Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA
KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ YẾN NHI
MSSV: 1151110242 Lớp: 11DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân em. Những kết quả và
số liệu trong báo cáo tốt nghiệp được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới và phòng
thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, không sao chép bất kỳ
nguồn nào khác. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015
Sinh viên
Trần Thị Yến Nhi

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ
Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại
trường. Đó là những hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp một
phần sức lực nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng đất nước.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người đã tạo
điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian
nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. HCM và các anh chị phụ trách
phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học đã tạo điều kiện và hướng dẫn em hoàn
thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại đây.
Chân thành cảm ơn các thầy phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và tất cả
các bạn trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong lúc thực hiện đề
tài này.
Con xin gửi tình thương yêu và lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, mọi người
trong gia đình và những người luôn bên cạnh luôn sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động
viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong mọi bước đường đi.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015
Sinh viên
Trần Thị Yến Nhi

i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT....................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH...................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ....................................................................................x
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU..............................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài..............................................................................1
1.2. Tình hình nghiên cứu ..................................................................................2
1.3. Mục đích nghiên cứu...................................................................................3
1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu...................................................................................3
1.5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................3
1.6. Các kết quả đạt được của đề tài.................................................................3
1.7. Kết cấu của đồ án.........................................................................................4
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................5
2.1. Khái quát chung về enzyme...........................................................................5
2.1.1. Sơ lược về enzyme .....................................................................................5
2.1.2. Tính chất của enzyme................................................................................6
2.1.2.1. Bản chất sinh học.................................................................................6
2.1.2.2. Bản chất hóa học..................................................................................7
2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose........................................................................7
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase..........................................................9
2.3.1. Định nghĩa.................................................................................................9
2.3.2. Phân loại..................................................................................................10
2.3.3. Tính chất..................................................................................................10

ii
2.3.3.1. Tính đặc hiệu......................................................................................10
2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học..................................................................10
2.3.3.3. Các chất ức chế ..................................................................................10
2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme...................................................................11
2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ..................11
2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) ..............................11
2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)........................12
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase.12
2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy.......................................................12
2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy...............................................................................13
2.3.5.3. pH môi trường....................................................................................14
2.3.5.4. Độ ẩm.................................................................................................14
2.3.5.5. Môi trường không khí........................................................................14
2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase .............................................................14
2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc ...............................14
2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật ...................15
2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose .....................................15
2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase ......................................................................15
2.4.1. Nấm sợi ....................................................................................................15
2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii.............................................................16
2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase.....................17
2.5.1. Bã mía ......................................................................................................17
2.5.2. Cám gạo ...................................................................................................17
2.6. Phương pháp lên men bề mặt......................................................................19

iii
2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme........20
2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase..................................................22
2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase ...........................................................23
2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase .........................................................23
2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel ...............................................................................24
2.9.1. Bản chất của phương pháp.....................................................................24
2.9.2. Đặc tính của gel.......................................................................................25
2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide .....26
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................28
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...............................................................28
3.2. Vật liệu...........................................................................................................28
3.2.1. Nguồn vi sinh vật.....................................................................................28
3.2.2. Cơ chất.....................................................................................................28
3.2.3. Hóa chất...................................................................................................28
3.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................29
3.3.1. Thiết bị .....................................................................................................29
3.3.2. Dụng cụ....................................................................................................30
3.4. Môi trường.....................................................................................................31
3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu........................................................31
3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất ..................................................31
3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy........................32
3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii..............................................32
3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA ................................32
3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa.........................................................33

iv
3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase.........................34
3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii..............................................35
3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu
............................................................................................................................36
3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô................................................36
3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose...................................................36
3.5.8. Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford ....................37
3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase)...........40
3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase........42
3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất...............................................43
3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu .......................43
3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu ................................................44
3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng .................................45
3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.....................................45
3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống.................................................45
3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm.................................................46
3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme.47
3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa ..47
3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme ........................48
3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.........48
3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase....48
3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase
.........................................................................................................................48
3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô.................................48

v
3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel............49
3.5.14.1. Nguyên tắc .......................................................................................49
3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ.........................................................................49
3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm .......................................................................49
3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide.......51
3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu......................................................55
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................56
4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii........................56
4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch ......57
4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu ......................57
4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất ..................................................................58
4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase trên môi trường lên men bán rắn .......................................................59
4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase...59
4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
............................................................................................................................60
4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase...........61
4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase..............................................................................................................62
4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase..............................................................................................................64
4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase.......65
4.6. Quy hoạch thực nghiệm ...............................................................................66
4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất
...............................................................................................................................71

vi
4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol ...........71
4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone ...........73
4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu ......................................74
4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase..75
4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase...............75
4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase.......76
4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc lọc gel...............................................77
4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS
– PAGE .................................................................................................................79
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................82
5.1. Kết luận..........................................................................................................82
5.2. Kiến nghị........................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83
PHỤ LỤC

vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BM:CG : Bã mía và cám gạo
CBB : Coomasie brilliant blue
CMC : Carboxymethyl cellulose
CMCase : Carboxymethyl cellulase
DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid
DTT : Dithiothreitol
EC : Enzyme commission number (tiểu ban về enzyme)
FPA : Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc)
HEC : Hydroxyethyl cellulose
HL : Hàm lượng protein (mg)
HT : Hoạt tính enzyme (U)
HTR : Hoạt tính riêng (U/mg)
MT : Môi trường
MW : Molecular weight (trọng lượng phân tử)
NĐC : Nồng độ chuẩn
OD : Optical density (trị số mật độ quang)
PGA : Potato glucose agar
SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
T. koningii : Trichoderma koningii
TEMED : N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine
U : Đơn vị hoạt tính enzyme
VSV : Vi sinh vật

viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo..........................................................18
Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase................................................22
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek .......................................31
Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật.....37
Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine ...............................................39
Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose...................................................41
Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase.................................42
Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất.........................................................43
Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường.........44
Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme ...................................47
Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách.................................................53
Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom .......................................................54
Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG...........................................................59
Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm............................................66
Bảng 4.3. Mã hóa các biến số...................................................................................66
Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa ...............................................................................67
Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy
.............................................................................................................................................68
Bảng 4.6. Kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗 .......................................................................................69
Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm..........................................69
Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase
khi tủa bằng dung môi ethanol 960
và dung môi acetone .........................................74
Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel ......................................................78
Bảng 4.10. Giá trị 𝑅𝑓 và log của các protein trong thang chuẩn ..............................79
Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2..................81

ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose ................................................................7
Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase ...................................................................9
Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase.........................................................11
Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase.......................................................11
Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase ..............................................................12
Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii.......................................................16
Hình 2.7. Bã mía.......................................................................................................17
Hình 2.8. Cám gạo....................................................................................................17
Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel........................................24
Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi nuôi cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình
b)................................................................................................................................56
Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và
kính hiển vi điện tử (hình d)......................................................................................56
Hình 4.3. Vòng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình
e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g) ...................................57
Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi .........................58
Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase ......................................................78
Hình 4.6. Kết quả điện di..........................................................................................79

x
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau.............................................................59
koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau.......................................................................61
koningii có pH ban đầu khác nhau............................................................................62
koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau..............................................................63
koningii có thời gian nuôi cấy khác nhau..................................................................64
koningii có tỷ lệ giống khác nhau .............................................................................65
Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch
chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol ...........................................................72
Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch
chiết enzyme cellulase với dung môi acetone...........................................................73
Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase
khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone................................74
Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau .......75
Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau76
Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong
thang chuẩn với 𝑅𝑓 ....................................................................................................80

1
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, cuộc sống hiện đại với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật,
các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được áp dụng nhiều hơn vào thực tế góp
phần giúp cho đời sống con người ngày càng được nâng cao và hoàn thiện. Trong đó,
ngành công nghệ sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu triển vọng, đặc biệt là
trong lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme.
Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả
năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chóng,
do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do
vi sinh vật tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho
phép chúng ta có thể tận dụng được các phế thải của các ngành khác.
Nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn
như: rơm rạ, trấu, bã mía, agar,…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose.
Cellulose có thể bị phân hủy bằng phương pháp vật lý và hóa học nhưng việc này rất
phức tạp. Trong khi đó, nếu sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật
bằng công nghệ sinh học để xử lý các chất thải hữu cơ sẽ có nhiều điểm ưu việt hơn
kể cả về mặt kỹ thuật, môi trường cũng như về kinh tế.
Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme
cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Mặt khác, số
lượng loài vi sinh vật tham gia tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên
rất phong phú như nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn,…Nấm Trichoderma spp hiện diện
gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác với mật độ
cao. Các nhà khoa học phân lập thành công chủng nấm mốc Trichoderma koningii để
tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả và giá thành lại rẻ. Bên cạnh đó,
celluase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp, nông nghiệp, y học,…Vì vậy, việc sản xuất được một lượng lớn enzyme
cellulase với chi phí thấp là một điều rất cần thiết. Và để thu nhận được enzyme
cellulase một cách hiệu quả nhất thì ta cần khảo sát các điều kiện, yếu tố ảnh hưởng

2
đến môi trường sinh tổng hợp tối ưu của enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm sinh học
có giá trị cao trong ứng dụng.
1.2. Tình hình nghiên cứu
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase từ Trichoderma koningii (T. koningii), nhưng trên thế giới đã có
nhiều đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme của T. koningii.
Theo Cui Fumian và cộng sự (1995), thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng
hợp enzyme cenllulase đã được thực hiện bằng cách phát triển các giống đột biến trên
môi trường bán rắn bao gồm 3 g bột rơm, 2 g cám lúa mì và 10 ml ammonium sulfate
1% trong 250 ml bình ở 280
C, 72 giờ tại pH ban đầu là 6,0. Với hiệu suất tổng hợp
enzyme cellulase là 4880 U/g carboxymethyl cellulose – Na và 480 U/g trên sợi bông.
Hoạt tính enzyme cellulase từ chủng đột biến là gấp 3 lần so với chủng mẹ. Các điều
kiện tối ưu cho hoạt động enzyme trên bông là pH 4,5 – 5,0 và 45 – 500
C. Enzyme
ổn định ở mức pH 3,5 – 6,5 ở 450
C trong 4 giờ. Sau khi ủ men ở 600
C trong 1 giờ,
vẫn còn 20% hoạt tính của enzyme cellulase.
Theo Liu Xiao-jie và cộng sự (2003), khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
của T. koningii trên môi trường bột rơm đã có tác động tốt, trong khi môi trường
(NH4)2SO4 có tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp enzyme cellulase. Hoạt tính mạnh
nhất của enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase), hoạt tính giấy lọc (FPA) và β –
glucosidase lần lượt là 765,8 U/ml, 155,3 U/ml và 39,54 U/ml, tương ứng với môi
trường nuôi cấy tối ưu hóa sau 6 ngày.
Theo Zou Shui – yang và cộng sự (2011), điều kiện nuôi cấy được tối ưu cho
nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T. koningii đã được thiết lập như sau:
tỷ lệ rơm : cám là 3 : 2 (w/w), tỷ lệ dinh dưỡng môi trường là 1:1,5 (w/v), pH ban đầu
là 5,5 và nuôi cấy trong 120 giờ ở 28,50
C. Với điều kiện tối ưu trên, hoạt tính giấy
lọc, β – glucosidase và xylanase lần lượt là 13,1 U/g chất khô, 12,2 U/g chất khô và
994,7 U/g chất khô.
Theo Wang S và cộng sự (2013), các gen sản sinh enzyme cellulase và
xylanase của nấm Trichoderma tồn tại dưới dạng sợi carbon catabolite áp trung gian

3
bởi các hoạt hóa dị hóa carbon (CRE1). Việc sản xuất enzyme có thể được cải thiện
hơn nữa bằng cách bất hoạt gen CRE1. Việc bất hoạt gene CRE1, dẫn đến thay đổi
biểu hiện gen sinh enzyme cellulase trong nuôi cấy cơ bản trên đường. Kết quả là
hoạt tính giấy lọc, hoạt tính β – 1,4 – exoglucanase, hoạt tính β – 1,4 – edoglucanase
và hoạt tính xylanase đã thay đổi trên lần lượt là 2,1, 1,4, 0,8 và 0,8 lần. Việc can
thiệp vào RNA là một phương pháp khả thi để phân tích các cơ chế quản lý biểu hiện
gen và cải thiện năng suất sinh enzyme xylanase và enzyme cellulase trong T.
koningii.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma
koningii một cách tối ưu nhất.
1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Quan sát đại thể và vi thể hình thái của nấm mốc Trichoderma koningii.
- Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii
trên môi trường bán rắn.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase
của Trichoderma koningii.
- Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.
- Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel.
- Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
1.5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.
- Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và
stagraphic plus.
1.6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Thu được enzyme cellulase.
- Có được các thông số tối ưu quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của
Trichoderma koningii.

4
- Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa.
- Tinh sạch được enzyme cellulase.
1.7. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

5
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát chung về enzyme
2.1.1. Sơ lược về enzyme (Lê Minh Trí, 2011)
Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme
có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng
hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi
là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học
khác.
Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra
trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay
kiềm mạnh,…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp
nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng
(370
C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh,…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả
năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một
kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận
enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể vi sinh vật. Tất cả các tế bào
động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa nhiều enzyme thì hoàn toàn khác nhau.
Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:
- Động vật (hạn chế)
- Thực vật (hạn chế)
- Vi sinh vật (phổ biến)
Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu
thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.

6
Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
- Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.
- Hệ enzyme có vi sinh vật vô cùng phong phú.
- Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng
tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng
trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là
rất cao.
- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.
- Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể
tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể
dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu
được hiệu suất cao trong sản xuất.
- Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công
nghiệp.
2.1.2. Tính chất của enzyme (Nguyễn Văn Mùi, 2011)
2.1.2.1. Bản chất sinh học
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng
cả trong và ngoài tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng.
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh
vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính
chất gây độc.
Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện
nhiệt độ 20 – 450
C, 1 atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản
ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học, vì vậy enzyme cần dùng với
lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, …

7
2.1.2.2. Bản chất hóa học
Gồm hai nhóm:
- Nhóm enzyme đơn cấu tử: enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy
nhất là protein.
- Nhóm enzyme đa cấu tử: là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành
gồm: một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải protein.
Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình
xúc tác.
2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose.
Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp ra nhờ
quá trình quang hợp. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần
chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ (Lê
Ngọc Tú và cộng sự, 1982).
Ligno – cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm
(cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose và lignin (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Cellulose (40 – 60% trọng lượng khô) là polymer thẳng của các đơn vị β-D-1,4-
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose
(http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch05/cellulose.html)

8
glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen cho thấy, cellulose có cấu tạo
dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu
trúc không đồng nhất, có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn
(phần vô định) (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong
nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid
hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở
nhiệt độ 40 – 500
C nhờ các ezyme thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase
(Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982).
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20
– 40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide
như galactose mananose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất
không kết tinh nên hemicellullose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết
chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất
nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ
trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết (Lê Ngọc
Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose. Tất
cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme của vi sinh vật
(VSV). Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn –
cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Các chủng VSV như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn
có khả năng phân hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase.
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất
này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp hóa chất, nhiên liệu, thực
phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy (Hamelinck và
cộng sự, 2003).

9
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase
2.3.1. Định nghĩa (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)
Cellulase là hệ enzyme xúc tác phản ứng cho quá trình chuyển hóa cellulose
thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt,
cellulase tương tự enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng chặt chẽ),
mặt khác chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát
bởi cơ chế dị hóa.
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid
amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Cấu trúc không gian
cellulose bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian.
Cấu trúc không gian khoảng 280 – 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase
thường khoảng 300 – 450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin.
Cellulase là một loại homopolymer của β-D-glucose được nối với nhau qua
liên kết β-D-1,4-glucan. Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3
enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,
Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase
(http://sci.waikato.ac.nz/farm/content/microbiology.html)

10
EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β-
glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc
hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-
β-D glucoside trong phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose
thành glucose.
2.3.2. Phân loại
Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB –
International Union pf Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống các enzyme
thủy phân cellulose gồm có endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có
ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21 (Huỳnh Thị Hồng
Sương, 2013).
2.3.3. Tính chất (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)
2.3.3.1. Tính đặc hiệu
Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và các β-
D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động trên các đầu
chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellulobiose, β-glucosidase thủy phân các
gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose.
2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học
Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành
phần acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.
Bên cạnh hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác
của enzyme và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm.
Cenllulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu trong khoảng 4 – 5. Nhiệt
độ tối ưu từ 40 – 500
C. Hoạt tính cellulase bị phá huỷ hoàn toàn ở 800
C trong 10 đến
15 phút.
2.3.3.3. Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi chính các sản phẩm phản ứng được tạo ra như glucose,
cellobiose. Thủy phân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác nhau như
Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.

11
2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme
2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (Nguyễn Hoàng
Phúc và những cộng sự, 2012)
Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, cellobiohydrolase, exo-
cellobiohydrolase, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan
cellobiohydrolase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase.
Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose.
2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) (Nguyễn Hoàng Phúc và
những cộng sự, 2012)
Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-
glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl
cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase
A3, 9.5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS.
Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase
(http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionExo)
Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase
(http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionEndo)

12
Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của
chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc.
2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) (Nguyễn Hoàng Phúc
và những cộng sự, 2012)
Enzyme này có tên gọi khác như là: β-glucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6-
glucosidase, β-glucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl β-glucosidase, aryl-β-
glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase,
primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase.
Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng
thích ra β-D-glucose.
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
 Nguồn carbon (Lương Đức Phẩm, 1998)
Theo lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh
vật tổng hợp enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn
carbon.
Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, mạt
cưa, bã củ cải, rơm, than bùn. T. lignorum và T. koningii được nuôi trên môi trường
có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả tương tự như vậy
khi nuôi Myrothecium verucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải.
Chất cảm ứng enzyme cellulase còn là cellobiose octaacetate, cám mì, lactose, salixyl.
Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase
(http://worthington-biochem.com/cel/images/reactionCello)

13
Đối với Stachy botrys atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh
bột.
Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetate, citrat, oxalate, succinat
và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kìm hãm sinh tổng
hợp cellulase. Nhưng trong môi trường có nồng độ glucose thấp có tác dụng kích
thích vi sinh vật phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme.
 Nguồn Nitơ (Lương Đức Phẩm, 1998)
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là
muối nitrate. Đối với các giống của bộ nấm bông (hyphomycetales) nguồn nitơ tốt
nhất lại là (NH4)2HPO4. Nó chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt tính
enzyme này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy,
các muối này làm acid hóa môi trường. Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme
và thậm chí có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành.
Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp
cellulase. Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và
cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt tính cellulase của vi sinh vật; nhưng với cao
ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn cao nấm men.
 Các nguyên tố khoáng (Lương Đức Phẩm, 1998)
Các nguyên tố khoáng như: Fe, Mn, Zn, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng
tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Trong đó Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo
thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 1,11 – 2,2 mg/l, Fe 2 –
10 mg/l, Mn 3,4 – 27,2 mg/l.
2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp đối với việc sinh trưởng và tích
lũy cellulase của nhiều loại nấm khác nhau thường ở nhiệt độ 28 – 300
C.

14
2.3.5.3. pH môi trường (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)
pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng
sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật.
2.3.5.4. Độ ẩm (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)
Độ ẩm không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh
vật mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Các cơ chất khác nhau
có khả năng giữ nước khác nhau. Do đó, quá trình lên men bán rắn được thực hiện
với hàm lượng nước trong cơ chất khác nhau từ 30 – 80%.
2.3.5.5. Môi trường không khí (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)
Vi sinh vật hiếu khí thì môi trường nuôi cấy cần đảm bảo cung cấp đủ oxy để
vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thường để
trên máy lắc, môi trường bán rắn thì cơ chất phải có độ xốp tạo sự thông thoáng giữa
các tiểu phần cơ chất. Ngược lại vi sinh vật kỵ khí chỉ phát triển trên môi trường
không có sự hiện diện của oxy. Ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được cả hai điều kiện
trên.
2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase
2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc
Sử dụng phối hợp enzyme cellulase với các enzyme thủy phân khác như
pectinase, hemicellulase,…trong quá trình ủ cỏ xanh có tác dụng phân giải thành tế
bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi khuẩn lactobacillus lên
men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh có hại khác.
Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nấu thức ăn có trộn thêm cellulase sẽ
tăng sự tiêu hóa, hấp thụ thức ăn cho động vật, đặc biệt động vật ăn còn non có hệ
tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng
sẽ tăng trọng nhanh hơn.

15
2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật
Cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực
vật, từ cây thuốc được dễ dàng. Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào thực vật, tế
bào thực vật mất vách cellulose trở thành tế bào trần. Sử dụng tế bào trần để nghiên
cứu lai tế bào nhằm tạo ra các tế bào lai có những tính trạng mới theo hướng mong
muốn, tế bào trần còn được sử dụng để tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gene.
2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose
Cellulase được ứng dụng trong sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu
giàu cellulose như rơm rạ, mạt cưa, gỗ vụn (thay dần cho phương pháp thủy phân
bằng acid) dùng làm thức ăn cho người và động vật.
Dịch đường sau khi đã thủy phân làm nguồn nuôi cấy nấm men rất tốt. Sử
dụng cellulase của T. viride để chuyển hóa nguyên liệu có cellulose thành ethanol
đang được nghiên cứu và áp dụng. Theo biện pháp này, nếu tận dụng được ba triệu
tấn cellulose trong phế liệu hằng năm ở Mỹ thì có thể thỏa mãn tới 20% nhu cầu nhiên
liệu của nước này. Người ta thấy rằng nếu trộn xăng với ethanol sẽ làm giảm đáng kể
chi phí nhiên liệu cho các loại xe máy, ô tô và bớt khói bụi.
2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase
2.4.1. Nấm sợi
Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất ở
môi trường khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rộng rãi và
tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải các chất
hữu cơ và hình thành chất mùn (Võ Thị Bích Viên, 2009).
Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống
Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum.
Trong đó hai giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa
học nghiên cứu để sản xuất cellulase.

16
2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii (Clipson, 2001)
Trichoderma koningii được phân loại như sau:
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreacea
Giống: Trichoderma
Loài: T. koningii
 Đặc điểm:
T. koningii hiện diện nhiều ở lớp đất mặt nhưng ở độ sâu 120 cm vẫn có sự
hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260
C trở lên tùy theo
nguồn gốc của loài. pH cho sự phát triển của nấm là 3,7 – 6,0 (Domsch và Gams,
1980).
Khuẩn lạc có đường kính 3 – 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200
C, bào
tử đính có dạng hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8 µm) x (1,3 – 2,8
µm).
 Khả năng phân hủy chất hữu cơ của nấm Trichoderma spp.
Nấm Trichoderma spp. đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy dư thừa
thực vật có trong đất (Kredics và cộng sự, 2003). Theo Klein và Eveleigh (1998),
nấm Trichoderma spp. hiện diện khắp nơi, sống hoại sinh và có khả năng phân hủy
nhanh các chất hữu cơ trong tự nhiên. Khả năng phân hủy cellulose của nấm
Trichoderma spp. bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: ẩm độ, độ thoáng khí,
pH, hàm lượng nitrogen (Alexander, 1962).
Chế phẩm nấm Trichoderma spp. được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm
rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân
hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết
quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân
hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50%
Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii

17
phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%.
Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây
hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn
so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001).
2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase
2.5.1. Bã mía
Bã mía chiếm 25 – 30% trọng
lượng mía đem ép.Thành phần trung bình
của bã mía:
- Nước: khoảng 40 – 50%.
- Xơ: khoảng 45 – 48% (trong đó
45–55% là cellulose).
- Chất hoà tan (đường): 2,5%.
Tùy theo loại mía và đặc điểm nơi
trồng mía mà thành phần hoá học các chất
có trong bã mía khô (xơ) có thể biến đổi. Thành phần của bã mía sau khi rửa sạch và
sấy khô gồm: cenlulose khoảng 45 – 55%, hemicellulose khoảng 20 – 25%, lignin
khoảng 18 – 24 %, tro 1 – 4%, sáp: <1%,…
2.5.2. Cám gạo (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009)
Cám gạo là sản phẩm phụ của
quá trình xay xát và chế biến gạo.
Cám gạo có giá trị khá cao. Cám được
thu hồi dưới 2 dạng là cám khô và
cám ướt. Cám gạo thường có dạng
bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm
khoảng 10 – 12% khối lượng lúa chưa
xay xát. Cám gạo thường được cho
các loại gia súc và thủy sản ăn chứ
không cho người. Nguyên nhân là do
Hình 2.7. Bã mía
Hình 2.8. Cám gạo

18
cám gạo có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh mẽ sẽ oxy hóa các
nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó
chịu. Thêm vào đó công nghệ xay xát gạo chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu
cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá). Vì lý do này
mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng làm thức ăn cho
các loại gia súc, gia cầm. Hằng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu tấn cám
được sản xuất và 90% là nằm ở châu Á.
Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo
Thành phần Khối lượng/100g
Calori
Tổng số lipid
Chất béo bão hòa
Chất xơ tiêu hóa được
Carbohydrat
Đường
Protein
Vitamin E
Vitamin B6
Canxi
316 KJ
21 g
4 g
21 g
28 g
0,9 g
13,3 g
4,9 g
4,1 mg
47 mg
(http://www.nutriondata.com)
Theo bảng 2.1, cám có lượng dinh dưỡng rất cao và lượng chất béo chưa bão
hòa cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, canxi đều rất cao, ngoài ra trong
cám còn chứa chất béo omega 3 khá cao; 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở
cám, thành phần của cám có nhiều loại vitamin và chất béo tốt, lại cân đối với nhiều
chất xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho cả con người.

19
2.6. Phương pháp lên men bề mặt (Trần Anh Đào, 2012)
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện
theo phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp này phát triển rất rộng rãi, không
chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng
sinh và một số quá trình lên men truyền thống.
 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt (Trần Anh Đào, 2012)
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trường, những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy này là:
- Nuôi cấy dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng
enzyme tạo ra từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy
chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng để giải thích tại sao nuôi cấy bề
mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại.
- Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,
enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ vẫn rất dễ dàng xử lý. Môi
trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm
chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác
sẽ hoàn toàn được an toàn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những nhược điểm cần quan tâm để khắc
phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất là khá tốn nhiều diện
tích nuôi cấy, phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt của môi trường (môi
trường lỏng hoặc bán rắn) nên cần nhiều diện tích.

20
 Phương pháp lên men bề mặt và thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc
Trichoderma koningii
Đây là quá trình vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (bã
mía, cám gạo) được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng
nước từ 30 – 70% phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cơ chất và thế nước tối
thiểu cần cho sự phát triển của vi sinh vật) (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013).
T. koningii phát triển trên môi trường chất dinh dưỡng dạng rắn (môi trường
rắn trước khi nuôi cấy nấm mốc cần làm ẩm trước). Để môi trường không bị bết dính
trong khi hấp chín cần bổ sung một số chất dinh dưỡng khác. Sau khi hấp môi trường
được làm nguội 30 – 400
C, sau đó cấy vi sinh vật vào, trộn đều và nuôi ở nhiệt độ 28
– 300
C trong 35 – 48 giờ, trong phòng thí nghiệm vô trùng có độ ẩm không khí 80 –
90% (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013).
Nấm khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng
oxy của không khí để hô hấp. Để đảm bảo nấm mốc mọc đều trên bề mặt của môi
trường và sử dụng nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh enzyme, lớp môi trường rắn cần
phải mỏng, chiều dày khoảng từ 2 – 5 cm (Lương Đức Phẩm, 1998).
Sau khi nuôi đủ thời gian để T. koningii tổng hợp enzyme, thu lấy môi trường
và sấy nhẹ ở nhiệt độ 400
C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai,
lọ sứ, thủy tinh hay túi PE. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzyme thô. Muốn có chế
phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế (Đông Thị Thanh Thu, 1995).
2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme (Huỳnh
Thị Hồng Sương, 2013)
Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào. Các phân tử enzyme không có
khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút enzyme nội bào trước hết
cần phải phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện
pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng
tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butanol, acetone, glycerin) của sóng siêu
âm.

21
Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách phải
hết sức lưu ý:
Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần
khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme
là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài.
Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần
khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme
là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài.
Enzyme là protein mà protein enzyme luôn luôn đi cùng với những loại protein
không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau. Do đó việc tách
protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt
và không phải không gặp những khó khăn nhất định.
Đa số ngành sản xuất thực phẩm cũng như công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải
dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trường rắn, thường dùng nước, các
dung dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó nước được sử
dụng rộng rãi và cho kết quả tốt nhất. Các enzyme được chuyển từ tế bào vào nước
do sự chênh lệch nồng độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme được cô đặc dưới
áp suất thấp sao cho hàm lượng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%.
Theo phương pháp khuếch tán bằng nước, có thể chiết được lượng enzyme
trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường
dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 280
C. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong,
chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống còn 10 – 120
C.
Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại
bỏ những thành phần tạp cần thực hiện nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối
và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường sử dụng biện pháp thẩm tích đối với
nước hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel. Để loại bỏ các protein
tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp
khác nhau. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của
môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi

22
hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương
pháp lọc gel.
2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase (Uhlig Helmut, 1998)
Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase
Đo hoạt tính Cơ chất Phương pháp xác định
Tổng hoạt tính cellulase (C1)
Giấy lọc
Avicel
Solkafloc
Glucose
Hoạt tính hòa tan
Giấy lọc
Avicel
Cellulose azur
Giảm trọng lượng
Đo mật độ quang
Đo mật độ quang
Endoglucanase
CMC, HEC, Cellulase
được tẩm H3PO4
Đường khử
Giảm độ nhớt
Exoglucanase Avicel, giấy lọc Đường khử
Β-glucosidase Cellobiose Glucose
Wood và McCrae (1972) đã chứng minh rằng hoạt tính exoglucanase (được
tinh chế) có khả năng phân cắt mạnh cellulose (được xử lý với acid phosphoric) nhưng
hoạt động trên CMC rất chậm. Sản phẩm phần lớn là cellobiose (95%).
Endoglcanase (EC 3.2.1.4) phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucosid
ngay ở vùng trong của chuỗi cellulose được xử lý với acid phosphoric và cũng phân
cắt các dẫn xuất của cellulose như CMC và HEC (hydroxyethyl cellulose).
Vì bản chất của cơ chất lẫn enzyme đều phức tạp, nên việc phân tích hoạt tính
cellulase cũng không đơn giản. Cellulase thu nhận được từ các vi sinh vật khác nhau
cho thấy có rất nhiều dữ liệu khác nhau. Thành phần của enzyme từ cùng một chủng
vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào phương pháp lên men, thành phần môi trường và các
điều kiện lên men.

23
Cơ chất để phân tích hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase và
β-glucosidase là cellulose tinh thể không tan như Avicel, Solkafloc và đặc biệt là giấy
lọc. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các cơ chất này rất khó, vì bản chất đại phân tử
như mức độ polymer hóa, mức độ tinh thể, mức độ tinh sạch và nguồn gốc của cơ
chất; tất cả đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Các cơ chất phân tử nhỏ như p-nitrophenyl-β-glucoside, cellobiose hoặc
oligocellulodextrin là cơ chất lý tưởng để chuẩn hóa việc phân tích hoạt tính cellulose.
Tuy nhiên, các cơ chất này không thích hợp cho hoạt động phối hợp của cả hệ
cellulase mà chỉ thích hợp cho β-glucosidase.
2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase (hoạt tính giấy lọc)
Hoạt tính giấy lọc được định nghĩa là lượng đường được tạo ra khi ủ giấy lọc
Whatman No. 1 (50 mg) với 0,5 ml dung dịch enzyme ở pH 4,8 (đệm Na-citrate)
trong một giờ với tổng thể tích 1,5 ml.
Vì phản ứng xác định hoạt tính FPU không tuyến tính, phản ứng tuyến tính là
phản ứng mà sản phẩm tạo ra tỷ lệ thuận với lượng enzyme trong mỗi phút của phản
ứng, nên enzyme phải được pha loãng đến nồng độ mà có thể thủy phân giấy lọc sinh
ra 2 mg đường khử/giờ.
2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase
Cơ chất ở đây là dẫn xuất của cellulose hòa tan trong nước như CMC hoặc
HEC được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, phương pháp này không xác định hoạt tính
cellulase thực sự mong muốn mà chỉ xác định hoạt tính endoglucanase là chính.
Phân tích hoạt tính endoglucanase bằng cách đo lượng đường khử tạo ra sau
phản ứng thủy phân cơ chất CMC hay HEC bằng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
hoặc thuốc thử Nelson – Somogy hoặc sử dụng ferric cyanide theo phương pháp của
Wood và McCrae (1972).

24
2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel
2.9.1. Bản chất của phương pháp (Phan Thị Ánh Nhung, 2011)
Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử
và phân tích định lượng tương tác phân tử.
 Một số thông số vật lý của phương pháp
 Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ
nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G-75 có FR
từ 30.000 – 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui
vào hạt gel.
 Phạm vi tách (fractionation range): Thí dụ, sephadex G-75 có FR từ 30.000
– 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ
được phân tách dễ dàng bởi G-75.
 Độ ngậm nước (water regain): là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô
hấp thụ vào. Thí dụ G-50 có WR là 5,0 ± 0,3g. Giá trị này chưa tính đến
lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng để tính thể tích của cột.
 Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu
khi trương nở trong nước. G-50 có thể tích nền 9 – 11 ml/g gel khô.
Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel
(Http://voer.edu.vn/m/phuong-phap-nghien-cuu-enzyme/e887870c)

25
 Hạt gel (gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định
bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt có kích
thước lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao,
nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 – 40 µm)
lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, hiệu quả tách cũng không tốt. Các hạt
gel có kích thước 100 – 200 mesh (50 - 150 µm) thường được chọn.
 Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel
trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons.
 Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách
ra khỏi cột.
2.9.2. Đặc tính của gel (Trần Lương Hồng Yến, 2012)
Có 4 loại gel thường được sử dụng.
 Dextran: có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB
(Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Saphadex. Giới hạn tách của gel
dextran – 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó
giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ
sung thêm các liên kết ngang bởi N, N’ – methylenebisacrylamide thì dextran
có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia – LKB cung
cấp).
 Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và
N, N’ – methylenebisacrylamide (Bio-Rad cung cấp, Bio-gel – P là tên
thương hiệu).
 Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ
galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro
nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên
thương mại là Bio-gel A, còn Pharmacia cung cấp với tên thương mại là
sepharose và seperose.

26
Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho
phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất
để tách.
2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide (Trần
Linh Thước, 2003)
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrymide và N, N’ – methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammonium persulfate (APS), N, N, N’, N’-Tetramethyl ethylenediamine
(TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích
thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các
phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-
acrylamide. Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép tách các phân tử sinh học
có kích thước lớn và ngược lại.
SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của
SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol hoặc dithiothreitol (DTT). Với tác nhân này, protein có cấu trúc bậc
2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được
tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc
vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân
tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng
của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử
tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, cần so sánh với một thang phân tử
chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa
các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt
hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục
(discontinuos gel). Trong phương pháp này gel gồm hai lớp:

27
- Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và
trong một lớp băng mỏng.
- Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát
ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau dung dịch đệm, nồng độ
acrylamide và vị trí.
Kỹ thuật SDS – PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000 – 20.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn
hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn
2,5%.
Ngoài kỹ thuật SDS – PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến
tính protein, (Denaturing condition), người ta dùng một số kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính
(Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số
vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính protein như tạo liên kết giữa
các protein với nhau. Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng
giữa những protein khác, người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện
(Isoelctic focusing gel electrophoresis).

28
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ 16/05/2015 đến 16/08/2015 ở phòng các
hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh và
phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí
Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn vi sinh vật
Giống nấm mốc Trichoderma koningii được cung cấp bởi phòng vi sinh ứng
dụng – Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh.
3.2.2. Cơ chất
Bã mía được phơi khô, cắt nhỏ và cám gạo do Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.
Hồ Chí Minh cung cấp.
3.2.3. Hóa chất
Các hóa chất dùng để chuẩn bị môi trường giữ giống và bổ sung vào môi
trường lên men bán rắn gồm: (NH4)2SO4, K2HPO4, urea, glucose, peptone, CaCl2,
MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CoCl2 của Trung Quốc sản xuất.
Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH3COONa.3H2O, CH3COOH.
Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: glucose (Trung Quốc), CMC,
giấy lọc, thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid).
Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein: albumine, thuốc thử
Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Ethanol 960
, Acid phosphoric 85%).
Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di: Sodium dodecyl sulphate,
ammonium persulfate, bromophenol blue, N,N,N’,N’-Tetramethyl ethylenediamine
(C6H16N2-TEMED), acrylamide/bisacrylamide, β-mercaptoethanol, thang phân tử
lượng nhỏ (sigma) glycerol, glycine (C2H5O2N).

29
Cách pha một số thuốc thử:
- Dung dịch đệm acetate 0,05 M pH 5: dung dịch acid acetic 0,05 M hút 2,91
ml acid acetic định mức tới 1000 ml. Cân 4,1 g natri acetate định mức tới 1000 ml,
chỉnh pH bằng máy đo pH.
- Dung dịch thuốc thử lugol: cân đúng 2 g KI hòa tan trong khoảng 100 ml nước
cất. Nghiền 1 g tinh thể iode trong cối và thêm 50 – 100 ml nước cất. Cho dung dịch
iode vào dung dịch KI khuấy cho tan hoàn toàn rồi thêm nước cất đến 300 ml.
- Dung dịch thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic):
+ Cân 10 g DNS cho vào beaker 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt
cốc vào chậu nước 800
C và khuấy đều.
+ Hòa tan 16 g NaOH trong 150 ml nước cất. Thêm dung dịch NaOH từ từ vào
dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800
C.
+ Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch
DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800
C.
+ Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng sau đó chuyển dung dịch vào
bình định mức 1000 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung
dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.
- Dung dịch CMC (1%): cân 10 g CMC hòa tan với 800 ml nước cất, tiếp tục
cho vào 100 ml acid acetic 1 M. Điều chỉnh pH 5 với NaOH 1N. Định mức
với nước cất 1000 ml.
3.3. Thiết bị và dụng cụ
3.3.1. Thiết bị
- Autoclave (Memmert – Đức).
- Máy đo quang phổ kế UV – Vis 2500.
- Kính hiển vi quang học Nikon.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật.
- Tủ cấy vô trùng.
- Tủ mát Alaska.
- Bể ủ nhiệt Memmert.

30
- Tủ sấy (Memmert – Đức).
- Máy ly tâm.
- Máy đo pH.
- Bộ điện di đứng.
- Hệ thống máy sắc ký cột áp suất thấp BIO-RAD BioLogic.
- Bếp điện, bếp từ.
- Máy nước cất.
3.3.2. Dụng cụ
- Đĩa petri.
- Cốc thủy tinh 100 ml, 200 ml, 1000 ml.
- Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml.
- Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml.
- Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml.
- Pipetman 100 – 1000 µl. Đầu típ.
- Ống ly tâm.
- Que cấy, que gắp.
- Đũa thủy tinh.
- Giá đỡ ống nghiệm.
- Đèn cồn.
- Bình định mức.
- Bóp cao su
- Bông thấm nước.
- Bông không thấm nước
- Lamlle, lamelle.
- Buồng đếm hồng cầu.
- Phễu, giấy lọc.
- Bao nilon hấp, dây thun.
- Giấy gói,…

31
3.4. Môi trường
 Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men
bán rắn).
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek
Thành phần Hàm lượng
NaNO3
K2HPO4
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
KCl
FeSO4
Saccaroza
Nước
3,5 g
1,5 g
30 g
0,5 g
0,5 g
0,01 g
30 g
1000 ml
3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất
Tiến hành theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm
không đổi.
Sử dụng tủ sấy:
- Tiến hành: sấy 3 cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050
C đến trọng lượng không
đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân 𝑚0 (g). Cho vào mỗi cốc 2
g cơ chất, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng cốc và
mẫu 𝑚1 (g).
- Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050
C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra
để nguội 30 phút trong bình hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để cốc vào sấy
tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu các lần sấy
không thay đổi. Ghi nhận khối lượng 𝑚2 (g). Kết quả tính độ ẩm:
W =
(𝑚1− 𝑚2) × 100
𝑚1− 𝑚0

32
Trong đó:
𝑚0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
𝑚1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
𝑚2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy (Karimi, 2009)
Công thức tính lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường:
F =
𝐴 × (𝐵 − 𝐶)
100 − 𝐵
Trong đó:
A: khối lượng cơ chất nuôi cấy (g)
B: độ ẩm môi trường mình cần (%)
C: độ ẩm trong cơ chất A (%)
F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml)
100: độ ẩm 100%.
Ví dụ: 20 g cơ chất có độ ẩm khoảng 10% nhưng cần đạt độ ẩm 50%.
Từ công thức trên suy ra: F =
20 × (50 − 10)
100 − 50
= 16 ml
Như vậy cần bổ sung thêm 16 ml nước cất sẽ được độ ẩm là 50%.
3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii
Cấy chuyển giữ giống và nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii trên môi
trường bán rắn nhằm thu nhận enzyme cellulase phục vụ cho quá trình nghiên cứu.
3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA
 Mục đích: ổn định giống.
 Chuẩn bị:
Môi trường giữ giống PGA gồm có: khoai tây 200 g, glucose 20 g, agar 20 g,
nước cất 1000 ml, pH môi trường là 6,5.
Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt miếng nhỏ cho vào cốc, cho nước cất
vào nấu đến khi khoai tây chín mềm trong khoảng 30 phút sau đó đem ra để nguội rồi
lọc chiết lấy nước. Cho agar vào và tiếp tục nấu, trong quá trình nấu phải khuấy đều,
cuối cùng cho glucose vào và khuấy cho tan hết.

33
Cho môi trường vào 1/4 các ống nghiệm, hấp khử trùng ở 1210
C, 1 atm trong
15 phút, sau đó xếp nghiêng các ống nghiệm, để nguội tạo môi trường thạch nghiêng.
Mặt thạch không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm.
 Thao tác thực hiện:
Dùng que cấy móc đã khử trùng, lấy một ít bào tử từ ống giống cấy nhẹ nhàng
lên bề mặt thạch nghiêng được chuẩn bị ở trên theo hình ziczăc. Sau 2 ngày ở nhiệt
độ phòng, bào tử nấm phát triển và mọc đều, các ống nghiệm giữ giống sẽ được cấy
sang môi trường giữ giống cấp 2 (môi trường lúa) hoặc được bảo quản trong tủ lạnh
ở nhiệt độ 5 – 90
C để sử dụng cho các thí nghiệm về sau. Tất cả các thao tác trên đều
được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa
 Mục đích: nhằm tạo giống tốt hơn, bảo quản được lâu hơn và chuẩn bị giống,
đảm bảo lượng giống cho việc nuôi cấy trên môi trường bán rắn.
 Chuẩn bị:
Lấy 40 g lúa cho đều vào 2 bình tam giác 500 ml, bổ sung môi trường khoáng
tối ưu và nước sao cho độ ẩm môi trường đạt 50%, hấp thanh trùng môi trường ở
1210
C trong 15 phút. Môi trường lúa sau khi nguội sẽ được cấy mốc giống từ môi
trường thạch nghiêng vào.
Lượng khoáng bổ sung vào môi trường được tính theo công thức đã được trình
bày ở phần 3.5.2.
Dùng pipet hút 2 ml nước cất vô trùng cho vào ống thạch nghiêng chứa giống,
dùng que cấy cạo lớp sinh khối, sau đó chuyển dịch chứa sinh khối sang bình môi
trường lúa. Trộn đều, đậy nút bông lại, bao gói, ủ ở nhiệt độ 300
C. Các thao tác cấy
phải tiến hành gần ngọn đèn cồn, dụng cụ phải vô trùng bằng cồn 700
. Sau khi cấy 2
– 3 ngày, quan sát thấy nấm mốc mọc đều và bao phủ kín bề mặt các hạt lúa thì được
đem bảo quản ở 40
C trong tủ lạnh.

34
3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase (Raimbault, 1998),
(Tolan, 1999)
 Mục đích: tạo môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho nấm mốc phát triển để
thu nhận enzyme hiệu quả nhất.
 Chuẩn bị:
Phối trộn bã mía với cám gạo (BM:CG) theo các tỷ lệ khối lượng cần khảo sát.
Cơ chất được chứa trong các erlen có dung tích 250 ml và được làm ẩm bằng nước
có bổ sung môi trường dinh dưỡng Czapek (lượng nước và khoáng bổ sung được tính
theo công thức đã trình bày ở phần 3.5.2). Điều chỉnh theo độ ẩm ban đầu, pH ban
đầu, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống. Hấp khử trùng môi trường ở 1210
C, 1 atm trong
20 phút, làm nguội.
Cho nước cất vô trùng từ bình erlen vào bình môi trường lúa sao cho vừa ngập
hết cơ chất, lắc đều, dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy đều (để bào tử nấm mốc tách
khỏi môi trường lúa) để có huyền phù.
Dùng pipet hút dung dịch chứa nấm mốc trong bình môi trường lúa vào bình
môi trường bán rắn, khuấy đều, đậy nút bông lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong
thời gian thích hợp sẽ trích ly thu nhận enzyme.
Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme, nấm mốc được nuôi trên môi trường có tỷ lệ bã mía và cám
gạo khác nhau (2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3), độ ẩm môi trường ban đầu từ 45 – 65%,
pH ban đầu từ 4 – 8, nồng độ dung dịch dinh dưỡng từ không bổ sung đến nồng độ
gấp 0,5 – 3 lần nồng độ chuẩn (NĐC), thời gian nuôi cấy từ 8 – 112 giờ, tỷ lệ giống
từ 0,5x107
– 3x107
bào tử/môi trường.

35
3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii (Trần Linh Thước, 2003)
Thí nghiệm quan sát hình thái nhằm khẳng định lại các đặc điểm khuẩn lạc
của chúng trên môi trường PGA, hình thái vi thể và các đặc tính các chủng vi nấm.
 Quan sát đại thể
Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ trên bào tử đính của nấm mốc, chuyển
sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã hấp vô trùng, cắm đầu móc xuống mặt thạch
thành 3 điểm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày. Quan sát khuẩn lạc của
nấm mốc (hình dạng và màu sắc).
 Quan sát vi thể
Để quan sát thấy hình dạng của vi nấm trước tiên ta phải nuôi cấy buồng ẩm.
Chuẩn bị 5 đĩa petri có giấy thấm nước vừa đĩa petri đặt ở đáy đĩa, trên giấy
đặt một miếng lamlle và một miếng lamelle, ta đem hấp khử trùng cùng với nước cất,
môi trường 50 ml môi trường PGA, 1 đĩa petri sạch.
Sau khi hấp khử trùng xong, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn đổ môi
trường PGA vào đĩa petri, chờ cho môi trường PGA trong đĩa nguội và đặc lại. Sau
đó ta dùng dao có mũi nhọn được khử trùng dưới ngọn đèn cồn, ta cắt và chia đều
thạch PGA trong đĩa thành miếng vuông có kích thước 1,5 x 1,5 cm. Cho miếng thạch
vuông lên miếng lamlle trong đĩa petri đã chuẩn bị sẵn, sau đó dùng que cấy móc lần
lượt cấy giống trong thạch nghiêng môi trường PGA lên 4 góc của miếng thạch
vuông. Tiếp đó dùng lamelle đặt lên trên mặt thạch vừa cấy mẫu, rồi cho vài giọt
nước cất vô trùng lên miếng giấy thấm nước đặt ở đáy đĩa, đậy nắp đĩa petri lại để ở
nhiệt độ phòng.
Chờ sau 24 – 48 giờ lấy miếng lamelle ra khỏi đĩa petri. Nhỏ vài giọt cồn 960
lên lamelle, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10%, đậy lá kính lên
và quan sát dưới kính hiển vi (vật kính 40X) cuống sinh bào tử đính và ti thể. Mục
đích của việc trên là tăng khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi
nấm và làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát.

36
3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê
Duy Linh và cộng sự, 1997)
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men,
bào tử nấm mốc). Các loại buồng đếm hồng cầu thường được sử dụng: buồng đếm
Thomas và buồng đếm Goriep.
Nguyên tắc cấu tạo của hai loại buồng đếm này đều giống nhau. Đó là một
phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành hai
khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông.
Mỗi ô lớn có diện tích là 1/25 mm2
lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là
16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2
và chiều cao là 0,1 mm. Như vậy thể tích
của một ô nhỏ là 1/400 mm2
x 0,1 mm = 1/4000 mm3
hay 1/4000000 ml.
3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô
 Mục đích: tách dịch enzyme thô từ môi trường bán rắn.
 Nguyên tắc: dùng nước cất để hòa tan enzyme trong sinh khối nuôi cấy để thu
được dung dịch có chứa enzyme ta gọi là enzyme thô.
Sau thời gian nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, cân lấy 10 g canh trường. Thêm
nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy bằng máy khuấy với
tốc độ 600 vòng/phút trong vòng 30 – 45 phút, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút
trong vòng 10 phút để loại bỏ tạp chất và thu dịch. Dịch chiết enzyme thô để mát ở
nhiệt độ 40
C.
3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose
CMC là cacbonxylmethylcellulose các đơn vị glucose liên tiếp với nhau bằng
liên kết 1-4-β glucose được sử dụng như một phần nguồn cacbon. Ta tiến hành pha
môi trường và chuẩn bị đĩa petri hấp khử trùng cùng với môi trường. Sau đó tiến hành
đổ đĩa trong tủ cấy vô trùng. Chờ môi trường nguội tiến hành cấy giống. Ủ ở nhiệt độ
phòng và sau 48 giờ tiến hành nhỏ lugol đo đường kính phân giải CMC.
Tiến hành pha môi trường CMC – agar trong nước cất. Cân 2 g CMC thêm
nước cất thành 200 ml môi trường, tiến hành đổ khoảng 18 đĩa môi trường. Sau khi

37
môi trường nguội ta tiến hành đục mỗi đĩa 3 lỗ. Sau thời gian trích ly, chuẩn bị đĩa
thạch và nhỏ dịch enzyme vào lỗ thạch. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt lugol vào đĩa
petri và quan sát vòng phân giải CMC.
Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật
Hóa chất Hàm lượng
NaNO3 0,4 g
K2HPO4 0,2 g
MgSO4 0,1 g
KCl 0,1 g
CMC 1 g
Pepton 0,04 g
Agar 2,5 g
Nước cất 200 ml
Sau khi hấp đĩa và môi trường xong tiến hành đổ 5 đĩa. Đợi môi trường nguội
tiến hành cấy điểm. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ thuốc thử lugol lên và đo đường kính vòng
phân giải.
3.5.8. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (Đinh Hoàng Yến,
2012)
Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái
tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion
(màu xanh da trời). Dưới điều kiện acid mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở
trạng thái bị proton hoá do bị gắn 2 H+
hoặc còn gọi là cation có màu đỏ. Ở trạng thái
này Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 470 nm. Tuy nhiên, khi
gắn với protein, nó chuyển sang dạng ổn định ở trạng thái không bị proton hoá hay
còn gọi là anion và có màu xanh da trời. Trong quá trình phản ứng tạo phức với
protein có 2 dạng tương tác hoá học xảy ra. Dạng cation (màu đỏ) chuyển các điện tử
tự do của nó vào các nhóm có thể ion hoá có trong phân tử protein dẫn đến việc bộc
lộ một số vùng kị nước trong phân tử protein. Những vùng này sẽ phản ứng với vùng

Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Similar to Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel