Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID
VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ SEN
NELUMBO NUCIFERA
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHÊ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Ngọc Hồng
Th.S: Nguyễn Thị Thu Hương
Sinh viên thực hiện : Trần Thị Kim Ngân
MSSV: 1151110218 Lớp: 11DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
được thực hiện dưới sự đồng hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng
và Thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Hương.
Các số liệu, những kết luận được trình bày trong đồ án này hoàn toàn trung
thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào.
Em xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình
Sinh viên
Trần Thị Kim Ngân

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Ngọc Hồng và
Th.S Nguyễn Thị Thu Hương, là giáo viên đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức quý cho tôi trong suốt khoảng
thời gian học tập tại Trường Đại học Công nghệ TP.HCM.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh,
chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm – Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Sinh viên
Trần Thị Kim Ngân

Mục lục
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................3
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH...............................................................................................5
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................7
1. Lý do chọn đề tài...................................................................................................7
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...........................................................8
3. Mục đích nghiên cứu.............................................................................................9
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................9
5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................9
6. Các kết quả đạt được của đề tài...........................................................................10
7. Kết cấu của ĐATN..............................................................................................10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................11
1.1. Tổng quan về cây Sen......................................................................................11
1.1.1. Vị trí, phân loại .........................................................................................11
1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái...............................................................11
1.1.3. Thành phần hóa học ..................................................................................12
1.1.4. Tính vị, tác dụng .......................................................................................14
1.1.5. Công dụng, chỉ định, phối hợp..................................................................14
1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics ....................................................................16
1.2.1. Phân loại....................................................................................................16
1.2.2. Tính chất hóa học......................................................................................17
1.2.3. Vai trò của các hợp chất trong phenol trong thực vật...............................17
1.2.4. Flavonoid...................................................................................................18
1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid.......................................................................20
1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa ...........................................................24
1.4.1. Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa...24
1.4.2. Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen ...................................25
1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS.................................................26
1.5.1. Phổ khối lượng..........................................................................................26
1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế ...........................................................................27
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..........................................................35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2
2.1. Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................35
2.2. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm ..........................................................................35
2.3. Phương pháp thí nghiệm..................................................................................36
2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu ............................................37
2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu.......................................................................39
2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết........................................................41
2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được...............................................43
2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá sen....................44
2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số.............................45
2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số..............................................45
2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số ................................................46
2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử.........................................................48
2.3.10. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH............................49
2.3.11. Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS .............................................50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................53
3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen....................................................................53
3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu..............................................................................55
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được......................56
3.4. Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết lá sen ..........................58
3.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết .............................................61
3.6. Định lượng Flavonoid tổng số .........................................................................64
3.7. Định lượng alkaloid tổng số.............................................................................67
3.8. Xác định năng lực khử.....................................................................................68
3.9. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH......................................................69
3.10. Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS...........74
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................78
4.1. Kết luận............................................................................................................78
4.2. Kiến nghị..........................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................80

3
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AG: Acid Gallic
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EtOAC: Ethyl Acetate
Et-F: Ethyl acetate Fraction
IC50: half maximal inhibitory concentration
LC-MS: Liquid Chromatography–Mass Spectrometry
TPHH: Thành Phần Hóa Học
TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số)
TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số)
db: gam dược liệu khô
.

4
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu................................................................................................ 55
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khô thu được.............................. 56
Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá sen ................................... 59
Bảng 3.4: Kết quả đường chuẩn Acid Gallic..................................................................... 60
Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số............................................................ 61
Bảng 3.6: Kết quả đường chuẩn Rutin .............................................................................. 63
Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số.............................................................. 64
Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng alkaloid toàn phần ............................................................ 65
Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu. .................................................... 66
Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C......................................................... 68
Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96%....... 70
Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70%............................. 71
Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen .................................... 73

5
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây sen .............................................................................................................. 11
Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferine ........................................................................................... 13
Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen.................................................. 13
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen. ...................................... 14
Hình 1.5: Một số hợp chất phenol ..................................................................................... 17
Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế. .............................................................................. 27
Hình 2.1: Lá sen non ......................................................................................................... 34
Hình 2.2: Lá sen trưởng thành........................................................................................... 34
Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm................................................................................ 35
Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu......................................................................... 37
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen........................................... 40
Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid toàn phần .................................................................... 46
Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình năng lực khử ............................................................................ 48
Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen ...................................................................................... 53
Hình 3.2: Bột lá sen........................................................................................................... 53
Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen.............................................................................................. 54
Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau .......................... 56
Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH.......................................... 57
Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer ........................................................................ 57
Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút............................................................ 58
Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành................................................................................ 58
Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết ................................................................................ 59
Hình 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic...................................................... 60
Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic................................................................................ 61
Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn.................................................................................... 63

6
Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin ......................................................................................... 64
Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3 ............................................................................. 64
Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết.................................................................. 67
Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+
............................................... 68
Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C ....................................... 69
Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C.......................................... 69
Hình 3.19: Phản ứng của dịch mẫu + DPPH..................................................................... 70
Hình 3.20: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen trưởng thành cồn 96%...................... 70
Hình 3.21: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen non trong ethanol 70%..................... 71
Hình 3.22: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C ................... 71
Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen........................... 73

7
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Từ ngày xưa người ta đã biết dùng đến các loại thảo dược để chữa trị nhiều loại
bệnh khác nhau, trong đó có bệnh béo phì và tim mạch, Bên cạnh đó, khả năng
chống béo phì trên người của nhóm hợp chất catechin đã được nghiên cứu và
chứng minh.
Sen là loại cây quen thuộc với người dân Việt Nam, là loại cây mà hầu như tất
cả các bộ phận đều được sử dụng để phục vụ cho việc trang trí, thực phẩm, dược
phẩm chữa bệnh…Dù vậy, việc nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong sen vẫn
còn rất hạn chế ở nước ta.
Việc nghiên cứu sản xuất ra các chất chiết từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ
uống, thực phẩm nói riêng và trong các ngành công nghiệp khác nói chung luôn
được quan tâm mà chủ yếu là các hợp chất phenolic như flavonoid và các hợp chất
alkaloid.
Những hợp chất nay tồn tại nhiều trong các loại hoa lá, củ quả…của nhiều loại
thảo dược, Những thành phần này được sử dụng như một loại thực phẩm chức
năng nhằm mục đích ngừa bệnh do có tính chống oxy hóa mạnh. Chúng được sử
dụng với nhiều mục đích khác nhau trong các ngành công nghiệp như thực phẩm,
dược phẩm, mỹ phẩm…
Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm, là
một điều kiện tốt để sen tồn tại và phát triển. Việc nghiên cứu, phân tích các thành
phần hóa học có trong sen sẽ là một bước đi cụ thể nhằm tìm ra các hợp chất thứ
cấp có dược tính tốt trong cây sen, trong đó có alkaloid và flavonoid, tạo tiền đề cơ
bản cho việc ứng dụng các hợp chất này vào trong các chế phẩm phòng và chữa
bệnh cho người.
Sen là một loài thực vật gần gũi với đời sống của người dân Việt Nam. Tất cả
các bộ phận của sen đều được sử dụng để phục vụ cho con người: lá dùng gói xôi,
hoa sen dùng để trang trí, hạt sen thì dùng nấu chè, tâm sen lại có dược tính an thần
cho những ai mắc căn bệnh mất ngủ. Trong dân gian, lá sen được dùng nấu nước
uống thay trà, nhưng hiện nay, chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu về lá sen
cũng như những thành phần dược tính có giá trị của nó. Do vậy, đề tài “Nghiên
cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen Nelumbo

8
nucifera” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho việc tạo sản phẩm trà túi lọc từ
lá sen hoặc tạo viên nang chức năng mang lại nhiều giá trị thực tiễn.
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Những nghiên cứu trong nước
- Tiến sĩ Hoàng Thị Tuyết Nhung đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và
tinh chế Conessin, Kaempferon, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối
chiếu trong kiểm nghiệm thuốc”.Trong đó Nuciferin là chất được chiết xuất và
tinh sạch từ cây Sen (Nelumbo nucifera).
- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết cây
sen thu hái ở Đà Nẵng.
- Xây dựng qui trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và
quercetin-3-0-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò
PDA.
- Độc tính mãn và tác dụng chống béo phì từ lá trà xanh và lá sen
- Phương pháp khối lượng định lượng alkaloid toàn phần của lá sen và sự thay
đổi hàm lượng alkaloid theo tuổi và thời vụ thu lá.
- Nghiên cứu thành phần hóa học của tâm sen và gương sen,
- Tinh chế và xác định một vài tính chất đặc trưng của lectin từ nhị hoa sen
(Nelumbo nucifera) và hoa cây thiên lý (Telosma condata)
- Chiết xuất alkaloid từ lá sen làm thuốc senin chữa bệnh loạn nhịp tim.
- Tác dụng chống loạn nhịp tim của lá sen.
Những nghiên cứu nước ngoài
Trên thế giới đã có những nghiên cứu về cây Sen như:
- Phân tích thành phần Alkaloid trong lá sen bằng phương pháp sử dụng tia UV
và đo phổ khối lượng.
- Xác định hàm lượng các hợp chất phenolic trong hoa sen (Nelumbo nucifera)
bằng phương pháp điện di mao dẫn.
- Xác định Nuciferin và các đồng phân của nó bằng phương pháp sắc ký lỏng
cao năng ngược pha.

9
3. Mục đích nghiên cứu
- Xác định các thành phần hóa học của cây sen thu hái tại khu vực quận 7, Thành
phố Hồ Chí Minh.
- Xác định được hàm lượng các chất có dược tính trong lá sen, đồng thời xác
định được khả năng chống oxy hóa của lá sen sẽ là tiền đề cho việc tạo những
chế phẩm có hàm lượng phenolic, alkaloid cao, có thể được bổ sung vào các
thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thiên nhiên, tăng cường sức khỏe, phòng
chống bệnh tật.
- Xác định một số thành phần flavonoid, alkaloid, mở ra hướng ứng dụng trong
việc khai thác các chế phẩm chức năng giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên
cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo.
- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp
xác định, khảo sát, phân tích.
- Nhiệm vụ 3: Thu nhận dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong
ethanol
- Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hóa học có trong lá sen
- Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số và
alkaloid tổng số từ dịch chiết lá sen
- Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50 hay nồng
độ ức chế 50% gốc tự do của dịch chiết lá sen, đánh giá năng lực khử và thử
nghiệm in vitro trên mô hình DPPH.
- Nhiệm vụ 7: Khảo sát các thành phần hóa học trong lá sen bằng phương pháp
HPLC-ESI/MS
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về lá sen, sơ bộ thành
phần hóa học của lá sen, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ
cấp, mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa, phương pháp HPLC/MS

10
- Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết
các nhiệm vụ nghiên cứu.
- Phương pháp xử lý số liệu bằng toán học và phân tích phương sai ANOVA
bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.I: Các số liệu thu được sẽ
được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài.
6. Các kết quả đạt được của đề tài.
- Thu nhận được dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol
96% có hàm lượng phenolic và alkaloid cao (đối với lá sen trưởng thành) và
trong ethanol 70% (đối với lá sen non).
- Định tính sơ bộ các thành phần hóa học trong dịch chiết cồn lá sen.
- Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số, alkaloid toàn phần
của dịch chiết.
- Xác định được các thành phần flavonoid, alkaloid trong dịch chiết lá sen
- Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa trên mô hình DPPH với
Vitamin C và so sánh năng lực khử của dịch chiết với Acid Gallic.
7. Kết cấu của đề tài.
- Mở đầu
- Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài
- Chương 2: Vật liệu, hóa chất và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3: Kết quả và thảo luận
- Chương 4: Kiến nghị

11
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây Sen
1.1.1. Vị trí, phân loại
Hình 1.1: Cây sen
1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái
Về mặt thực vật học, Nelumbo nucifera (Gaertn,) đôi khi còn được gọi theo các
danh pháp cũ như Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo. Đây là một
loại cây thủy sinh sống lâu năm. Trong thời kỳ cổ đại nó đã từng là loại cây mọc phổ
biến dọc theo bờ sông Nin ở Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng
gần gũi có tên gọi dài dòng là hoa sen xanh linh thiêng sông Nin (Nymphaea caerulea)
Dạng thân thảo mọc dưới nước, sống dai nhờ thân rễ (ngó sen). Ngó sen màu trắng,
tiết diện gần tròn, có khía dọc màu nâu, ngọn có mang chồi hình chóp nhọn. Thân rễ
phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong
có nhiều khuyết rộng.
Lá hình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép lá
hơi uốn lượn, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng; mặt dưới xanh nhạt, nhám. Gân tỏa tròn,
nổi rõ ở mặt dưới. Cuống lá màu xanh, hình trụ, dài 1-1,5m, rám, có nhiều gai.
Hoa đơn độc, to, màu hồng hay trắng. Cuống hoa màu xanh, dài 1,3-1,5 m, già
chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn. Cuống lá và cuống hoa có nhiều khoang
rỗng bên trong. Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng,
Giới (regnum): Plantae
Bộ (ordo) Proteales
Họ (familia) Nelumbonaceae
Chi (genus) Nelumbo
Loài (species): N. nucifera
Danh pháp: Nelumbo nucifera

12
già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều quả sen. Bao hoa gồm 12-
16 phiến xếp xoắn ốc không phân biệt rõ lá đài và cánh hoa, bên ngoài 3-5 phiến màu
xanh hơi hồng, dài 3-6 cm; bên trong các phiến thuôn dài hình thuyền, dài 9-16 cm,
rộng 4-9 cm, màu trắng hồng, đậm hơn ở bìa và ngọn cánh hoa, nhiều gân dọc nổi rõ ở
mặt dưới; móng rất ngắn, màu trắng, hình chữ nhật hơi loe.
Bộ nhị: nhiều, rời, đều, đính xoắn ốc, chỉ nhị màu trắng, hình sợi, dài 7-9 mm,
nhẵn; chung đới màu trắng, hình sợi, dài 1,2-1,3 cm, đầu chung đới kéo dài thành hình
chùy (gạo sen), màu trắng, dài 4-5 mm; bao phấn 2 ô, màu vàng, thuôn dài, nứt dọc,
hướng ngoại, đính đáy, hạt phấn hình bầu dục hay hình trứng, màu vàng, dài 57-75
µm, có rãnh. Bộ nhụy nhiều lá noãn rời đính thành nhiều vòng vùi sâu trong đế hoa,
bầu màu vàng nhạt, hình bầu dục dài 6-11 mm, rộng 3-4 mm, 1 ô có 1 noãn đính nóc.
Vòi nhụy rất ngắn, đầu nhụy hình tròn, lõm ở giữa. Quả bế màu xanh, nhẵn, hình bầu
dục, dài 1,7-2,5 cm, đường kính 0,6-1,2 cm, Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 m, đường kính
5-6 mm, 2 lá mầm dày mập màu trắng bên trong có tâm sen màu xanh.
Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm không rõ;
thân mầm màu xanh, dài 3-4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng; 2 lá đầu tiên, 1 to, 1
nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8-2 cm, phiến lá
mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm.
Nelumbo lutea là loài sen thứ hai có màu trắng thấy phổ biến ở Bắc Mỹ.
Thế giới có 1 chi 2 loài, phân bố ở nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Úc, Bắc
Mỹ. Ở Việt Nam có 1 loài.
1.1.3. Thành phần hóa học
Lá có nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain,
roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, N-methyl-coclaurin, 4-
methyl-N-methylcoclaurin, nepherin, liriodenin, dehydroroemerin, armepavin,
dehydronuciferin, dehydroanonain, N- methylsococlaurin, Nuciferin là thành phần
chính, Ngoài alkaloid ra, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin,
leucocyanidin, leucodelphinidin.

13
Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferin
Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen
Tâm sen có các alkaloid sau đã được biết: liensinin, isoliensinin, methyl-corypalin,
neferin, lotusin, 1(p-hydroxybenzyl) 6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydroisoquinolin,
Gương sen có quercetin, 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat và một
lượng nhỏ vitamin C 0,017%,
R= R1= R2=
Nuciferin CH3 CH3 CH3
N-Nornuciferin CH3 CH3 CH3
O-Nornuciferin H CH3 CH3
Anonain -CH2- H
Roemerin -CH2- CH3

14
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen
Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%), đường raffinose, 1% chất đạm, 2% chất béo và
có một số chất khác như canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064%, với các chất
lotusine, demethyl coclaurine, liensinine, isoliensinine.
Tua nhị Sen có tannin.
Ngó Sen chứa 70% tinh bột, 8% asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose,
vitamin C, A, B, PP, tinh bột và một ít tannin.
1.1.4. Tính vị, tác dụng
Hạt Sen: Vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ tỳ dưỡng tâm, sáp trường, cổ tinh.
Tâm Sen: Vị rất đắng, có tác dụng an thần nhẹ.
Gương Sen: Có tác dụng tiêu ứ, cầm máu.
Tua nhị Sen: Vị chát, tính ấm; có tác dụng sáp tinh, ích thận, thanh tâm, chỉ huyết.
Lá Sen: Vị đắng, tính mát; có tác dụng hạ huyết áp, an thần, thanh thử,lợi thấp, tán
ứ, chỉ huyết.
Ngó Sen: Có tác dụng cầm máu, tráng dương, an thần.
1.1.5. Công dụng, chỉ định, phối hợp
Hạt Sen: Chữa các bệnh đường ruột như tỳ hư, tiết tả, lỵ; di mộng tinh, đới hạ, hồi
hộp mất ngủ, cơ thể suy nhược, kém ăn ít ngủ. Ngày dùng 12-20g có thể đến 100g,

15
dạng thuốc sắc hay hoàn tán. Là thực phẩm cao cấp để dùng cho người già yếu, trẻ con
hoặc dùng chế biến các món ăn quý, chất lượng cao như làm mứt, nấu chè; là phụ liệu
cho các món ăn dân tộc như bánh phồng tôm.
Tâm Sen: Chữa sốt và khát nước, di mộng tinh, tim đập nhanh, huyết áp cao, hồi
hộp hoảng hốt mất ngủ, Dùng 1,5-3g.
Gương Sen: Chữa chảy máu tử cung, băng huyết, đau bụng dưới do máu ứ, tiêu ra
máu, nôn ra máu. Dùng 10-15g, Trong các bài thuốc chữa băng huyết, rong huyết,
thường có kèm gương sen bên cạnh các vị thuốc khác.
Tua nhị Sen: Chữa băng huyết, thổ huyết, di mộng tinh, trĩ bạch đới, đái dầm, tiểu
nhiều, Dùng 3-10g.
Lá Sen: trị say nóng, viêm ruột, nôn ra máu dạ dày, chảy máu cam và các chứng
chảy máu khác. Dùng 5-12g sấy trên than hoặc ngày dùng độ 1 lá, sắc nước uống. Còn
dùng chữa chứng béo phì; dùng 15g lá sen rửa sạch đun với nước sôi trong 50 phút
hoặc hãm với nước sôi trong 10 phút, mỗi sáng uống 1 ấm.
Ngó Sen: Dùng chữa bệnh sốt có khát nước và dùng cầm máu (tiêu ra máu, tiểu ra
máu, nôn ra máu, chảy máu cam, xuất huyết sau sinh) và trị bạch đới, tiêu chảy. Dùng
ngó sen 5-12g phơi khô sắc uống hàng ngày hoặc có thể giã lá sen tươi lấy nước uống.
Các bài thuốc dân gian từ lá sen
Giảm béo phì: Dùng lá sen sấy khô đun lấy nước uống thay trà lá vối hàng ngày
hoặc cho một giúm nhỏ vào tách (ly) rồi hãm với nước sôi, sau khoảng 2 - 5 phút thì
uống. Uống thường xuyên và liên tục sẽ giảm lượng mỡ dư thừa trong cơ thể đáng kể,
giúp bạn có thân hình khỏe và đẹp.
Chữa háo khát: Lá sen non (loại lá còn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, thái
nhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần trong ngày. Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại rau
ghém, ăn sống hằng ngày. Người bị tiêu chảy vừa chữa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nước
dùng rất tốt.
Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30g tán nhỏ, uống với
nước hoặc đồng tiện (nước tiểu trẻ em) hoặc sắc với 200ml nước còn 50ml, uống làm
một lần trong ngày.

16
Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt mã
đề 20g, sắc uống ngày một thang. Nếu xuất huyết nhiều, có thể tăng liều của lá và ngó
sen lên 50-60g.
Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp: Lá sen
15,5g, cam thảo 15,5g, đỗ trọng 12,5g, sinh địa, mạch môn, tang ký sinh, bạch thược
mỗi vị 10g, sắc uống ngày một thang.
Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12g
sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày.
Chữa ho ra máu, nôn ra máu: Lá sen, ngó sen, sinh địa mỗi vị 30g; trắc bá, ngải
cứu mỗi vị 20g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống trong ngày.
Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô, sắc hoặc hãm
uống. Có thể dùng viên nén gồm cao mềm lá sen 0,03g, bột mịn lá sen 0,09g, tá dược
vừa đủ cho một viên, Ngày uống 3-6 viên trước khi đi ngủ 3 giờ. Hoặc sirô lá sen gồm
cao mềm lá sen 4g, cồn 45% 20ml, sirô đơn vừa đủ cho 1,000ml, Người lớn uống
15ml, trẻ em tùy tuổi 5ml.
1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics
Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà
khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên. Đặc biệt trong
cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp
một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và
được đặc trưng bởi tính acid yếu.
1.2.1. Phân loại
- Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3
nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loại
này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm
phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon,
C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1
(acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid
hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4
(naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone),

17
C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-
C3)2(lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n
(catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ).
- Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol,
có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân,
Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng
Hình 1.5: Một số hợp chất phenol
1.2.2. Tính chất hóa học
Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặc
điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzene nên chúng có một số
tính chất chung :
 Phản ứng của nhóm hydroxyl.
 Phản ứng phá vòng benzen
 Phản ứng tạo phức với kim loại
 Phản ứng este hóa
1.2.3. Vai trò của các hợp chất trong phenol trong thực vật
Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không
thể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này, Nhìn chung
vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh
dưỡng của chúng

18
Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ,
xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra
các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với
sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả
năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn
toàn
Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ
chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ
phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường
Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều
chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp. Một số
hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng
thụ phấn cho hoa.
1.2.4. Flavonoid
Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn
4,500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nước màu vàng nên được gọi là “flavonoid”
(flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng, một sắc tố xanh đỏ tím hoặc không màu
cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học.
Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon
chung là C6-C3-C6. Flavonoid gồm hai vòng benzen A, B và vòng pyran C, trong đó
A kết hợp với C tạo thành khung chroman.
1.1.1.1. Tính chất của Flavonoids
Tính chất vật lý
- Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phương pháp phân lập, phân tích
và xác định các hợp chất flavonid. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt,
flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam. Các chất
thuộc nhóm isoflavonne, flavanol, isoflavanone, flavanone, leucoantoxyanidin,
catechin không màu. Các dẫn chất anthocyanidin có màu thay đổi tùy theo pH
môi trường.

19
- Tính tan trong dung môi: khả năng hào tan cuar flavonoid không giống nhau,
tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng. Flavonoid
glycoside không tan trong ether, tan được trong nước nóng, tốt nhất là cồn
nóng. Các dẫn xuất 7-hydroxyl thường dễ tan trong kiềm loãng.
- Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại.
Nguyên nhân này có thể do hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi hai vòng
benzen A, B và vòng pyran C. Flavonoid có hai dãy hấp thụ cực đại, giải 1 ở
bước sóng > 290nm, giải 2 ở bước sóng 220 – 280 nm
Tính chất hóa học
- Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóa hoc của
chúng rất lớn phụ thuộc vào nhiều yếu tố : vị trí các nhóm OH, hệ thống nối
đôi liên tiếp và các nhóm thế. Dưới đây là các phản ứng hóa học cơ bản của
flavonoid
 Phản ứng của nhóm OH: gồm phản ứng oxyl hóa, phản ứng tạo thành
liên kết hydrogen, phản ứng este hóa,
 Phản ứng của vòng thơm : phản ứng diazo hóa
 Phản ứng của nhóm carboxyl: phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức với
kim loại, Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như Fe, Zn, Mg và
HCl, Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ. Phản ứng này đặc trưng cho các
flvonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3. Điển hình là
flavonol, flavanone, flavanonol.
Tính chất sinh học
Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú, Các cơ
chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng
vai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa. Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu
gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống
bệnh tật.
- Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi
gốc tự do hoạt động, Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc
vào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất cấu

20
tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động
vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, bị oxyl hóa từng bước và tồn
tại ở dạng hydroxyl, semiquinone, Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự
do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO*. Chúng có thể nhận điện tử và
hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone, Các chất này có
khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý
và bệnh lý để triệt tiêu chúng.
- Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các
polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein. Tương tác này có
thể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của flavonoid lên
các enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng
các chất flavonoid để chữa bệnh.
- Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng
chống ung thư. Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìm
hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn
chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào.
- Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sức bền và
tính đàn hồi của thành mao mạch. Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch,
bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch như đái
đường, trĩ, giãn tĩnh mạch.
1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid
Năm 1806 một dược sĩ là Friedrich Wilhelm Sertüner phân lập được một chất từ
nhựa thuốc phiện có tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Cinchonino”, sau đó
chiết được chất kết tinh từ vỏ cây Canhkina và đặt tên là “Cinchonino”, sau đó P,J,
Pelletier và J,B,Caventou lại chiết được hai chất có tính kềm từ một loài Strychnos đặt
tên là strychnin và brucin. Đến năm 1819 một dược sĩ là Wilhelm Meissner đề nghị
xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và ông đề nghị gọi
tên là alkaloid do đó người ta ghi nhận Meissener là người đầu tiên đưa ra khái niệm
về alkaloid và có định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có
phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra.

21
Ngoài tính kiềm, alkaloid còn có những đặc tính khác như có hoạt tính sinh học
mạnh, có tác dụng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid… Sau này
Pôlônôpski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có
nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động
vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc
thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid.
Tuy nhiên cũng có một số chất được xếp vào nhóm alkaloid nhưng nitơ không có dị
vòng mà ở mạch nhánh như: Ephedrin trong ma hoàng (Ephedra sinica Staf,),
capsaisin trong ớt (Capsicum annuum L,), hordenin trong mầm mạch nha (Hordenum
sativum Jess,), colchicin trong hạt cây tỏi độc (Colchicum autumnale L,); một số
alkaloid không có phản ứng với kiềm như colchicin lấy từ hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt
thầu dầu (Ricinus communis L,), theobromin trong hạt cây cacao (Theobroma cacao
L,) và có alkaloid có phản ứng acid yếu như arecaidin và guvacin trong hạt cau (Areca
catechu L.)
Tính chất vật lý
Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong
công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví
dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin
(C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)…
Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như:
Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2). Tuy nhiên cũng có vài chất
trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecolin (C8H13NO2), pilocarpidin
(C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecvirin (C19H16N2),
conexin (C24H40N2),
Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có
một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy,
Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ở
nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu,
- Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như
capsaixin, piperin…
- Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng
như berberin, palmatin, chelidonin,

22
- Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung
môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen,, trái lại các muối
alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân
cực,
Có một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid base lại tan được trong nước như coniin,
nicotin, spactein, colchicin, cafein (tan 1/80 trong nước lạnh và 1/2 trong nước sôi).
Một số alkaloid có chức phenol như morphine, cephelin tan trong dung dịch kiềm.
Muối alkaloid như berberin nitrat lại rất ít tan trong nước.
Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụng
dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.
- Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có
cacbon không đối xứng), thường tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền như cinchonin,
quinidin, aconitin, pilocacpin…một số không có tác dụng với ánh sáng phân cực (vì
không có cacbon không đối xứng) như piperin, papaverin, naxein… một số alkaloid là
hỗn hợp đồng phân tả tuyền và hữu tuyền (raxemic) như atropin, atropamin,… năng
suất quay cực là hằng số giúp ta kiểm tra độ tinh khiết của alkaloid, Khi có hai dạng D
và L thì alkaloid dạng L có tác dụng sinh lý mạnh hơn dạng D.
Tính chất hóa học
- Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base
mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu
như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng
kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu
như arecaidin, guvacin.
Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những
kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định lượng
alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ
thị màu cho thích hợp.
- Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.
- Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.
- Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của
alkaloid, Những phản ứng chung này được chia làm 2 loại:
 Phản ứng tạo tủa:

23
Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid
Nhóm thuốc thử thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, Tủa này sinh ra hầu hết là do
sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp
của thuốc thử.
Có nhiều thuốc thử tạo tủa với alkaloid:
+ Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – kalitetraiodomercurat): Cho tủa trắng hay màu vàng
nhạt.
+ Thuốc thử Bouchardat (iodo – iodid): Cho tủa nâu.
+ Thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng cam
đến đỏ.
+ Muối Reinecke [NH4[Cr(SCN)4(NH3)2],H2O – amoni tetra sulfocyanua diamin
cromat III]
+ Thuốc thử Scheibler [acid phosphovonframic – H3P (W3O10)4].
+ Thuốc thử Godeffroy [acid silicovonframic – H3Si [(W3O10)4].
+ Thuốc thử Sonnenschein [acid photphomolybdic – H3P (Mo3O10)4].
Phản ứng tạo tủa này rất nhạy, độ nhạy của mỗi loại thuốc thử đối với từng alkaloid
có khác nhau, Ví dụ: Thuốc thử Mayer còn xuất hiện tủa với morphin khi pha loãng
1/2,700 nhưng với quinin ở độ pha loãng 1/125,000, Cafein còn tạo tủa với thuốc thử
Dragendorff ở độ pha loãng 1/600, nhưng với thuốc thử Bouchardat ở độ pha loãng
1/10,000.
Trong phân tích alkaloid, một số thuốc thử tạo tủa trên còn được dùng với ý nghĩa
khác: Thuốc thử Dragendorff còn được dùng phun hiện màu trong sắc ký giấy và sắc
ký lớp mỏng. Muối Reinecke dùng trong định lượng alkaloid bằng phương pháp so
màu. Acid photphomolybdic và acid photphovonframmic được dùng trong định lượng
alkaloid bằng phương pháp cân và phương pháp so màu.
Nhóm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể:
+ Dung dịch vàng clorid
+ Dung dịch platin clorid
+ Dung dịch nước bão hòa acid picric
+ Acid picrolonic
+ Acid styphnic

24
Người ta thường đo điểm chảy của các hợp chất này để góp phần xác định các
alkaloid.
 Phản ứng tạo màu:
Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho màu đặc biệt khác nhau do đó người
ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có
alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong đó.
Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acid
H2SO4 đậm đặc. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: Acid sulfuric đậm đặc
(d=1,84), acid nitric đậm đặc (d=1,4), thuốc thử Fröhde (acid sulfomolybdic), thuốc
thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic), thuốc thử
Erdmann (acid sulfonitric), thuốc thử Wasicky (p, dimetylaminobenzaldehyt hòa trong
H2SO4), thuốc thử Merke (acid sulfoselenic).
Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu
không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết.Do đó
để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương
pháp sắc ký lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.
1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa
1.4.1. Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa
Gốc tự do là các nguyên tử không trọn vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là số
lẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn
để bền vững, Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tử
không trọn vẹn khác và tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên
tử không trọn vẹn và tiếp tục chu kỳ bất tận như thế. Phản ứng hóa học của nó rất
mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho ra những phân tử
khác bị hư hại hay bị oxy hóa, Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất
đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là tác nhân oxi hóa các phân
tử chung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh. Và quá trình
này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thường dẫn tới các loại bệnh
như: xơ vữa động mạch, ung thư…
Theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lão
hóa…có liên quan rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong các tế bào sống.

25
Các quá trình oxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết
để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể. Gốc tự do là
những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất
hay được đưa vào từ bên ngoài do virút, vi khuẩn…Các gốc tự do được tạo thành gồm
các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+
O),Cu(OH)2 những gốc tự do
có hoạt tính trung bình và yếu như peroxyl (ROO), hydrogen peroxde H2O2, singlet
oxy (O1), nitric oxide (NO), ankoxyl…
Thông thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng
được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất
như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase, Ngoài ra cơ thể
còn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B-cell…có khả năng chống lại các yếu tố
oxy hóa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong các tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo
ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các
chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá,
môi trường ô nhiễm…Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ
để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hòa của tế bào,
làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ
bên ngoài oxy hoá các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quá
trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa
enzym trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh…
1.4.2. Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen
Trong cơ thể con người có sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa
nhiều loại gốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiều
trong các tế bào hồng cầu và gan, Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơ
thể phải nhờ đến các chất chống oxy hóa từ bên ngoài như vitamin E, vitamin C…Tuy
nhiên người ta đặc biệt chú tâm tới khả năng chống oxy hóa của các hợp chất
polyphenol có trong các loại thực phẩm như: lá dâu tằm, trà xanh, lá chè…
Công thức hóa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl
flavonoids (1, 3, 6, 7) có mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa

26
mạnh, Quá trình kháng oxy hóa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếp
lên các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưa
chúng về trạng thái các chất bền qua đó làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua
các dạng phản ứng sau:
RO2
*
+ AH ROOH + A*
(1)
RO*
+ AH ROH + A (2)
RO2
*
+ A*
ROOA*
(3)
RO*
+ A*
ROA (4)
Các chất A*
tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2
*
, RO*
vì
chúng không có khả năng lấy các ion H+
từ các acid béo không no hay của các hợp
chất trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình
oxy hóa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kết
quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.
1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS
1.5.1. Phổ khối lượng
Một trong những phổ có ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xác
định các chất tự nhiên là phổ khối lượng (mass spectrometry, MS, thường được gọi là
phổ khối), Phổ khối cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ
phân tử.
Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa
khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z), Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion
thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion, Với
các đại phân tử, điện tích của ion có thể lớn hơn 1, Khi đó, để xác định khối lượng
phân tử (M) cấn phải biết số điện tích của ion.
Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion
phân tử (hay còn gọi là ion mẹ) M+, Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh
nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lượng của các electron rất nhỏ,
có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử.

27
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion
mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra
những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng
với các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất
chưa biết, So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp
định danh chất đó dễ dàng và chính xác.
Khối phổ kế có thể hoạt động độc lập như một thiết bị đo phổ các chất tinh
khiết hay ghép nối với các thiết bị sắc ký như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di
mao quản… như một detector và đồng thời cung cấp các thông tin cấu trúc.
1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế
Cấu tạo của một khối phổ kế gồm có các bộ phận chính sau: (a) Đầu vào, (b)
buồng ion hóa, (c) bộ phận phân tích khối, (d) detector và (e) máy tính ghi nhậ xử lý,
lưu trữ kết quả và điều khiển hệ thống, Các bộ phận từ (b) - (d) được đặt trong một
buồng chân không sâu, Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu tạo và nguyên lý hoạt
động của từng bộ phận có thể khác nhau.

28
Đầu vào
Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế
Đầu vào là nơi mẫu được đưa vào máy phổ khối, Mẫu có thể được đưa vào trực
tiếp hay được ghép nối với đầu ra của một hệ thống sắc ký. Mẫu có thể được đưa vào
dưới dạng rắn, lỏng hay khí nhưng được ion hóa trong buồng ion hóa. Cổ điển nhất là
mẫu được hóa hơi, Với các kỹ thuật ion hóa mới, mẫu có thể được ion hóa trực tiếp từ
dạng lỏng hay dạng rắn. Ngày nay, việc ghép nối đã trở nên dễ dàng và khối phổ đang
dần trở thành một detector phổ thông cho các hệ thống sắc ký.
Buồng ion hóa
Buồng ion hóa là nơi mẫu thử được biến thành các ion để đi vào hệ thống phân
tích, Hiện nay, có nhiều kỹ thuật để biến các phân tử trung hòa thành ion. Tùy từng kỹ
thuật, mức độ bị ion hóa của các phân tử có thể khác nhau, từ ion hóa mạnh cho các
chất dễ bay hơi và bền tới ion hóa nhẹ nhàng cho các phân tử lớn, khó bay hơi.
Cách cổ điển nhất để ion hóa các chất là kỹ thuật bắn phá electron hay sau này còn
được gọi là ion hóa bằng electron (electron impact hay electron ionization, EI). Người
ta dùng một chùm electron để “bắn phá” phân tử mẫu ở trạng thái hơi, Điều kiện chuẩn
để thực hiện EI là 70eV, Phổ EI thu được ở điều kiện này có thể dùng để so sánh với
phổ chuẩn để xác định các chất.
EI là phương pháp ion hóa mạnh, nhiều chất trong điều kiện này bị phân mảnh đến
mức không còn nhậ thấy ion M+ nữa. Để có thể phát hiện được M+, nhiều kỹ thuật ion
hóa nhẹ nhàng hơn đã được áp dụng, Ion hóa hóa học (Chemical Ionization, CI) là một
trong những kỹ thuật sớm nhất được sử dụng. Nguyên tắc của phương pháp là trong

29
buồng ion hóa, người ta đưa vào một chất khí khác (được gọi là khí thử). Chất này sẽ
bị ion hóa và các ion này sẽ tác động lên mẫu để ion hóa mẫu tạo ra M+ hay các ion
cộng tương ứng. Các khí thử thường dùng trong CI là methan, isobutan hay ammonia.
Quá trình ion hóa mẫu thử M với khí thử là ammonia xảy ra như sau:
NH3 + e- → NH4
+
+ 2 e-
NH4+ + M → NH3 + [M+H]+
Phân tử proton hóa
NH4+ + M → [M+NH4]+
Ion cộng amoni
Với CI, phổ MS thu được có số lượng các ion ít hơn và cường độ các ion cao hơn nên
dễ xác định được phân tử lượng của mẫu.
EI và CI chỉ thích hợp với kỹ thuật đưa mẫu rắn (phân tích trực tiếp các mẫu
tinh khiết) và khí (như GC-MS). Với dạng mẫu lỏng như trong HPLC–MS, CE-
MS…các kỹ thuật ion hóa nhẹ nhàng ở áp suất thường như ion hóa phun điện
(electrospray ionization, ESI), ion hóa hóa học ở áp suất thường (atmospheric pressure
chemical ionization, APCI), ion hóa phun nhiệt (Thermospray Ionization, TS hay TSP)
thường được sử dụng. Các chất dễ bị phân hủy nhiệt, khó hay không bay hơi cũng có
thể áp dụng tốt bởi các kỹ thuật ion hóa này.
Với ESI, dung dịch mẫu được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân
không dưới một điện trường mạnh. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hoiw dung
môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các ion (dương hay
âm) cần được phân tích sẽ được đẩy vào bộ phận phân tích khối, Các phân tử bị ‘vỡ’
nhẹ nhàng hơn tạo ra ít phân mảnh và có cường độ lớn hơn. Với các polymer (với M
tới vài chục ngàn đơn vị khối), điện tích của các ion (z) sẽ >1 (có thể tới 20 hay hơn)
do vậy vẫn có thể được phân tích trong thiết bị phổ với m/z 1000-2000.
APCI tạo ra các ion dương được proton hóa hay ion âm do loại bỏ khỏi phân tử,
Dung dịch mẫu được hóa hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào trong vùng
plasma của các ion dung môi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển. Sự cho nhận
proton xảy ra giữa mẫu và dung môi tạo nên các ion của mẫu thử.
Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưới áp suất tương đối cao qua 1 mao
quản được nung nóng bởi bằng nhiệt điện. Khi ra khỏi ống mao quản, dung môi được

30
hóa hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộ
phận phân tích khối, TSP có thể áp dụng cho những hệ thống có tốc độ dòng cao
(HPLC). Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lớn được thay thế bằng ESI.
Ngoài những phương pháp ion hóa trên được sử dụng nhiều trong phân tích các
hợp chất phân tử nhỏ còn có nhiều kỹ thuật ion hóa khác sử dụng cho các đại phân tử.
Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (Fast Atom Bombardment, FAB), các
kỹ thuật giải hấp trường (Field Desorption, FD), giải hấp laser (Laser Desorption, LD)
và một trong những kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợ
bởi chất nền (matrix – assisted laser desorption ionization, MALDI). Với MALDI,
mẫu được trộn với dung dịch chất nền và được làm khô dung môi trên phiến kim loại
rồi đưa vào buồng ion hóa của máy phổ khối chứ không kêt nối trực tiếp được với hệ
thống sắc ký.
Bộ phận phân tích khối
Nhiệm vụ của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộ
phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo m/z để đưa các ion này tới detector để ghi
nhận phổ, Có nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường và
vận tốc của các ion…Các bộ phận phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khối
gồm có các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap),
thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier
(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR).
Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khối là thiết bị sử dụng từ trường, Dưới một
từ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích và
khối lượng ion. Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đi
vào detector, Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và có độ chính xác cao
nhất được dùng trong các máy khối phổ phân giải cao (HR-MS).
Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại có tiết diện tròn hay hyperbol đặt song
song với nhau dài khoảng 100 - 200 mm. Một điện thế một chiều không đổi được điều
biến bởi điện thế tần số radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực.
Dưới tác động của điện trường, chỉ có những ion nhất định bay dọc theo tứ cực đi tới
detector. Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngoài.

31
Thay đổi dòng điện tần số radio trên tứ cực sẽ lần lượt cho phép các ion khác nhau bay
vào detector và được ghi nhận thành phổ.
Bẫy ion có cấu tạo gồm một điện cực vòng với mặt trong có dạng hyperbol và hai
điện cực chỏm nằm ở hai đầu trống của điện cực vòng cũng có dạng hyperbol. Bằng
cách thay đổi điện thế các điện cực, người ta có thể điều khiển được quỹ đạo của các
ion trong bẫy. Tuy nhiên, khác với tứ cực, các ion khi đi vào bẫy ion sẽ bị giữ tại đó
bởi điện trường nếu điện thế của điện cực vòng và 2 điện cực chỏm không khác nhau.
Thay đổi điện thế và tần số của điện cực vòng sẽ lần lượt quét các ion ra khỏi bẫy đi
tới detector để ghi nhận thành phổ. Thay đổi thế của hai điện cực chỏm sẽ giữ lại một
hay một vài ion nhất định trong bẫy (trong chế độ chọn lọc ion) hay gia tốc các ion
(trong chế độ MS nhiều lần).
Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất có m/z tới 5000. Độ chính xác khối
của tứ cực và bẫy ion không cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đơn giản, dễ sử
dụng và rẻ tiền hơn nên được áp dụng nhiều trong các hệ LC-MS.
Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion. Ở
cùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion. Phân tử
càng nhẹ vận tốc càng lớn. Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tới
detector sẽ tính ra được khối lượng của ion. Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xác định
thời gian bay của ion (TOF), TOF có độ phân giải tương đối cao (tới 20,000), với số
khối chính xác hơn (tới 0,0001). Khoảng phân tích khối của TOF là không giới hạn, rất
hữu dụng cho việc phân tích các đại phân tử.
Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổi
Fourier (FT-ICR). Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường
mạnh ở bên và một điện trường theo hướng trục. Giống như trong cộng hưởng từ hạt
nhân, tất cả các ion trong buồn được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng
(10KHz - 1MHz), Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion
cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tần
số nhất định phụ thuộc vào m/z.Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhận
dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đó được biến đổi
Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống, FT-ICR có độ phân giải và độ chính

32
xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m/z tới 10,000).
Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện có thể đạt tới mức attomole. Khi
phối hợp với ESI, FT-ICR có thể phân tích các protein tới 15,000 đơn vị khối.
Ngoài các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, còn có các loại khác đã hoặc đang
được phát triển như bẫy quỹ đạo (orbital trap) hay dựa trên tính linh động của ion (ion
mobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên.
Detector
Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiện điện để được ghi nhận thành các
tín hiệu phổ khối, Có nhiều loại detector khác nhau nhưng thường là loại ống nhân
điện, ống nhân quang… các tín hiện điện thu được từ detector sẽ được số hoá và lưu
trữ dưới dang các tập tin kỹ thuật số.
Trong phân tích khổ phối, việc xác định chính xác một ion (M+
hay các phân
mảnh) rất quan trọng cho việc xác định chất được phân tích. Một hợp chất xác định,
trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối. Tuy nhiên, một
ion có số khối xác định trên phổ khối lại có thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau.
Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký - khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảm
bảo, các chất tách ra không hoàn toàn dẫn tới phổ khối thu được sẽ có các ion của các
phân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả. Trong các trường hợp này,
việc xác định MS thông thường (một lần) khong cho được kết quả chính xác. Để khắc
phục, người ta sử dụng các kỹ thuật khối phổ n lần với n thường là 2 hay đôi khi hơn.
Kỹ thuật này được gọi là MS/MS hay MSn.
Nguyên tắc của các kỹ thuật này là lực chọn một ion xác định (thường là
M+
nhưng cũng có thể là các ion con) trong các ion của lần ion hoá thứ nhất và loại bỏ
tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion này sau đó được cho tiếp xúc
với 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon). Với vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vào
các phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn. Các ion sinh ra trong lần phân mảnh
thứ 2 này sẽ được phân tích và ghi nhận phổ MS, Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1
loại ion duy nhất nên không còn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa. Việc
nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khih hàm lượng chất
phân tích thấp và năm trong hỗn hợp phức tạp.

33
Các thiết bị để thực hiện MS/MS có 2 loại chính là: loại phổ khối nối tiếp và bẫy
ion.
Loại cổ điển nhất của phổ khối nối tiếp gồm 3 tứ cực ghép nối tiếp với nhau. Tứ cực
thứ nhất làm nhiệm vụ chọn lọc ion. Các ion được chọn sẽ bay vào tứ cực thứ 2 và va
đập với khí argon để phân mảnh ion lần 2. Tất cả các ion tạo ra sẽ bay vào tứ cực thứ 3
và được quét lần lượt bởi điện trường để đi tới detector và ghi nhận thành phổ. Do cấu
tạo bởi 3 tứ cực nên loại này thường được gọi là triplequad (triple quadrupoles).
Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy tra trong bẫy theo trình tự thời gian. Vì
các ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh có thể được thực hiện thêm nhiều
lần nữa, Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chóng do số
ion giảm, Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2.
Ngoài hai thiết kế cơ bản trên, còn có các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợp
giữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫy
ion và TOF)… Các loại thiết bị này kết nối với GC, HPLC…hiện có mặt trên thị
trường.
Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phân
tích các chất có nguồn gốc tự nhiên. Phổ khối cho nhiều thông tin về các trúc để xác
định cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết. Phổ khối có độ nhạy cao,
khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt là
trong phân tích vết.Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối có thể sử dụng như một
detector phổ thông, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion nó lại là
detector chọn lọc cho những chất xác định rất có ích trong việc định lượng các chất
trong một hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị phổ khối ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giới
hạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dang và giá thành
ngày càng hạ, Điều này làm cho thiết bị khổ phối dần trở thành các phương tiện phân
tích thường quy trong phân tích dược liệu.

35
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Lá sen được thu hái tại khu vực quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.
- Lá sen thu hái gồm 2 dạng: một loại lá còn non, lá còn cuộn lại, chiều dài
khoảng từ 10-15cm và một loại lá đã trưởng thành (lá xòe rộng đường kính từ
20-30cm).
H
ì
n
h
Hình 2.1: Lá sen non Hình 2.2: Lá sen trưởng thành
2.2. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm
- Máy sấy; Máy cô quay chân không; Máy lọc chân không.
- Máy lắc; Hệ thống chạy khối phổ MS; Máy quang phổ UV-Vis 2000
- Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy.
Hóa chất
- Thuốc thử Folin-Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa 20%;
Acid Gallic.
- Rutin, dung dịch AlCl3 2%, đệm photphast (pH=6,6)
- Vitamin C ; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Methanol
- Dung dịch FeCl3 0,1%; dung dịch K3Fe(CN)6 1% ; CCl3COOH 10%
- Chloroform, NH4OH 25%, H3PO4 3%, NH4OH 10%.
- Ethanol 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, PE, Cloroform, Ethyl acetate.

36
2.3. Phương pháp thí nghiệm
Sơ đồ tiến trình thí nghiệm
Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm
Lá sen trưởng
thành và lá non
Vi phẫu lá còn tươi
Sấy khô
Xay nhỏ
Định tính sơ bộ
TPHH
Thử độ tinh khiết
& soi bột
Ngâm dầm trong cồn với các
nồng độ khác nhau
Thu cao
Xác định hàm
lượng cao thu được
Định lượng một số
hợp chất thức cấp
Polyphenol tổng số
Flavonoid tổng
Alkaloid tổng số
Thử hoạt tính
kháng oxy hóa
Xác định TPHH bằng
phương pháp LC-MS

37
2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu
2.3.1.1. Phương pháp vi phẫu
Chọn mẫu
Dùng mẫu lá tươi để thực hiện vi phẫu. Mẫu lá sen không quá già cũng cũng không
quá non (DĐVN quyển III).
Cắt vi phẫu
Cắt mẫu bằng tay với dao lam. Dao lam mới, khi cắt đặt dao lam thẳng góc với
mẫu vật.Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến lá sen. Bỏ bớt phần
thịt lá 2 bên, còn lại bề rộng 0,6 - 0,8cm. Độ dày lát cắt khoảng <1mm. Chọn các
lát cắt thật mỏng để nhuộm.
Nhuộm vi phẫu

38
Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu
2.3.1.2. Phương pháp soi bột
Chuẩn bị bột để soi
Lấy lá sen cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60o
C, tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng
máy xay. Rây qua rây số 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được tán hoặc xay và rây
tiếp (có thể sấy lại cho dễ xay tán, nếu cần) cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột
mịn
Bột lá sau khi xay mịn thường có màu xanh lục hoặc xanh nâu. Các cấu tử thường
thấy là: biểu bì mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch
gỗ v.v…
Làm tiêu bản bột
Ngâm vi phẫu trong Javel
(t=15-20 phút)
Rửa bằng nước cất
(3-4 lần)
Ngâm vi phẫu trong acid acetic
10% trong 2 phút
Rửa bằng nước cất
(3-4 lần)
Ngâm vi phẫu trong thuốc nhuộm
2 màu (t=15 phút)
Rửa mẫu bằng nước cất và ngâm
ngay vào nước

39
- Cho 1 giọt nước cất vào giữa lame kính, lấy một ít bột cho vào giữa chất lỏng
- Đậy lamette lại, Dùng ngón trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử phân tán đều.
- Loại bỏ phần bột và nước cất thừa bằng giấy thấm rồi quan sát bằng kính hiển
vi
- Nêu không nhìn thấy rõ vân tễ có thể bổ sung thêm 1 giọt dung dịch KOH 5%
để quan sát rõ hơn
2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu
2.3.2.1. Xác định độ ẩm
Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối
lượng do làm khô . Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường.
theo DĐVN III Phụ lục 5.16 (Trang PL-98).
Cách thực hiện
Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125-1300
C trong 1h. Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút.
Dùng cân phân tích có độ chính xác 0,001g cân khối lượng của cốc.
Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt vào
tủ sấy ở nhiệt độ 125-1300
C trong 1 giờ và cân khối lượng.
Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5
mg.
Tính toán kết quả
Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức:
%
Trong đó: W: độ ẩm của dược liệu (%)
mbd: Khối lượng ban đầu (g)
msay: Khối lượng sấy (g)
2.3.2.2. Xác định tro toàn phần

40
Xác định tro toàn phần theo DĐVN Phụ lục 7.5 và 7.6 (Trang PL-128 -129)
Cách thực hiện
Trong chén nung bằng sứ, đường kinh 35mm, sơ bộ đã đem nung đỏ, để nguội
và cân bì.
Cân chính xác 5g lá sen đã được cắt nhỏ cho vào chén nung.
Lúc đầu đốt nhẹ rồi tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết. Cần theo dõi và
điều chỉnh nhiệt độ để tránh than không bị thoát ra khỏi miệng chén.
Đốt xong cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 5000
C cho đến khi thu được khối
lượng không đổi. Để tránh các dược liệu hóa gỗ tạo ra than khó đốt cháy, có thể ngừng
nung rồi làm ẩm bằng nước cất hoặc acid nitric đậm đặc rồi đem nung lại.
Sau khi tro không còn màu đen, để nguội trong bình hút ẩm và đem cân.
Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức sau

Trong đó: X: tỉ lệ tro toàn phần. tính ra phàn tram
a: Khối lượng chén có tro
b: Khối lượng chén không
c:Khối lượng dược liệu dung
W: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm

41
2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết
2.3.3.1. Sơ đồ quy trình
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen
- Ngấm kiệt với cồn 60%, 70%, 80%, 90%, 96%
- Cô quay loại dung môi
Bột dược liệu khô
Cao chiết cồn-nước
- Nước
- Dung môi CHCl3
Dịch chiết CHCl3 Dịch chiết cồn-nước sau lắc
CHCl3
Dung môi EtOAC
Cô quay loại
dung môi
Et-F
Phân tích
bằng sắc
ký LC-MS
Xác định TPHH
Dịch chiết cồn-nước
sau lắc EtOAC

42
2.3.3.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu : lá sen tươi được lựa chọn, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 600
C và
xay cho đến khi tạo thành bột có kích thước từ d=1,5-2 mm.
Chiết
Mục đích: Chiết các hợp chất có trong lá sen nhờ dung môi ethanol với nhiều
nồng độ khác nhau, nhằm khảo sát nồng độ dung môi nào phù hợp vớitừng đối tượng
lá sen, Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24h, trên máy lắc 150 vòng /phút.
Cách thực hiện : Ngâm bột lá sen vào 200ml dung dịch ethanol tại các nồng độ
khác nhau, Để trên máy lắc 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Lọc
Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch
chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình tinh chế. Thể tích dung dịch sau lọc
V=175ml
Cô quay
Nhằm thu hồi dung môi ethanol để tái sử dụng, Dịch sau cô quay được chuyển
sang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác không mong muốn cũng như thực hiện
quá trình tiếp theo.
Cô quay bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ 70 – 800
C, sau đó tiến hành quá trình
xử lý chloroform.
Xử lý chloroform
Mục đích: Sau khi xử lý lá sen bằng dung môi chiết, thì trong dịch chiết, ngoài
polyphenol và các alkaloid cần thiết, còn có mặt cafein, pigment và polysacarit, Để
tách cafein và các tạp chất dịch trích sau khi loại dung môi chiết được xử lý với
chloroform để giải phóng polyphenol, alkaloid tự do.
Lắng
Mục đích : Do chloroform không hòa tan trong dịch trích chứa polyphenol,
Alkaloid mà chỉ hòa tan cafein và các tạp chất nên sau khi xử lý cần quá trình lắng để
cho tách lớp.

43
Cách thực hiện: Chloroform có khối lượng riêng cao nên sau khi tách lớp nằm
phía dưới, tiến hành loại chloroform bằng bình chiết hoặc cẩn thận hút lớp dung dịch
phía trên ra khỏi chloroform.
Cô quay loại dung môi
Nhằm loại bỏ triệt để chloroform ra khỏi dịch chiết và thu hồi chloroform, bằng
cách cô quay 70 – 800
C, trong 30 phút. Dịch sau khi cô đặc được chuyển sang công
đoạn thu nhận sau,
Xử lý ethyl acetate
Mục đích: Dịch chiết sau khi xử lý bằng chloroform tuy đã loại bỏ một phần tạp
chất nhưng vẫn còn lại polysacarit và một số thành phần không hòa tan trong
chloroform. Do đó dịch chiết tiếp tục được xử lý bằng dung môi ethyl acetate nhằm
làm tăng độ tinh sạch của chế phẩm.
Dùng dung môi là ethyl acetate để lôi kéo các chất cần có trong dung dịch. Sau
khi để yên, hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp bên trên là dịch ethyl acetate, bên dưới
là nước. Tách lấy lớp trên là dung dịch ethyl acetate. Dung chiết Et-F được sử dụng để
phân tích sắc ký LC-MS, xác định các thanh phần hóa học của dịch chiết lá sen.
2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được
Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết. Cân khối
lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số lẻ.
Tính toán % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu.
Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo công thức sau:
Trong đó: mcao : khối lượng cao thu được (g)
mdl : khối lượng dược liệu đem chiết (g)
wdl : độ ẩm của dược liệu đem chiết

44
2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá sen.
Định tính Alkaloid
Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn vào chén sứ, bốc hơi tới cắn, Hòa tan cắn trong
2-4ml dung dịch HCl 5%. Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử Mayer.
So sánh với ống đối chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa:
có alkaloid
Định tính Flavonoid
Nếu hơ một tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có màu
vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Flavon và
flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương, Chalcon và auron có
thể cho màu đỏ da cam.
Định tính Tannin
Pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3
5% lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen, xanh rêu hay nâu (tùy theo số lượng
nhóm OH): có polyphenol trong đó bao gồm cả tannin.
Định tính Saponin
Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn, Hòa tan
cắn trong 5m cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước cất và
lắc mạnh theo chiều dọc, Nếu có bọt bền: có saponin
Định tính các chất khử
Lấy 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn, Hòa cắn với 3ml
nước cất trên bếp cách thủy, để nguội, lọc qua giấy lọc.
Thêm 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B.
Đun cách thủy 5 phút.
Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử (chủ yếu là
đường khử).

45
2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử Folin-
Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bước sóng λ=765 nm,
Hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid Gallic.
Đường chuẩn acid Gallic:
- Chuẩn bị các dung dịch acid Gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5 mg/ml,
- Cho 60 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74ml nước cất, sau đó
cho 300 thuốc thử Folin-Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giấy
đến 8 phút cho vào 900 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản
ứng được giữ ở 400
C trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng λ=765 nm
- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất
nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường
chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán
dựa theo đường chuẩn Acid Gallic trên.
2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi
phản ứng với AlCl3 tại bước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng
(theo phương pháp của Woisky and Salatino)
Dựng đường chuẩn Rutin
- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 960
theo dãy nồng độ sau: 0;
0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 (mg/ml)
- Hút 2ml từ mỗi nồng độ vào 6 ống nghiệm sạch
- Thêm 2ml dung dịch AlCl3 2%
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1h, So màu ở bước sóng λ=420 nm,
chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính toán
dựa theo đường chuẩn Rutin.

46
2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số
Alkaloid tổng số được định lượng bằng phương pháp cân (Tạp chí dược liệu số
2+3/2011).
Nguyên tắc: Trước tiên dung dung môi hữu cơ chiết alkaloid toàn phần trong
môi trường kiềm, Acid hóa dịch chiết kiềm, loại nhựa và các tạp chất khác, Sau đó
kiềm hóa dịch acid và chiết alkaloid ở dạng bazo, làm khô cắn, cân và tính kết quả
Cách tiến hành

47
Nguyên liệu
2,50-3,00g bột lá sen
Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid toàn phần
Tẩm uớt dược liệu bằng 2ml ethanol 960
và
3ml ammoniac 25%
Chiết với chloroform trong máy Soxhlet 4h
Thu hồi chloroform đến cắn khô.
Kiềm hóa dịch acid đến pH 10-11 bằng
ammoniac 10%
Lắc dung dịch đã kiềm hóa với chloroform
Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan,
chuyển vào bình có khối lượng đã biết
Hòa cắn với 15ml acid phosphoric 3% nóng
Rửa cắn và giấy lọc bằng 5ml acid rồi 5ml
nước cất
Thu hồi chloroform
Sấy cắn alkaloid ở 1000
C đến khối lượng không đổi

48
Hàm lượng % alkaloid toàn phần được tính theo công thức:
X =
.
Trong đó:
a: cắn alkaloid (g)
b: Lượng dược liệu (g)
c: Độ ẩm dược liệu (%)
2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử
Năng lực khử của dịch chiết lá được xác định theo phương pháp của Wang và
cộng sự 2008.
Nguyên tắc: Dựa trên giá trị OD tại bước sóng λ=700 nm của dung dịch khi có
sự biến đổi màu sắc từ vàng sang màu xanh lục do sự khử Fe3+
thành Fe2+
Cách thực hiện: theo sơ đồ 2.7.

49
Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm đánh giá năng lực khử
2.3.10.Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH
Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro
và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn
định hơn, Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do
DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch
sẽ giảm đi.
Z + AH = ZH + A,
(1)
Trong đó: Z: là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ôxi hóa
Hút 2,5ml dịch chiết với các nồng độ khác
nhau từ 0,001-0,005 mg/ml
Thêm 2,5ml đệm photphate (pH=6,6).
Bổ sung 2,5ml dung dịch K3Fe(CN)6 1%.
Ly tâm hỗn hợp 3000 vòng/10 phút.
Thêm 0,5 ml FeCl3 0,1%
Đo OD ở bước sóng λ=700 nm
Ủ ở 500
C khoảng 20 phút
Thêm vào 2,5ml CCl3COOH 10%.
Hút 2,5ml lớp trên và cho vào 3,5ml nước
cất.

50
- Đánh giá Khả năng kháng oxy hóa thông qua IC50 là một giá trị nồng độ
của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do
Dựng đường chuẩn Vitamin C
- Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25;
0,5 (mg/ml).
- Dùng micropipet hút 50 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn
2ml dung dịch DPPH.
- Ủ trong tối 15’ ở nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng λ=517 nm.
chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị
IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức
chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định
- Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thông số giá trị IC50
Phần trăm ức chế (%I) = %
Trong đó:
ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol
(ADPPH=0,705)
ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu)
Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y=ax+b theo công thức
2.3.11.Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS
Nguyên tắc: khi dung dịch chạy qua hệ thống phân tích TOF-Time of Fly sẽ cho ra
các peak phân mảnh của các chất có trong dung dịch trên detector. Giải phổ khối
lượng các chất này bằng phần mềm ChemDraw và đối chiếu với ngân hàng dữ
liệu.

51
Cách tiến hành:
- Dịch chiết nguyên liệu được lọc nhiều lần qua màng vi lọc trước khi bơm
vào bộ phận tiêm mẫu, tiến hành cùng phương pháp với dịch chiết cồn.
- Tiến hành thí nghiệm bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ
bắn phá ion dương trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ HPLC Agilent
1200 Series coupled to MS detector, micrOTOF-QII Bruker. Thiết lập các
thông số cho hệ thống: điện thế tần số radio RF buồng va chạm 250,0 Vpp;
tốc độ phun khí gas N2 làm sạch 9,0 l/phút với nhiệt độ dòng khí 20oC; áp
lực bơm phun 1,2 bar; điện thế ion hóa 4500V, điện tích nền -500V, khối
phổ được quét ở chế độ quét liên tục với điểm bắt đầu 50 m/z đến điểm kết
thúc 3000 m/z. Không kích hoạt hệ thống tham số thông minh.
- Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Chemstation cung cấp bởi Agilent
Corporation, MA, USA. So sánh với dữ liệu trong phần mềm Bruker
compass data analysis 4.0 với mức sai số ý nghĩa 0,005 để kết luận.

53
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen
Vi phẫu lá sen
Gân giữa Biểu bì trên tế bào hình chữ nhật khá đều, kéo dài thành núm lồi đầu
tù dài 7,5-15 µm có lỗ khí.
Biểu bì dưới giống biểu bì trên nhưng tế bào dài hơn, vách hóa mô cứng, lớp
cutin dày. Dưới biểu bì trên là mô mềm giậu.
Dưới mô mềm giậu và trên biểu bì dưới là mô dày góc gồm nhiều lớp tế bào đa
giác gần tròn.
Mô mềm khuyết tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước lớn xếp tạo
nhiều khuyết to, ven khuyết có nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
Nhiều bó libe gỗ kích thước không đều, 2 bó to giữa 2 khuyết lớn, một số bó
nhỏ hơn nằm rải rác trong mô mềm. Mỗi bó dẫn gồm gỗ ở trên, libe ở dưới; mạch gỗ
to, hình bầu dục hoặc đa giác gần tròn; tế bào mô mềm libe hình đa giác, kích thước
nhỏ, sắp xếp lộn xộn; nhiều mạch rây hình đa giác.
Bao quanh bó libe gỗ là 1-2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô
cứng thành vòng.

54
Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen
A: Cấu trúc gân lá. B: Mô mềm khuyết với bó mạnh libe-gỗ; C: Biểu bì dưới
D: Biểu bê trên, E: Mô mềm giậu và các tinh thể calci oxalate; F: Mô dày
Soi bột
Hình 3.2: Bột lá sen
Bột lá sen: Bột màu xanh đến nâu, mịn, vị chát. Mảnh biểu bì trên tế bào hình
đa giác, có núm lồi. Mảnh biểu bì dưới tế bào vách uốn lượn. Sợi vách dày, khoang

Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera

Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera

Similar to Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen nelumbo nucifera