Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma spp. với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long
1. New Text Document.txt
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm
trắng trên cây Thanh long
Nguyễn Thị Bích Tuyền
Nguyễn Thị Hai (giảng viên hướng dẫn)
Page 1
2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC.........................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................v
DANH MỤC BẢNG......................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài..........................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu....................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu....................................................................................................2
4. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................................3
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp.......................................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................5
1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp.......................................................................5
1.1.1 Phân loại...........................................................................................................5
1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập.......................................5
1.1.3 Đặc điểm hình thái ..........................................................................................8
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................................10
1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây
bệnh cây trồng .........................................................................................................11
1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động
enzyme chitinase của Trichoderma spp.. ................................................................17
3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ii
1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp. trên thế giới và ở
Việt Nam .................................................................................................................18
1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp. trong nông nghiệp .....................................21
1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây
Thanh long ..................................................................................................................24
1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum..............................................24
1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long..............................................25
1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum.......................................26
1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long ................... 32
1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ
sinh học.......................................................................................................................34
1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam ..............................34
1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost ................................................................34
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................41
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. .......................................................................41
2.2 Vật liệu..................................................................................................................41
2.2.1 Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh.....................................................41
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................41
2.2.3 Hóa chất..........................................................................................................42
2.2.4 Các loại môi trường........................................................................................42
2.3 Phương pháp nghiên cứu. .....................................................................................45
2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm .............................................................46
Giải thích sơ đồ .......................................................................................................46
4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
iii
2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm........................................................48
2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh
long..........................................................................................................................49
2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma ..
.................................................................................................................................50
2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên cây thanh long........................................................................52
2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều
kiện trong chậu ........................................................................................................54
2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng
ruộng........................................................................................................................55
2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma.......57
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................61
3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long ..........................61
3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng
nấm Trichoderma spp.................................................................................................63
3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập.............................63
3.2.2 Đặc điểm sinh trưởng .....................................................................................75
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma
spp. sau 2 ngày nuôi cấy..........................................................................................78
3.3 Khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên thanh long..................................................................................83
3.4 Kết quả định danh chủng Trichoderma T3 ...........................................................88
5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
iv
3.5 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện
trong chậu ...................................................................................................................89
3.6 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng
....................................................................................................................................92
3.7 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma
asperellum...................................................................................................................95
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................98
4.1 Kết luận.............................................................................................................98
4.2 Kiến nghị ..........................................................................................................99
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................100
PHỤ LỤC.........................................................................................................................1
Phụ lục A. Bảng số liệu thô..............................................................................................1
A.1. Tốc độ tăng tưởng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày.............................1
A.2. Đường kính trung bình vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma
sau 2 ngày.........................................................................................................................3
A.3 Đường kính trung bình vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma sau
2 ngày...............................................................................................................................5
A.4. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày đối kháng invitro.
..........................................................................................................................................7
A.5. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 4 ngày đối kháng invitro.
..........................................................................................................................................9
A.6. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 6 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................11
6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
v
A7. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 7 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................13
Phụ lục B: Hình ảnh .......................................................................................................16
B1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp. sau 2 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA.............................................................................................................16
B2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitin (cm) của các chủng
Trichoderma 2NSC ........................................................................................................18
B3 Kết quả khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm
gây bệnh đốm trắng trên thanh long...............................................................................25
B4. Lô thí nghiệm và lô đối chứng trong thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh của chế
phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng............................................................................30
7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CMC: Carboxymethyl cellulose.
NT: nghiệm thức.
ĐC: Đối chứng.
PDA: Potato D-glucose Agar.
VSV: Vi sinh vật
NSC: ngày sau cấy
8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma ........................................... 5
Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí............. 37
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Trichederma asperellum ..
....................................................................................................................................... 54
Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm
Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả bởi Crous & Slippes (2006) ........................... 61
Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập............................ 62
Bảng 3.3 Đường kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau 2 ngày nuôi cấy ................ 75
Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichodema spp......... 78
Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichodema spp.............. 80
Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp. với Neoscytalidium
dimidiatum..................................................................................................................... 82
Bảng 3.7 Chiều dài và khối lượng thanh long trong từng công thức sau 30 ngày thử
nghiệm........................................................................................................................... 90
Bảng 3.8 Tình hình bệnh đốm trắng thanh long ở các công thức................................. 94
Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu
ban đầu và 15 ngày sau ủ .............................................................................................. 94
9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum ................................................. 5
Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp..................................... 9
Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan
....................................................................................................................................... 13
Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết
ra từ Trichoderma harzianum ....................................................................................... 16
Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp ............................................ 21
Hình 1.6 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose ................................................... 35
Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Cellulose..................................................................... 35
Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy
trên môi trường PDA..................................................................................................... 60
Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử..................... 61
Hình 3.3 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma T3, T22 và T26 sau 2 ngày nuôi
cấy trên môi trường PDA.............................................................................................. 77
Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng Trichoderma.T22, TC15 và
TC6................................................................................................................................................................................................. 79
Hình 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng Trichoderma T22, T3 và TC7 ......
....................................................................................................................................... 82
Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 2,4,6,7NSC .................... 86
10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ix
Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm
Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 2,4,6,7 NSC ............................................. 86
Hình 3.8 Sợi nấm Trichoderma T3 tấn công Neoscytalidium dimidiatum dưới kính hiển
vi quang học với độ phóng đại 100X............................................................................ 86
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen 18S......................................................................... 87
Hình 3.10 Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm Trichoderma spp....
....................................................................................................................................... 87
Hình 3.11 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều
kiện trong chậu.............................................................................................................. 88
Hình 3.12 Kết quả thử nghiệm ở điều kiện trong chậu ................................................ 89
Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh của thanh long trong từng công thức 30 ngày sau tưới............. 90
Hình 3.14 Sinh viên thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Trichoderma asperellum
ngoài đồng ruộng........................................................................................................... 92
Hình 3.15 Cây thanh long ở công thức đối chứng và thí nghiệm ................................ 93
Hình 3.16 Cành thanh long bị nhiễm bệnh ở công thức đối chứng (a) và thí nghiệm (b)
....................................................................................................................................... 93
Hình 3.17 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm ............. 95
Hình 3.18 Thanh long ở công thức đối chứng 15 ngày sau ủ ...................................... 95
Hình 3.19 Thanh long ở công thức thí nghiệm 15 ngày sau ủ ..................................... 96
11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw) thuộc họ xương rồng có nguồn gốc
ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Đây là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợp
khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu úng, sau khi trồng một năm cây bắt
đầu cho quả. Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đất như đất xám, đất phù sa, đất
đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có hiệu quả kinh tế cao do giá bán
cao và có giá trị xuất khẩu. Trên thế giới, Thanh long đã và đang là cây ăn quả quan
trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia,
Trung Quốc,…
Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm nay,
nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Thanh long gồm có 3
loại: ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở Việt Nam
là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ.
Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh long
sinh trưởng phát triển tốt. Theo Cục Bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông
thôn), trên cả nước hiện trồng khoảng 33.600 ha cây thanh long thương phẩm. Trong
đó, tại tỉnh Bình Thuận có 24.000 ha, Long An có 5.400 ha và tỉnh Tiền Giang trồng
4.200 ha (năm 2014) [39].
Tuy nhiên, nhiệt độ cao lượng mưa lớn cũng là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh
vật phát triển và gây hại. Trong quá trình sinh trưởng, Thanh long bị gây hại bởi một số
loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi vàng, bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm
nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành
(Sphaceloma sp) và gần đây là bệnh đốm trắng do nấm gây ra.
12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2
Bệnh đốm trắng mới phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013, gây hại trên thân,
quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát
triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả ở các vùng sản xuất Thanh long tập
trung như Bình Thuận, Tiền Giang. Đặc biệt, các vết đốm tồn tại trên quả đã làm giảm
giá trị thương phẩm. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên cây Thanh long ở Việt
Nam hầu như rất ít. Xuất phát từ thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạng
dịch bệnh đặc biệt là bệnh đốm trắng trên cây Thanh long là vấn đề rất quan trọng được
các nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm. Theo Võ Thị Thu Oanh
(2015), nấm gây bệnh đốm trắng thanh long có trong đất, việc lây lan cũng bắt đầu từ
đất và nguồn nấm bệnh trên cành, quả. Hiện vẫn chưa có giải pháp quản lý bệnh hiệu
quả, việc phòng trừ bệnh đốm trắng thanh long chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học để
phun lên cây, nhưng hiệu quả không cao. Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật
trong sản phẩm là rào cản lớn nhất để xuất khẩu thanh long ra các thị trường khó tính
như EU, Mỹ, Nhật... Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài:
“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm gây
bệnh đốm trắng trên cây Thanh long”, nhằm tìm ra biện pháp an toàn để quản lý tác
nhân này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm kiếm các chủng Trichoderma spp. có khả năng phòng trừ nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Đồng thời bổ
sung các chủng mới cho bộ sưu tập nấm Trichoderma spp. của phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
3. Nội dung nghiên cứu
– Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long.
– Xác định khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp
13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3
– Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Trichoderma spp.
– Tuyển chọn chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên thanh long, từ đó đánh giá khả năng
phòng trừ bệnh trên đồng ruộng.
– Xử lí các phế phẩm thanh long bằng phương pháp ủ compost.
4. Đối tượng nghiên cứu
- Các dòng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma.
- Bệnh đốm trắng thanh long.
- Cây trồng: Thanh long.
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm
gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long” có tất cả 3 chương gồm:
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân
bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây thanh long ở Việt Nam. Qua
đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long. Từ đó, đưa ra các kết quả
nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm
Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng
phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương
pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm
tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu
tập trung ở nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma
spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS.
14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
4
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm
Trichoderma với nấm bệnh trên cây thanh long đã được phân lập.
15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
5
1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp.
1.1.1 Phân loại.
Chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794, nhưng
các nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định. Theo truyền thống, hệ thống phân loại
thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và
quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc
phân loại [38]:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Chi: Trichoderma
1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập
Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùy
từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [6]
Hình 1. 1 Hình thái vi thể của
Trichoderma harzianum [38].
16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
6
Một số loài Trichoderma spp. được ứng dụng trong phòng trừ sinh học:
Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma
Tên loài Đặc điểm Hình ảnh
Trichoderma
atroviride
Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,
đạt 8 - 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở
20 0
C, sợi nấm trong suốt, vách dày,
trơn láng rộng 2 - 14µm. Bào tử màu
xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục
đường kính từ 4 - 12µm, khi nấm già
thường mất màu hay màu vàng nhạt
hoặc xám, bào tử già phát ra mùi
hương dừa (Kubicek và Harman,
1998) [6].
Trichoderma
hazianum
Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ
15 - 350
C, pH: 3,7 - 4,7 rất thích
hợp cho sự phát triển của nấm
(Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn
lạc phát triển nhanh, đường kính
khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ 200
C. Bào tử đính có hình
cầu méo đến bầu dục ngắn, màu
xanh lục, vách trơn láng, kích thước
(2,7 - 3,2)x(2,5 - 2,8)µm
17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
7
Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến
trong đất (cook và baker, 1983), nảy
mầm tốt nhất trong môi trường mùn
cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch
và Gams,1980) [5].
Trichoderma
koningii
Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính
3 - 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ 200
C, bào tử có hình trụ
ngắn, vách trơn láng, kích thước
(3,0 - 4,8)x(1,9 - 2,8)µm.
Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp
đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm
vẫn có sự hiện diện của loài nấm
này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ
từ 260
C trở lên tùy theo nguồn gốc
của loài, pH: 3,7 - 6,0 [6].
Trichoderma
hamatum
Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt
7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200
C.
Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng
elip, có kích thước khác nhau tùy
theo chủng (Domsch và
Gams,1980).
Sinh hóa: Nhiệt độ 240
C và pH: 3,7
- 4,7 là những điều kiện rất thuận
lợi cho sự phát triển của
18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
8
Trichoderma hamatum và chúng
phát triển chậm lại ở 00
C (Domsch
và Gams,1980) [5].
Trichoderma
viride
Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách
xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4-
5)x(2,5-3)µm. (cook và baker,
1983) [6].
Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai
nguồn nitrogen đơn giản và phức
tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng
trên nguồn cacbonhydrate như là
nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì
ammonium được sử dụng tốt hơn là
nitrate (Danielson và Davey, 1973)
[19].
1.1.3 Đặc điểm hình thái [9].
19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
9
Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp [38].
Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất.
Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất,
trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của
cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi
mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và
Eveleigh,1998). Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có
liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung
tính hoặc kiềm.
Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân
nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình
trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của
hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3)
rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5
µm.
Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9
cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250
C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng
phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng
tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả
năng này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học
của Trichoderma.
Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến
hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy của đất kháng nấm được
công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide. Các bào tử phân sinh kháng nấm
nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh. Thiết lập quần
20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
10
thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều
loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non
(chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất. Bào tử
sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong
đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma
harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của
Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên
Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp
nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là
monosaccharide, disaccharide, polysaccharide…NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta
thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường
có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng
sinh trưởng của Trichoderma [28].
Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300
C, có một vài loài Trichoderma tăng
trưởng được ở 350
C. Một số ít phát triển tốt ở 400
C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có
độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt
ở pH trung tính [16].
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác
nhau. Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống
trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum
21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
11
thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu
ấm áp.
Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá
trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá
trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa. Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ
đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá
trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng
hoặc ánh sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do
thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm
của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt khác, việc hình thành bào
tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển
trong tối, trước khi để chiếu sáng [26].
1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây
bệnh cây trồng
Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây hại
như: Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytisspp.
và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu
riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua
[1].
Nấm Trichoderma spp. đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau: ký
sinh, tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơi
sống với nấm bệnh [29].
22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
12
1.1.5.1 Cạnh tranh.
Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV. Thiếu
dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến. Trichoderma cạnh tranh
khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng
chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores).
Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng
chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử
dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm
Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. [18].
Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium
spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào
tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự
nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào
tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây
bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương,
do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh [18].
Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng
trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây
bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại
những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự
cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát
nấm bệnh F. oxysporum [26].
23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
13
1.1.5.2 Kí sinh [11].
Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung
quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi
nấm. Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của
nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh. Những
nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho
thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự
xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy
phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi
nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá
rối từng phần hoặc hoàn toàn.
Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng
các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Một điều quan trọng cho sự ký sinh
của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bao tử của nấm Trichoderma sau
khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành
được thể giác bám. Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào
Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm
gây bệnh Rhizoctonia solani [22]
24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
14
của nấm vật chủ. Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm
Trichoderma với nấm vật chủ.
1.1.5.3 Tiết kháng sinh [9].
Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký
sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của
nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động
của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.
Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh
nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh
Rhizoctonia solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh
không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng
sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một
trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức
chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác.
Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm:
–Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm
1936 do nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh
ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm
(Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…).
–Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo
thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945.
Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như
một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T.
virens.
25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
15
–Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát
hiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài
T. koningii và T. aureoviride.
Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có
liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,
isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh
gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra.
Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt
các hợp chất hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể
được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone
(6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii)
peptaibol. Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22
aminoacid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa
một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T. polysporum, harzianum,
koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình
thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự
phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh.
Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của
Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh.
Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T. harzianum bổ sung vào môi trường nuôi
cấy của chủng Pythium ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa
kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng T. harzianum, ức chế sự phát triển của chủng
Pythium ultimum [23].
26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
16
Hình 1. 4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết
ra từ Trichoderma harzianum [9].
1.1.5.4 Tăng khả năng kháng của thực vật.
Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn
trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng kích
thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường hợp này,
các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ
miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều
kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và
phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin, ligin… trong các phế
thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng
[41].
Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ, sau
đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều này được
xem như là phản ứng phòng vệ của cây. Khi bón T. harzianum vào rễ cây đậu cho thấy
rằng giảm được từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra. Các nhà
khoa học đã sử dụng T. harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng
chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng T. harzianum T39
27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
17
ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thương
cho cây (Audenaert et al., 1998). Theo Yedidia et al. (1999), thì sự kích hoạt hệ thống
phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử lí với T. harzianum T-203. Những rễ
được bổ sung chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và
perosidase cao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ. Còn những cây dưa leo
được xử lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ
của thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhưng không giống với khi xử
lí bằng T. harzianum. Theo Khan et al. ,(2001) thì T. hamatum chủng 382 kích ứng hệ
thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra
[18].
1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động
enzyme chitinase của Trichoderma spp. [15]
Trichoderma spp. có khả năng phân giải vách tế bào nấm. Harran (2004) đã khảo
sát cơ chế phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát sinh học
của Trichoderma harzianum. Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa vào hoạt tính
của enzyme chitinase, glucanase và protease. Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh,
sợi nấm của nấm kí sinh tạo lỗ hổng trên vách của sợi nấm ký chủ. Màu sắc của sợi
nấm ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết hợp của fluorescein
isothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcoflour White. Cả phức hợp
này được gắn với B – glucan và oligomer N – acetyl – D – glucosamine. Hiện tượng
này được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại vị trí tiếp xúc bởi
Trichoderma harzianum khi phân hủy vách của Rhizoctonia solani và Sclerotium
rolfsii. Nếu có sự hiện diện của cycloheximid, hiện tượng đối kháng bị ngăn chặn và
hoạt tính của enzyme bị suy giảm. Hoạt tính của enzyme chitinase cũng được tìm thấy
khi Trichoderma tấn công Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii trong môi trường
đất.
28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
18
T. harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết B – 1,3 – glucanase và
chitinase nhiều hơn những chủng không có khả năng tấn công nấm bệnh, khả năng đối
kháng của Rhizoctonia solani khi bị T. harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu.
Sợi nấm T. harzianum khi xâm chiếm vào hạch của Sclerotium rolfsii và tạo lỗ trên bề
mặt của hạch này, cuối cùng làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất của
nó.
Các chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc vào hoạt tính enzyme thủy phân
được để tấn công sợi nấm của các loại nấm bệnh.
1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp. trên thế giới và ở
Việt Nam
1.1.7.1 Trên thế giới
Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm
Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan,
Philippin…) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng.
Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp. và R.
solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981). Ở Ấn Độ, hiệu quả ức
chế bệnh do R. Solani gây trên khoai tây của nấm T. harzianum đạt tới 89,1%. Ở Thái
Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm S.rolfsii: tỷ lệ cây
sống đạt 91,7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61,9%. Ở Philippin, nấm
T.harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh
khi dùng T.harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86% (Davide, 1991).
Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự (1979),
Wu. W. S (1996) dùng chế phẩm Trichoderma spp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại
cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm
Trichoderma sp. có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh,
29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
19
tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây.
Nghiên cứu của Diby và cộng sự, 2003 đã ghi nhận nấm Trichoderma
harzianum IISR - 1369, 1370 được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu có khả năng
kích thích sinh trưởng và hạn chế được bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm
Phytophthora capsici gây nên. Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma
harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR - 11 cho hiệu quả
phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36% [25].
Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối
kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy [29].
Năm 2011, Th. Kamala và S. Indira đã chọn được 21 chủng Trichoderma để đối
kháng với Pythium aphanidermatum cũng bằng phương pháp đồng nuôi cấy. Và ông
cũng đã thử nghiệm thành công 4 chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh
Pythium aphanidermatum ở điều kiện nhà lưới [32].
1.1.7.2 Tại Việt Nam
Tuy chỉ mới được nghiên cứu khoảng 20 năm tại Việt Nam nhưng Trichoderma
spp. đã có ảnh hưởng rất lớn trong lĩnh vực nông nghiệp. Với việc sử dụng chế phẩm
Trichoderma đã làm giảm đáng kể các nấm gây bệnh như: Rhizoctonia solani,
Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Pythiumaphanidermatum và Rhizoctonia
bataticola. Việc sử dụng chế phẩm này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì
lâu hơn. Ngoài ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại về môi trường
do tập quán sử dụng thuốc hóa học gây ra. Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng
sản phẩm thương mại Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các
viện nghiên cứu và các công ty phân bón [9].
Một số đề tài nghiên cứu về nấm Trichoderma ở Việt Nam:
Tác giả Trần Thị Thuần và cộng sự (2004), đã tiến hành phân lập từ các nguồn
30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
20
khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đã thu thập, kết quả cho
thấy các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 - 85,5% đối với các nấm
gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp. , Aspergillus spp.[-6]
Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tinh đối kháng của
nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên
cây lúa và bắp”. Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp. có
khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum [9].
Theo Trần Kim Loang và cộng sự (2008), sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm
Trichoderma virens và Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% mỗi tháng một lần,
hạn chế được sự phát triển và gây hại của bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu và ca cao
trong điều kiện vườn ươm. [17]
Hồng Châu, 2009 cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải
chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian
hoai mục [4].
Năm 2010, Trần Nguyên Hà với đề tài “Sử dụng các chủng Trichoderma để điều
khiển sinh học các tác nhân gây bệnh trên cây trồng ở Việt Nam” kết quả là phân lập
được 7 chủng Trichoderma từ một số cây trồng ở Việt Nam có khả năng kiểm soát tốt
các loài nấm bệnh. Nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Ngọc Anh Thư thuộc
viện cây ăn quả miền nam đã phân lập được 3 chủng nấm Trichoderma cho hiệu quả
đối kháng tốt với nấm Phytophthora và Fusarium. Hiệu quả sản phẩm được kiểm tra
trên cây ăn quả và cây hoa được kiểm chứng bằng số khuẩn lạc của nấm Fusarium có
trong 1g đất sau khi tưới nấm Trichoderma giảm rất nhiều so với đối chứng và so với
trước khi tưới [9].
Theo các tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2012), sử dụng nấm đối kháng
Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây cao su
31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
21
đã được một nhóm tác giả thuộc Viện Bảo vệ Thực vật nghiên cứu. Trong điều kiện
phòng thí nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả năng phòng trừ bằng ký sinh sợi
nấm đạt hiệu quả là 100% đối với nấm Phytophthora Botryosa và nấm Phytophthora
Citrophthora. Khả năng phòng trừ bằng chất kháng sinh bay hơi đạt hiệu quả là 84,8 –
93,4% đối với nấm Phytophthora Botryosa và đạt hiệu quả là 90,4 – 91,8% đối với nấm
Phytophthora Citrophthora. Các nguồn khác có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả
thấp hơn (70,3 – 85,9). Nấm Trichoderma asperellum có khả năng đối kháng cao với
nấm Phytophthora spp. gây bệnh trên cao su bằng ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất
kháng sinh bay hơi. Đồng thời nấm này có hoạt độ các enzyme phân giải như Cellulase,
Chitinase, β-Glucanase cao [10].
Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp.
1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp. trong nông nghiệp
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông
Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy
hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông
Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho ta thấy:
1.1.8.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây
32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
22
Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho
cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối
kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và
Fusarium [2].
Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề
mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi
tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng
hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như
“thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh
đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy
chúng [13].
Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích
thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các
chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [2].
Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có
khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có
khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm.
1.1.8.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng
Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma
bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những
chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả
năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ
tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma
bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều
cao của cây, tăng năng suất cây trồng.
33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
23
Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số
lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như
bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [2].
1.1.8.3 Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan.
Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà
trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình
phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để
bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh
các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm
bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn.
Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó
được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được
bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên
cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho
năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ
với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón
100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại cho
cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón
100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14]. Với những hiệu quả mà chế
phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho
việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng,
góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp.
34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
24
1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây
Thanh long
1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum
Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái
tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm
trắng trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B. Sutton & Dyko, 1989),
hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006)
[31].
Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N.dimidiatum (Agrios, 2005; Crous & Slippers,
2006).
Ngành: Ascomyta
Lớp: Dothideomycetes
Bộ: Botryosphaeriales
Họ: Botryosphaeceae
Chi: Neoscytalidium
Loài: Neoscytalidium dimidiatum
N. dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh
dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một
nhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành
cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo
bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên
cạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người, gây
nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản dinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy
chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính
(conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn
bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh
35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
25
chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân
lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai
đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn
đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả
thể mở lỗ và quả thể hở.
1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long [36]
Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi
khác nhau mà bà con nông dân trồng Thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long
An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất
và chất lượng trái Thanh long và có xu hướng ngày càng phát triển và lây lan rộng trên
diện lớn, ảnh hưởng đến xuất khẩu.
Triệu chứng:
Bào tử nấm nảy mầm trên bề mặt thân cành, quả thanh long, sau đó xâm nhập vào
trong mô gây hoại tử
Trên cành: Khi mới xuất hiện, vết bệnh là những chấm li ti (như vết kim châm)
nhỏ, hơi lõm vào bề mặt bẹ hoặc trái và chuyển sang màu trắng sau khoảng 3-4 ngày.
Về sau vết bệnh xuất hiện những chấm nhỏ màu cam ở vị trí trung tâm được bao bọc
bởi vòng tròn màu vàng (10-20 ngày) và dần dần vết bệnh nổi lên thành đốm tròn màu
nâu (18-20 ngày).
Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, các vết bệnh phát triển lan rộng ra, liên kết
nhau thành từng mãng lớn làm sần sùi bề mặt cành, trong một số trường hợp bệnh gây
thối từng mảng lớn.
Trên quả: Bệnh tấn công và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của quả,
đặc biệt ở giai đoạn sau trổ hoa và giai đoạn chuẩn bị chín. Triệu chứng bệnh gây hại
36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
26
trên quả cũng tương tự như trên cành và những quả nhiễm nặng thì không thể bán
được.
Tác nhân: Do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra.
Điều kiện phát sinh:
Bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mưa (tháng 5 đến tháng 11
dương lịch). Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 30-350
C và ẩm độ càng cao tạo
điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan nhanh.
Nguồn bệnh và sự lây lan:
Ở điều kiện ngoài đồng, bệnh thường tồn tại trong đất, tán cây, xác bả thực vật có
trên vườn hoặc trên cành, trái bị bệnh không được tiêu hủy.
Bào tử nấm bệnh lây lan chủ yếu qua hom giống, cành và quả thanh long bị bệnh,
qua gió, dòng nước chảy và qua dụng cụ cắt tỉa
1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum
1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì
vậy, việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất
nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một
số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium
agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp). Tuy nhiên những
năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium dimidiatum đây là
một bệnh có ảnh hưởng lớn đến năng suất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho
người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp thiết trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới
đã nghiên cứu tìm hiểu về nấm N.dimidiatum.
37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
27
Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi
và cs, 2008) [27] vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý
ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi (cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck cv.
Tarocco Scires) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồi
kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm.
Trong một thời gian ngắn xuất hiện khối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây
và trên bề mặt vết thối. Sau khi phân lập trên môi trường PDA, xác định nấm có đặc
điểm giống nấm Scytalidium với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân nhánh có
vách ngăn, bào tử hình trứng, elip, đỉnh tròng có 0-2 vách ngăn, màu nâu. Sau khi phân
lập tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiết suất từ sợi nấm sau đó
sử dụng các mồi V9G và ITS4 để khếch đại operon rRNA hạt nhân kéo dài đầu 3’ của
gen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, gen rRNA 5.8S, và một phần của
kết thúc 5’ của gen 28S rRNA. Sau khi phân tích trình tự DNA trên cơ sở đặc điểm
hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác định là do nấm N.dimidiatum gây ra.
Bệnh đã được kiểm tra lại bằng phương pháp lây nhân tạo trên cây cam ngọt 2 tuổi.
Theo báo cáo đầu tiên về nấm N.dimidiatum và N.novaehollandiae trên cây xoài
tại Australia của ( J. D. Ray, T. Burgess anh V. M. Lanoiselet. 2010). N.dimidiatum là
loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt sung, vả, cây có
múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al. 1980). N.dimidiatum còn
gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012).
N.dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm
cây chết. Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N.dimidiatum là
độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970; Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar
2001).
N.dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh chết
mầm của xoài (2010). Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ
38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
28
nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thực
hiện. Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nghiên cứu đã tiến hành phân lập
các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ cây sung, sau khi tiến hành phân lập đã
phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối rễ, thối cây…là do nấm
Neoscytalidium spp gây ra. Neoscytalidium spp tiếp tục được phân lập và tiến hành giải
trình tự một phần DNA của từng vùng ITS kết qủa xác định là do Neoscytalidium gây
ra. Trong cuộc khảo sát, N.dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại
Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst,
Northen Territory vào tháng 10 năm 2008. Sau khi phân lập, các nhà khảo sát đã tiến
hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Kock đã thu được kết quả tốt. Tiến
hành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo
sát đã phát hiện rằng N.dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian
dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiate 1914)). Theo báo cáo này, yếu
tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh.
Trước đây N.dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum
dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula
toruloidea,…(Crous et ai. 2006).
Theo nghiên cứu của Mohd và ctv. 2013 viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại
học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã
xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ,
tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm N.dimidiatum gây ra.
Năm 2008, 2009 nấm N.dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở
Malaysia. N.dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau đó mục
nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 250
C trong
7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA , nấm có quả cành màu đen,
đường kính 90 mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2
39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
29
vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phản
ứng khếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để so
sánh đánh giá bệnh.
Đến tháng 7 năm 2011 bệnh đốm trắng trên Thanh long đã được phát hiện ở
Trung Quốc với các đặc điểm là có nhiều vết nhỏ đốm nâu nhỏ hơn các vết bệnh ban
đầu, các vết này lan rộng và hình thành các vùng rộng lớn gây chết hoại. Nấm được
nuôi cấy trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) và ủ ở 280
C trong 3 ngày. Sau
khi phân lập tiến hành phản ửng PCR (phản ứng khếch đại gen), DNA được chiết suât
từ sợi nấm đã được nuôi cấy trong 7 ngày sử dụng Kit DNAsecure thực vật, miếng đệm
ghi chép nội bộ (ITS) khu vực của rDNAs từ phân lập được khếch đại bởi mồi ITS1 và
ITS4.
Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium
dimidiatum gây hại trên Thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc.
1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:
Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gây bệnh đốm trắng trên cây
Thanh long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam
(2011) rằng bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Nấm này còn
có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula
toruloidea,… bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích
hợp cho nấm phát triển từ 20-300
C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho
bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua
theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh
kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân
chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón
thiếu trung vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó
40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
30
phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau
chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có
màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị
thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn
chuẩn bị thu hoạch.
Năm 2009, khi những ổ dịch đầu tiên được phát hiện ở Bình Thuận thì một số nhà
chuyên môn nhận định trên báo chí rằng: “Đây là bệnh do sinh lý, do thâm canh kém
và thắp đèn quá mức” (Báo điện tử nông nghiệp).
Tại Việt Nam mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhân gây bệnh
đốm trắng trên Thanh long nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiên cứu cần làm
sáng tỏ thêm (Nguyễn Thành Hiếu và ctv,…2011).
Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh, với diện tích gần 1.000ha, tỷ lệ
nhiễm nặng từ 10% trở lên chiếm trên 80% và bệnh đã có mặt ở khắp các vùng trồng
Thanh long tập trung của Việt Nam như Bình Thuận, Tiền Giang và Long An, đến
tháng 6 năm 2013 diện tích nhiễm bệnh đốm trắng đã lên đến 3.000ha, tỷ lệ gây hại từ
20-50%.
Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích Thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng
nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800ha, nặng 400ha, trong tổng số 21 nghìn ha. Tiền Giang,
với gần 3.000ha Thanh long thì có đến 2.420ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích
nhiễm nặng 80ha. Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766ha, nặng 41ha, trong tổng số gần
2.700ha…và đang có xu hướng lan nhanh.
Đến đầu tháng 9/2014, có gần 16.500ha thanh long ở các tỉnh Bình Thuận, Long
An, Tiền Giang bị nhiễm bệnh đốm nâu, tăng khoảng 7.000ha so với năm trước, trong
đó diện tích bị nhiễm nhẹ với tỷ lệ bệnh phổ biến từ một vài đốm đến dưới 5%, là hơn
41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
31
8.000ha, chiếm tỷ lệ 24,1% so với tổng diện tích gieo trồng; tỷ lệ nhiễm nặng từ 5% trở
lên là 8.262ha, chiếm tỷ lệ 24,6% tổng diện tích gieo trồng [40].
Theo báo điện tử nông nghiệp Việt Nam 28/11/2013 Thạc sĩ Nguyễn Mỹ Phi
Long, người phụ trách kỹ thuật của công ty Điền Trang cho biết đã phân lập và nhân
nuôi thành công bào tử của nấm gây nên bệnh đốm trắng. Mặc dù chưa khẳng định
100% nhưng có thể chắc chắc đến 90% rằng đấy là nấm N.dimidiatum. Nấm bệnh này
không mới nhưng là mới khi nó gây bệnh nặng trên cây Thanh long. Các báo cáo khoa
học về bệnh hại trên cây Thanh long của cả trong và ngoài nước đến hiện nay vẫn chưa
ghi tên nấm N.dimidiatum. N.dimidiatum chẳng những có mặt trên thân, cành, lá, hoa,
quả thực vật mà còn tồn tại cả trong đất. Trong quá trình nuôi cấy bào tử nấm bệnh,
nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra một loài vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis có khả
năng kiềm chế quá trình phát triển của nấm này. Công ty Điền trang đã nhanh chóng
đưa ra ứng dụng tại Long An, An Lục Long và Dương Xuân Hội-Châu Thành-Long
An đã thu được nhiều kết quả rất khả quan [35].
Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS-
RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên
Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các
mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã
được định danh về hình thái [21].
Tại hội thảo Quốc Gia về Khoa học và công trồng diễn ra vào ngày 11/08/2016.
Hà Thị Thúy và Cộng sư thuộc Viện Môi trường Nông nghiệp dựa trên phương pháp
khuếch trên thạch đĩa đã tìm ra 2 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm
Neoscytalidium dimidiatum đó là Streptomyces fradiae và Bacillus polyfermenticus [3].
42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
32
1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long [36]
Bệnh đốm trắng là loài dịch hại mới, khó quản lý và do tính đặc thù của cây
Thanh long là có khả năng ra hoa, mang quả gần như liên tục quanh năm nên việc
phòng trị bệnh phải áp dụng nhiều giải pháp tổng hợp, đồng bộ và triệt để thì mới đạt
hiệu quả cao. Để quản lý bệnh đốm nâu hại thanh long hiệu quả phải áp dụng các biện
pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), trong đó nhất thiết phải áp dụng các biện pháp
sau:
a. Biện pháp giống
Trồng giống sạch bệnh, kiểm tra kỹ để loại bỏ hom giống nhiễm bệnh; chỉ được
lấy giống ở vườn thanh long không nhiễm bệnh.
b. Biện pháp canh tác
Trong mùa khô
- Những vườn trồng trên 4 năm cần cắt tỉa bớt cành già vô hiệu phí trong để trụ
thông thoáng, giảm nguồn bệnh và giảm ẩm độ.
- Cắt bỏ những cành, quả bị bệnh, thu gom và xử lý bằng chế phẩm sinh học để
làm phân bón; không vứt cành, quả bị bệnh xuống nguồn nước hoặc bỏ lại trong vườn
nếu chưa qua xử lý.
- Bón phân hữu cơ hoai mục, tăng cường bón lân, kali; bổ sung thêm phân trung -
vi lượng (Canxi, Magie, Silic, Bo,…) để làm tăng sức kháng cho cây; không bón phân
đạm và phun kích thích sinh trưởng khi cây đang bị bệnh.
- Không vận chuyển cành, quả bị bệnh sang vườn khác; không tưới nước cho cây
lúc chiều tối.
- Cuối mùa khô, những cành còn phần non nên tiến hành cắt 2-3 cm ở đầu mút
cành đẻ thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trinh già hóa cành nhằm hạn
chế bệnh gây hại.
Trong mùa mưa:
43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
33
- Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng
ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng (có thể phun thuốc phòng bệnh ngay khi
cắt).
- Trong các đợt khô kéo dài nếu cần tưới nước phải tưới dưới gốc, không tưới lúc
chiều tối sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nấm gây bệnh nảy mầm, gây hại nặng.
c. Biện pháp sinh học
Cuối mùa khô hoặc đầu mùa mưa bón chế phẩm sinh học Trichoderma trộn với
phân hữu cơ để tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh trong đất. Có thể bón chế phẩm
sinh học lần 2 vào giữa mùa mưa để tăng khả năng kiểm soát nấm bệnh trong đất. Liều
lượng theo khuyến cáo ghi trên bao bì sản phẩm.
d. Biện pháp hóa học
Cuối mùa khô tiến hành rắc vôi bột khử trùng trên mặt đát với liều lượng 1 – 2
tấn/ha.
Thường xuyên kiểm tra vườn, phát hiện bệnh sớm khi mới chớm xuất hiện để
phun kịp thời. Trong mùa mưa, sau mỗi đợt khô kéo dài cần chú ý kiểm tra
bệnh để phun thuốc phòng bệnh kịp thời. Những vùng thường xuyên bị bệnh
hại nặng cần phun phòng ngay sau khi hết đợt mưa kéo dài.
Phun phòng bệnh bằng các loại thuốc trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật
được phép sử dụng ở Việt Nam được Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn
ban hành hàng năm như hoạt chất Phosphorous acid (Agri-Fos 400…; có thể
sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật chứa gốc đồng hoặc hoạt chất Azoxystrobin,
Difenoconazole, Hexaconazole, Mancozeb, Metalaxul,… phối hợp với chất
bám dính để phòng trừ bệnh đốm nâu, lượng dùng theo khuyến cáo của nhà
sản xuất ghi trên bao bì.
Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật theo nguyên tắc “4 đúng” và đảm bảo thời gian
cách ly ghi trên bao bì.
44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
34
Lưu ý: vùng trồng thanh long xuất khẩu phải tuân thủ quy định về sử dụng thuốc
bảo vệ thực vật củ quốc gia hoặc vùng lãnh thổ nhập khẩu.
1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ
sinh học
1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam
Lâu nay, nông dân trồng thanh long đang gặp khó trong các khâu đảm bảo vệ sinh
môi trường. Một trong những nguyên do là sau khi cắt tỉa cành, phế phẩm từ cây thanh
long không có chỗ tiêu hủy. Tìm biện pháp để “biến” các loại phế phẩm đó trở thành
phân hữu cơ sinh học, đang là sự quan tâm của không ít nông dân. Trong số hơn
13.000 ha thanh long phế phẩm hàng ngày thải ra một lượng lớn các phế phẩm như
cành, bông lép, trái thối... Nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long,
hoặc đổ đống ngay tại vườn, gây hôi thối. Điều này vừa ảnh hưởng đến môi trường,
vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn VietGAP [42].
1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost
1.3.2.1 Định nghĩa compost và quá trình chế biến compost
Theo Haug, 1993, quá trình chế biến compost và compost được định nghĩa như
sau: Quá trình chế biến compost là quá trình phân hủy sinh học và ổn định của chất
hữu cơ dưới điều kiện nhiệt độ thermorpholic. Kết quả của quá trình phân hủy
sinh học tạo ra nhiệt, sản phẩm cuối cùng ổ định, không mang mầm bệnh và có ích
trong việc ứng dụng cho cây trồng.
Compost là sản phẩm của quá trình chế biến compost, đã được ổ định như
humus, không chứa các mầm bệnh, không lôi kéo các côn trùng, có thể được lưu trữ
an toàn và có lợi cho sự phát triển của cây trồng.
Các phản ứng hóa sinh
45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
35
Quá trình phân hủy chất thải xảy ra rất phức tạp, theo nhiều giai đoạn và sản
phẩm trung gian. Ví dụ quá trình phân hủy protein bao gồm các bước: protein =>
protides =>amono acids => hợp chất ammonium => nguyên sinh chất của vi khuẩn và
N hoặc NH3
Đối với carbonhydrates, quá trình phân hủy xảy ra theo các bước sau:
carbonhydrate => đường đơn => acids hữu cơ => CO2 và nguyên sinh chất của vi
khuẩn.
1.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose
Xenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật, chiếm tới 50% tổng số
hydratcacbon trên trái đất. Trong vách tế bào thực vật, Xenlulose tồn tại trong mối liên
kết chặt chẽ với các polisaccarit khác; Hemixenlulose, Pectin và Lignin tạo thành liên
kết bền vững
Xenlulose thường có mặt ở các dạng sau:
- Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô….
- Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…
- Các chất thải gia đình: rác, giấy loại…
Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh ra các men xúc tác trong
quá trình phân giải xenlulose. Chúng có ý nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng
tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì
nhiêu của đất.
Hình 1.6 Các mắt xích β-D-
Glucose trong cellulose
Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử
cellulose
46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
36
Trong điều kiện tự thoáng khí, cenlulose có thể bị phân giải dưới tác dụng của
nhiều vi sinh vật hiếu khí. Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham
gia tích cực vào quá trình phân giải xenlulose. Các loài vi sinh vật như: Cytophaga,
Cellulomonas, giống Bacillus, giống Clostridium, Aspergillus, Penicillium …
Xenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn.
Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác có trong đất tạo
ra mùn.
47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
37
Cơ chế phân giải: Xenlulozo→disaccarit→monosaccarit (glucozo)
Khi mùn được tạo thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình
amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3. Sự tạo thành NH3 trong đất xảy
ra rất chậm chạp và điều này rất có lợi cho cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ
NH3 cho cây hấp thụ:
Chất mùn + O2 –vi sinh vật => CO2 + H2O + NH3
Dựa trên cơ sở này, nhiều công ty đã sản xuất phân vi sinh phân giải Xenlulose,
trong đó người ta chú ý đến sự phân hủy của xạ khuẩn Actinomyces và nấm sợi
Trichoderma, Aspergillus. Các loài nấm sợi và xạ khuẩn này được nuôi trong những
môi trường tương ứng để thu sinh khối. Sinh khối này được trộn với than bùn và đưa
vào đất trồng. Việc sử dụng xạ khuẩn và nấm Trichoderma trong sản xuất phân vi sinh
phân giải Xenlulose còn tận dụng khả năng tạo kháng sinh và chất diệt côn trùng
(mycotoxin) của 2 loài này để chống sâu bệnh.
Các nhóm vi sinh vật có mặt trong quá trình ủ phân
- Vi khuẩn: với các dạng phân hủy hình que, hình cầu hay hình xoắn. Nhiều loài có
khả năng tự di chuyển. Khi bắt đầu của quá trình ủ phân rác, các vi khuẩn chịu nhiệt
trung bình chiếm ưu thế. Khi nhiệt độ gia tăng trên 40o
C, các vi khuẩn hiếu nhiệt sẽ
tiếp quản. Trong giai đoạn này, khuẩn hình que sẽ chiếm ưu thế về số lượng. Khi quá
trình ủ phân rác được làm mát, vi khuẩn chịu nhiệt trung bình lại chiếm ưu thế.
- Xạ khuẩn: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ phức tạp như
cellulose, lignin, chitin và protein trong quá trình ủ rác. Enzyme của chúng cho phép xạ
khuẩn phân hủy hóa học các mảnh vụn như thân cây, vỏ cây hoặc tạp chí. Một vài loài
xuất hiện trong giai đoạn chịu nhiệt trung bình, những loài khác đóng vai trò quan
trọng trong giai đoạn làm mát và ổn định.
48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
38
- Nấm: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các mảnh vụn, tạo cho các vi
khuẩn tiếp tục quá trình phân hủy hết các cellulose còn lại. Các loài nấm có số lượng
lớn trong cả 2 giai đoạn: nhiệt độ trung bình và nhiệt độ cao. Hầu hết nấm sống ở lớp
bên ngoài của đống ủ khi nhiệt độ cao.
- Động vật nguyên sinh: được tìm thấy ở trong nước rỉ rác của đống ủ nhưng có vai
trò khá nhỏ trong phân hủy phân rác.
- Trùng roi: được tìm thấy trong nước rỉ rác của đống ủ. Chúng ăn các hợp chất hữu
cơ, vi khuẩn và nấm.
1.3.2.3 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí
Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí
Thông số Giá trị
1. Kích thước
Quá trình ủ đạt hiệu quả tối ưu khi kích thước CTR khoảng 25 –
75mm
2. Tỉ lệ C/N
Tỉ lệ C:N tối ưu dao động trong khoảng 25 - 50
- Ở tỉ lệ thấp hơn, dư NH3, hoạt tính sinh học giảm
- Ở tỉ lệ cao hơn, chất dinh dưỡng bị hạn chế.
3. Pha trộn Thời gian ủ ngắn hơn
4. Độ ẩm
Nên kiểm soát trong phạm vi 50 – 60% trong suốt quá trình ủ. Tối
ưu là 55%
5. Đảo trộn
Nhằm ngăn ngừa hiện tượng khô, đóng bánh và sự tạo thành các
rảnh khí, trong quá trình làm phân hữu cơ, CTR phải được xáo trộn
định kỳ. Tần suất đảo trộn phụ thuộc vào quá trình thực hiện
49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
39
6. Nhiệt độ
Nhiệt độ phải được duy trì trong khoảng 50 – 550
C đối với một vài
ngày đầu và 55 – 600
C trong những ngày sau đó. Trên 660
C, hoạt
tính vi sinh vật giảm đáng kể.
7. Kiểm soát
mầm bệnh
Nhiệt độ 60 – 700
C, các mầm bệnh đều bị tiêu diệt
8. Nhu cầu về
không khí
Lượng oxy cần thiết được tính toán dựa trên cân bằng tỷ lượng.
Không khí chứa oxy cần thiết phải được tiếp xúc đều với tất cả các
phần của CTR làm phân
9. pH
Tối ưu: 7 – 7,5. Để hạn chế sự bay hơi Nitơ dưới dạng NH3, pH
không được vượt quá 8,5
10. Mức độ
phân hủy
Đánh giá qua sự giảm nhiệt độ vào thời gian cuối
11. Diện tích
đất yêu cầu
Công suất 50T/ngày cần 1 hecta đất
1.3.2.4 Sản xuất phân compost [34]
Sử dụng chế phẩm vi sinh Trichoderma dùng ủ phân chuồng, xác, bã thực vật
thành phân hữu cơ vi sinh là một mô hình sản xuất phân đơn giản với các nguyên liệu
sẵn có như: phân chuồng, xác bã thực vật (rơm rạ, thân cây đậu, bắp, lá cây…) kết hợp
với phân lân. Các bước tiến hành để tạo ra phân hữu cơ sinh học cũng không khó.
Chọn nơi khô ráo, có mái che để tránh ánh nắng trực tiếp của mặt trời và che mưa tránh
bị rửa trôi làm chế phẩm sinh học Trichoderma không thể lên men phân hủy các chất
bả đang ủ.
50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
40
Việc sản xuất phân hữu cơ sinh học từ cây thanh long vừa tận dụng được nhiều
phế, phụ liệu trong nông nghiệp, giúp đất trồng màu mỡ, không gây hại đến môi trường
sống vừa giải quyết được lượng rác thải xả ra hàng ngày từ vườn cây thanh long mặt
khác lại giúp hạn chế phần nào tình trạng lây bệnh trên diện rộng.
Cách thứ nhất: Các phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp được băm thành những
đoạn ngắn (10-15 cm) trước khi cho vào ủ. Sau đó trải một lớp mỏng phân chuồng, rác
bã thực vật rồi rải đều một lớp mỏng chế phẩm vi sinh Trichoderma đã được pha loãng
trong nước, với tỷ lệ 1 tấn phân chuồng hay rác, bã thực vật sử dụng 2 kg chế phẩm vi
sinh Trichoderma. Kế đến hòa với 6-7 lít nước để tưới trên bề mặt, cứ thế ủ nhiều lớp,
sau đó dùng tấm bạt để che.
Cách thứ hai: Trộn men vi sinh Trichoderma với phân lân, sau đó cho một lớp
phân chuồng vào hố ủ dày khoảng 20 cm. Tiếp theo, rải một lớp hỗn hợp vi sinh
Trichoderma và phân lân. Hết lớp này lại rải tiếp một lớp hỗn hợp, một lớp phân gia
súc, gia cầm.
Đống phân ủ được thiết kế theo hình khối chữ nhật, có chiều cao khoảng từ 1-1,5
m để dễ đảo, trộn. Sau đó tưới nước đủ độ ẩm cho đống phân. Độ ẩm ủ phân phải đạt
khoảng 50-55% (dùng tay nắm hỗn hợp phân ủ, thấy nước vừa rịn kẽ tay là được).
Không nên để quá khô cũng như quá ướt làm chậm quá trình phát triển của nấm men.
Không nên nén quá chặt sẽ làm hạn chế sự phát triển của nấm men, kéo dài thời gian ủ,
chất lượng phân không tốt. Nên dùng bạt màu tối phủ kín đống phân để che nắng, che
mưa. Sau 5-7 ngày, tiến hành đảo một lần. Sau gần 2 tháng có thể đưa vào sử dụng bón
cho các loại cây trồng, lúc này tất cả xác bã thực vật, phân chuồng đã nhuyễn bột, khô
ráo không còn mùi.
Lưu ý, khi ủ phân không nên dùng vôi vì sẽ làm hủy diệt các vi sinh vật trong
phân, nên bón ngoài ruộng trước khi làm đất là tốt nhất.
51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
41
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Thời gian: tháng 9/2016 đến tháng 8/2017.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và
Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM.
2.2 Vật liệu
2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh
2.2.1.1 Nấm đối kháng
Các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập lần lượt từ mẫu đất thu
thập tại vườn trồng tiêu tại Long Thành tỉnh Đồng Nai, phân lập từ tai nấm linh chi
thuộc huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh và phân lập từ đất Ca Cao tại Bến Tre.
2.2.1.2 Nấm gây bệnh
Nấm Neocystilidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên thanh long được phân
lập từ các vườn thanh long bị nấm bệnh tấn công thuộc xã Bình Trinh Đông, huyện
Tân Trụ, tỉnh Long An.
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
2.2.2.1 Dụng cụ.
– Ống nghiệm
– Đĩa petri
– Que cấy
– Đũa thủy tinh
– Khoan thạch hình trụ
– Cốc thủy tinh
– Ống đong
– Đèn cồn
– Khay nhựa
– Bình xịt nước
52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
42
2.2.2.2 Thiết bị.
Tủ cấy
Máy hấp Autoclave
Tủ lạnh
Lò nung
Tủ hút khí độc
Kính hiển vi
Cân phân tích
Máy cất nước
Bếp từ
Hệ thống chưng cất mẫu
kjeldahl
2.2.3 Hóa chất
D – Glucose
CMC
Bột chitin
NaNO3
K2HPO4
MgSO4
MgSO4.7H2O
NH4NO3
NaOH
ZnSO4
KCl
FeSO4
Agar
Nước cất
Cồn 700
, 960
53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
43
2.2.4 Các loại môi trường
2.2.4.1 Môi trường phân lập nấm bệnh WA.
Thành phần:
– Agar: 20 g
– Nước cất: 1000 ml
2.2.4.2 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA.
Thành phần:
– Khoai tây: 200 g
– D – glucose: 20 g
– Agar: 20 g
– Nước cất: 1000 ml
Cách pha môi trường:
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nước cất vào đun sôi
khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Sau đó, lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, rồi cho lần
lượt đường và agar vào (Lưu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). và đem
hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210
C trong 15 phút.
2.2.4.3 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase CMC [8].
Thành phần môi trường:
– NaNO3 0,4 g
– K2HPO4 0,2 g
– MgSO4 0,1 g
– KCl 0,1 g
– CMC 1%
– Agar 2%
– Nước cất: 1000 ml
Cách pha môi trường:
54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
44
Đun tan CMC trong nước cất rồi cho các thành phần môi trường còn lại vào chai
thủy tinh và khuấy đều sau đó đậy kính nắp đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn lửa đèn
cồn, lần lượt đổ môi trường vào đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
2.2.4.4 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase [7]:
Thành phần môi trường:
– NaNO3 3,5 g/l
– K2HPO4 1,5 g/l
– MgSO4.7H2O 0,5 g/l
– KCl 0,5 g/l
– FeSO4.7H2O 0,01 g/l
– Cloramphenicol 0,005 g/l
– Dịch chitin huyền phù 1%: Bổ sung đến 1 lít.
– pH: 7
Cách pha huyền phù chitin 1%:
Dung dịch chitin huyền phù 1% được chuẩn bị như sau: 1g bột chitin được cho
dần vào 20 ml HCl đậm đặc, ủ ở 4o
C và để qua đêm [12].
Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20o
C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua
đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/ phút, trong 10 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng
nước cất cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100 ml.
2.2.4.5 Môi trường Czapeck dox để nhân giống cấp 2 Trichoderma
Thành phần môi trường:
– Saccharose 30g
– NaNO3 3 g
– K2HPO4 1 g
– MgSO4.7H2O 0,5 g
– KCl 0,5 g
55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
45
– FeSO4.7H2O 0,01 g
– Nước cất 1000ml
– pH: 6