FOODCROPS.VN 2017. Hoàng Thị Hằng. Xây dựng quy trình nuôi cấy mô invitro Lan Thạch Hộc tía

1. Hội nghị khoa học toàn quốc 2017
Sinh lý thực vật ứng dụng trong công nghệ cao
BÁO CÁO
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA
(DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO) TRÊN MÔI
TRƢỜNG HỮU CƠ CHỨA PHÂN TRÙN QUẾ (PERIONYX
EXCAVATUS) KẾT HỢP BỘT SẮN DÂY (PUERARIA THOMSONI)
Đơn vị: TRƢỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
Hồ Chí Minh, tháng 12/ 2017
Nhóm tác giả: Hoàng Thị Hằng, Nguyễn Huỳnh Trâm Anh
01286606922 Đỗ Tấn Phát, Đoàn Thị Tuyết Lê

2. NỘI DUNG
ĐẶT VẤN ĐỀ1
VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2
3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 2
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ4

3. Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
Xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro lan
thạch hộc tía (Dendrobium officinale
Kimura et Migo) trên môi trƣờng hữu cơ
chứa phân trùn quế (Perionyx excavatus)
kết hợp bột sắn dây (pueraria thomsoni).
Phòng chống ung thƣ
Tiểu đƣờng
Cao huyết áp.
Tăng sức đề kháng của
cơ thể
3
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

4. MỤC TIÊU
MỤC ĐÍCH
Xác định hàm lượng phân trùn quế phù hợp làm môi
trường cơ bản trong nuôi cấy in vitro lan Thạch hộc tía
Góp phần giảm thiểu việc sử dụng các thành phần
dinh dưỡng có nguồn gốc vô cơ trong nuôi cấy in
vitro tế bào, đưa giống cây sạch vào trong nghiên cứu
tách chiết các hợp chất có giá trị dược liệu đảm bảo
an toàn sức khỏe cho người sử dụng
Xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh nuôi cấy in
vitro lan Thạch hộc tía trên môi trường hoàn toàn hữu
cơ gồm phân trùn quế và bột sắn dây nhằm thu được
lượng sinh khối cao với chi phí thấp.
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 4

5. Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
Phân trùn quế Củ chi
1.1 GIỚI THIỆU VỀ PHÂN TRÙN QUẾ
STT/No
Chỉ tiêu kiểm nghiệm/
Parameters
Đơn vị tính/
Unit
Kết quả/
Result
Phương pháp Test/
Test method
1 B mg/kg 17.8 Ref.AOAC 957.02
2 Ca % 1.28 Ref.AOAC 957.02
3 Cu mg/Kg 19.5 Ref.AOAC 957.02
4 Fe % 0.10 Ref.AOAC 957.02
5 K2O % 0.21 Ref.AOAC 957.02
6 Mg % 0.25 Ref.AOAC 957.02
7 Mn % 0.028 Ref.AOAC 957.02
8 Mo mg//kg 1.94 Ref.AOAC 957.02
9 P2O5 % 1.14 AOAC 957.02
10 S % 0.13 Ref.AOAC 957.02
11 Zn % 0.011 Ref.AOAC 957.02
12 Acid Fulvic % 1.21 TCVN 8561:2010
13 Acid Humic % 3.81 TCVN 8561:2010
14 Cl-
mg/100g 68.5
CASE.NS.0018
(Ref.AOAC 980.25)
(*)
15 Độ ẩm % 70.5 TCVN 9297-2012
16 N % 0.91
Ref.AOAC 993.13
(*)
17 Chất hữu cơ %
19.1
Kết quả
tính trên
mẫu
nguyên ban
đầu
TCVN 9294: 2012
5

6. Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 6
1.2 GIỚI THIỆU VỀ BỘT SẮN DÂY
Trong sắn dây có tinh bột 12 – 15%,
adenin, và axit amin, ngoài ra còn có
một số chất có hoạt tính dược liệu có
chức năng bảo vệ thiếu máu cấp tính cơ
tim, giải nhiệt...
Cát căn, phấn cát , cam cát căn. Là một
loại dây leo, có thể dài tới 10m, rễ phát
triển to thành củ, nhiều bột

7. 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU
THIẾT BỊ VÀ DỤNG
CỤ THÍ NGHIỆM
MẪU NGHIÊN CỨU
Protocorm lan
Dendrobium officinale
Kimura et Migo
Chồi lan Dendrobium
officinale Kimura et
Migo
Mẫu do phòng nuôi cấy tế bào thực vật trường đại
học Lạc Hồng cung cấp
DỤNG CỤ NUÔI CẤYTHIẾT BỊHÓA CHẤT
Phân trùn quế của công ty cổ
phần TRÙN QUẾ CỦ CHI Bột sắn dây: KENTARY
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 7

8. Nội dung nghiên cứu
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 8
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn
quế lên sự thay đổi khối lượng tươi protocorm
lan Thạch hộc tía
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên
sự nhân chồi của lan Thạch hộc tía
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên
sự ra rễ của lan Thạch hộc tía

9. Mục đích: Xác định hàm lượng phân
trùn quế thích hợp để sử dụng làm
môi trường cơ bản trong nuôi cấy in
vitro lan Thạch hộc tía.
Cơ sở khoa học: So sánh kết quả
phân tích thành phần phân trùn quế
Củ Chi và thành phần dinh dưỡng
khoáng thiết yếu cho cây Nguyễn Kim
Thanh [4].
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA HÀM LƢỢNG
PHÂN TRÙN QUẾ LÊN SỰ THAY ĐỔI KHỐI LƢỢNG TƢƠI
PROTOCORM LAN THẠCH HỘC TÍA
Cách tiến hành:
Cân 0,2g mẫu protocorm Thạch
hộc tía cấy chuyền vào môi
trường bổ sung 20g/l glucose + 8
g/l agar và hàm lượng phân trùn
quế theo các tỉ lệ: 5%/l, 10%/l,
20%/l, 30%/l, 40%/l, 50%/l.
Chỉ tiêu theo dõi:
Khối lượng mẫu/1 bình.
Protocorm lan Thạch hộc tía
Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô 26 ±
2oC
- Sử dụng đèn huỳnh quang ánh sáng
trắng cường độ 1800 – 2000 lux.
- Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày,
độ ẩm không khí 70% - 80%
- Môi trường được điều chỉnh pH =
5,6 – 5,8. Sau đó hấp khử trùng ở
nhiệt độ 121OC, 1 atm trong 15 phút.
9

10. THÍ NGHIỆM 2: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA HÀM LƢỢNG
SẮN DÂY LÊN SỰ NHÂN CHỒI LAN THẠCH HỘC TÍA
• Mục đích: khảo sát hàm lượng
sắn dây bổ sung vào môi trường
trùn quế lên sự nhân chồi lan
Thạch hộc tía
• Cơ sở KH: Phạm Thị Lệ Huyền,
2015 do TS. Bùi Minh Trí hướng
dẫn [15], Nguyễn Kim Thanh
[4], Đỗ Tất Lợi [1], Bảng thành
phần thực phẩm Việt Nam [9]
• Hàm lƣợng SD: 0g/l, 5g/l, 10g/l,
20g/l, 30g/l, 40g/l, 50g/l
• Môi trƣờng nền:
5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar
Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao
chồi (cm), Số chồi/mẫu, màu
sắc chồi
Vật Liệu:
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 10

11. THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA HÀM LƢỢNG
SẮN DÂY LÊN SỰ RA RỄ CỦA LAN THẠCH HỘC TÍA
• Mục đích: khảo sát hàm lượng sắn
dây bổ sung vào môi trường trùn
quế lên sự ra rễ lan Thạch hộc tía.
• Cơ sở KH: Phạm Thị Lệ Huyền,
2015 do TS. Bùi Minh Trí hướng
dẫn [15]
• Hàm lƣợng SD: 5g/l, 10g/l, 20g/l,
30g/l, 40g/l, 50g/l
• Môi trƣờng nền:
5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 11
Vật Liệu:
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi
tạo rễ/1bình (%), số rễ/1 chồi,
chiều dài rễ (cm).

12. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của phân trùn quế
lên sự thay đổi khối lƣợng tƣơi của lan Thạch hộc tía
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
5 10 20 30 40 50
Hàm lƣợng phân trùn quế
Khối lượng protocorm
12
Ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn quế lên sự
thay đổi khối lượng tươi protocorm lan Thạch
hộc tía.
Ảnh hưởng của hàm lượng phân trùn quế lên sự thay đổi
khối lượng tươi protocorm lan Thạch hộc tía; a1. 5% phân
trùn quế, b1. 10% phân trùn quế, c1. 20% phân trùn quế, d1.
30% phân trùn quế, e1. 40% phân trùn quế, f1. 50% phân
trùn quế.

13. THÍ NGHIỆM 2: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG SẮN DÂY
LÊN SỰ NHÂN CHỒI LAN THẠCH HỘC TÍA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0g 5g 10g 20g 30g 40g 50g
(g/l)
Hàm lƣợng sắn dây
Chiều dài chồi
Số chồi
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 13
Ảnh hưởng của hàm lượng sắn dây lên sự nhân chồi của lan
Thạch hộc tía; dc. 0g/l sắn dây, a. 5g/l sắn dây, b. 10g/l sắn
dây, c. 20g/l sắn dây, d. 30g/l sắn dây, e. 40g/l sắn dây, f. 50g/l
sắn dây

14. THÍ NGHIỆM 3: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG SẮN DÂY
LÊN SỰ NHÂN CHỒI LAN THẠCH HỘC TÍA
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 14
Kết quả khảo sát hàm lượng sắn dây lên sự ra rễ
lan Thạch hộc tía trên môi trường cơ bản chứa
phân trùn quế; dc. 0g/l SD, b. 10g/l SD, c. 20g/l
SD, d. 30g/l SD, e. 40g/l SD, f. 50g/l SD

15. Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THẠCH HỘC TÍA
15
Chồi
Cụm chồi
Ra rễ
Môi trƣờng: 5% TQ+ 10g/l SD + 20g/l glucose + 8g/l agar; pH= 5.8
Thời gian nuôi cấy: 8 tuần
Môi trƣờng: 5% TQ + 5g/l SD + 20g/l glucose + 8.0g/l agar; pH= 5.8
Thời gian nuôi cấy: 8 tuần
Protocorm
Môi trƣờng: 5% TQ + 20g/l glucose + 8g/l agar; pH= 5.8
Thời gian nuôi cấy: 4 tuần

16. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017
 Hàm lượng phân trùn quế thích hợp làm môi trường nền cơ bản trong
nuôi cấy in vitro lan Thạch hộc tía là 5%TQ + 20g/l glucose + 8.0g/l
agar cho các đặc điểm và hàm lượng protocorm ghi nhận tốt nhất.
 Môi trường được bổ sung 10g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8.0g/l
agar có hệ số nhân chồi đạt tỉ lệ cao nhất cho việc nhân nhanh chồi lan
thạch hộc tía.
 Thử nghiệm ra rễ sử dụng 5g/l SD + 5% TQ + 20g/l glucose + 8.0g/l
agar cho quá trình ra rễ lan Thạch hộc tía.
KẾT LUẬN
16

17. KIẾN NGHỊ
 Tối ưu hóa các thành phần dinh dưỡng trong nuôi cấy
 Thực hiện các nghiên cứu tiếp sau như chuyển cây ra
vườn ươm để tiếp tục theo dõi quá trình phát triển của
cây con đối với môi trường bên ngoài.
 Ứng dụng thành phần môi trường hữu cơ để nuôi cấy
trong bioreactor nhằm tách chiết các dược chất.
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 17

18. Tài Liệu Tiếng Việt
[1] Đỗ Tất Lợi (2004, 638-640), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
[2] Nguyễn Thanh Thuận, “Giá trị dược liệu của cây lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale)”, Tạp
chí Đại học Thủ Dầu Một, số 6 (25) – 2015.
[3] Ngô Xuân Bình, “Nuôi cấy mô tế bào thực vật cơ sở lý luận và ứng dụng”, Nhà xuất bản Khoa học
và Kỹ thuật
[4] Nguyễn Kim Thanh (2005), Giáo trình sinh lý Thực Vật, Nhà xuất bản Hà Nội.
[5] Nguyễn Thị Ngọc Dinh, Phạm Tiến Dũng, Nguyễn Ích Tân, Nguyễn Hồng Hạnh, Phan Thị Thủy,
“Ảnh hưởng của liều lượng phân giun quế đến sinh trưởng, phát triển và năng suất giống lúa ĐTL2 trong
vụ xuân sản xuất theo hướng hữu cơ tại Gia Lâm, Hà Nội”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13,
số 7: 1081-1088
[6] Phạm Thị Lệ Huyền (2015), Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung tinh bột Sắn dây đến sinh trưởng,
phát triển và đặc điểm kiểu hình của lan Dendrobium in vitro. khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh
học. Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM
[7] Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn
Quang Thạch, “nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale kimura et migo (Thạch hộc thiết bì)”, Tạp
chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1274-1282
[8] Nguyễn Đồng Diệu Linh (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, NAA và dịch hữu cơ lên sự sinh
trưởng của cây lan Thạch hộc tía, khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Trường Đại Học Lạc
Hồng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 18

19. [9] Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam (2007), nhà xuất bản Y Học.
Tài Liệu Tiếng Anh
[10] Ding, G., Zhang, D.Z., Ding, X.Y., Zhou, Q., Zhang, W.C., Li, X.X., 2008. Genetic variation and
conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysis. Plant
Syst. Evol. 276, 149–156.
[11] Z. Yuan, G. Cong, J. Zhang, “Effects of exogenous salicylic acid on polysaccharides production of
Dendrobium officinale”, South African Journal of Botany 95 (2014) 78–84
[12] Shen J, Ding XY, Liu DY, Ding G, He J, Li XX, Tang F, Chu BH (2006) “Intersimple sequence repeats
(ISSR) molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et
Migo”. Biol Pharm Bull 29:420–42.
[13] Zhihao Zhanga, Duoduo Zhanga, Mengmeng Doua, Zhubo Lia, Jie Zhangb, Xiaoyan Zhaoa, “Dendrobium
officinale Kimura et Migo attenuates diabetic cardiomyopathy through inhibiting oxidative stress, inflammation
and fibrosis in streptozotocin-induced mice”, Biomedicine & Phamacotherapy, volume 84, december 2016, pages
1350 – 1358
[14] Edwards CA, Bohlen PJ (1996) Biology and ecology of earthworm, 3rd edn. hapman and Hall, New York,
London
[15] M C Borah, P Mahanta, S K Kakoty, U K Saha and A D Sahasrabudhe (2006) Study of quality parameters in
vermicomposting Department of echanical ngineering Indian Institute of Technology Guwahati Guwahati 781
039, India
[16] Gajalakshmi S & Abbasi S A, Earthworms and vermicomposting, Indian J Biotechnol, 3 (2004) 486-494.
[17] C. A. Edwards 7 J. Dominguez 7 E. F. Neuhauser, Growth and reproduction of Perionyx excavatus (Perr.)
(Megascolecidae) as factors in organic waste management, Biol Fertil Soils (1998) 27:155–161
[18] Tulecke W (1961), “Contributions from Boyce Thompson Isntitute”, 21, 115 – 128.
Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 19

20. Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 20