Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN
MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ
VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG
NẤM MEN Pichia pastoris
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng
Sinh viên thực hiện : Phan Vũ Hải Yến
MSSV: 1051110247 Lớp: 10DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên
cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về
lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Phan Vũ Hải Yến

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công
nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho
tôi trong suốt 4 năm đại học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô
kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn
Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến
thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt
nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm
Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và
hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài.
Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi
những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này.
Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi
dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều
kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn này.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Phan Vũ Hải Yến

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG.............................................................................................. ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề:......................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài ............................................................................2
1.3. Nội dung nghiên cứuc.....................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN..............................................................................................3
2.1. Cấu tạo lignocellulose ....................................................................................3
2.1.1. Cellulose.........................................................................................................4
2.1.2. Hemicellulose ................................................................................................6
2.1.3. Lignin..............................................................................................................7
2.2. Enzyme cellulase ............................................................................................8
2.2.1. Phân loại enzyme ..............................................................................................8
2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase......................................................................9
2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase.....................................................................10
2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum..............11
2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum.....................................11
2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome...........................................................12
2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris..............................................................14
2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris......................................14
2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris.........................................................14
2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris.............................15

ii
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium
thermocellum...........................................................................................................16
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................19
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: ..................................................................19
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:......................................................................................19
3.1.2. Thời gian nghiên cứu:.....................................................................................19
3.2. Nguyên liệu......................................................................................................19
3.2.1. Chủng vi sinh vật.............................................................................................19
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ..........................................................................................19
3.2.3. Hóa chất............................................................................................................20
3.2.4. Môi trường .......................................................................................................22
3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): .........................................................22
3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): ................................................22
3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)..........................22
3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): ...........................22
3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC...23
3.2.5. Plasmid .............................................................................................................23
3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt........................................................................23
3.2.5.2. Plasmid pPIC9K..................................................................................24
3.2.6. Các cặp mồi sử dụng.......................................................................................25
3.3. Phương pháp nghiên cứu:................................................................................26
3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của
Clostridium thermocellum.........................................................................................26
3.3.1.1. Thiết kế mồi ....................................................................................26

iii
3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng
PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế.....................................................................27
3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment
DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy............................................28
3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt ...28
3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp...............................................29
3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa
biến nạp ............................................................................................................30
3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ....................................31
3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli..............................32
3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn............................33
3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự
tương ứng trên GenBank..................................................................................34
3.3.2.Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD
......................................................................................................................................34
3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn..........................34
3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR &
Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON..........................................35
3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD...........................36
3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp...............................................36
3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5α..........36
3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc ....................37
3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn............................37
3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự
tương ứng trên GenBank..................................................................................38

iv
3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa
enzyme endoglucanase D..........................................................................................38
3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp............................39
3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp.............................................................39
3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen
CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D.............40
3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số...............................................40
3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng
phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R..........................................41
3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái
tổ hợp...........................................................................................................................42
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................43
4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của
Clostridium thermocellum ......................................................................................43
4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR.................................................43
4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD...................44
4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc .............................................45
4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu
CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn...................................................................46
4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng
giải trình tự..................................................................................................................48
4.2.1. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc .............................................52
4.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu
CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI ............................53
4.2.3. Kiểm tra dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD
bằng giải trình tự ........................................................................................................55

v
4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD ......................57
4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115
......................................................................................................................................58
4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D......59
4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương
pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R.....................................................................60
4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ
hợp................................................................................................................................62
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................63
5.1. Kết luận.........................................................................................................65
5.2. Đề nghị..........................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................66
PHỤ LỤC

vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AOX Alcohol oxydase
BMGY Buffered Glycerol-complex
BMMY Buffered Methanol-complex
bp Base pair
CBD Cellulose binding domain
CMC Carboxymethyl-cellulose
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
Kb kilo base
LB Luria-Bertani
MD Minimal Dextrose
Mut Methanol Utilisation
NCBI National Center for Biotechnology Information
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
Taq Thermus aquaticus
TAE Tris – acetate – EDTA
TE buffer Tris EDTA buffer
YNB Yeast Nitrogen Base
YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose. ..................................................3
Hình 2.2. Lignocellulose .............................................................................................4
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose ..........................................................................5
Hình 2.4. Cấu trúc cellulose ........................................................................................6
Hình 2.5. Hemicellulose. .............................................................................................7
Hình 2.6. Lignin...........................................................................................................7
Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase. ..................................9
Hình 2.8. Clostridium thermocellum........................................................................ 11
Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome...........................................................12
Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb ......................................................................................21
Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2.......................................................................................24
Hình 3.3. Plasmid pPIC9K ........................................................................................25
Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ...............27
Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/
pJET1.2R ................................................................................................................... 32
Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/
AOX1R.......................................................................................................................37
Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R...........41
Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD .....................43
Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-
CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml)...................................................444
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli
DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R...........................................45
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme
SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc
hiệu CelDF/ CelDR ....................................................................................................46
Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường
LB/ ampicillin (50 µg/ml). .........................................................................................51

viii
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli
DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R.................................................52
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi
CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.....................53
Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid
pPIC9K-CelD trên NCBI .......................................................................................... 56
Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD.................58
Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418
.....................................................................................................................................60
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid
pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 ..........................................................61
Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm
với thuốc đỏ Congo ................................................................................................... 63

ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: .......................................26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR..........................27
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2......................29
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R ...............31
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI................33
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI
và EcoRI .....................................................................................................................35
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K................36
Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI..............38
Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P. pastoris tái tổ hợp
.................................................................................................................................... 64

1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề:
Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học
và công nghệ sản xuất thực phẩm. Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch
có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch
đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai. Hiện nay 98% ethanol
được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm. Điều này sẽ gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới. Trong khi đó, sản xuất
nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì,
trấu, bã mía,…Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học
không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn
giảm ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái
sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân
cellulose là phương pháp hóa học và sinh học. Trong thủy phân hóa học, cellulose
bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao. Công nghệ
này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi
trường và con người. Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose
là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ.
Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose
thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên, việc sử
dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất
chuyển hóa cơ chất thấp. Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ
vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp,
enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn. Chính vì thế, ứng dụng
những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp
là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng
lớn.

2
Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy
cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum.
Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn
cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất
trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose. Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid
tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn
Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành.
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân
hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản
xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý.
1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài
Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme
endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum.
1.3. Nội dung nghiên cứu:
- Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium
thermocellum bằng phản ứng PCR.
- Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa
gen CelD
- Tạo dòng E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa
enzyme endoglucanase D.
- Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme
endoglucanase D.

3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Cấu tạo lignocellulose
Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm sản
lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là
lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007). Việc chuyển hóa lignocellulose không
chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi
dinh dưỡng cho cây.
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong
phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các
chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose
và lignin. Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác
nhau của cây.
Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose
Nguồn: Pérez và cộng sự (2002)
Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu
tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy
trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành
phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ. Do đó muốn
phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi
sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng. (Himmel và cộng sự,
2007).

4
Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này gắn lại với nhau
nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi. Hemicellulose và lignin bao bọc xung
quanh các vi sợi, tạo nên một cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công
của enzyme cũng như các hóa chất khác trong quá trình thủy phân (Charles E.
Wyman, 1996).
Hình 2.2. Lignocellulose
Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992)
2.1.1. Cellulose
Cellulose là thành phần polymer phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50%
lượng sinh khối thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Thành
phần cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta
thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây. Cellulose chiếm đến
90% trong sợi bông, 50% trong gỗ, 40 – 50% trong bã mía, 35 – 40% trong rơm lúa
mỳ và lúa gạo (Sloneker, J. H., 1971; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012).
Cellulose là chất rắn màu trắng, không mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan
trong nước và các dung môi thông thường (rượu, ete, benzen,…) nhưng tan trong
dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 trong NH3). Cellulose bị phân hủy mạnh
dưới tác dụng của một số dung dịch axit vô cơ mạnh như: HCl, H2SO4,… và tương
đối yếu với các axit hữu cơ (axit acetic, axit formic,…) nhưng bền vững dưới tác
dụng của kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004).

5
Cellulose là polysaccharide có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng
phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose
nối lại với nhau bằng liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi. Các phân tử
cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hidro tạo thành
cấu trúc dạng sợi bền vững.
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose
Nguồn: Gardner và cộng sự (1974)
Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng 3 nm. Nhiều sợi liên kết
song song với nhau thành chùm nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH, tạo thành vi
sợi. Trong tự nhiên, các vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở 2 vùng:
- Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng
¾ cấu trúc cellulose (Taiz và cộng sự, 2006). Các mạch cellulose liên kết với nhau
nhờ liên kết hidro giữa nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch
khác, tạo thành một mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản sự tác động của
enzyme ở điều kiện bình thường.
- Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals do đó
vùng này có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (Charles
E. Wyman, 1996). Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi
cho enzyme cellulase tấn công dễ dàng, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Tuy vậy việc thủy phân cellulose chỉ có thể đạt hiệu quả cao khi tách cellulose khỏi
các thành phần khác cùng cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh và cộng
sự, 2010).

6
Hình 2.4. Cấu trúc cellulose
Nguồn: Hsu và cộng sự (1980)
2.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau
cellulose. Đây là polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ hơn nhiều so với
cellulose. Chúng được cấu tạo từ các gốc đường khác nhau như arabinose,
galactose, glucose, mannose và xylose. Các gốc đường này liên kết với nhau thông
qua các liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside, 𝛽 – 1,3 glucoside và 𝛽 – 1,6 glucoside tạo thành
cấu trúc dạng mạch nhánh. Sự phân nhánh trong cấu trúc của hemicellulose cũng
tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi và các chất hóa học tấn công. Cấu trúc của
hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm. Khi bị phân
hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,
2012).

7
Hình 2.5. Hemicellulose
Nguồn: Fengel và Wegener (1989)
2.1.3. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt
trần và thực vật hạt kín). Hàm lượng và thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mô
và theo nhóm thực vật, ở cây gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30%... Lignin có nhiệm vụ
kết dính và tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn
chặn các độc tố và sự xâm nhiễm của các vi sinh vật đồng thời cản trở sự tiếp xúc
của enzyme cellulase với cellulose (Odier và cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng và
cộng sự, 2012). Do vậy phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả
cellulose. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tỉ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân
hủy và mức độ thủy phân cellulose ( Kim và cộng sự, 2006).
Hình 2.6. Lignin
Nguồn: J. Pérez và cộng sự (2002)

8
Lignin có cấu tạo vô định hình, kị nước và bền với các tác nhân phân giải
hóa học và sinh học. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải
tạo ra các hợp chất thơm. Đây là hợp chất được tạo thành từ sự ngưng tụ của các
loại rượu khác nhau, trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, synafilic và
courmarylic. Các loại rượu này liên kết với nhau bằng liên kết C – C và C – O.
2.2. Enzyme cellulase
2.2.1. Phân loại enzyme
Cellulase là enzyme được sinh ra từ nhiều sinh vật khác nhau như nấm mốc,
vi khuẩn, thực vật,…có khả năng thủy phân cellulose. Cellulase có thể tồn tại dưới
dạng enzyme đơn hoặc phức hệ enzyme còn gọi là cellulosome. Dựa vào cơ chế
thủy phân cellulose, enzyme cellulase được Wood và Mc. Cral (1979) chia làm 3
nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase.
- Endoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là enzyme
tham gia phân giải liên kết 𝛽-1.4 glucoside trong cellulose. Sản phẩm của quá trình
phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến
cấu trúc cellulose vô định hình và tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh.
- Exoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt
đầu không khử của chuỗi cellulose và giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này
không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất
hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng.
- 𝛽 – D – glucoside glucohydrolase hay 𝛽 – glucosidase (EC 3.2.1.21):
enzyme này có tác dụng thủy phân cellobiose và cellodextrine tan tạo thành D –
glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn
nhau của quá trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992).

9
2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase
Trong thiên nhiên, quá trình thủy phân cellulose có sự tham gia của cả ba
loại enzyme là endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase. Mỗi loại enzyme
tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định, xúc tác cho các giai đoạn nối
tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau trong quá trình thủy phân từ cellulose thành
glucose (Cullen và cộng sự, 1992). Nhờ vào sự phối hợp hoạt động của các enzyme
này mà cơ chất được thủy phân hoàn toàn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme endoglucanase có tác dụng phân cắt
tốt trên vùng vô định hình, đặc biệt trên các cellulose biến tính như carboxymethyl-
cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC). Ngược lại, enzyme exoglucanase
tác động trên vùng cellulose kết tinh, ít trên vùng cellulose vô định hình và hầu như
không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,
2012)
Dưới tác dụng của exocellulase và endocellulase, mạch cellulose tách thành
các mạch nhỏ (oligosaccharide), sau đó tiếp tục bị phân cắt thành đường glucose
nhờ enzyme β-glucosidase.
.
Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase

10
2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase
Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng cellulose vô cùng đa dạng và
phong phú. Nhiều loài nấm hoặc vi khuẩn có phân giải cellulose mạnh ở điều kiện
hiếu khí và kị khí và ở các nhiệt độ khác nhau.
Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết một lượng lớn enzyme cellulase có cấu
trúc hoàn chỉnh ra ngoài môi trường nên phân hủy cellulose khá mạnh. Đại diện có
các loài như Trichoderma reesei, T. viridae, Aspergillus niger, Fusarium solani,
Penicillium pinophinum, Sporotrichum pulverulentum. Các loài nấm ưa nhiệt cũng
được chú ý vì chúng có thể sinh các enzyme bền nhiệt, sinh trưởng và phân giải
nhanh cellulose. Nhưng thông thường các chủng nấm sợi phân giải cellulose điển
hình thường thiếu enzyme 𝛽 − glucosidase, vì vậy để hệ này hoạt động hiệu quả
cần phải bổ sung 𝛽 − glucosidase (Lee và cộng sự, 1996).
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, đa số sống trong đất và phát triển
trong điều kiện hiếu khí, một số ít loài có thể sống trong điều kiện kị khí. Một số xạ
khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là: Streptomyces, Streptosporagium,
Actinomyces nocardia, Micromonospora …(Schimz và cộng sự, 1983).
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phân giải cellulose mạnh nhưng cường độ
không bằng nấm do lượng enzyme tiết ra ít hơn. Vi khuẩn hiếu khí và kị khí đều có
thể phân giải cellulose. Các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng phân giải cellulose
khá mạnh như Cellulomonas, Vibrio,…Trong điều kiện yếm khí, các loài vi khuẩn
ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose. Đại diện điển hình cho các
vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30 – 400C là loài Clostridium
omelanskii, vi khuẩn ưa nóng là loài Clostridium thermocellum, nhiệt độ tốt nhất
cho sự phát triển của chúng là 60 – 650C. Các vi khuẩn ưa ấm, ưa nóng phát triển
tốt trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và
cellubiose, chúng sử dụng đường này như nguồn năng lượng (Schwarz WH và cộng
sự, 1986; Schwarz, 2001).

11
Trong tự nhiên, đa số các loài không có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp
tất cả các loại enzyme có trong phức hệ cellulase. Có loài này có khả năng sinh tổng
hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp loại enzyme khác. Chính vì vậy,
sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để
(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên có một loại vi khuẩn có khả
năng phân hủy cellulose nhanh hơn nhờ vào hệ thống phức hợp đa enzyme. Đó
chính là vi khuẩn Clostridium thermocellum.
2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum
2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum
Hệ thống phân loại:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Firmicutes
Lớp: Clostridia
Bộ: Clostridiales
Họ: Clostridiaceae
Chi: Clostridium
Loài: Clostridium thermocellum Hình 2.8. Clostridium thermocellum
Clostridium thermocellum là trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, ưa
nhiệt, sinh bào tử, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 600C – 650C và pH từ 6,1 – 7,5 (Freier
và cộng sự, 1988). Đây là một vi sinh vật tiềm năng trong công nghiệp sản xuất cồn
sinh học vì nó có khả năng phân hủy cellulose. Quá trình phân giải cellulose bởi
Clostridium thermocellum là các phản ứng được thực hiện bởi 1 phức hệ enzyme
gắn kết với nhau gọi là cellulosome (Bayer và cộng sự, 1998). Tuy nhiên đây là vi
sinh vật kị khí bắt buộc nên quá trình nuôi cấy đạt hiệu quả không cao, lượng
enzyme tạo ra thấp, khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.

12
2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome
Cellulosome là phức hệ đặc biệt gồm nhiều enzyme liên kết với nhau. Phức
hệ này có khả năng phân huỷ cơ chất phức tạp như cellulose vì có chứa đầy đủ các
thành phần enzyme để thuỷ phân triệt để cơ chất này. Vì vậy, cellulosome có thể
thủy phân cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose trong khi các enzyme
đơn lẻ không thể thực hiện được chức năng này.
Cấu trúc quan trọng của cellulosome bao gồm scaffoldin cùng dạng enzyme
hoạt động cho phép thủy phân cellulose một cách có hiệu quả.
Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome
Nguồn: Shoham Y và cộng sự (1999)
Scaffoldin là thành phần quan trọng của hệ cellulosome có các vùng chức
năng :
- Kết nối các enzyme thủy phân thuộc phức hợp cellulsome thông qua tương
tác cohesin (scaffoldin) và dockerin (enzyme).

13
- Kết nối phức hợp và các nguồn cơ chất, cellulose nhờ vùng CBD (cellulose-
binding domain).
- Kết nối bề mặt tế bào và phức hợp enzyme nhờ các protein dính kết với bề
mặt tế bào, nhờ đó mà tế bào thuận tiện trong việc sử dụng sản phẩm phân giải cho
quá trình đồng hóa.
Trong cấu tạo của scaffoldin thì cohesin luôn có mặt và là thành phần dính
kết với các dockerin của enzyme. Số lượng các cohesin là khác nhau trong các
scaffoldin khác nhau và có tính đặc trưng cho tương tác của chúng với dockerin
trong các enzyme có nguồn gốc cùng loài. Ví dụ trong Clostridium thermocellum,
scaffoldin bao gồm 9 cohesin loại I nối với các enzyme phân giải qua các dockerin
loại I, các dockerin này không tương tác với các cohesin được tìm thấy trong
scaffoldin của Clostridium cellulolyticum. Bên cạnh đó, một dockerin loại II nối với
các protein bề mặt tế bào qua các cohensin loại II. Tương tác này sẽ gắn chặt cấu
trúc cellulosome lên bề mặt tế bào, giúp quá trình thủy phân cellulose hiệu quả hơn
(Doi và cộng sự, 2004).
CBD (Carbonhydrate binding domain) là một thành phần của scaffoldin, có
chức năng gắn hệ cellulosome vào cơ chất cellulose. Scaffoldin của Clostridium
thermocellum chứa CBD IIIa liên kết rất mạnh với cellulose kết tinh. Ngoài ra nó
còn làm yếu các liên kết giữa các sợi của cellulose kết tinh, thúc đẩy cho quá trình
phân giải tiếp theo (Bayer và cộng sự, 1998).
Ở C. thermocellum có một hệ thống enzyme endoglucanase rất đa dạng bao
gồm: CelA, CelB, CelC, CelD, CelE, CelF, CelG, CelH, CelJ, CelK, CelN, CelO,
CelP, CelQ (Roy H. Doi và Akihiko Kosugi, 2004). Trong đó, endoglucanase CelD
có hoạt tính rất cao được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Enzyme này
hoạt động tối ưu ở pH 6,3 và nhiệt độ 600C. Hoạt tính riêng của enzyme này đạt 428
IU/ mg cao hơn nhiều so với các enzyme endoglucanase khác của C. thermocellum
(Gwennael và cộng sự, 2000).

14
Do đó, khi tương tác với scaffoldin thì hoạt tính của enzyme tăng lên nhiều
so với enzyme tự do, giúp cho enzyme gắn chặt với cơ chất hơn và nâng cao hiệu
quả thủy phân.
2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris
Pichia pastoris là sinh vật eukaryote thuộc họ Saccharomycetaceae. Chúng
sinh trưởng ở nhiệt độ từ 28 – 320C. Nếu nhiệt độ môi trường nuôi cấy cao hơn
320C sẽ ảnh hưởng đến quá trình tiết protein của nấm men này. Pichia pastoris là
một trong số không nhiều nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn
cacbon duy nhất. P. pastoris có hai gen mã hóa enzyme alcohol oxydase (AOX) là
AOX1 và AOX2.
Ứng dụng của P. pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác
promoter AOX, promoter liên quan đến quá trình đồng hóa methanol. Thông
thường gen biểu hiện protein mong muốn đặt dưới sự kiểm soát của promoter
AOX1. Promoter AOX1 có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự phiên mã
của gen nhân dòng và việc sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp. Promoter AOX2
cũng mã hóa alcohol oxydase nhưng hoạt tính thấp hơn khoảng 10 – 20 lần so với
AOX1 (Daly R, Hearn MT, 2005). Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có
khả năng tích hợp vào hệ gen của P. pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao đổi
chéo, qua đó làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ (Thân Văn Minh,
2012).
Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P. pastoris đều có nguồn gốc từ
chủng dại NRRL-Y 11430. P. pastoris GS115 và KM71 là các chủng đột biến gen
histidinol dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến
nạp có thể được chọn lọc bằng môi trường khuyết dưỡng histidine.
2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris
Các vector biểu hiện trong P. pastoris được thiết kế tương đồng với locus
AOX1 hay locus his4. Giống như ở S. cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định

15
quá trình biến nạp vào P. pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương
đồng trong bộ gen nấm men. DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản
sao trong bộ gen tế bào chủ. Ở chủng Mut+ hoặc MutS, gen sát nhập tại locus his4
do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện.
Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình
His+. Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+ hay
MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao
của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp (Thân Văn Minh, 2012).
2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris
Một số hệ thống biểu hiện phổ biến hiện nay bao gồm: E. coli, B. subtilis, S.
cerevisae, P. pastoris, A. niger và tế bào động vật. Mỗi hệ biểu hiện có những ưu
điểm có những ưu điểm và hạn chế riêng, tùy thuộc sản phẩm protein mà cần lựa
chọn hệ biểu hiện phù hợp.
Nấm men đang là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay do có
nhiều ưu điểm. Chúng là các sinh vật nhân chuẩn có khả năng tích hợp gen lạ của
các sinh vật khác vào genome của mình. Ngoài ra chúng là sinh vật nhân chuẩn duy
nhất có khả năng thực hiện các thao tác kĩ thuật di truyền phân tử dễ dàng như khi
thực hiện ở E. coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy.
Đặc biệt ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạng
protein hoạt động và có khả năng tiết protein mạnh với cơ chế điều hòa nghiêm
ngặt, thao tác dễ dàng (R. Daly, M. T. Hearn, 2005).
Pichia pastoris có thể sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục và có khả
năng lên men với mật độ tế bào cao. Chúng có thể sinh trưởng trên môi trường pH
tương đối thấp từ 3 đến 7 do đó có thể điều chỉnh được pH để giảm thiểu tối đa hoạt
động của protease đối với protein được tiết ra.
Có khả năng sử dụng methanol là nguồn cacbon chính nên môi trường nuôi
cấy chứa nhiều methanol, hạn chế được sự nhiễm của các loài sinh vật khác. Do vậy
nuôi cấy P. pastoris ít bị tạp nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài. Đồng thời methanol là
chất rẻ tiền hơn so với IPTG, chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E. coli.

16
Nấm men P. pastoris tổng hợp protein ngoại lai trong peroxisome, thuận tiện
cho việc vận chuyển và tiết protein. Hệ thống P. pastoris có khả năng sản xuất
lượng lớn protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gram trên lít.
Vector biểu hiện pPIC9K có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu được
tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác,
đồng thời protein của bản thân P. pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên
quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau rất dễ dàng.
Quá trình lên men được thực hiện nhanh chóng, dễ dàng thu được sản phẩm
ở dạng gấp cuộn có hoạt tính, mỗi mẻ từ 5-6 ngày, đáp ứng được nhu cầu sản xuất
protein số lượng lớn, các thông số pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm
soát chặt chẽ.
Ngoài ra P. pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế
bào và còn có một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ bằng nguồn cacbon.
Với các thuận lợi trên, P. pastoris thu hút được nhiều sự quan tâm và là đối
tượng được lựa chọn để biểu hiện nhiều loại protein, nâng cao được hiệu quả và tiết
kiệm được chi phí sản xuất so với các hệ thống biểu hiện khác.
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium
thermocellum
Khởi đầu cho những nghiên cứu về hệ enzyme cellulase ở Clostridium
thermocellum là T.Kobayashi và cộng sự (1990). Nhóm nghiên cứu đã tạo hệ
minicellulosome và tiến hành khảo sát hoạt tính phân giải cellulose. Hoạt tính của
hệ cellulosome này cao hơn 8 lần trên Avicel (microcrystalline cellulose powder)
(pH 5,5 – 7; 700C) và hơn 15 lần trên CMC ( (pH 5,5 – 7; 650C) so với dịch
cellulase ngoại bào thô đã được phân tách từ hệ cellulase của C. thermocellum.
Năm 1993, Wang và cộng sự đã nhân dòng và phân tích trình tự gen CelS từ
Clostridium thermocellum ATCC 27405 vào DH1OB. E. coli XL-1 Blue bằng
plasmid pBluescript SK. Đến năm 1994, Wang và các cộng sự của mình tiếp tục tạo
dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pRSET chứa gen mã hóa CelS.
Thông qua phân tích bằng phương pháp Western blot đã phát hiện được protein tái

17
tổ hợp với kích thước tương tự protein từ CelS. Tiến hành kiểm tra định tính khả
năng sinh enzyme cellulase của các dòng E. coli tái tổ hợp, kết quả cho thấy các
dòng này phân hủy rất ít trên môi trường cacboxymethyl cellulose nhưng có khả
năng phân hủy mạnh trên môi trường cellulose tinh thể.
Năm 1996, Mohammad Mainul Ahsan và cộng sự cũng nghiên cứu tạo dòng,
giải trình tự và biểu hiện gen mã hóa cellulase CelJ trong tế bào E. coli JM109. Kết
quả điện di SDS - PAGE cho thấy gen CelJ có khả năng biểu hiện cao trong tế bào
này.
Shen-Long Tsai và cộng sự (2009) đã thiết kế một hệ minicellulosme ba
chức năng từ các enzyme endoglucanase CelA, β-glucosidase BglA của Clostridium
thermocellum, exoglucanase CelE và endoglucanase CelG từ C. cellulolyticum với
hướng biểu hiện bề mặt scaffoldin trên hệ thống biểu hiện Saccharomyces
cerevisiae. Kết quả lên men ethanol với hiệu quả gấp 2,6 lần so với việc sử dụng
các enzyme tinh sạch trên phối hợp với nhau, mặc dù hàm lượng đo được là giống
nhau.
Vào năm 2011, Jian-Ming Liu và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện năm gen
mã hóa enzyme cellobiohydrolase và một gen mã hóa enzyme endoglucanase của
Clostridium thermocellum DSM 1237 là CbhA, CelK, CelO, Cel48Y, Cel48S và
CelA vào hai dòng tế bào Bacillus subtilis WB600 và WB800. Các enzyme
cellulase từ các dòng B. subtilis tái tổ hợp trên có khả năng tiết enzyme hiệu quả
trong môi trường nuôi cấy, có hoạt tính khá tốt trên chất nền photphoric acid
swollen cellulose (PASC). Kết quả cụ thể cho thấy khi khi nghiên cứu biểu hiện
cellobiohydrolase của CbhA, Cel48S, Cel48Y cho hàm lượng enzyme lần lượt là
304, 110 và 153 mg/l, nhưng khi có sự phối hợp CbhA – Cel48S và CbhA – Cel48Y
thì hàm lượng enzyme thu được của mỗi phức hợp lần lượt là 532 mg/l và 611 mg/l.
Bên cạnh đó sự phối hợp giữa CelA với các tỉ lệ CbhA khác nhau cũng cho hàm
lượng từ 761 – 905 mg/l trên chất nền phosphoric acid swollen cellulose (PASC).

18
Tuy nhiên hai gen mã hóa cho CelO và CelK thì chưa được biểu hiện thành công
trên Bacillus subtilis.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme cellulase từ
Clostridium thermocellum chưa nhiều và chủ yếu được thực hiện trên hệ thống
Bacillus subtilis. Phạm Lương Thắng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tạo dòng và
biểu hiện endoglucanase A (CelA) từ Clostridium thermocellum vào các chủng
Bacillus subtilis 1012 và WB800N. Nguyễn Hoàng Ngọc Phương cũng đã nghiên
cứu đề tài tạo mini – cellulosome từ các protein tái tổ hợp của Clostridium
thermocellum và biểu hiện trên hệ thống Bacillus subtilis.
Hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme
cellulase từ Clostridium thermocellum trên các hệ thống E. coli, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisiae nhưng chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ thống biểu
hiện Pichia pastoris. Vì thế, nghiên cứu dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa cellulase
từ Clostridium thermocellum trên hệ thống Pichia pastoris là một hướng nghiên cứu
tiềm năng ở Việt Nam và trên thế giới.

19
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu:
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu:
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2014 đến tháng 7/2014.
3.2. Nguyên liệu
3.2.1. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn Clostridium thermocellum JCM 9322 có nguồn gốc từ hãng
Riken, Nhật Bản.
Chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5𝛼 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen,
Hoa Kỳ được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, chọn dòng và nhân
dòng plasmid tái tổ hợp.
Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen,
Hoa Kỳ được dùng để biểu hiện gen mục tiêu.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Máy Gel doc (BioRrad), máy li tâm lạnh Centrifuge 5810R
(Eppendorf), máy luân nhiệt (BioRad), bộ điện di DNA (BioRad), máy đo quang
phổ Biomate3 (Thermo EC), tủ ấm (Memmet), máy lắc ổn nhiệt, tủ lạnh -200C
(Sanyo), tủ lạnh sâu -800C (Sanyo), tủ mát 40C (Alaska), cân phân tích (Prescisa),
bộ điện biến nạp ECM399, tủ cấy cấp II.
Dụng cụ:
- Eppendorf 200 µl
- Eppendorf 1500 µl
- Pippetman với đầu típ tương ứng (1000 µl, 100 µl, 10 µl)
- Đĩa petri nhựa, que cấy trang, đèn cồn
- Falcon 50 ml

20
3.2.3. Hóa chất
Hóa chất nhân dòng trong vector pJET1.2: Kit nhân dòng CloneJET™ PCR
Cloning Kit.
Hóa chất tách chiết plasmid: Kit tách chiết plasmid (Plasmid Mini Kit -
Bioline).
Hóa chất tinh sạch DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR: Kit tinh sạch
DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR (MEGAquick – spin Total Fragment DNA
Purification Kit – INTRON Biotechnololy).
Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn:
Các loại enzyme cắt giới hạn (New England BioLabs) được sử dụng :
SnaBI với trình tự nhận biết:
EcoRI với trình tự nhận biết:
SacI với trình tự nhận biết:
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Các thành phần cần thiết cho phản ứng
PCR được cung cấp bởi Thermo Scientific : Taq polymerase, dNTP, Taq buffer
10X.
Hóa chất điện di DNA:
- Agarose
- TAE 1X: Tris acetate 40 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0.
- Dung dịch nạp mẫu (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 40% glycerol
trong TAE 1X.
- Ethium bromide 10 mg/ml.
- Thang DNA 1 Kb: được cung cấp bởi Invitrogen.

21
Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb (Nguồn: Invitrogen)
Hóa chất tách chiết bộ gen nấm men
- Nitơ lỏng
- Lysis buffer (50 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, 1% 𝛽-mercaptoethanol, 3%
SDS, pH 8,0)
- Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1)
- Isopropanol 100%
- Ethanol 70%
- Dung dịch TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)
Hóa chất kiểm tra định tính hoạt tính enzyme endoglucanase
- Tris – HCl 0,1M
- Congo Red 1%
- NaCl 1M
- Acid acetic 5%.

22
3.2.4. Môi trường
3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani):
Tryptone 10 g
Yeast extract 5 g
NaCl 5 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng, bổ sung thêm 2%
agar. Kháng sinh dùng để chọn lọc là ampicillin được bổ sung vào môi trường với
nồng độ cuối là 50 µg/ml.
3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose):
Sorbitol 182 g
Agar 20 g
Bổ sung 800 ml nước. Hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm
các thành phần sau:
YNB 10X 100 ml
Biotin 500X 2 ml
D – Glucose 10X 100 ml
3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)
Yeast extract 10 g
Pepton 20 g
Nước cất vừa đủ 900 ml. Hấp khử trùng 1210C, 15 phút. Bổ sung 100 ml
D – Glucose 10X rồi lọc lại với màng lọc 0,2 µm.
3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex):
Yeast extract 10 g
Peptone 20 g
Nước cất 700 ml
Hấp khử trùng ở 1210C. Bổ sung thêm các thành phần sau:

23
Potassium photphate buffer 1M 100 ml
YNB 10X 100 ml
Glycerol 10X 100 ml
Biotin 500X 2 ml
3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC
Yeast extract 10 g
Peptone 20 g
CMC 0,5% 5 g
Agar 20 g
Thêm 700 ml nước cất. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Bổ sung thêm
các thành phần sau:
Potassium photphate buffer 1M 100 ml
YNB 10X 100 ml
Methanol 10X 100 ml
Biotin 500X 2 ml
3.2.5. Plasmid
3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt
- Kích thước 2974 bp.
- Mang gen kháng ampicillin dùng để chọn lọc tế bào tái tổ hợp
- Mang gen gây độc eco47IR giúp chọn lọc khuẩn lạc mang gen chèn
- Plasmid cho phép gắn chèn đoạn DNA ở dạng đầu bằng
- Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.

24
Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2
(Nguồn : CloneJET™ PCR Cloning Kit #K1231, Fermentas)
3.2.5.2. Plasmid pPIC9K
Plasmid pPIC9K (Invitrogen) dùng biểu hiện gen trong Pichia pastoris GS
115 có những đặc điểm sau:
- Có trình tự tiết nhân tố 𝛼 giúp hỗ trợ tiết protein mục tiêu ra ngoài môi
trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác protein của Pichia
pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận
protein mục tiêu về sau rất dễ dàng.
- Có gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase giúp Pichia pastoris GS115 có
khả năng tự tổng hợp histidine.
- Có trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen
của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào.
- Có chứa trình tự gen HIS4 để chọn lọc thể biến nạp ở P. pastoris khi sử dụng
các chủng khuyết dưỡng histidine.
- Có trình tự gen kháng ampicillin dùng để sang lọc tế bào E. coli tái tổ hợp.
- Có gen kháng Kanamycin giúp Pichia pastoris kháng lại Geneticin dùng để
chọn lọc tế bào P.pastoris tái tổ hợp, đồng thời xác định tương đối số bản sao của
gen được chèn vào bộ gen tế bào dựa vào nồng độ Geneticin tế bào có khả năng
kháng được (4 mg/ml tương ứng 7 – 12 bản sao).

25
- Không có điểm khởi đầu sao chép của nấm men nên khi biến nạp vào trong
tế bào mà plasmid không chèn vào bộ gen sẽ không tồn tại độc lập được trong tế
bào. Đặc điểm này giúp bước sàng lọc tế bào mang gen mục tiêu đơn giản hơn.
Khuẩn lạc nào mọc được trên môi trường có kháng sinh tức là đã có mang trình tự
gen mục tiêu trong bộ gen tế bào.
- Trình tự cắt duy nhất của NotI, BgIII, SacI và SalI dùng để làm thẳng vector
trước khi chuyển vào tế bào Pichia và tạo dạng tái tổ hợp Mut+ (sử dụng methanol
mạnh nên tăng sinh tốt trên môi trường có methanol) hoặc MutS (sử dụng methanol
ít nên tăng sinh chậm trên môi trường có methanol).
Hình 3.3. Plasmid pPIC9K (Nguồn: Invitrogen)
3.2.6. Các cặp mồi sử dụng
Cặp mồi pJET1.2F và pJET1.2R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có
mang gen đã được nối vào plasmid pJET1.2.
Cặp mồi CelDF và CelDR được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mã hóa
cho đoạn gen CelD dựa trên trình tự gốc từ Genbank. Hai đoạn mồi này được thiết
kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRIvà SnaBI phù hợp với vị trí
cắt của plasmid pPIC9K.
Cặp mồi AOX1F và AOX1R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có
mang gen đã được nối vào của plasmid pPIC9K.

26
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng
TÊN MỒI TRÌNH TỰ MỒI (5’ – 3’)
ĐỘ
DÀI
(NU)
pJET1.2F CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 23
pJET1.2R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 24
CelDF
ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG
SnaBI
35
CelDR
AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC
EcoRI
29
AOX1F GACTGGTTCCAATTGACAAGC 21
AOX1R GCAAATGGCATTCTGACATCC 21
3.3. Phương pháp nghiên cứu:
3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid mang gen CelD của
Clostridium thermocellum
3.3.1.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen CelD của Clostridium thermocellum từ ngân hàng gen
NCBI, thiết kế cặp mồi CelDF/ CelDR để khuếch đại gen CelD kích thước 1824 bp.
Hai đoạn mồi này được thiết kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI
và SnaBI phù hợp với vị trí cắt của plasmid pPIC9K. Cặp mồi CelDF/ CelDR có
trình tự như sau:
CelDF: 5’- ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG-3’
SnaBI
CelDR : 5’- AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC-3’
EcoRI
Sau khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR để khuếch đại đoạn gen
CelD, tiến hành phản ứng PCR để thu nhận đoạn gen.

27
3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng PCR
dựa vào cặp mồi đã thiết kế
Sử dụng DNA tổng số của C. thermocellum làm mạch khuôn cho phản ứng
PCR khuếch đại gen CelD với cặp mồi đặc hiệu CelDF và CelDR.
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)
Taq Buffer 10X 1X 2,5
dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5
Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM 0,5
Mồi ngược 10 µM 0,2 µM 0,5
DNA mạch khuôn - 0,5
Taq polymerase 5 U/µl 1 U 0,25
H2O - 20,25
Tổng thể tích 25 µl
Thiết lập chu trình nhiệt độ:
Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR
950C
5’
950C
30’’
520C
30’’
720C
2’
720C
10’
40C
∞
30 chu kỳ

28
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% sẽ được
tinh sạch qua cột bằng bộ kit của INTRON để thu nhận đoạn gen CelD.
3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA
Purification Kit – INTRON Biotechnololy
- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là
5 : 1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000
vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.
- Thêm 700 μl dung dịch rửa vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ
dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1
phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng
cho phản ứng nối.
- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa
màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch.
Sau khi được tinh sạch, gen CelD được nối vào vector nhân dòng pJET1.2 để
tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD.
3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt
Đoạn gen CelD thu nhận từ phản ứng PCR được nối với plasmid nhân dòng
đầu bằng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD. Thực hiện phản ứng nối
với thành phần trong bảng 3.3 và ủ ở nhiệt độ 220C trong 30 phút.

29
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2
Thành phần Thể tích (µl)
2X Reaction Buffer 10
DNA 1 (75 – 100 ng)
DNA Blunting Enzyme 1
H2O 6
Vortex nhẹ rồi ủ ở 700C trong vòng 5 – 10 phút
pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/µl) 1
T4 DNA Ligase (20000 U/ml) 1
Sản phẩm nối CelD và plasmid pJET1.2 được biến nạp vào tế bào E. coli
DH5𝛼 bằng phương pháp hóa biến nạp.
3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5𝛼 khả nạp
Thu tế bào E. coli phát triển ở pha log, ly tâm và huyền phù tế bào trong
CaCl2. Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất sẽ bị thay đổi trở nên xốp,
mỏng hơn và tạo các lỗ giúp cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế
bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát
hiện trên môi trường chọn lọc.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:
- Cấy một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 3 ml môi trường LB, lắc 250
vòng/phút ở 370C qua đêm.

30
- Chuyển 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 100 ml LB trong erlen 500 ml, ủ ở
370C, lắc với tốc độ 250 vòng/phút cho tới khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng
0,375 (không được để OD600 quá 0,4).
- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong đá 5 – 10
phút.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 1600xg trong 7 phút ở 40C. Bỏ dịch nổi.
- Hoà tan nhẹ nhàng tế bào thu được trong 10 ml CaCl2 100 mM lạnh.
- Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi. Hòa tan tủa nhẹ nhàng trong 10
ml CaCl2 lạnh. Giữ phần tế bào đã hòa tan trong đá 30 phút.
- Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi, hoà tan tủa trong 1,5 ml dung
dịch CaCl2 100 mM lạnh, bổ sung thêm 0,75 ml glycerol 50%.
- Chia 100 µl tế bào vào các tube 1,5 ml đã trữ lạnh trước. Bảo quản tế bào
khả nạp trong tủ -800C, khi sử dụng rã đông các eppendorf chứa tế bào khả nạp
trong bể đá.
3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp
Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng
phương pháp hóa biến nạp.
Quy trình hóa biến nạp:
- 5 µl plasmid pJET1.2-CelD được trộn đều với 100 µl tế bào E. coli DH5α
khả nạp. Ủ trong đá 30 phút, sau đó sốc nhiệt ở 420C trong 2 phút, tiếp tục ủ đá 10
phút.
- Thêm vào 1 ml môi trường LB lỏng và tiến hành lắc 250 vòng/phút ở 370C
trong 30 phút để phục hồi các tế bào E. coli DH5α.
- Hút 100 µl dịch biến nạp trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch LB có bổ
sung kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml.
- Ly tâm 900 µl dịch còn lại ở 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi,
thêm vào 100 µl nước vào hòa tan phần sinh khối kết tủa.

31
- Hút toàn bộ dịch hòa tan trải trên đĩa petri chứa môi trường LB có bổ sung
kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml. Ủ đĩa ở 370C trong 14 – 16 giờ. Kiểm tra
các khuẩn lạc phát triển trên đĩa. Thí nghiệm được thực hiện song song với đối
chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu.
3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Chọn ngẫu nhiên các dòng E. coli DH5α từ các khuẩn lạc mọc được trên môi
trường kháng sinh, sau đó kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi
pJET1.2F/ pJET1.2R để xác định các khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp quan
tâm. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên kĩ thuật PCR, trong đó plasmid tái tổ hợp
từ khuẩn lạc sẽ dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thực hiện phản ứng PCR theo
chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong hình 3.5 với các thành phần trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)
Buffer 10X 1X 2,5
dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5
Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM 0,5
Mồi ngược 10 µM 0,2 µM 0,5
Dịch huyền phù khuẩn lạc - 0,5
Taq polymerase 5 U/µl 1 U 0,25
H2O - 20,25

32
Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi
pJET1.2F/pJET1.2
Kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Từ
kết quả PCR, chọn những dòng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp để tách
plasmid và cắt kiểm tra với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sau khi kiểm tra các dòng
E. coli DH5α tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, chọn một số dòng cho sản
phẩm cắt phù hợp để giải trình tự với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R.
3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli
Sử dụng bộ kit Plasmid Mini Kit của Bioline để tách plasmid. Quy trình tách
chiết như sau:
- Nuôi cấy khuẩn lạc trong trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút
ở 370C cho đến khi OD600 đạt 1 – 1,5.
- Dịch huyền phù được ly tâm 13000 vòng/phút ở 160C trong 30 giây, thu sinh
khối, loại bỏ dịch nổi.
- Thêm vào 420 μl Resuspension Buffer, vortex mạnh để hòa tan sinh khối.
Chuyển toàn bộ dịch vào eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 420 μl Lysis Buffer để ly giải tế bào. Đóng nắp và đảo eppendorf
nhiều lần. Chú ý không được vortex, thời gian thực hiện bước này không được quá
5 phút.
- Thêm 500 μl Neutralization buffer và đảo eppendorf nhiều lần. Dung dịch sẽ
trở nên đục và kết tủa. Sau đó ủ trong đá lạnh 5 phút.
950C
5’
950C
950C
30’’
600C
30’’
30’’
720C
2’
720C
720C
10’
40C
40C
∞
30 chu kỳ

33
- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển vào màng
lọc được đặt trong eppendorf mới.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây, bỏ dịch, thu phần phía trên màng lọc.
Thêm 700 μl Washing buffer và ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Đổ bỏ dịch
bên dưới, thu phần trên màng.
- Làm khô màng bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Chuyển
màng lọc vào eppendorf mới và ủ ở 500C, thêm 30 – 50 μl Elution buffer vào giữa
màng, để yên 1 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây để thu plasmid.
3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn
Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn,
plasmid mang gen tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra..
Các vị trí cắt giới hạn của hai enzyme cắt SnaBI và EcoRI được thiết kế ở hai
đầu các cặp mồi khuếch đại gen CelD nên phản ứng cắt plasmid tổng số với hai
enzyme cắt vừa được sử dụng trong quá trình sàng lọc dòng E. coli DH5α tái tổ hợp
vừa được sử dụng trong quá trình tạo vector biểu hiện mang gen mục tiêu.
Phản ứng cắt DNA bằng enzyme SnaBI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện
của đoạn gen CelD gồm các thành phần trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI
Buffer CutSmart 10X 2
pJET1.2-CelD 1 µg
SnaBI (5000 U/ml) 0,4
EcoRI (20000 U/ml) 0,5
H2O vừa đủ 20 µl

34
Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C
trong 20 phút. Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose.
Chọn lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pJET1.2-CelD tiến hành giải trình tự
kiểm tra trình tự gen mục tiêu.
3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương
ứng trên ngân hàng Gen
Plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR
và phản ứng cắt sẽ được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) với cặp mồi
pJET1.2F/ pJET1.2R. Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng
phần mềm Genetyx, blast trên NCBI để so sánh và phân tích sự tương đồng của
trình tự này với trình tự gen CelD đã được công bố trên ngân hàng Gen.
3.3.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD
Gen mã hóa CelD thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2-CelD bằng phản
ứng cắt giới hạn với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sản phẩm cắt được điện di và tinh
sạch từ gel agarose 0,8% để tiến hành thu nhận gen, chuẩn bị cho giai đoạn gắn
chèn vào vector biểu hiện pPIC9K. Plasmid pPIC9K cũng được cắt bởi enzyme
EcoRI và SnaBI, sau đó được nối với gen CelD bằng T4 DNA ligase để thu được
plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli
DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp tương tự như đối với vector pJET1.2.
3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Plasmid pJET1.2-CelD được cắt với hai enzyme EcoRI và SnaBI để thu
nhận đoạn gen CelD, vector biểu hiện pPIC9K được cắt mở vòng cũng với hai
enzyme trên.

35
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với
SnaBI và EcoRI
Thành phần pPIC9K CelD
Buffer CutSmart 10X 20 µl 20 µl
pPIC9K 10 µg -
Plasmid pJET1.2-CelD - 10 µg
SnaBI (5000 U/ml) 4 µl 4 µl
EcoRI (20000 U/ml) 5 µl 5 µl
H2O vừa đủ 200 µl vừa đủ 200 µl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C
trong 20 phút. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột. Sau đó, nối gen CelD vào
plasmid biểu hiện pPIC9K đã cắt mở vòng để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.
3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose
Gel DNA Extraction System – INTRON
- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là
5:1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000
vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.
- Thêm 700 μl Washing Buffer vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ
bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được
dùng cho phản ứng nối.

36
- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa
màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch
3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD
Sau khi tinh sạch, đoạn gen CelD được nối vào vector biểu hiện pPIC9K đã
mở vòng bằng T4 DNA ligase. Nồng độ của đoạn DNA cần nối và vector đã cắt mở
vòng tương ứng theo tỷ lệ 3:1 để tạo thành plasmid tái tổ hợp.
Hỗn hợp phản ứng nối được ủ ở 220C trong 2 giờ. Sau khi nối, tiến hành biến
nạp plasmid mang gen mục tiêu vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp
hóa biến nạp.
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào vector biểu hiện pPIC9K
Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích (µl)
T4 DNA ligase buffer 10X 1X 2
T4 DNA ligase (20000 U/ml) 20 U 1
pPIC9K 200 ng -
CelD 118 ng -
H2O - vừa đủ 20 µl
3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5𝛼 khả nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 3.3.1.5.
3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5𝛼
Biến nạp được thực hiện như mục 3.3.1.6. Thí nghiệm được thực hiện song
song với đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các
gen mục tiêu. Mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K và
không có đoạn chèn CelD. Tế bào sau khi biến nạp được trải trên môi trường đĩa
thạch LB chứa 50 µg/ml ampicillin và ủ ở 370C trong 16 giờ.

37
3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc
Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi trường kháng
sinh và kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R.
Cặp mồi AOX1F/AOX1R cho phép xác định vector biểu hiện pPIC9K có mang
đoạn gen chèn CelD. Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc tương tự mục 3.3.1.7 với
chu trình nhiệt độ như hình 3.6.
Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi
AOX1F/ AOX1R
3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc
với cặp mồi AOX1F/ AOX1R được nuôi cấy để tách plasmid như mục 3.3.1.8. và
kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với SnaBI và EcoRI. Sau đó chọn ra một dòng
E. coli DH5α mang plasmid pPIC9K-CelD để giải trình tự kiểm tra trình tự gen mục
tiêu.
950C
5’
950C
950C
30’’
540C
30’’
30’’
720C
2’30’’
720C
720C
10’
40C
40C
∞
30 chu kỳ

38
Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI
Buffer CutSmart 10X 2
pPIC9K-CelD 1 µg
SnaBI (5000 U/ml) 0,4
EcoRI (20000 U/ml) 0,5
H2O vừa đủ 20 µl
3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương
ứng trên ngân hàng Gen
Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR
khuẩn lạc và phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn sẽ chọn ra một dòng E. coli
DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD gửi đi giải trình tự để kiểm tra trình tự
gen mục tiêu đồng thời chuẩn bị cho thí nghiệm biến nạp vector biểu hiện vào
Pichia pastoris.
3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa
enzyme endoglucanase D
Plasmid pPIC9K-CelD được thu nhận từ các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp đã
qua kiểm tra được làm thẳng bằng enzyme cắt giới hạn SacI để tăng khả năng trao
đổi chéo giữa plasmid và bộ gen của tế bào nấm men, cũng như để tạo được chủng
P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K-CelD dạng thẳng được chuyển
vào tế bào P. pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp. Do có sự tương
đồng giữa trình tự gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gen của tế bào
P. pastoris và trên plasmid nên xảy ra tái tổ hợp tương đồng, dẫn đến việc gen mục
tiêu từ plasmid được chuyển nạp vào trong bộ gen của tế bào Pichia pastoris.

39
3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp
- Tăng sinh một khuẩn lạc Pichia pastoris trong 5 ml môi trường YPD, lắc
250 vòng/phút ở 280C qua đêm.
- Lấy 0,1 – 0,5 ml dịch tế bào cho vào 50 ml môi trường YPD trong erlen 2 lít.
Nuôi cấy như trên với điều kiện qua đêm cho đến khi OD600 nm = 1,3 – 1,5.
- Ly tâm 1500xg trong 5 phút và ở 40C để thu tế bào. Sau đó huyền phù cặn tế
bào với 50 ml nước lạnh vô trùng.
- Ly tâm tương tự bước trên. Bỏ dịch nổi .Sau đó huyền phù cặn tế bào với 25
ml nước lạnh vô trùng.
- Ly tâm 1500xg trong 5 phút. Bỏ dịch nổi. Huyền phù tế bào trong 20 ml
sorbitol 1M lạnh.
- Ly tâm như trên, huyền phù cặn tế bào trong 1 ml sorbitol 1M lạnh cho 1,5
ml. Sau đó hút 80 µl dịch tế bào nấm men khả nạp ra các eppendorf. Nên dùng ngay
vì hiệu suất sẽ giảm đáng kể khi giữ ở -800C.
3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp
Quy trình điện biến nạp:
- Trộn 80 µl tế bào P. pastoris khả nạp với 10 – 15 µg plasmid đã được làm
thẳng bằng enzyme cắt giới hạn (trong 5 – 10 µl buffer TE). Chuyển vào cuvette 0,2
cm đã được giữ trong đá lạnh trước. Tiếp tục ủ trong đá lạnh 5 phút.
- Thực hiện điện biến nạp ở hiệu điện thế 1500V trong 5 giây bằng bộ điện
biến nạp ECM399.
- Thêm nhanh chóng 1 ml sorbitol 1M vào cuvette biến nạp. Chuyển dịch tế
bào sang một eppendorf mới vô trùng.
- Trải 200 µl dịch tế bào đã biến nạp trên môi trường MD. Ủ đĩa ở 280C cho
đến khi khuẩn lạc xuất hiện. (khoảng từ 3 – 5 ngày).
- Các plasmid dạng vòng (phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn
toàn) sẽ không tồn tại được trong tế bào nấm men do plasmid pPIC9K được thiết kế
không có trình tự khởi đầu sao chép của nấm men. Ngoài ra chỉ có những tế bào

40
nấm men P. pastoris biến nạp thành công mới có khả năng tự tổng hợp histidine vả
phát triển trên môi trường MD. Vì vậy chỉ có những tế bào có sự sáp nhập thành
công giữa plasmid và bộ gen của nấm men thì gen mục tiêu mới tồn tại ổn định
trong tế bào, đồng thời có khả năng kháng lại kháng sinh geneticin (G418).
3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD
và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D
Do vector pPIC9K có chứa gen kháng G418 nên các dòng tế bào P. patoris
có mang gen CelD sẽ phát triển được trên môi trường YPD có kháng sinh G418.
Các khuẩn lạc thu nhận được trên môi trường YPD có nồng độ kháng sinh G418 là
4 mg/ml tương ứng có khoảng 7 – 12 bản sao của gen mục tiêu. Tiến hành sàng
lọc các dòng P. pastoris tái tổ hợp trên các nồng độ kháng sinh 0,25 – 4 mg/ml.
Chọn một số dòng P. pastoris có thể mọc trên môi trường chứa nồng độ kháng
sinh cao nhất, tách chiết DNA và kiểm tra sự sát nhập gen CelD vào bộ gen của
nấm men bằng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R, đồng thời phân tích định tính
khả năng phân hủy cellulose của các P. pastoris tái tổ hợp trong thí nghiệm tiếp
theo.
3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số
Quy trình ly trích DNA dựa trên quy trình ly trích của Lee và Taylor
(1990).
- Chọn lọc 1 số dòng Pichia pastoris phát triển được trên môi trường YPD
chứa 4 mg/ ml G418 tăng sinh trong BMGY lỏng qua đêm ở 280C để ly trích DNA
tổng số.
- Sinh khối nấm men được nghiền trong eppendorf với nitơ lỏng đến khi mịn.
Đối với những ống chưa sử dụng ngay được giữ ở -800C.
- Cho 600 µl Lysis buffer 2X vào eppendorf có chứa sinh khối nấm, vortex
mạnh cho đến khi tạo huyền phù đồng nhất, giúp cho việc phá vỡ tế bào được tốt
hơn.
- Ủ ở 650C trong 1 giờ, cứ 20 phút đảo mẫu một lần.

41
- Cho 450 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1) vào đảo đều, để 5
phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm ở 40C trong 5 phút.
- Thu dịch nổi (300 – 400 µl) cho vào eppedorf mới. Cho 180 – 240 µl
isopropanol lạnh vào (nồng độ 100%, đảm bảo thể tích isopropanol gấp 0,6 lần
dịch nổi), lắc mạnh rồi ủ ở tủ -200C trong 20 phút. Ly tâm 13000 rpm, 7 phút ở
40C. Tiến hành thu tủa, bỏ dịch nổi.
- Cho 300 – 400 µl ethanol 70% vào eppendorf rửa tủa. Vortex nhẹ và ly tâm
13000 rpm , 7 phút ở 40C. Tiến hành rửa tủa lặp lại 2 lần.
- Để khô tự nhiên, cho khoảng 30 – 50 µl TE buffer vào, trộn nhẹ và bảo
quản ở -200C.
- Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel
0,8%.
3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương
pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R
Nhằm kiểm tra khả năng sát nhập của vector tái tổ hợp chứa gen CelD vào bộ
gen của nấm men, các dòng nấm men tái tổ hợp mọc trên môi trường YPD có nồng
độ kháng sinh G418 là 4 mg/ml được tăng sinh trong môi trường BMGY ở 280C
qua đêm để tách chiết DNA bộ gen, sau đó thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
AOX1F/AOX1 theo thành phần trong bảng 3.2 và chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong
hình 3.7.
Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R
950C
5’
950C
30’’
540C
30’’
720C
2’30’’
720C
10’
40C
∞
30 chu kỳ

42
3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ
hợp
Các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên nồng độ kháng sinh cao nhất
được tăng sinh trong môi trường BMGY. Sau đó các dòng tế bào này được sàng lọc
biểu hiện trên đĩa thạch môi trường BMMY có bổ sung 0,5% cơ chất
Carboxymethyl Cellulose (CMC), ủ ở 280C trong 72 giờ. Các dòng có khả năng
sinh enzyme cellulase sẽ phân hủy được CMC và tạo vòng phân giải khi nhuộm với
thuốc nhuộm đỏ Congo. So sánh vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ
hợp.
Quy trình nhuộm thuốc đỏ Congo theo Nakazawa, H. và cộng sự (2008):
- Các đĩa nuôi cấy được rửa bằng 2 – 3 ml Tris – HCl 0,1M, pH 8,0.
- Nhỏ 2 ml thuốc nhuộm đỏ Congo 1% lên đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30
phút.
- Rửa thuốc nhuộm bằng 5 – 7 ml NaCl 1M.
- Rửa lần cuối bằng dung dịch acid acetic 5% và quan sát vòng phân giải. Những
đĩa có xuất hiện vòng phân giải chứng tỏ dòng đó có tiết endoglucanase có hoạt tính.
- Đối chứng âm là chủng Pichia pastoris không chứa plasmid tái tổ hợp
pPIC9K-CelD.
Từ kết quả so sánh đường kính vòng phân giải, chọn ra những chủng có khả
năng tiết enzyme cellulase ngoại bào mạnh để nghiên cứu biểu hiện và xác định
hoạt tính endoglucanase của các dòng này.
Xử lí số liệu: các dữ liệu được xử lý thống kê ANOVA với mức ý nghĩa 95%
bằng phầm mềm Statgraphic 7.0.

43
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid mang gen CelD của
Clostridium thermocellum
4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR
Dựa vào trình tự gen CelD trên ngân hàng gen, thiết kế cặp mồi đặc hiệu
CelDF và CelDR để khuếch đại đoạn gen. Cặp mồi được thiết kế thêm vào trình tự
cắt đặc hiệu của hai enzyme giới hạn là SnaBI và EcoRI nên khi xử lý bằng hai
enzyme này sẽ cho ra đoạn DNA một đầu bằng và một đầu so le. Đây là cơ sở tạo
điều kiện thuận lợi cho quá trình ghép nối và tạo khung dịch mã đúng trong quá
trình biểu hiện protein tái tổ hợp sau này.
DNA tổng số được sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu CelDF/ CelDR dùng cho gen CelD.
Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD
Giếng 1 – 3: sản phẩm khuếch đại đoạn gen CelD bằng phản ứng PCR với cặp mồi
CelDF/ CelDR; N: đối chứng âm; M: thang DNA 1 Kb

44
Theo NCBI, gen mã hóa cho CelD của Clostridium thermocellum có kích
thước 2286 bp (mã số GenBank là X04584.1). Tuy nhiên, cặp mồi được thiết kế chỉ
để khuếch đại đoạn gen có kích thước 1824 bp (từ vị trí 324 đến 2147) mã hóa
peptide có hoạt tính. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 4.1 cho thấy giếng 1, 2,
3 hiện các vạch có kích thước khoảng 1800 bp, phù hợp với kích thước của gen mục
tiêu tại vị trí mồi bắt cặp, đồng thời đối chứng âm không hiện vạch. Như vậy đoạn
gen CelD đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc
hiệu, sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm
nhân dòng gen tiếp theo.
4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD
Đoạn gen CelD sau khi tinh sạch qua cột sẽ được nối với vector nhân dòng
pJET1.2 nhờ enzyme nối T4 DNA ligase. Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến
nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5𝛼 bằng phương pháp hóa biến nạp. Các chủng
biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường thạch LB có bổ sung
ampicillin (50 µg/ml) ở 370C qua đêm. Thí nghiệm được thực hiện song song với
đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp. Kết quả thu
nhận được trên đĩa biến nạp các khuẩn lạc như hình 4.2.
Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp
pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50µg/ml)
A: Đĩa đối chứng âm; B: Đĩa biến nạp
A B

45
Do plasmid pJET1.2 có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin nên chỉ tế bào
E. coli DH5𝛼 mang vector này mới có thể sinh trưởng trên môi trường LB có bổ
sung ampicillin. Bên cạnh đó, vector pJET1.2/blunt mang gen gây độc eco47IR nên
nếu tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết sau khi biến nạp và không
nhân lên được. Vì vậy chỉ có các dòng tế bào E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp
mới sinh trưởng trên đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin.
4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Đoạn gen CelD sau khi chèn vào plasmid pJET1.2 được biến nạp vào E. coli
DH5𝛼. Để khẳng định các thể biến nạp thu được chứa plasmid tái tổ hợp, tiến hành
chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường đĩa thạch LB/ampicillin
và thực hiện phản ứng PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng
E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R
Giếng 1 – 6: E. coli DH5α /pJET1.2-CelD (E1 – E6); M: thang DNA;N: Đối chứng âm

46
Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R
cho thấy từ giếng 1 đến giếng 6 đều cho vạch có kích thước khoảng 2000 bp. Kích
thước này tương ứng với tổng kích thước lý thuyết của gen CelD khi chèn vào
plasmid pJET1.2. Để chắc chắn, chọn lọc ngẫu nhiên một số dòng E. coli DH5α
tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phương pháp PCR, enzyme cắt giới hạn và giải
trình tự.
4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu
CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn
Ba dòng tế bào E. coli DH5α cho đúng kích thước mục tiêu ở trên được chọn
ngẫu nhiên và tăng sinh qua đêm trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid
và thực hiện kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR, cắt với
hai enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI nhằm xác định các dòng E. coli DH5α
mang gen CelD. Vị trí cắt của hai enzyme này được thiết kế ở đầu 5’ của hai cặp
mồi khuếch đại các gen mục tiêu. Những dòng tế bào có plasmid pJET1.2-CelD sẽ
bị cắt thành hai đoạn có kích thước tương ứng với kích thước của plasmid pJET1.2
(2974 bp) và của gen CelD (1824 bp). Chọn một dòng gửi giải trình tự và tiến hành
chuyển gen mục tiêu sang vector biểu hiện.

47
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD
bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp
pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR
Giếng 1 - 3: plasmid pJET1.2-CelD cắt bằng SnaBI vả EcoRI (E1 – E3); giếng 4 –
6: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi CelDF/ CelDR; 7: sản
phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi pJET1.2F/ pJET1.2R; M:
thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm.
Kết quả điện di sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD bằng
enzyme SnaBI và EcoRI ở giếng 1, 2, 3 tương ứng với các dòng E. coli DH5α E1,
E2, E3 đều cho hai vạch rõ nét. Một vạch có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng
với kích thước lý thuyết của plasmid pJET1.2 khi mở vòng (2974 bp) và một vạch
có kích thước khoảng 1800 bp tương ứng với kích thước của gen CelD là 1824 bp.
Bên cạnh đó giếng 4, 5, 6 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với
cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen, cho các cho vạch có kích thước khoảng 1800 bp so
với thang chuẩn tương ứng với kích thước của đoạn gen CelD là 1824 bp. Vạch này
thấp hơn vạch điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-CelD với cặp mồi
pJET1.2R/ pJET1.2R là 2000 bp ở giếng 7. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản

Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris

Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris

Similar to Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (cel d) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris