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến
nhƣ flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone.. Chỉ riêng hai nhóm flavon,
flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38 627 chất
(Ngô Văn Thu, 1998).
Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các
protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng có khả
năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011).
b. Phân loại: Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của
mạch 3C nên các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính:

19. Đồ án tốt nghiệp
7
- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid.
- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid.
- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011).
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid,
(C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid
c. Vai trò:
- Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy
hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung
thƣ, tăng nhanh sự lão hóa,...) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng.
- Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu
cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl,… giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình
oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất
flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão
hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn
ở gan và bảo vệ chức năng gan.

20. Đồ án tốt nghiệp
8
- Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự
phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ
histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien,… (Quỳnh Ngọc, 2011).
1.1.5.2. Alkaloid
a. Khái niệm:
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản
ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thƣờng các
alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các
muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít
phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi
thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.
Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin do
động vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác động
dƣợc lý học đối với con ngƣời và các động vật khác. Các alkaloid thông thƣờng là các
dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng. Chúng đƣợc tìm
thấy nhƣ là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động
vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có thể đƣợc tinh chế từ
các dịch chiết thô bằng phƣơng pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv,
2010).
Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm
thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh
ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là
anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với
phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt
khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu
cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998).
b. Phân loại

21. Đồ án tốt nghiệp
9
Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:
- Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin,
nicotin, spartein, pelletierin.
- Nhóm isoquinolin: các ancaloit gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain,
papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.
- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin.
- Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine.
- Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine,
brucin, veratrin, cevadin.
- Nhóm phenothylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine.
- Nhóm indole:
Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin
Các ergolin: Các ancaloit từ nhựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamine, acid
lysergic v.v
Các beta-cabolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin
- Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffeine, theobromin, theophylline (Tôn Nữ Minh
Nguyệt và ctv, 2010).
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid

22. Đồ án tốt nghiệp
10
c. Vai trò
Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần
kinh nhƣ morphin, codein, cocain,… Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp
chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013).
1.1.5.3. Carbohydrate
a. Khái niệm
Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật.
Đƣợc cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n,
thƣờng m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lƣợng carbohydrate ở
thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn
sinh trƣởng và phát triển.
- Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận nhƣ củ, quả, lá, thân, cành.
- Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,.. (Phùng Trung Hùng và ctv,
2013).
b. Phân loại
Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate đƣợc chia làm ba nhóm lớn:
monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide (Phùng Trung
Hùng và ctv, 2013).
Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate

23. Đồ án tốt nghiệp
11
c. Vai trò:
Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng:
- Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lƣợng cho các quá trình sống.
- Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican...).
- Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide).
- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phƣơng Hà
Linh Linh, 2011).
1.1.5.4. Glycoside
a. Khái niệm
Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng
(glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv
(2011). Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị
phân huỷ khi có nƣớc dƣới ảnh hƣởng của các enzyme (men) có chứa trong cây.
Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây
là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycosides phụ thuộc vào phần aglycon
còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hòa tan
trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010).
b. Phân loại
Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết
giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011).

24. Đồ án tốt nghiệp
12
Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside
c. Vai trò
Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có vai
trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra một số chất
kháng khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt nhƣ độc tố Solanine ở khoai tây (Trần
Trƣờng Hận, 2010).
1.1.5.5. Saponin
a. Khái niệm
Saponin là một glycoside tự nhiên thƣờng gặp trong nhiều loài thực vật.Dƣới tác
dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponins bị thuỷ phân thành
genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngô Văn Thu, 2011).
Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol và
rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm sức
căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).
b. Phân loại
Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid
(Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

25. Đồ án tốt nghiệp
13
Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin
c. Vai trò
- Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng).
- Một số saponin có tác dụng chống viêm.
- Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus.
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.
1.1.5.6. Tannin
a. Khái niệm
“Tannin” đƣợc dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch
chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến
thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin đƣợc định nghĩa là những hợp chất
polyphenol có trong thực vật, có vị chát đƣợc phát hiện dƣơng tính với “thí nghiệm
thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất
hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thƣờng gặp chủ yếu trong
thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm.

26. Đồ án tốt nghiệp
14
Tannin tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong
các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân,
kẽm, sắt).
b. Phân loại
Tannin có thể chia thành hai loại chính:
- Tannin thủy phân đƣợc hay còn gọi là tanin pyrogalli (Gallic acid).
- Tannin ngƣng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone).
c. Vai trò
- Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ sâu.
- Tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng.
- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy…(Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012).
1.1.5.7. Amino acid
a. Khái niệm
Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử chứa
cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide
hay polypeptides.Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid, nhóm amino
(-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngoài các nhóm –NH2,
−COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhómchức khác nhƣ: −OH, HS−,
−CO−…
b. Phân loại
Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm. Một trong
các cách phân loại là 20 amino acid đƣợc phân thành 5 nhóm nhƣ sau (Hồ Chí Tuấn,
2009):
- Nhóm 1: Các amino acid có gốc R không phân cực kị nƣớc, thuộc nhóm này có
6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline
(P).

27. Đồ án tốt nghiệp
15
- Nhóm 2: Các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino
acid: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W).
- Nhóm 3: Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dƣơng, thuộc nhóm này có 3
amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H).
- Nhóm 4: Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này
có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine
(N), Glutamine (Q).
- Nhóm 5: Các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2
amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E).
c. Vai trò
Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật:
- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất.
- Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật.
- Tăng khả năng ra hoa và quả.
1.1.5.8. Isoprenoid
a. Khái niệm
Isoprenoid (terpene)là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon đƣợc tạo
thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8.Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ
thông.
b. Phân loại
Phân loại dựa và số đơn vị isoprene cấu thành phân tử
- Sesterterpenoid (5 đơn vị)
- Triterpenoid (6 đơn vị)
- Tetraterpenoid (8 đơn vị)
- Polyterpenoid (n đơn vị)
- Monoterpenoid (2 đơn vị)
- Sesquiterpenoid (3 đơn vị)

28. Đồ án tốt nghiệp
16
- Diterpenoid (4 đơn vị)
c. Vai trò
- Ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thƣ
- Bảo vệ thực vật
- Có khả năng xua đuổi côn trùng
1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật
1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn
Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật,
có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn
thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng
rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn
Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã
đƣợc nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá
trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đƣờng truyền tín hiệu
(Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003).
Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và
một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hƣởng bởi các cơ chế khác (Hình 1.7).

29. Đồ án tốt nghiệp
17
Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)
Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi
khuẩn ở các mức độ khác nhau nhƣ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của
màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy
các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần
cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ
chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ
màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng
điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và
ctv, 2008) cụ thể ở Bảng 1.1.

30. Đồ án tốt nghiệp
18
Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,
1999)
Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế
Phenolic
Phenol đơn
Catechol Phá vỡ màng sinh chất
Epicatechin Phá vỡ vách tế bào
Phenolic acid Cinnamic acid ?
Quinone Hypericin
Liên kết bám dính, tạo
phức hợp với thành tế bào,
làm bất hoạt enzyme
Flavonoid Chrysin Liên kết bám dính
Flavone
- Tạo phức hợp với thành tế
bào
Abyssinone
Khử hoạt tính enzyme
Ức chế phiên mã ngƣợc
HIV
Flavonol ?
Tannin Ellagitannin
Bám dính Protein
Bám dính Adhesin
Ức chếenzyme
Phá vỡ màng sinh chất
Tạo phức hợp với thành tế
bào
Phá vỡ vách tế bào

31. Đồ án tốt nghiệp
19
Tạo phức kim loại-ion
Coumarin Warfarin
Tƣơng tác với DNA nhân
thực (hoạt tính kháng vius)
Terpenoid
Tinh dầu
-
Capsaicin
Phá vỡ vách tế bào
Alkaloid
- Berberine Xen vào thành tế bào hoặc
DNA
Piperine
Lectin
Polypeptide
- Mannose-
specific
agglutinin
Khóa sự kết hợp của virus
hoặc hấp phụ
Falxatin Hình thành cầu Disulfide
Polyacetylen
- 8s-heptadeca-
2(Z),9(Z)-
diene-4,6-
diyne-1,8-diol
?
1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật
1.2.3.1. Hợp chất phenolic
Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là
sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm
sulfhydryl hoặc thông qua sự tƣơng tác không đặc hiệu của các chất này với protein.
Quinone
Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất
màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trƣng cao.

32. Đồ án tốt nghiệp
20
Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein,
thƣờng dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng kháng
khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào,
polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền
không thể sử dụng đƣợc cho các vi sinh vật.
Ngƣời ta nhận thấy rằng anthraquinone đƣợc lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ
Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium
pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với
Pseudomonas pseudomalliae.Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng
chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và
ctv, 2010).
Flavonoid
Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và
có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của
flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế
bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho
thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo
càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).
Catechin là những hợp chất flavonoid đƣợc nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt
trong trà xanh oolong. Qua những nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy trà xanh có hoạt tính
kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella spp., và
các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế
enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S.mutans, cơ chế tác dụng cũng là do khả
năng tạo phức nhƣ đƣợc mô tả ở phần quinone. Hoạt động nghiên cứu gần đây đƣợc
tiến hành trên cơ thể chuột. khi chuột đƣợc cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0,1%
catechine có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của chuột do S.mutans gây ra
giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

33. Đồ án tốt nghiệp
21
Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng
ức chế virus (RSV). Ngƣời ta đã tìm ra hoạt tính và phƣơng thức hoạt động của
quercetin, naringin, hesperetin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus type
1 (HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ
hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phƣơng thức khác nhau.
Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chếsự lây
nhiễm nhƣng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV-1, quercetin là
chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm cácloại bệnh do vi sinh vật gây ra.
Ngƣời ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hƣởng rất
quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng.
Tannin
Một trong những tính chất rất đặc trƣng của tannin là tạo phức với các protein
thông qua các liên kết không đặc hiệu nhƣ liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị.
Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các
protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide…
Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông đƣa
ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này,
tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng
khuẩn của tannin đƣợc tăng cƣờng bởi tia cực tím (UV) ởmức ánh sáng kích hoạt bƣớc
sóng khoảng 320 đến 400nm.Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng tannin
có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngƣợc quá trình phiên mã DNA của virus.
1.2.3.2. Nhóm alkaloid
Solamargine
Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và
Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây
bệnh tiêu chảy. Thƣờng có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum) và các

34. Đồ án tốt nghiệp
22
alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải
HIV.
Berberine
Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng,
hoàng bá, hoàng liên… có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp.,
Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần
đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều vi
khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số
nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh.
Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do
berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chínhđiều này
mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này.
Nhóm terpenoid và tinh dầu
Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và
động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh
dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế đƣợc vi khuẩn. Đồng thời,
các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế đƣợc
HIV. Cơ chế tác động của tecpen chƣa đƣợc khẳng định rõ ràng, nhƣng đƣợc suy đoán
là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic.
Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu
thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogene. Theo Mendoza, việc tăng
nhóm ƣa nƣớc (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng
khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện
diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria
monocytogenes. Dầu húng quế, một thảo dƣợc đƣợc thƣơng mại hóa, đƣợc xác định là
hiệu quả kháng khuẩn tƣơng đƣơng với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tôn
Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

35. Đồ án tốt nghiệp
23
1.3. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh
1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli
Đặc điểm hình thái
E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau
trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp
(ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm).
Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di
động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012).
Trực khuẩn E.coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150
C
– 400
C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370
C với pH = 7,2 – 7,4 ; phát triển đƣợc ở pH
= 5,5 – 8,0 (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 1997).
Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E.coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để
lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi
khuẩn lắng xuống đáy ống.
Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng,
không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm.
Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi
Khả năng gây bệnh
E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu
hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân

36. Đồ án tốt nghiệp
24
chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm
màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ
dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong
bỏng.
Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên
ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập
vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu
quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp
hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hải Hòa, 2012).
E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải
cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ
mới gây chết đƣợc súc vật.
1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.
Đặc điểm hình thái
Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thƣớc trung bình 3,0 x 0,5
µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có khả năng di
động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005).
Là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông
thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42o
C và pH từ 6 – 9 , nhƣng điều kiện
thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37o
C ở pH 7,2.
Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trƣờng
đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có
màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong
hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa.

37. Đồ án tốt nghiệp
25
Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp.
Khả năng gây bệnh
Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay
còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy, co thắt dạ
dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nƣớc (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có thể tiến triển
từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thƣờng kéo dài trong vòng từ 4 –
7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và
gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013).
Salmonella spp. còn gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S.typhii gây thƣơng tổn
mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt
kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạch… Các bệnh khác (không phải thƣơng hàn)
thƣờng là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S.typhimurium,
S.enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có
thể gây nên các tổn thƣơng ở ngoài đƣờng tiêu hóa nhƣ viêm màng não, thể nhiễm
trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi...
Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể
bệnh: bệnh thƣơng hàn, phó thƣơng hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc,
S.choleraesuis chủng Kunzendorf và S.typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó
thƣơng hàn cho heo, S.enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thƣơng hàn

38. Đồ án tốt nghiệp
26
cho bò, bê, S.abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S.gallinarum – pullorum gây
bệnh thƣơng hàn cho gà (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.
Đặc điểm hình thái
Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đƣờng ruột) là trực khuẩn gram
âm, nhỏ, dài với kích thƣớc 0.5-0.6 x 1 – 3 µm, không sinh bào tử, không di động,
thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhƣng phát triển tốt trong điều kiện
hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370
C. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều
kiện lý hóa khắc nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl
hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử
trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur.
- Trong môi trƣờng lỏng, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục
đều môi trƣờng.
- Trên môi trƣờng đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đƣờng kính khoảng 1mm,
tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều.
Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp.
Khả năng gây bệnh
Nhiễm khuẩn Shigella spp. thƣờng chỉ giới hạn ở đƣờng tiêu hóa. Chỉ cần số lƣợng
nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp biểu mô

39. Đồ án tốt nghiệp
27
niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết.
Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ngày và
kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thƣờng
kéo dài dƣới 7 ngày (Nguyễn Văn Minh Hoàng, 2013).
Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết
mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết,... theo
Nguyễn Đức Hiền (2013).
1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp.
Đặc điểm hình thái
Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dƣơng, có kích thƣớc ngắn (0,4 – 0,5 x
0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy không acid, không sinh nha
bào. Ở 200
C chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella),
nhƣng sự di dộng không quan sát đƣợc ở 370
C. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt
buộc và có thể sinh trƣởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 450
C (tối
ƣu là 30 – 360
C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng có thể mọc ở
pH 9,6, nhƣng đạt điều kiện tối ƣu ở pH hơi kiềm hoặc môi trƣờng trung tính (Nguyễn
Hữu Liêm, 2013).
Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp.

40. Đồ án tốt nghiệp
28
Khả năng gây bệnh
Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở ngƣời với các triệu chứng rất nguy
hiểm và có tỷ lệ tử cong cao. Ngƣời nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ
nhƣ sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L.monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở
trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô cấy ghép và có hệ
miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi ngƣời mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu
chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống nhƣ bị cảm cúm nhƣng bào thai và thai
nhi sẽ bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ
sinh hay nhiễm trùng.
Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp .tác động chuyên biệt
trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ viêm não, viêm màng não, nhiễm
trùng máu, sảy thai, đẻ non.
1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.
Đặc điểm hình thái
Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn
Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thƣớc 0,3 –
0,5 x 1,4 – 2,6 µm.Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên
mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là
vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trƣờng bổ sung muối (NaCl) và không
sinh H2S.
Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp.

41. Đồ án tốt nghiệp
29
Khả năng gây bệnh
Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm
sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ
dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài phân lỏng có
mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu
không điều trị kịp thời.
Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày,
đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013).
Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã đƣợc công bố là tác nhân gây
bệnh nghiêm trọng ở một số đối tƣợng thủy sản (Austin & Austin 1993).Một số bệnh ở
thủy sản do Vibrio spp. gây ra nhƣ sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết
lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh khác nhƣ: gây
chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đƣờng ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp
xác…(Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp.
Đặc điểm hình thái
Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình thẳng, hai
đầu tròn, dài 1 – 5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm mao đơn
cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn.
Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ phát
triển tối ƣu ở 370
C, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 50
C – 420
C. Trên môi trƣờng đặc,
thƣờng có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù
xì, lồi.

42. Đồ án tốt nghiệp
30
Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas
Khả năng gây bệnh
Pseudomonas spp. gây bệnh cho ngƣời: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có
điều kiện nhƣ khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi
dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết
thƣơng hở,…
Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi,
chúng gây bệnh toàn thân nhƣ nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc
nhiễm trùng đƣờng tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não,
viêm tủy xƣơng…
Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm
vào màng bụng chuột 0,1 – 0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ,
những con chuột sống dần dần đƣợc hình thành những ổ mủ.
1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp.
Đặc điểm hình thái
Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn gram
dƣơng thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đƣờng kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh
trƣởng và phát triển là 30 – 350
C.

43. Đồ án tốt nghiệp
31
Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trƣờng, không chịu
đƣợc sự thành trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. Không sinh độc tố.
(Dƣơng Văn Sĩ, 2010).
Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp.
Khả năng gây bệnh
Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thƣờng của
ngƣời, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ
thể ngƣời khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu
dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thƣờng gây nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, gây
nhiễm trùng vết thƣơng (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn
huyết.
1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus
Đặc điểm hình thái
Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ
lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay
thành từng chuỗingắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí
hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả

44. Đồ án tốt nghiệp
32
năngsinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch
nhiều (nhiệt độ từ 100
C – 450
C).
Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Khả năng gây bệnh
Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây
bệnh. Staphylococcus aureus cƣ trú trên ngƣời và động vật, có trong sữa bò bị bệnh,
thịt heo tƣơi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất.
Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc
(khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn nhƣ tổ chức lympho,
biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra Staphylococcus aureus
còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng nhƣ: nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết
thƣơng hậu phẩu, tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng.
Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ
cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột.

45. Đồ án tốt nghiệp
33
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian
2.1.1. Địa điểm
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực
phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM.
2.1.2. Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Nguồn mẫu
Mẫu cây Bồ công anh (cành, lá) đƣợc thu ở vƣờn trồng tại tỉnh Thái Bình.
2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị
Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn đƣợc cung
cấp bởi Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm:
- Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7.
- Nhóm vi khuẩn Salmonella: S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, S.dublin.
- Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri.
- Nhóm vi khuẩn Vibrio: V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi,
V.cholerae.
- Nhóm vi khuẩn Listeria: L.monocytogenes, L.innocua.
- Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa.
2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng
Môi trường nuôi cấy và tăng sinh vi khuẩn
- Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
Hóa chất

46. Đồ án tốt nghiệp
34
- H2SO4 đậm đặc, HCl đậm đặc, chloroform.
- Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol.
- Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium.
- NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%.
- Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff,
Hager, Wagner.
- Hồ tinh bột, KNO3/ KI 0,001N
- NH4OH, NH4OH 10%
- DPPH
Dung môi
- Ethanol 70 %, 96% (Việt Nam).
- Methanol 85%.
- Nƣớc cất.
- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc).
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ
- Đĩa petri
- Ống nghiệm lớn, nhỏ
- Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml
- Ống đong 100 ml, 250 ml, 500
ml
- Pipet 1 ml, 10 ml
- Ống ly tâm ependoff 2 ml
- Bình môi trƣờng 250 ml, 500 ml,
1000 ml
- Que cấy trang
- Đèn cồn
- Ống trụ kim loại (d= 6 mm)
- Thƣớc đo
- Bông thấm và bông không
thấm nƣớc
- Đũa thuỷ tinh
- Các loại đầu típ
- Micropipette 100 µl, 1000 µl
- Eppendorf
- Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao
chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp
gấp, muỗng, dao, thun,...

47. Đồ án tốt nghiệp
35
Thiết bị
- Autoclave (Huxky Đài Loan)
- Tủ ấm 300
C, 370
C (Memmert
mermany)
- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
- Máy cô cách thủy
- Máy đo UV – VIS (Hach)
- Tủ hút (Fumehood)
- Cân phân tích (Orbital
Germany)
- Bếp từ (Billy – England)
- Máy nƣớc cất (Branstead USA)
- Thiết bị cô quay chân không.
- Tủ an toàn sinh học (Biosafety
cabinet)
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu
Mẫu bồ công anh đƣợc thu một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá mang đi rửa
sạch và sấy ở 400
C đến khi có đƣợc khối lƣợng không đổi.
Mẫu sau khi đƣợc sấy khô tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lƣợng
bột mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói trong túi nhựa và lƣu trữ trong một bình kín hơi
dùng để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm.
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật
Mẫu bồ công anh đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp ngâm kiệt ở nhiệt độ thƣờng
và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết
bằng các thiết bị cô thích hợp.
Nguyên tắc: sử dụng phƣơng pháp ngâm kiệt, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong
lƣợng lớn dung môi ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan
vào dung môi.
Cách tiến hành: ngâm một lƣợng bột mẫu vào lƣợng lớn dung môi (tỷ lệ 1:20
(w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc ngâm trong khoảng 24h,
thỉnh thoảng đƣợc lắc đều sau đó đem đi lọc, ép bã thu dịch chiết. Tiếp tục cho thêm
lƣợng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi
dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết đƣợc cô đặc, thu hồi cao bằng

48. Đồ án tốt nghiệp
36
phƣơng pháp cô cách thủy ở 70o
C (đối với dung môi nƣớc). Cao chiết đƣợc bảo quản ở
nhiệt độ 40
C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể
giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá
trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy
các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để
khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và
làm tan nhanh nhƣ glycerol.
Cách tiến hành: Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích
hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu
cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở
nhiệt độ lạnh -150
C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị
Nhằm hoạt hoá các vi khuẩn đƣợc giữ giống phát triển lại bình thƣờng vì chúng có
thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.
Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh
dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh
dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật
mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa
vi sinh vật và môi trƣờng.
Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn
chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng
cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB trong điều kiện
vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).

49. Đồ án tốt nghiệp
37
Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD ở bƣớc
sóng 600nm.
Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland):
Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109
(cfu/ml)
2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai
trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ
thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật.
Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp
vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi sinh vật trong mẫu.
Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml
dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1
. Tiếp tục từ ống
nghiệm 10-1
hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta
đƣợc nồng độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần
thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu

50. Đồ án tốt nghiệp
38
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp
khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phƣơng pháp của
Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều
kiện của phòng thí nghiệm.
Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác
động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi
khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó,
đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng
ức chế (mm).
Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi
trƣờng lỏng TSB, lắc qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ
106
cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng
đƣờng kính 6 mm.
Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lƣợng cao chiết trong Dimethyl
Sulfoxide (DMSO) 1% theo nồng độ yêu cầu 200 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao
chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để
dịch cao đƣợc khuếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370
C
trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm)
trên đĩa thạch. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết
Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các
phản ứng hóa học theo các phƣơng pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã đƣợc
chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lƣơng Văn Tiến và ctv, 2015).
Cách tiến hành: Cao chiết đƣợc đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành
lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần
hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trƣng.

51. Đồ án tốt nghiệp
39
2.3.7.1. Định tính carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2 –
3 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và
đọc kết quả. Kết quả đƣợc xem là dƣơng tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím.
Thử nghiệm Fehling: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lƣợt 0,5
ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả.
Kết quả dƣơng tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O.
Thử nghiệm Barfoed: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml
thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết
quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013).
2.3.7.2. Định tính alkaloids
Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt
thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi quan sát đƣợc kết tủa màu
trắng đục tạo thành.
Thử nghiệm Dragendorff: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài
giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa
màu vàng cam.
Thử nghiệm Hager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml
thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng.
Thử nghiệm Wagner: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 1 ml
thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi hình thành kết tủa
màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013).
2.3.7.3. Định tính saponin
Thử nghiệm tạo bọt: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2
ml nƣớc cất vào lắc mạnh. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn
định (Abba và ctv, 2009).
2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside

52. Đồ án tốt nghiệp
40
Thử nghiệm Legal: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml
pyridine hoặc 0,5 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 2 – 3 giọt NaOH 10% vào và
đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.
Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5
ml acid acetic glacial và 0,5 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 0,5 ml H2SO4 đậm đặc vào
và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic
(Yadav và ctv, 2013)
2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside
Thử nghiệm Bontrager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml
dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, bổ
sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống nghiệm
khác, tiếp tục thêm 1 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dƣơng
tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009).
2.3.7.6. Định tính flavonoid
Thử nghiệm Alkaline reagent: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho
vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy
ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối
chứng làm tƣơng tự, thay NaOH 10% thành nƣớc cất). Kết quả dƣơng tính nếu xuất
hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có
thực hiện ống đối chứng dƣơng thay NaOH thành nƣớc cất.
Thử nghiệm Shinoda: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột
Magnesium vào, cho từ từ vài giọt HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó
thêm 3 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi mẫu có xuất hiện
cam, hồng, đỏ đến tím,..
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó
thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi
ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012).

53. Đồ án tốt nghiệp
41
2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol
Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào
1.5 ml chì acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa
trắng trong ống nghiệm.
Thử nghiệm Gelatin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt
gelatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trắng.
(Mamta và ctv, 2012).
2.3.7.8. Định tính tannin
Thử nghiệm ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1
ml NaCl 10%, cho 2 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng
tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh (Abba và ctv, 2009).
Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1
ml NaCl 10%, cho 2 giọt chì acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi
ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu vàng (Mamta và ctv, 2012).
2.3.7.9. Định tính steroid
Thử nghiệm Salkowski: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 1
ml chloroform và nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2
lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: ở lớp
dƣới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid.
Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm
thêm 1 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi
đọc kết quả. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: Xuất hiện vòng màu nâu
ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là
triterpenoid (Mamta và ctv, 2012)
2.3.7.10. Định tính amino acid

54. Đồ án tốt nghiệp
42
Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho
vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng
tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013).
2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH
Nguyên tắc: Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl) bằng cách cho hydrogen sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác
định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bƣớc sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm.
Cách tiến hành: Bổ sung 100l DPPH (6mM) và 2800l methanol vào mỗi ống
nghiệm đã chứa 100l mẫu cao chiết tại các nồng độ khác nhau (0-1000g/ml). Ủ 30
phút trong điều kiện không có ánh sáng, sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại
bƣớc sóng 517nm. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của
mẫu. Chứng dƣơng trong thí nghiệm là acid ascorbic (3 mg/ml), chứng âm là nƣớc cất.
Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa đƣợc xác định theo công thức sau:
Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = x 100
Trong đó, ODC : là giá trị mật độ quang OD của đối chứng âm;
ODm : là giá trị mật độ quang OD của mẫu thử.
2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học
2.3.9.1. Định lượng vitamin C
Nguyên tắc: Acid ascorbic là một hợp chất không no có chứa nhóm endiol dễ bị
oxy hóa khử thuận nghịch, bị phá hủy nhanh dƣới tác dụng của các chất oxy hóa và bền
trong môi trƣờng acid.
Cách tiến hành: Cân 10g lá cây bồ công anh, nghiền nhỏ trong dung dịch HCl
1%. Chuyển dịch vào bình định mức 100ml, trích ly và định mức đến vạch bằng dung
dịch HCl 1%. Lắc trộn đều và lọc, ta có dung dịch phân tích.
Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức cho vào erlen, thêm 5 giọt hồ tinh bột và
đem định phân bằng KIO3/KI 0,001N cho tới khi xuất hiện màu xanh.

55. Đồ án tốt nghiệp
43
Tiến hành song song mẫu kiểm chứng thay dịch chiết vitamin C bằng dung dịch
HCl 1%.
Tính kết quả: Hàm lƣợng vitamin C trong mẫu thí nghiệm đƣợc tính bằng công
thức:
( )
Trong đó:
X: hàm lƣợng vitamin C, mg%
a là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân dịch chiết vitamin C
b là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân mẫu kiểm chứng
100: thể tích bình định mức
0.088: số mg acid ascorbic tƣơng ứng với 1ml dung dịch KIO3/KI 0,001N
m : là khối lƣợng mẫu nguyên liệu, g
2.3.9.2. Định lương Alkaloid
Nguyên tắc: Định lƣợng alkaloid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của
Harbone (1973). Tách alkaloid ra khỏi nguồn nguyên liệu, do có tính kiềm nên trong
thực vật alkaloid thƣờng tồn tại ở dạng muối và acid hữu cơ. Để chiết rút các alkaloid
trong nguyên liệu thƣờng sử dụng các dung dịch đã đƣợc acid hóa. Sau đó làm bay hơi
một phần dung môi, muối alkaloid trong môi trƣờng acid tiếp tục đƣợc trích ly bằng
dung môi hữu cơ, làm bay hơi dung môi thu đƣợc alkaloid.
Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 40ml
acid acetic 10% và để yên trong 4 giờ sau đó cô cách thủy ở 700
C đến khi còn ¼ thể
tích.
Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc vào cho đến khi tạo tủa. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng
NH4OH 10% rồi đem đi sấy đến khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính toán
hàm lƣợng alkaloid nhƣ sau:
( )

56. Đồ án tốt nghiệp
44
Trong đó, X: Hàm lƣợng alkaloid có trong mẫu (%)
ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu alkaloid (g)
mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g)
m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g)
2.3.9.3. Định lượng Flavonoid
Nguyên tắc: Định lƣợng flavonoid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của Bohm
và Kocipai – Abyazan (1994) (Mir và ctv, 2013). Chiết xuất và tinh chế thành phần
flavonoid trong dƣợc liệu. Ứng dụng đối với nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít
tạp chất. Ƣu điểm là thực hiện nhanh, để thực hiện tuy nhiên sai số mắc phải lớn.
Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 25ml
dung dịch methanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy lắc 150vòng/phút trong
1 giờ. Lọc thu dịch, sấy đến khi khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính hàm
lƣợng flavonoid nhƣ sau:
( )
Trong đó, X: Hàm lƣợng flavonoid có trong mẫu (%)
ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu flavonoid (g)
mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g)
m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g)
2.3.10.Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm
SAS. với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phƣơng sai One-way
ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê.
2.4. Bố trí thí nghiệm

57. Đồ án tốt nghiệp
45
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Mẫu Bồ công anh
Xử lý mẫu
Tách chiết và thu hồi cao
Cao chiết nƣớc Bồ công anh
Khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của cao
Khảo sát hoạt tính
kháng oxy hóa của cao
Xác định sự hiện diện
một số thành phần hóa
học của cao
Định lƣợng một số
thành phần của cao
Đánh giá kết quả