đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC
ĐẦU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT
SỐ CAO CHIẾT TỪ PODOCARPUS SP.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th S. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Vân
MSSV: 1151110422 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong đồ án này do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt. Mọi tham khảo dùng trong đồ án này đều
được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Mọi
sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, hay gian trá, tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng Vân

LỜI CẢM ƠN
Tôi chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ
Chí Minh, thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận
tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói
chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng
nghiên cứu. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy.
Cuối cùng em xin cảm ơn thầy cô ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh
học- Thực phẩm- Môi trường, cùng bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để
em hoàn thành đồ án của mình.
Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng Vân

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................2
MỤC LỤC ..............................................................................................................................i
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG...................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................vi
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................1
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................2
4. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................................3
1.1. Giới thiệu Podocarpus sp...................................................................................3
1.1.1. Phân loại......................................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái......................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học............................................................3
1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp. ..................................................................4
1.2. Thành phần hóa học của thực vật....................................................................5
1.2.1. Carbohydrate ...............................................................................................5
1.2.2. Amino acid...................................................................................................5
1.2.3. Alkaloid........................................................................................................6
1.2.4. Glycoside......................................................................................................7
1.2.5. Steroid..........................................................................................................8
1.2.6. Tannin..........................................................................................................8
1.2.7. Isoprenoid (Terpene)...................................................................................9
1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật .............................................10
1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn .......................................10
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn .................................................................................10
1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật...................................................11
1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC.................................................13
1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình ...........................................................14

ii
1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy........................................................14
1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da................................................19
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................22
2.1. Địa điểm và thời gian ......................................................................................22
2.1.1. Địa diểm.....................................................................................................22
2.1.2. Thời gian....................................................................................................22
2.2. Vật liệu..............................................................................................................22
2.2.1. Nguồn mẫu................................................................................................22
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ......................................................................................22
2.2.3. Hóa chất, môi trường................................................................................22
2.2.4. Dụng cụ, thiết bị........................................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................24
2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu.....................................................24
2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn......................24
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống.......................................................25
2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu ..........................................................................25
2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)
26
2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC............................26
2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học ...........................................27
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................27
2.4. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................28
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách
chiết cao...................................................................................................................29
2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với
các dung môi khác nhau.........................................................................................33
2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao
chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng
thạch (agar well diffusion method)........................................................................36
2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp.................39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................46
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao ..46
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp. với
các dung môi khác nhau............................................................................................47
3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. ............................................................................................................54
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp..................................56

iii
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................58
4.1. Kết luận ............................................................................................................58
4.2. Đề nghị..............................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................60

iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli
TSB: Trypton Soya Broth
TSA: Trypticase Soya Agar
MIC: Minimal Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu
DMSO: dimethysulfoside

v
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng
vi sinh vật....................................................................................................................52
Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. ...........................................................................................................54
Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. ......56

vi
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus..........................................................4
Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi............................................14
Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân.......................................15
Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella ..........................................................................16
Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae..........................................................................17
Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử.................18
Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa .........................................................19
Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus...................................................20
Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis ...............................................................21
Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu ....................................................................................24
Hình 2. 2.Quy trình chung..........................................................................................28
Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao
.....................................................................................................................................29
Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o......................................................30
Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o.....................................................31
Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o.....................................................31
Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn...........33
Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .................................................35
Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. ...........................................................................................................36
Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC..........................................................................38
Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7 .........................................................38
Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học..................................................39
Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin.....................................................40
Hình 2. 15 Thử nghiệm flavonoid..............................................................................42
Hình 2. 16 . Thử nghiệm phenolic .............................................................................43
Hình 2. 17 . Thử nghiệm tannin .................................................................................44
Hình 2. 18 . Thử nghiệm steroid ................................................................................45
Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi ...................46
Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml.............................................................47
Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau
và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml ....................................................................48
Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml............................................................49
Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml................................................................50
Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây
bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml....51

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ ngày xưa, con người đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để
phục vụ vào cuộc sống hằng ngày như làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa
bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban
tặng cho con người. Những thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo
thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng,
cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm
thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn
tồn tại cho tới ngày nay.
Xã hội ngày càng phát triển thì tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng thì
việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có hiệu quả cao đồng thời không có tác
dụng phụ là điều hết sức cần thiết. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà
khoa học nghiên cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có
trong các bài thuốc dân gian. Bên cạnh đó, các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa
trở nên rất phổ biến và phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng
sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng
thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn
giúp ta tạo ra một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số
bệnh thông thường.
Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của
một số cao chiết từ Podocarpus sp.”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi
khác nhau

2
Xác định thành phần hóa học của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi
khác nhau.
3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá ảnh hưởng của một số dung môi đến hiệu suất thu hồi từ
Podocarpus sp.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số dung môi từ Podocarpus sp.
Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC của Podocarpus sp.
Xác định thành phần hóa học của một số dung môi từ Podocarpus sp.
4. Phạm vi nghiên cứu
Các khảo sát thực hiện trên dung môi ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol
90%, nước, methanol 75%.
Chỉ khảo sát cây thuốc với mức độ chi Podocarpus sp.
Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu Podocarpus sp.
1.1.1. Phân loại
Giới : Plantae
Ngành: Pinophyta
Lớp : Pinopsida
Bộ : Pinales
Họ : Podocarpaceae
Chi : Podocarpus
Tên tiếng Việt: Thông lông gà; Thông nàng; Bạch tùng; Mạy hương; Savat;
Songo; Nori; Tran; Ngo ri; Sri; Vra panh; Ca do; O ri
Có khoảng 105 loài trong chi này. Dạng sống chủ yếu của thực vật trong chi
này là cây gỗ thường xanh và cây bụi. Chi này có 2 phân chi là là Podocarpus và
Foliolatus.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Bạch tùng là loài cây gỗ có kích thước lớn, thân tròn đều, dáng thân thẳng
đẹp, cao đến 30 m và đường kính 50 - 60 cm. Vỏ thân xám trắng, vỏ bên trong màu
đỏ sáng với nhựa nâu, dát gỗ màu kem. Thân cành lan rộng và các nhánh thấp hơn
thường rủ xuống. Nhựa màu đỏ-cam, thơm, trên cây non, lá mọc xếp thành hai dãy
như lông chim, dài khoảng trên dưới 1 cm, còn trên cây già, lá hình vẩy nhỏ, đầu
nhọn. Tán rậm màu xanh đậm. Hạt hình trứng, dài 0,5-0,6 cm, bóng.( Vũ Văn
Dũng).
1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học
Chi này có 2 phân chi là Podocarpus và Foliolatus
Phân chi Podocarpus thường thấy ở các khu rừng thuộc Tasmania, New
Zealand, nam Chile, một vài loài (nhưng hiếm thấy) ở vùng cao nguyên nhiệt đới

4
châu Phi và châu Mỹ. Phân chi Foliolatus thường thấy phân bố tự nhiên ở châu Á
và châu Úc. Ở Việt Nam, cây mọc ở rừng nhiệt đới ẩm thường xanh, giữa các độ
cao 300 - 2400 m. Phân bố rải rác ở một số nơi, như đã gặp ở vùng Quảng Ninh
(Hoành Bồ), Lào Cai (Sa Pa), Nghệ An (Pù Mát), Quảng Bình, Quảng Trị, Khánh
Hoà và Lâm Đồng. Cây còn mọc ở một số nơi vùng Tây Nguyên như Gia Lai, Kon
Tum và Đắc Lắc. Phân bố của loài rất thưa thớt, không tìm thấy cây mọc thành
quần thụ hoặc thành đám, tái sinh tự nhiên chủ yếu ở chỗ trống, ven đường đi. Gây
trồng khó và sinh trưởng chậm. Bạch tùng đã được trồng thử tại Đà Lạt, song sắc lá
màu vàng chứng tỏ sinh trưởng kém. Một số cây con cũng đã được trồng thử tại
Mang Linh trong những năm vừa qua. Cây mọc chậm, sống lâu, ưa sáng, lúc nhỏ
cần che bóng (Vũ Văn Dũng, 1996).
Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus
1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp.
Một số loài Podocarpus được sử dụng trong y học cổ truyền cho các bệnh
như sốt, ho, viêm khớp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục. Một loại thuốc hóa
trị liệu được sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu được làm từ Podocarpus. Một số
loài Podocarpus được trồng làm cây vườn, hoặc hàng rào, thường cho tán lá xanh,
bao gồm P.macrophyllus, dương xỉ, hoặc P.kusamaki, P. salignus từ Chile,
và P. nivalis, cây bụi đỏ cho trái nhỏ hơn. Gỗ bạch tùng đẹp, màu vàng nhạt hay
màu nghệ, thớ mịn, có giá trị, dễ gia công chế biến, được khai thác mạnh ở khắp nơi

5
để dùng làm gỗ xây dựng và trần nhà, sàn nhà. Tỷ trọng đạt 0,56. Không thuộc loại
gỗ bền, tốt nhưng đẹp và hiếm nên vẫn được ưa dùng.
1.2. Thành phần hóa học của thực vật
1.2.1. Carbohydrate
1.2.1.1. Khái niệm
Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O.
Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong
bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở
thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ.
1.2.1.2. Tính chất
Carbohydrate có thể chia thành 3 nhóm:
- Monosaccharide: glucose, fructose
- Disaccharide: saccharose, lactose, maltose
- Polysaccharide: tinh bột, cellulose
Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng
nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể
xuất hiện tương đối nhanh trong máu.
1.2.1.3. Vai trò
- Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật
- Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,…)
- Bảo vệ (Mucopolysaccharide)
- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể).
1.2.2. Amino acid
Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức
chung: (H2N)x – R – (COOH)y

6
Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ
tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ
200 – 3000C.
1.2.2.3. Vai trò
Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các
loại protein của cơ thể sống
Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật
Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật
Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013).
1.2.3. Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino
acid, đa số có nhân dị vòng
Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như
base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất
yếu như caffein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có
phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản
ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.
Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó bằng
những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi
định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để
lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp.
Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.
Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.
1.2.3.3. Vai trò

7
- Alkaloid co tác dụng diệt khuẩn
- Tác động lên hệ thần kinh
- Hạ huyết áp
- Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011)
1.2.4. Glycoside
Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp
chất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường. Phần đường của
glycoside gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin.
Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường
Glycoside là dạng tinh thể không màu.
Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì
vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme
(men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid
hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của
một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong
glycoside tim). Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ
khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các
aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy. Do đặc tính
dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường
gặp nhiều khó khăn.
Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác
dụng của chúng.

8
1.2.5. Steroid
Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của
bốn vòng cycloalkane được nối với nhau
Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng
hợp
Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel.
1.2.5.3. Vai trò
Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay,
người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được
sử dụng trong y học.
Thường dùng làm các thuốc kích thích (Pedro Aqueveque và ctv, 2005).
1.2.6. Tannin
Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết
bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và
alkaloid)
1.2.6.2. Đặc điểm
Tannin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn,
glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.
Tannin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng
chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tannin tủa bông trắng với dung dịch gelatin.
Tannin tủa với alkaloid, muối kim loại nặng như ch́ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt.
Với muối sắt những tannin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ

9
khác nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu - nhỏ
muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tannin).
1.2.6.3. Vai trò
Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu
Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng
Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Katie E. Ferrell và ctv, 2006).
1.2.7. Isoprenoid (Terpene)
Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo
thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8. Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn
xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen.
Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành
các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen.
Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu trúc mạch hở,
mạch vòng.
Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo
mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh.
Terpene hường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa
tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol.
1.2.7.3. Vai trò
Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa.
Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực
phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu .
Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoid đa dạng của

10
các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các
chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene. (Đỗ Tất Lợi, 2004)
1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật
1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn
Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật
có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở
mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của
vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc
hiệu với một nồng độ rất nhỏ.
Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid,
flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010).
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn
Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: tác động lên quá trình
tổng hợp vách tế bào làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp
suất thẩm thấu.
Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): cơ chế làm
mất chức năng của màng, các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với
receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính
xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn
cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm
refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành
mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA
gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình

11
nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic
acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm
ức chế quá trình tạo acid nucleic (Amoros và ctv, 1992).
1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật
1.3.3.1. Alkaloid
a. Solamargine
Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum
khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây
nhiễm khi đã mắc phải HIV.
Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên
quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.
b. Berberine
Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn,
nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit. Ngoài ra có còn chống
lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng
khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do
khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các
nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi
khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số
thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra
bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.
1.3.3.2. Terpenoid và tinh dầu
Các loại terpenoid tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng
hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic. Phá vỡ vách tế
bào. Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động
vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu

12
có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Các acid
betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được
HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện
diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria
monocytogenes.
1.3.3.3. Phenol đơn và acid phenolic
Phenolic được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp
chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự
tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein.
a. Quinone
Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân
trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó
khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn.
Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở
thành tế bào và các enzyme trên màng.
b. Tannin
Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein
chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin
(Hisanori Akiyama và ctv, 2001).
c. Flavonoid
Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức
với thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế
bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn
khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố
đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng
hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của
vi khuẩn (Cushnie T. P và Lamb A. J, 2006).

13
1.3.3.4. Lectin và polypeptide
Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh
vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật
chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi
chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất.
1.3.3.5. Saponin
Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae.
Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn (Michał
Arabski và ctv, 2012).
1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimal Inhibitory concentration) là nồng độ
thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nồng
độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định.
1.3.4.2. Cách xác định
Muốn biết vi khuẩn nhạy với kháng sinh ở nồng độ chính xác là bao nhiêu, ta
phải làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp. Kháng sinh có thể
được pha loãng với phương pháp:
- Agar well diffusion method
- Disc diffusion method
Ta có thể xác định MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự
tăng trưởng của vi khuẩn, quan sát được bằng mắt trần

14
1.3.4.3. Ý nghĩa
Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất
của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi
trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt
đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng
mắt thường đã có thể xác định được điều này.
1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình
1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy
1.4.1.1. Escherichia coli
a. Đặc điểm
Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống
ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi
trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường
glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.
Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi
b. Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột.
EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở
trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ.
ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột.
EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào.

15
EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao
Minh Nga, 2014).
1.4.1.2. Shigella
a. Đặc điểm
Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh
ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường
nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và
chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.
Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân
b. Khả năng gây bệnh của một số Shigella
Gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm:
Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga
Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin)
Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố
Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga. (Cao Minh Nga, 2014)
1.4.1.3. Salmonella
a. Đặc điểm

16
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường
tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo
thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển
hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.
Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella
b. Khả năng gây bệnh của một số Salmonella
S. typhi: gây sốt thương hàn
S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp- xe khu trú ở các cơ quan nội
tạng
S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014)
1.4.1.4. Vibrio
a. Đặc điểm
Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và
catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose
trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate.

17
Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae
b. Khả năng gây bệnh của một số Vibrio
Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây
bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết
thương hở và gây nhiễm trùng huyết. Tiếu biểu như Vibrio alginolyticu gây nhiễm
trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc. V.
cholera là tác nhân gây bệnh tả. V. harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài
động vật thủy sinh. Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống
hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính,
nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản
gây ra.
1.4.1.5. Listeria
a. Đặc điểm
Listeria là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có
thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái
cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến.

18
Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử
b. Khả năng gây bệnh
Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây
ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên
bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis
bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh,
người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis.
c. Một số Listeria
Listeria innocua
L. monocytogenes
L. welshimeri… (Jemmi và Stephan, 2006)

19
1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da
1.4.2.1. Pseudomonas aeruginosa
a. Đặc điểm
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều
môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số
những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong
công nghệ sinh học.
Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không
có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng,
không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và
con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ
thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của

20
người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông
thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các
cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử
vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ
thể. Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao
gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên
nhân gây ra viêm chân lông.
1.4.2.2. Staphylococcus aureus
a. Đặc điểm
Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi.
Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm
khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da
được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston A, 1984)
1.4.2.3. Enterococcus feacalis
a. Đặc điểm

21
Enterococcus feacalis: Gram dương,lên men glucose, sinh acid làm giảm pH
môi trường. Không tạo độc tố, và không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen
peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch
máu.
Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis
E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm
trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người.

22
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian
2.1.1. Địa diểm
Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam
Rông, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học- Thực phẩm- Môi
trường, Trường Đại học Công nghệ TpHCM.
2.1.2. Thời gian
Từ tháng 3/2015 đến 8/2015
2.2. Vật liệu
2.2.1. Nguồn mẫu
Cây thuốc dân gian (tự nhiên) thu ở Lâm Đồng gồm lá, thân, cành của cây
Podocarpus sp.
2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị
- 4 chủng Escherichia coli spp.
- 4 chủng Salmonella spp.
- 4 chủng Vibrio spp.
- 3 chủng Shigella spp.
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus
- Enterococcus feacalis
2.2.3. Hóa chất, môi trường
Dung môi DMSO (dimethysulfoside) (Trung Quốc)
Methanol (Trung Quốc)
Ethanol (Trung Quốc)
Cồn (Việt Nam)

23
Nước cất (Việt Nam)
NaCl (Đức)
Môi trường TSA, TSB (Trung Quốc)
Agar (Việt Nam)
2.2.4. Dụng cụ, thiết bị
Tủ cấy vô khuẩn
Autoclave
Tủ ấm, Tủ lạnh
Tủ sấy
Máy lắc
Máy đo OD
Cân điện tử, Cân phân tích
Bếp điện
Phễu
Giấy lọc
Bình tam giác
Pipette loại 100 – 1000 μl.Đầu típ loại 100- 1000 μl
Ống nghiệm
Que cấy trang, que cấy vòng
Đèn cồn, đĩa petri
Parafilm.

24
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu
Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu
Lá, thân, cành của Podocarpus sp. được thu thập từ vùng Lâm Đồng rửa sạch
và phơi khô trong không khí tới khi có trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô
được cắt thành miếng nhỏ và sau đó nghiền thành bột. Bột mẫu được đựng trong túi
nhựa và được lưu trữ trong một nơi kín khí chuẩn bị cho công việc tiếp theo
(Moses, A.G, 2013).
2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn
Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt
hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo
quản.
Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật
phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với
môi trường.
Rửa sạch
Phơi khô đến trọng lượng không đổi
Xay mẫu thành bột mịn
Lá, thân, cành cây
Podocarpus sp.

25
Tiến hành:
- Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh
- Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào chai môi trường
- Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên
làm đục môi trường nuôi cấy)
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống
Hiện nay có 3 cách giữ giống:
- Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho
VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử
dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày.
- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh,
hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch
và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ
-40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian
sử dụng từ 1 – 3 tháng.
- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ - 180C: cách làm tương tự như trên
nhưng bảo quản ở nhiệt độ - 180C. Giống này khi sử dụng để chuyển về -40C
trước khi cấy sang thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 6 tháng – 1 năm.
2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu
Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu
Nguyên tắc: sử dụng dung môi để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ
lực liên kết hóa học
Tiến hành:
- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch
lần 1
- Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2
- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

26
2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương
pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) các hợp chất kháng khuẩn
có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn
chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện
vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ
106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút
đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng
kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ.
Dùng 100 µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa
tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm.
Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng
kháng khuẩn.
2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất
của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi
trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt
đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng
mắt thường đã có thể xác định được điều này.
Phương pháp xác định chỉ số MIC của cao chiết dựa trên phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) tại các nồng độ cao chiết khác
nhau, các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường
agar cũng khác nhau và cùng tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nồng độ cao chiết thấp
nhất mà tại đó chúng bắt đầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng
kháng khuẩn xung quanh giếng thạch gọi là nồng độ ức chế tối thiểu.

27
Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ
106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút
đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng
kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ.
Hút 100µl dịch cao chiết với nồng độ khác nhau, nhỏ vào các lỗ trên đĩa
thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm.
Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng
kháng khuẩn.
2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học
Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ
Podocarpus sp. bằng các phản ứng hóa học với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính
chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm
đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất.
Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Moses
A.G, 2013 và Phani Deepthi Yadav, 2013 bao gồm xác định thành phần hóa học
nhóm Carbohydrate bằng các thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Flehling, thử
nghiệm Barfoed; định tính Alkaloid bằng thử nghiệm Mayer, thử nghiệm
Dragendroff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner; Saponin thử nghiệm Foam;
Cardiac glycoside gồm thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani;
Anthraquinone glycoside thử nghiệm Bontrager; Flavonoid gồm thử nghiệm
alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm ferric chloride; Phenolic gồm thử nghiệm
lead acetate, thử nghiệm gelatin; Tannin gồm thử nghiệm ferric chloride, thử
nghiệm lead acetate; Steroid gồm thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann
Burchard; Amino acid thử nghiệm Ninhydrin.
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm
Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu.

28
2.4. Bố trí thí nghiệm
Hình 2. 2.Quy trình chung
Mẫu Podocapus sp.
Xử lý mẫu
Cao chiết với các
dung môi khác nhau
Đánh giá hoạt tính
kháng khuẩn
Xác định chỉ số MIC
Đọc kết quả
Xác định thành
phần hóa học

29
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết
cao
Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao
Cây Podocarpus sp. thu thập từ Lâm Đồng được đem chọn lựa, rửa sạch,
phơi khô trong không khí đến khi trọng lượng không đổi. Sau đó, mẫu cây được cắt
nhỏ, xay nhuyễn thành bột mịn. Bột cây tiếp tục được ngâm với các dung môi
ethanol, nước, methanol.
Đối với dung môi ethanol (50 %, 70 %, 90 %):
Mẫu Podocapus sp.
Phơi khô, xay mịn
Ngâm trong các dung
môi (tỉ lệ 1:20, w/v)
Lọc
Cô cách thủy(70
0
C)
Thu cao
Ethanol 50 Ethanol 90
Ethanol 70 Cao nước
Cao
methanol
Ethanol 50%
Ethanol 70%
Ethanol 90%
Nước
Ly tâm 4000 v/p
Cô quay 500
C
Ngâm methanol 75% (tỉ
lệ 1:15, w/v)

30
- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi ethanol (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen,
ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1
- Cô cách thủy ở 700C, thu cao.
Đối với dung môi nước:
- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen,
ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 1
- Cô cách thủy ở 700C, thu cao
Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o

31
Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o
Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o

32
Đối với dung môi methanol (tỉ lệ 1:15, w/v) ngâm trong vòng 24 giờ. Sau đó
ly tâm 4000 v/p trong 10 phút thu được dịch lần 1, bã còn lại tiếp tục được ngâm
với methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 trong 24 giờ và ly tâm được dịch lần 2, làm tương
tự thu được dịch lần 3. Dịch ở cả 3 lần được thu hồi và đưa đến trường đại học
Khoa Học Tự Nhiên cơ sở Linh Trung quận Thủ Đức để tiến hành cô quay chân
không ở 500C tới khi thu được thể tích không đổi. Lượng dịch này sau đó được
đông khô ở -200C trong 3 ngày thu được cao chiết methanol. Mỗi nghiệm thức lặp
lại 3 lần.
Tiến hành đánh giá hiệu suất tách chiết cao ở mỗi nghiệm thức bằng công
thức:
H(%) =
M1−M
m
x 100 %
M1 (g): khối lượng cốc sau khi cô mẫu
M (g): khối lượng cốc ban đầu
m (g): khối lượng bột cao ban đầu

33
2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với
các dung môi khác nhau
Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn
Dịch cao (100 mg/ml)
Hút 100µl vào đĩa petri chứa
TSA/ TSA+NaCl 1.5%, trang đều
Lắc 150 vòng/phút,nhiệt độ phòng 18-24h
Cao+DMSO
1%
Tăng sinh trong TSB/ TSB+NaCl 1.5%
Vi sinh vật chỉ thị
Đo OD 600nm
Pha loãng vi sinh vật đạt 106
cfu/ml
Nước muối
sinh lý
Đục lỗ trên môi trường TSA
Nhỏ 100l dịch chiết vào
giếng trên môi trường TSA
Ủ 370
C, 24h
Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính
vòng kháng

34
2.4.2.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường tăng sinh:
- Môi trường TSB: 3g/100ml
- Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl
2.4.2.2. Tiến hành
Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh.
Cấy 20 chủng vi khuẩn vào 20 chai môi trường
Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch
Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm
Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’
Trong đó:
C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD)
V: thể tích cần cấy giống
C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml
V’: thể tích tăng sinh 10ml
 Tính V
Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml
Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý
Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô
Đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang
Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) nồng độ 100- 200 mg/ml cho vào từng
giếng thạch
Ủ 37oC, 24h

35
2.4.2.3. Đọc kết quả
Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao (20 chủng vi khuẩn)
So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh
Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn
chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định
nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).
Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
a) cao chiết ethanol 70% với ETEC
b) cao chiết ethanol 70% với Listeria monocytogenes
c) cao chiết methanol 75% và nước với Vibrio harveyi
d) cao chiết ethanol 50% với Vibrio cholera

36
2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao
chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng
thạch (agar well diffusion method)
Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp.
2.4.3.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường tăng sinh:
- Môi trường TSB: 3g/100ml
- Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl
2.4.3.2. Tiến hành
Chuẩn bị chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh.
Cấy các chủng vi khuẩn vào chai môi trường

37
Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch
Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm
Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’
Trong đó:
C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD)
V: thể tích cần cấy giống
C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml
V’: thể tích tăng sinh 10ml
 Tính V
Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml
Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý
Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô
Dùng ống kim loại đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang
Cao chiết ethanol 70 % được cân và pha loãng trong DMSO 1% theo dãy
nồng độ 100, 50, 25, 12.5 mg/ml
Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) cho vào từng giếng thạch. Mỗi nồng
độ được lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị
Ủ 37oC, 24h.
2.4.3.3. Đọc kết quả
Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao
Đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp đến cao. Nồng độ
MIC được xác định ở đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp nhất xuất hiện vòng
kháng khuẩn.

38
Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC
Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7

39
2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp.
Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học
Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong
khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong
để tiến hành thử nghiệm.
Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan
hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến
hành thử nghiệm.
2.4.4.1. Carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm vào 5-6
giọt thuốc thử Molisch. Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm. Kết
quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách
Mẫu Podocapus sp.
Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1%
Lọc Lọc
Alkaloid
Carbohydrate Saponnin,
cardiac
glycoside,
althraquinone
Flavonoid,
phenolic
compound,
tannin
Steroid,
amino acid

40
Thử nghiệm Feling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1 ml
thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100 mg cao chiết. Đun cách thủy trong 5
phút và đọc kết quả. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO
Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc
thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả: Hình
thành kết tủa màu đỏ gạch
Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin
2.4.4.2. Alkaloid
Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho vài giọt
thuốc thử Meyer. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.
Thử nghiệm Dragendroff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. Nhỏ vài
giọt thuốc thử Dragendroff. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam.
Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc thử
Hager. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng.
Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc
thử Wagner. Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

41
2.4.4.3. Saponin
Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh. Kết quả:
Hình thành bọt ổn định.
2.4.4.4. Anthaquinone glycoside (thử nghiệm Bontrager)
Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml H2SO4 loãng thêm H2O2 hoặc
FeCl3 và đun sôi 30 phút. Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc rồi thêm 3 ml
benzene và lắc đều rồi để yên. Tách lấy lớp benzene và thêm 2 ml ammonia 10% và
quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ.
2.4.4.5. Flavonoid
Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào
vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và
nước cất để so sánh. Thêm vài giọt HCl loãng  mất màu chứng tỏ có sự hiện diện
của flavonoid. Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho
HCl.
Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó cho dịch
mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung 5 ml
cồn 95%. Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện
của flavonoid.
Thử nghiệm Ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt
thuốc thử Ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím

42
Hình 2. 14 Thử nghiệm flavonoid
2.4.4.6. Phenolic
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml
Chì acetate 10%. Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.
Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm một vài gelatin
1% . Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.

43
Hình 2. 15 . Thử nghiệm phenolic
2.4.4.7. Tannin
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và
thêm 2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu
xanh.
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm
2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt Chì acetate. Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng.

44
Hình 2. 16 . Thử nghiệm tannin
2.4.4.8. Steroid
Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml
chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc. Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2
lớp. Đọc kết quả ở mặt phân cách:
- Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol
- Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid
Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm
2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc
theo thành ống nghiệm.Kết quả:
- Xuất hiện vòng màu xanh dương đậm hoặc xanh lá cây ở mặt phân cách:
steroid
- Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid

45
Hình 2. 17 . Thử nghiệm steroid
2.4.4.9. Amino acid
Hút 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin rồi đun
sôi cách thủy trong 5 phút. Kết quả: Xuất hiện màu tím.

46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao
Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi
Dựa vào hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất tách chiết ở các dung
môi khác nhau có sự khác biệt. Hiệu suất tách chiết ethanol 50%, 70%, 90% không
có sự khác biệt, nhưng cao hơn hiệu suất tách chiết của nước, methanol 75% một
cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Kết quả tách chiết cao từ cây Podocarpus sp. cho thấy rằng sử dụng dung
môi ethanol 90% cho hiệu suất tách chiết cao nhất trong số 5 dung môi, hiệu suất
trung bình là 16,99%, kế đến hiệu suất tách chiết ethanol 50% là 16,33%, hiệu suất
tách chiết ethanol 70% là 15,82%, hiệu suất tách chiết nước là 11,99%. Cuối cùng,
hiệu suất tách chiết methanol 75% thấp nhất 11,56%.
Qua kết quả trên có thể thấy hiệu suất tách chiết của dung môi ethanol là tối
ưu. Điều này cho thấy dung môi ethanol hòa tan được nhiều hoạt chất của cây
Podocarpus sp. hơn các dung môi khác.
b
b
b
a a
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol
Hiệu
suất
(%)

47
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp.
với các dung môi khác nhau
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Podocarpus
sp. được trình bày ở hình 3.2.
3.2.1. Nhóm Escherichia coli spp.
Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml
Dựa vào hình 3.2. chúng tôi nhận thấy rằng trong 5 loại cao chiết từ các dung
môi khảo sát chỉ có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 70%, 90% có thể hiện hoạt
tính kháng khuẩn trong nhóm E.coli khảo sát.
Đối với cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. phổ kháng khuẩn của
chúng khá rộng đối với nhóm E.coli spp., chúng kháng được 3/4 chủng E.coli khảo
sát. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện thông qua đường kính
vòng kháng khuẩn cũng mạnh nhất trong các loại cao chiết khảo sát (đường kính từ
8,5 mm đến 13,7 mm). Trong khi đó đối với cao chiết ethanol 90% chỉ kháng 1/4
chủng là Echerichia coli với đường kính vùng ức chế 8,67 mm.
Qua kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy đối với nhóm E.coli spp. cao
chiết ethanol 70% kháng tốt nhất so với các cao chiết bằng các loại dung môi khác.
a
b b
a a
b
b
c
0
5
10
15
20
25
30
35
Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90 Nước Methanol Ciprofloxacin
Đường
kính
vùng
ức
chế
(mm)
Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208
Escherichia coli Enterotoxigenic E.coil-ETEC

48
Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có
ý nghĩa so với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin nồng độ
500g/ml (P < 0,05).
3.2.2. Nhóm Salmonella spp.
Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau
và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml
Dựa vào hình 3.3. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính
kháng khuẩn với 4 chủng Salmonella spp., tuy nhiên các dung môi kháng với mức
độ khác nhau.
Kết quả này cho thấy cao chiết ethanol 50 % có phổ kháng khuẩn khá rộng
3/4 chủng gồm S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, đường kính vùng ức chế 9
mm. Cao chiết ethanol 70% kháng 2/4 chủng Salmonella khảo sát với đường kính
vùng ức chế 7,5 – 8,5 mm. Đối với cao chiết ethanol 90% cũng có phổ kháng khuẩn
rộng 3/4 chủng Salmonella thể hiện qua đường kính vùng ức chế từ 8,33 mm đến 9
mm. Trong khi đó cao chiết nước chỉ ức chế 1 chủng là S.typhii, đường kính vùng
ức chế 8,83 mm. Cao chiết methanol 75% ức chế S.enteritidis, S.typhii,
S.typhimurium, đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao chiết (10
mm).
ab
c
ab
a
b
c
ab a ab a
b
c
a a
b
c
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Nước Methanol Ciprofloxacin
500mg/ml
Đường
kính
vùng
ức
chế
(mm)
Salmonella dublin Salmonella enteritidis
Salmonella typhii Salmonella typhimurium

49
Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy nhóm Samonella spp. dung môi
methanol 75 % là ức chế tốt nhất so với các dung môi khác. Mặc dù vậy khi so sánh
với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của
cao chiết methanol 75% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
3.2.3. Nhóm Shigella spp.
Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml
Dựa vào hình 3.4. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính
kháng khuẩn với nhóm Shigella spp., đặc biệt Shi.boydii, Shi.flexneri bị ức chế bởi
cao chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%.
Đối với cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng đối với nhóm Shigella
spp., ức chế 2/3 chủng Shigella với đường kính vùng ức chế từ 8,83 mm đến 9,83
mm. Cao chiết ethanol 70% chỉ ức chế Shi.flexneri với đường kính vùng ức chế
10,17 mm. Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% ức chế 2/3 chủng Shigella khảo sát và
đường kính vùng ức chế 8,5 - 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ ức chế một chủng duy
nhất là Shi.sonnei với đường kính vùng ức chế 10 mm. Cuối cùng, cao chiết
methanol 75% cũng có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế 2/3 chủng thể hiện qua đường
kính vùng ức chế 9,83 - 10,83 mm.
ab ab b
ab
b
a
ab
c
b
d
0
5
10
15
20
25
30
35
40
500mg/ml
Đường
kính
vùng
ức
chế
(mm)
Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei

50
Kết quả trên cho thấy rằng đối với nhóm Shigella spp., cao chiết ethanol
50%, 90%, methanol 75% đều ức chế tốt, 2/3 chủng Shigella khảo sát. Tuy nhiên,
khi so sánh với kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của
các cao chiết đều thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
3.2.4. Nhóm Vibrio spp.
Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác
nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml
Dựa vào hình 3.5., chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết từ Podocarpus sp.
kháng tất cả các chủng Vibrio khảo sát, đặc biệt chủng Vibrio cholerae bị ức chế
bởi cao chiết ethanol 50%, 70%, methanol 75% và Vibrio parahaemolyticus bị ức
chế bởi cao chiết ethanol 50%, 90%, methanol 75%.
Kết quả này cho thấy cao chiết 50% kháng Vibrio cholera với đường kính
vùng ức chế 8,33 mm, V. parahaemolyticus với đường kính vùng ức chế 8,33 mm.
Đặc biệt, cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn khá rộng với nhóm Vibrio, chúng
kháng được 3/4 chủng. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện qua
đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các dung môi khảo sát (đường kính từ
8,17 mm đến 10,17 mm). Cao chiết ethanol 90% chỉ kháng V. parahaemolyticus với
đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cao chiết nước kháng V.harveyi với đường kính
a
e
a
ab ab
d
bc
d
f
a a
ab
c
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
8mg/ml
Đường
kính
vùng
ức
chế
(mm)
Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus

51
vùng ức chế 14 mm. Đối với cao chiết methanol 75% kháng 2/3 chủng Vibrio khảo
sát, với đường kính vùng ức chế 9,33 mm.
Kết quả này cho thấy đối với nhóm Vibrio spp. hoạt tính kháng khuẩn của
cao chiết ethanol 70% tốt nhất gồm Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae , Vibrio
harveyi. Mặc khác, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một
cách có ý nghĩa so với kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml (p < 0,05).
3.2.5. Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác
Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây
bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml
Dựa vào hình 3.6. nhận thấy tất cả dung môi đều có hoạt tính kháng khuẩn
với các vi sinh vật khảo sát, tuy nhiên mức độ kháng khuẩn của từng dung môi thì
khác nhau. Đặc biệt Pseudomonass aeruginosa, S.aureus đều bị ức chế bởi cao
chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%.
Đối với cao chiết ethanol 50% từ Podocarpus sp. kháng 2/5 chủng vi sinh vật
khảo sát với đường kính vùng ức chế 8 - 8,5 mm. Cao chiết ethanol 70% cũng
kháng 2/5 chủng vi sinh vật thể hiện qua đường kính vùng ức chế 8,33 - 9,33 mm.
ab a ab
b
c
a a a
ab
c c c
b
c
0
2
4
6
8
10
12
14
500mg/ml
Đường
kính
vùng
ức
chế
(mm)
Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis
Listeria innicua Listeria monocytogenes

52
Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% cũng kháng 2/5 chủng vi sinh vật khảo sát với
đường kính vùng ức chế 8 - 8,67 mm. Trong khi cao chiết nước chỉ kháng 1 chủng
là S.aureus với đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cuối cùng, cao chiết methanol
75% kháng đực 2 chủng với đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao
chiết (đường kính 9 - 9,5 mm).
Kết quả trên cho thấy đối với các vi sinh vật khảo sát, hoạt tính kháng khuẩn
của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. tốt nhất so với các dung môi khác.
Nhưng khi so với kháng sinh Ciprofloxacin thì hoạt tính kháng khuẩn của các cao
chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng
vi sinh vật
STT Chủng
Ethanol
50 %
Ethanol
70 %
Ethanol
90 % Nước
Methanol
75 %
1
Escherichia coli
O157:H7 8.83
2 Escherichia coli 0208
3 Escherichia coli 8.50 8.67
4
Enterotoxigenic E.coil-
ETEC 13.17
5 Listeria innicua
6 Listeria monocytogenes 9.33
7 Salmonella dublin 7.50
8 Salmonella enteritidis 9.00 8.33 10.00
9 Salmonella typhii 9.00 8.50 9.00 8.33 10.00
10
Salmonella
typhimurium 9.00 8.67 10.00
11 Shigella boydii 9.83 9.67 10.83
12 Shigella flexneri 8.83 10.17 8.50 9.83
13 Shigella sonnei 10.00
14 Vibrio alginolyticus 8.17
15 Vibrio cholerae 8.33 9.50 9.33
16 Vibrio harveyi 10.17 14.00
17
Vibrio
parahaemolyticus 8.33 8.17 9.33
18
Pseudomonass
aeruginosa 8.50 8.33 8.67 9.50
19 Staphylococcus aureus 8.00 8.00 8.17 9.00
20 Enterococcus feacalis
Đường kính giếng d = 8 mm

53
Dựa vào bảng 3.1. chúng tôi nhận thấy Podocarpus sp. có phổ hoạt động
rộng (4 - 11 chủng), đặc biệt là cao chiết ở dung môi ethanol 70% kháng 11/20
chủng. Tuy nhiên đường kính vòng kháng khuẩn của Podocarpus sp. tương đối hẹp
(8 – 14 mm).
Podocarpus sp. có khả năng kháng đều trên các vi sinh vật.
Cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng, kháng được 9/20 chủng vi
sinh vật chỉ thị, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella
boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass
aeruginosa, Staphylococcus aureus.
Tiêu biểu là cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn rộng nhất 11/20 chủng
vi sinh vật và hoạt tính kháng khuẩn thể hiện qua đường kính vùng ức chế lớn, ức
chế Escherichia coli, ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii,
Shigella flexneri, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus.
Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus,
Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus.
Trong khi đó, cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi
sinh vật khảo sát, ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi,
Staphylococcus aureus.
Cuối cùng, cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng
9/20 chủng vi sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium,
Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass
Cao chiết từ cây Podocarpus sp. tập trung kháng nhóm Salmonella spp.,
Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác. Vì những lý do trên
Podocarpus sp. ứng dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột.

54
Từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ cây
Podocarpus sp. bằng các dung môi môi khác nhau thì cao chiết ethanol 70% có hoạt
tính sinh học khá cao so với một số loại thực vật khác khi đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn đối với cùng một số chủng vi sinh vật chỉ thị. Như vậy, dung môi ethanol
70% được sử dụng để tách chiết cao từ Podocarpus sp. để xác định chỉ số MIC và
xác định thành phần hóa học.
3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp.
Sử dụng kết quả kháng khuẩn ở thử nghiệm trên làm cơ sở cho việc lựa chọn
chủng nào tiếp tục khảo sát nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).
Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp.
Chủng MIC(mg/ml)
Escherichia coli O157:H7 50
Escherichia coli 100
Enterotoxigenic E.coil - ETEC 12.5
Listeria monocytogenes 50
Salmonella dublin 100
Salmonella typhii 50
Shigella flexneri 25
Vibrio alginolyticus 50
Vibrio cholerae 50
Vibrio harveyi 12.5
Pseudomonass aeruginosa 50

55
Dựa vào bảng 3.2. nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết
ethanol 70% có giá trị khác nhau. Đầu tiên, nhóm Escherichia coli spp. nhạy hơn
các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 100 mg/ml, trong đó
Escherichia coli O157:H7 12,5 mg/ml. Listeria monocytogenes nồng độ ức chế tối
thiểu là 50 mg/ml. Nhóm Salmonella spp. nồng độ ức chế tối thiểu 50 -100 mg/ml.
Shigella flexneri nồng độ ức chế tối thiểu 25 mg/ml. Nhóm Vibrio spp. nhạy hơn
các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 50 mg/ml, trong đó
Vibrio harveyi 12,5 mg/ml. Pseudomonass aeruginosa nồng độ ức chế tối thiểu 50
mg/ml.
Từ đó thấy rằng cao chiết ethanol 70% kháng tốt với chủng Escherichia coli
O157:H7, Vibrio harveyi.
Theo nghiên cứu của cây Rosmarinus officinalis L. đối với chủng
Lis.monocytogenes của Rozman (2009) là 2,5 mg/ml, trong khi đó giá trị cao chiết
ethanol 70% từ Podocarpus sp. là 50 mg/ml. Ngoài ra trong nghiên cứu của Salem
(2014) về ethanol 70% của cây Sycomorus đối với Shi.flexneri là 30 mg/ml, còn với
Podocarpus sp. là 25 mg/ml. Nghiên cứu của Mon (2011) về giá trị MIC của cây
A.Japonica với V.cholerae là 5 mg/ml, còn giá trị cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. là 50 mg/ml.
Từ kết quả khảo sát trên có thể thấy chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70%
trên 11 chủng vi sinh vật cao hơn so với nghiên cứu khác. Nguyên nhân do dung
môi tách chiết khác nhau, phương pháp khác nhau và một số yếu tố khách quan
khác nên giá trị MIC khác nhau.

56
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp.
Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp.
Thành phần hóa học Thử nghiệm Ethanol 70%
Carbohydrate
Molisch +
Fehling +
Benedict +
Alkaloid
Mayer -
Dragendroff -
Hager -
Wagner -
Saponin Foam test +
Anthraquinone Bontrager -
Flavonoid
Alkaline +
Shinoda +
Ferric clorid +
Phenolic compound
Lead aceate +
Gelatin +
Tannin
Ferric clorid +
Lead acetate +
Steroid
Salkowski Sterol
Libermann Sterol
Amino acid Ninhydrin -
(+): dương tính
(-): âm tính
Dựa vào bảng 3.3. chúng tôi nhận thấy rằng thành phần hóa học Podocarpus
sp. bao gồm carbohydrate, saponin, flavonoid, phenolic, tannin, steroid.
Các thử nghiệm alkaloid, anthraquinone, amino acid đều cho kết quả âm tính
Những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn thực vật gồm alkaloid, saponin,
flavonoid, phenolic, tannin. Steroid phá vỡ vách tế bào của vi sinh vật. Hợp chất
phenolic, flavonoid, tannin có chức năng phá vỡ tế bào của vi sinh vật, tạo phức hợp
với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và có khả năng tương tác với DNA nhân

57
thực của vi sinh vật. Hợp chất alkaloid có khả năng xen vào thành tế bào hoặc DNA
của vi sinh vật và ức chế chúng. Podocarpus sp. gồm các hợp chất kháng khuẩn
flavonoid, phenolic, tannin, các hợp chất này giúp ức chế một số vi sinh vật gây
bệnh.

58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Cao chiết ethanol 50% từ cây Podocarpus sp. có hoạt tính kháng khuẩn 9/20
chủng vi sinh vật khảo sát gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium,
Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass
Cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli, ETEC,
Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii, Shigella flexneri, Vibrio
alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus.
Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus,
Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus.
Cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi sinh vật khảo sát,
ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus.
Cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng 9/20 chủng vi
sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii,
Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa,
Staphylococcus aureus.
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết ethanol 70% từ cây
Podocarpus sp. từ 25 mg/ml đến 100 mg/ml.
Thành phần hóa học Podocarpus sp. bao gồm carbohydrate, saponin, cardiac
glycosides, flavonoid, phenolic, tannin, steroid.
4.2. Đề nghị
Tôi đề nghị tiến hành thử nghiệm xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
(MBC- minimal bactericidal concentration) của Podocarpus sp. với các dung môi
khác nhau.

59
Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thay thế phương pháp
khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) bằng phương pháp MIC
trong môi trường lỏng (ống nghiệm) để có thể chia nhỏ nồng độ, thu hẹp, dể xác
định chính xác giá trị MIC hơn.
Định danh xác định loài Podocarpus
Định lượng thành phần hóa học chứa trong cây Podocarpus sp.

60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
Vũ Văn Dũng. 1996. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà
Nội, Việt Nam
Cao Minh Nga, 2014. Thực tập vi sinh học. Nhà xuất bản giáo dục,67,68
Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM
Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà
Nội
Phạm Thanh Kỳ và cs, 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học
Dược Hà Nội
Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y
học
Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I.
Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật
Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II,
Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
Trumbo P, Schlicker S, Yates AA, Poos M; Food and Nutrition Board of the
Institute of Medicine, The National Academies. Dietary reference intakes for
energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids.J
Am Diet Assoc
Nguyen Tien Hiep, Pan Ke Loc, Nguyen Duc To Luu, PI Thomas, A. Farjon,
L. Averyanov & J. Regalado Jr. 2004. Vietnam Conifers: Conservation Status
Review 2004. Fauna & Flora International, Vietnam Programme, Hanoi.

61
Abdillahi, HS, et al. (2011). Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase
and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in
South Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503.
Jean BRUNETON Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants -
Technique & Documentation - Lavoisier, 1995 (Translated by Caroline K. Hatton)
Austin, B. & D.A. Austin. 1993. Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed
and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester
Jemmi, T., and Stephan, R.,2006, Listeria monocytogenes: food-borne
pathogen and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571-580
Katie E. Ferrell; Thorington, Richard W. (2006). Squirrels: the animal
answer guide. Baltimore: Johns Hopkins University Press. 91.
Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre, and M. Cormier (1992), In vitro antiviral
activity of propolis. Apidologie 23:231–240.
Pedro Aqueveque và ctv, (2005). Favolon B, a New Triterpenoid Isolated
from the Chilean Mycena sp. Strain 96180, The Journal of Antibiotics 58, 61–64.
Hisanori Akiyama và ctv, (2001). Antibacterial action of several tannins
against Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 487-
491.
Cushnie T. P và Lamb A. J; (2006). Antimicrobial activity of flavonoids, Int
J Antimicrob Agents; 26(5):343-56.
Michał Arabski và ctv, (2012). Effects of Saponins against Clinical E. coli
Strains and Eukaryotic Cell Line, Journal of Biomedicine and Biotechnology
Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti-
tumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs,
International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics.

62
Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts
(Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae
Slovenica.
Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014),
Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some
pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology.
Aibinu và ctv (2007). “In vitro antimicrobial activity of crude extracts from
plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata”. Afr. J. Traditional,
Complementary and Alternative Medicines, 4 (3): 338 - 344.
Moses A.G., Erastus G., Leonard G. and Henry R., Preliminary
Phytochemical screening of eight selected medicinal herbs used for the treatment of
diabetes, Malaria and Pneumonia in Kisii Region, Southwest Kenya. Euroean
Journal of Applied Sciences Vol(5):01-06, 2013
Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in
sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of
Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia.
Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected
medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial
activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants.

1
PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA PODOCARPUS SP. VỚI CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU
A.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 50%
Chủng
Ethanol 50%
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Salmonella enteritidis 8.5 9.5 9
Salmonella typhii(K) 9.5 8.5 9
Salmonella typhimurium 9.5 9 8.5
Shigella boydii 10 9.5 10
Shigella flexneri 9 9.5 8
Vibrio cholerae 8.5 8.5 8
Vibrio parahaemolyticus 8 8 9
Pseudomonass aeruginosa 8.5 8.5 8.5
Staphylococcus aureus 8 8 8
Chủng Ethanol 70%
Escherichia coli O157:H7 8.5 9 9
Escherichia coli 0208
Escherichia coli (K) 8.5 8.5 8.5
ETEC
11 13.5 15
Listeria innicua
Listeria monocytogenes 10 9.5 8.5
Salmonella dublin 7.5 7.5 7.5
Salmonella enteritidis
Salmonella typhii(K) 9 7.5 9
Salmonella typhimurium
Shigella boydii
Shigella flexneri 10.5 10 10
Shigella sonnei
Vibrio alginolyticus 9 8 7.5
Vibrio cholerae 9 10 9.5
Vibrio harveyi 10.5 10.5 9.5
Vibrio parahaemolyticus
Pseudomonass aeruginosa 8 8.5 8.5
Staphylococcus aureus
Enterococcus feacalis

2
từ Podocarpus sp.
Chủng
Ethanol 90%
Escherichia coli (K) 8.5 9 8.5
Salmonella enteritidis 9 8 8
Salmonella typhii(K) 9 9 9
Salmonella typhimurium 8.5 8.5 9
Shigella boydii 10 10 9
Shigella flexneri 8.5 8 9
Vibrio parahaemolyticus 8.5 8 8
Pseudomonass aeruginosa 9 8.5 8.5
Staphylococcus aureus 8 8 8
A.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước từ
Podocarpus sp.
Chủng
Cao nước
Salmonella typhii(K) 8.5 8.5 8
Shigella sonnei 10 10 10
Vibrio harveyi 13.5 14.5 14
Staphylococcus aureus 8.5 8.5 7.5
A.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol
75% từ Podocarpus sp.
STT Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 Escherichia coli
0157:H7
- - -
2 Escherichia coli 0208 - - -
3 Escherichia coli (K) - - -
4 Enterotoxigenic
E.coil-ETEC
- - -
5 Listeria innicua - - -
6 Listeria
monocytogenes
- - -
7 Salmonella dublin
8 Salmonella enteritidis 9.5 10.5 10.0
9 Salmonella typhii(K) 10.5 9.5 10.0
10 Salmonella 10.5 10.0 9.5

3
typhimurium
11 Shigella boydii 11.0 10.5 11.0
12 Shigella flexneri 10.0 10.5 9.0
13 Shigella sonnei - - -
14 Vibrio alginolyticus
15 Vibrio cholerae 9.5 9.5 9.0
16 Vibrio harveyi
17 Vibrio
parahaemolyticus
9.0 9.0 10.0
18 Pseudomonass
aeruginosa
9.5 9.5 9.5
19 Staphylococcus aureus 9.0 9.0 9.0
20 Enterococcus feacalis - - -

4
PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM
STATGRAPHIC
B.1. Kết quả xử lí số liệu hiệu suất tách chiết cao của các dung môi
B.2. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Escherichia
coli spp.
B.3. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Shigella spp.
B.4. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Vibrio spp.

5
B.5. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm vi sinh vật gây
bệnh khác
B.6. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Listeria
monocytogenes
B.7. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella enteritidis

6
B.8. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella
typhimurium
B.9. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella typhii (K)

7
PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI
THIỂU CỦA PODOCARPUS SP.
C.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. (nồng độ 50,100 mg/ml)
STT Chủng
100 mg/ml 50mg/ml
Lần
1
Lần
2
Lần
3
Lần
1
Lần
2
Lần
3
1
Escherichia coli
O157:H7 13 15 15 11 10 10
2 Escherichia coli 0208
3 Escherichia coli 10.5 11 10.5
4
ETEC 13 14 13.5 11 10 11
5 Listeria innicua
6
Listeria
monocytogenes 11 10 10 8.5 9 9
7 Salmonella Dublin 9 11 11
8 Salmonella enteritidis
9 Salmonella typhii(K) 11 11.5 11.5 10 10 9
10
Salmonella
typhimurium
11 Shigella boydii
12 Shigella flexneri 11 12 11 10 10 9
13 Shigella sonnei
14 Vibrio alginolyticus 11 11 11 9.5 11.5 10
15 Vibrio cholerae 10.5 10.5 10.5 9 9
16 Vibrio harveyi 11 12 11 9 8.5 8
17
Vibrio
parahaemolyticus
18
Pseudomonass
aeruginosa 11 11 11 8 8.5 8.5
19 Staphylococcus aureus
20 Enterococcus feacalis
C.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ
Podocarpus sp. (nồng độ 12,5, 25 mg/ml)
STT Chủng 25 mg/ml 12.5 mg/ml

đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp.

đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp.

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp.

Similar to đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp. (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp.