Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ đất trồng rau và thử nghiệm trên rau muống ở Tiền Giang.pdf

1. MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG................................................................................................viii
DANH SÁCH HÌNH...................................................................................................ix
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU...................................................................................10
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................12
2.1 Auxin..........................................................................................................12
2.1.1 Lược sử nghiên cứu auxin.....................................................................12
2.1.2 Vai trò sinh lý của auxin........................................................................12
2.2 Vi sinh vật tổng hợp IAA và vai trò của chúng đối với cây trồng...............14
2.2.1 Các vi sinh vật tổng hợp Auxin.............................................................14
2.2.2 Tác dụng của auxin do vi sinh vật tổng hợp đối với cây trồng..............17
2.3 Qui trình tổng hợp IAA của vi sinh vật.......................................................18
2.4 Sơ lược về cây rau muống...........................................................................21
2.4.1 Đặc điểm thực vật học..........................................................................21
2.4.2 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh...............................................................21
2.4.3 Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế...................................................22
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................23
3.1 Phương tiện.................................................................................................23
3.1.1 Vật liệu thí nghiệm................................................................................23
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ...............................................................................23
3.1.3 Hóa chất................................................................................................23
3.1.4 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm..........................................24
3.2 Phương pháp...............................................................................................24
3.2.1 Phân lập các dòng vi sinh từ đất vùng rễ của cây rau muống...............24
3.2.2 Định lượng IAA....................................................................................25
3.2.3 Khảo sát đặc tính sinh hóa....................................................................26
3.2.4 Thử nghiệm trên cây rau muống...........................................................27
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN...............................................................30
i

2. 4.1 Phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp IAA..................................................30
4.2 Khảo sát đặc tính sinh hóa..........................................................................36
4.3 Kết quả thử nghiệm trên rau muống............................................................40
4.3.1 Thử nghiệm trong chậu.........................................................................40
4.3.2 Thử nghiệm ngoài đồng........................................................................42
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................2
ii

3. DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Vai trò của auxin trong thực vật.................................................................14
Bảng 2: Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất.............................16
Bảng 3. Nguồn gốc của 40 dòng vi khuẩn phân lập trong đất trồng rau Tiền Giang...30
Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của 40 dòng vi khuẩn được phân lập.............................33
Bảng 5. Tỉ lệ phần trăm các đặc điểm khuẩn lạc.........................................................33
Bảng 6. Phản ứng với thuốc thử của các dòng vi khuẩn.............................................37
Bảng 7. Các chỉ tiêu thu được.....................................................................................40
Bảng 8. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK lên các chỉ tiêu của rau muống.......43
iii

4. DANH SÁCH HÌNH
Hình 1 : Các lộ trình tổng hợp IAA của vi sinh vật (Suzuki et al., 2003).............19
Hình 2 : Cơ chế tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) của vi sinh vật.........................20
Hình 3. Colony............................................................................................................30
Hình 4.Phản ứng với thuốc thử Salkowski (Có trytophan)..........................................36
Hình 5.Phản ứng với thuốc thử Salkowski (Không trytophan)....................................36
Hình 6. Hình nhuộm Gram..........................................................................................40
Hình 7. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK lên rau muống.................................42
Hình 8. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK.........................................................44
Hình 9. Tương quan giữa chiều dài rễ và trọng lượng.................................................44
Hình 10. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK.......................................................46
Hình 11. Tương quan giữa đường kính thân và trọng lượng.......................................46
Hình 12. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK......................................................48
Hình 13. Tương quan giữa chiều cao và trọng lượng..................................................48
Hình 14. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK.......................................................49
Hình 15. Tương quan giữa số lá và trọng lượng..........................................................49
Hình 16. Ảnh hưởng của dòng P24 và phân NPK.......................................................52
iv

5. GIỚI THIỆU
Đồng bằng sông Cửu Long thích hợp với nhiều loại loại rau phục vụ cho đời sống
hằng ngày, nên vùng đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất và cung cấp một
lượng lớn sản phẩm nông nghiệp cho vùng và cả nước. Trong đó cây rau muống
rất quen thuộc của người Việt Nam, rất dễ chế biến các món ăn hằng ngày. Theo y
học hiện đại, rau muống cung cấp nhiều chất xơ, có vitamin C, vitamin A và một
số thành phần tốt cho sức khoẻ, là thức ăn tốt cho mọi người. Những người già ăn
hơn 2 bữa rau mỗi ngày có não trẻ hơn khoảng 5 năm và ít bị suy giảm tinh thần
hơn 40% so với những người ăn ít hoặc không bao giờ ăn rau.
Trong thời điểm hiện nay, đi đôi với việc gia tăng sản xuất nông nghiệp và sản
lượng cung cấp ra thị trường là việc sử dụng một lượng lớn phân bón hoá học vào
sản xuất nhằm gia tăng năng suất cây trồng. Tuy nhiên chính lượng phân hoá học
này đã gây ảnh hưởng xấu đến môi trường sống và sức khoẻ người dân, một lượng
lớn phân hoá học tồn dư trong đất ở dạng khó tan cây không hấp thụ được, gây ô
nhiễm nguồn nước, đất canh tác,….
Do đó việc tìm nguồn phân bón để giảm sử dụng phân hoá học là vấn đề cần được
lưu tâm và đầu tư nghiên cứu, trong đó nhóm PGPR (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria) là nhóm vi sinh vật sống tự do trong đất, có khả năng kích thích sự
sinh trưởng và gia tăng năng suất cây trồng bằng những cơ chế đặc biệt của chúng
như tổng hợp phytohormon, hoà tan lân khó tan thành dạng dễ tan cung cấp cho
cây trồng và nhất là khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật của vi
sinh vật như cytokinins, auxins kích thích sự phát triển hệ rễ của cây chủ, tăng khả
năng nẩy mầm của hạt, tăng khả năng hấp thu nước, chất dinh dưỡng trong đất, từ
đó gia tăng sự trao đổi chất, tăng năng suất của cây trồng cũng như phẩm chất của
trái và hạt, do đó trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về
phân sinh học.
Phân bón vi sinh có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài tác
dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi
phí sản xuất thì phân bón vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi
trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân
bón vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền
nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn
định. Do dó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân bón vi sinh là
việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các
chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm
(Đỗ Thu Hà et al.,2008).
5

6. Bên cạnh các vi sinh vật có khả năng tồng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) như
Rhizobium, Agrobacterium, Azotobacter, Azospirillum, thì Pseudomonas được xem
là một trong những giống vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA cao và có nhiều
đặc tính tốt kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng.
Từ các lý do trên nên tôi thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp “Phân lập một số
dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ đất trồng
rau và thử nghiệm trên rau muống ở Tiền Giang ”
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
- Phân lập được một số dòng vi sinh có khả năng tổng hợp IAA cao trong
đất trồng rau Tiền Giang.
- Tìm được dòng có độ hữu hiệu cao nhất có thể trộn phân sinh học.
- Khảo sát khả năng tổng hợp phytohormon của các dòng đã chọn trên cây
trồng.
6

7. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Auxin
1.1.1 Lược sử nghiên cứu auxin
Auxins là chất nhóm điều hoà sinh trưởng thực vật đã được phát hiện sớm nhất. Thuật
ngữ auxins có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “Auxein” nghĩa là “grow” (mọc, sinh
trưởng). Việc phát hiện ra auxins đã được Darwin (1880) khảo sát trên hiện tượng
quang hướng động của ngọn diệp tiêu hướng về phía có ánh sáng và cho rằng ánh
sáng đã kích thích ngọn diệp tiêu hướng về phía ánh sáng. Bằng nhiều thí nghiệm đơn
giản dùng một nắp che chóp diệp tiêu hay cắt nó đi thì diệp tiêu không còn hướng về
phía ánh sáng nữa.
Năm 1907 Fitting đã ước lượng ảnh hưởng của vết cắt một phía lên diệp tiêu của
Avena, ông cho rằng chất kích thích vận chuyển qua chất sống và di chuyển quanh vết
cắt, tuy nhiên những quan sát của ông đã không chính xác bởi vì một vách ngăn sự
vận chuyển đã không bao giờ được hình thành. Dựa trên thí nghiệm của Fitting nhưng
Boysen-Jensen (1913) đã chêm một miếng mica giữa phần chóp và phần gốc của diệp
tiêu đã chứng minh rằng có sự vận chuyển của auxins truyền xuống qua phía trong tối
của diệp tiêu và kích thích sự sinh trưởng cong về phía ánh sáng.
Vào những năm tiếp theo Paal (1918), Soding (1925), Went (1926) cho rằng có một
chất đã sinh ra trong ngọn của diệp tiêu Avena và điều khiển sự phát triển của diệp
tiêu, nếu cắt một bên của diệp tiêu thì diệp tiêu sẽ nghiêng về phía không bị cắt, nếu
cắt rời diệp tiêu thì sự sinh trưởng sẽ giảm, và khi đặt những khối agar chứa chất hoà
tan từ đỉnh chóp được cắt lên nơi diệp tiêu bị cắt bỏ thì đã kích thích sự phát triển trở
lại. Từ đó đã kích thích mạnh mẽ việc nghiên cứu chất kích thích sinh trưởng thực vật.
Năm 1934, Kogl và Haagen-Smit đã phân lập được IAA từ men bia và Thimann
(1935) cũng đã phân lập được IAA từ việc nuôi cấy Rhizopus suinus. Đến năm 1954
một nhóm các nhà khoa học đã xác lập đặc điểm của nhóm chất điều hoà sinh trưởng
auxins.
1.1.2 Vai trò sinh lý của auxin
Auxin tác dụng lên nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát
sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh
trưởng của quả và tạo quả không hạt.
Auxin kích thích sự sinh trưởng giản của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm cho tế
bào dài ra. Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào;
Auxin gây ra sự giảm độ pH trong thành tế bào nên hoạt hóa các enzyme phân giải các
polysacharid liên kết giữa cac sợi celluloz làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện
7

8. cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu của không bào trung tâm.
Ngoài ra auxin cũng kính thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào đặc
biệt là các cellulose, pectin, hemicellulose...Bên cạnh đó IAA còn ảnh hưởng đến sự
phân chia của tế bào. Tuy nhiên các ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia
tế bào trong mối tác động tương hỗ với các phytohormon khác (gibberellin,cytokinin).
(Cao Ngọc Điệp, 2007)
IAA gây ra tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa). Bằng cách sử dụng
nguyên tử đánh dấu người ta nhận thấy IAA phóng xạ được phân bố nhiều hơn ở phần
khuất ánh sáng cũng như phần dưới của bộ phận nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng
không đều ở hai phía của cơ quan. Phía khuất ánh sáng bao giờ cũng tích điện dương,
còn phía chiếu sáng bao giờ cũng tích điện âm. IAA trong cây thường bị ion hóa (IAA-
) và do đó phân bố ở phía điện dương nhiều hơn (Lương Minh Châu, 2004). Về
nguyên tắc IAA phân bố về phía mang điện dương nhiều hơn và kích thích sự sinh
trưởng ở phía khuất ánh sáng mạnh hơn ở phía chiếu sáng. Kết quả làm cây uốn công
về phía chiếu sáng.
IAA điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn: Hiện tượng ưu thế ngọn đặc tính quan trọng
và phổ biến ở thực vật. Khi chồi hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sự sinh trưởng
của chồi bên. Đây là một sự ức chế tương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách
cắt chồi ngọn rễ chính thì chồi bên rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh
trưởng. Hiện tượng này được giải thích IAA được hình thành trong đỉnh ngọn với hàm
lượng cao hơn được vận chuyển xuống dưới, trên con đường đi xuống nó sẽ ức chế sự
sinh trưởng của các chồi bên. Nếu cắt ngọn thì làm giảm hàm lượng auxin nội sinh và
sẽ kích thích chồi sinh trưởng. (Cao Ngọc Điệp, 2007)
IAA kích thích sự hình thành rễ: Trong sự hình thành rẽ đặc biệt là rễ phụ, hiệu quả
auxin là rất đặc trưng. Sự hình thành rễ phụ có thể chia làm 3 giai đoạn: Giai đoạn đầu
phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng
là rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài.
IAA còn kích thích sự hình thành quả và kìm hảm sự rụng lá hoa ,quả vì nó ức chế sự
hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh
trưởng.
8

9. Bảng 1. Vai trò của auxin trong thực vật
Tế bào gia tăng kích thước
Phân hóa các mạch
Địa hướng động thuận
Quang hướng động thuận
Rụng lá
Lá lâu già
Tạo quả và phát triển nhanh
Kích thích ra hoa
Phân hóa tế bào mô
Kích thích tổng hợp protein
Gia tăng hô hấp
Phân chia tế bào
Tạo rễ mới
Ức chế sự phát triển rễ
Phát triển đỉnh sinh trưởng
Rụng trái
Trái mau chín
Kích thích tạo bầu noãn
Gia tăng tốc độ tăng trưởng
Kích thích tổn hợp ARN
Gia tăng hoạt lực enzime
Phát triển mô sẹo
Nguồn: (Frankenberger W.T & Jr. Muhammad Arshad, 1995) .
Vi sinh vật tổng hợp IAA và vai trò của chúng đối với cây trồng
Các vi sinh vật tổng hợp Auxin
Auxins là một chất kích thích sinh trưởng được tổng hợp bởi thực vật, IAA có vai trò
trong quá trình phát triển tế bào như tăng trưởng tế bào, phân chia, hình thành rễ
(Ann Vande Broek, 1998), tuy nhiên sự tăng trưởng của thực vật lại chịu sự tác động
không nhỏ từ nguồn auxins bên ngoài và một trong những nguồn đó là auxins được
tổng hợp bởi các vi sinh vật có ích trong đất. Trong đó các vi sinh vật được phân lập
từ vùng rễ và trên bề mặt rễ của nhiều loại cây trồng là có khả năng tổng hợp IAA cao
(Arshad & Frankenberger, 1998). Theo Loper & Schroth (1986) thì có đến 80% các
dòng vi khuẩn được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng là có khả năng tổng
hợp auxins. Các dòng vi khuẩn thuộc các giống như Azospirilium, Pseudomonas,
Rhizobium, Xanthomonas, Bradyrhizobium japonicum, Gluconobacter diazotrophicus
đã được xác định là có khả năng tổng hợp IAA giúp kích thích sự sinh trưởng của cây
trồng (Patten & Glick, 1996). Gần đây là Ahmad (2005) đã phân lập được 10 chủng
Azotobacter và 11 chủng Pseudomonas từ đất vùng rễ cây lúa mì, mù tạt, cây cải, đều
cho thấy chúng có khả năng tổng hợp IAA rất cao trong môi trường có bổ sung
Tryptophan và không có bổ sung Tryptophan.
Stijn Spaepen et al.,(2007) đã nghiên cứu gen ipdC của vi khuẩn Azospirillum
brasilense có khả năng tổng hợp IAA cao ở đất vùng rễ của nhiều loại cỏ và ngũ cốc.
Azospirillum brasilense là vi khuẩn gram âm, vi khuẩn này tổng hợp được nitrogen và
sống cộng sinh với nốt rễ loài cỏ và nhiều loại ngũ cốt, các vi khuẩn này tổng hợp các
9

10. chất dinh dưỡng hóa học cho sợ phát triển cây trồng. Khi chủng Azospirillum kết quả
là làm tăng số rễ tơ và các rễ bên của cây, giúp cho cây hấp thu nước và các chất dinh
dưỡng trong quá trình phát triển của cây. ảnh hưởng đầu tiên là quá trình tổng hợp
IAA trong tự nhiên, trytophan là tiền chất tổng hợp IAA.
Nhiều dòng vi khuẩn sống trong đất có khả năng tổng hợp nên các chất tăng trưởng
của thực vật và giúp cho cây trồng phát triển. Trong đó có nhiều vi sinh vật sống
trong vùng rễ (rihzophere) có khả năng tổng hợp chất kích thích sự tăng trưởng của
thực vật gọi là nhóm (PGPR) (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2007). Vi khuẩn vùng rễ kích
thích tăng trưởng thực vật cải thiện sự tăng trưởng thực vật và gia tăng năng suất với
cơ chế trực tiếp (tổng hợp phytohormon, hòa tan lân khó tan, sản xuất ra auxin hay
cytokinin) và cơ chế gián tiếp (hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây hại)(Brown, 1974;
Klopper et al., 1986, 1989; Davision, 1988; Lambert & Joos, 1989). Với rất nhiều
nhóm vi sinh vật sơ hạch như Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998),
Azosprillium brasilense (Hartman et al., 1983), Azobacter vineelandii (Garcia-Tavares
et al, 1987), Agrobacterium tumefasciens (Liu et al., 1982), Rhizobium trifolii và
Rhizobium leguminosarum (Badenoch-Jones et al., 1982), Rhizobium phaseoli
(Ernstsen et al., 1987), Bradyrhizobium japonicum (Kaneshiro et al., 1983), Erwinia
herbola (Koga et al., 1991), thanh tảo Anabaena cylindrica và Nostoc rivulare
(Florenzano et al., 1978), Enterobacter cloacae (Koga, 1995), các vi sinh vật trên là
đại diện cho những vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng cho cây
trồng, bảng 2 dưới đây là một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng
trưởng.
10

11. Bảng 2: Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất
Vi sinh vật Sản phẩm Tác giả
Azotobacter vinelandii IAA Gonzalez-Lopez et al., (1983)
Azotobacter chroococcum IAA Muller et al., (1989)
Anabaena cylindrica IBA Florenzno et al., (1978)
Agrobacterium tumefaciens IAA Muller et al., (1989)
Arthrobacter spp. IAA Wilkinson et al., (1994)
Bacillus cereus IAA Wilkinson et al., (1994)
Bacillus subtilus IAA Muller et al., (1989)
Bradyrhizobium spp. NAA Sekine et al., (1988)
Nostoc rivulare IAA, IpyA Florenzno et al., (1978)
Pseudomonas spp. IAA, IAM, Martens & Franerberger (1991)
Pseudomonas syringae pv.
glycinea
IAA, ILA,
IAld
Fett et al., (1987)
Rhizobium melioti IAA Garcia-Rodriguez et al., (1981)
Rhizobium japonicum IAA Kaneshiro et al., (1983)
Rhizobium phaseoly IAA Ernstsen et al., (1987)
Nguồn: (Frankenberger W.T & Jr. Muhammad Arshad, 1995) .
11

12. Tác dụng của auxin do vi sinh vật tổng hợp đối với cây trồng
Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vai trò
của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng số
lượng rễ phụ, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây chủ làm tăng khả năng hấp thụ
chất dinh dưỡng trong đất, gia tăng khả năng nẩy mầm của hạt.
Lifshitz et al., (1987) đã nghiên cứu khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của
chủng Pseudomonas putida GR12-2 và tiến hành chủng trên cây trồng thì giúp gia
tăng chiều dài rễ, gia tăng chiều cao của chồi, tăng khả năng hấp thu lân hơn đối
chứng nhiều lần.
Malik et al., (1994) đã sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirilium, Acetobacter,
Bacillus và Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia tăng năng suất so
với đối chứng và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp rễ lúa phát triển nhiều
hơn để hấp thu nhiều nước và dưỡng chất hơn.
Asghar (2002) đã phân lập các vi sinh có khả năng tổng hợp IAA từ vùng rễ của cây
Brassica juncea L. và khi thử độ hữu hiệu của các chủng đó lên cây trồng thì giúp gia
tăng chiều cao cây (56,5%), gia tăng số nhánh (35,7%), đường kính thân (11%), số trái
trên một cây (26,7%), tăng hàm lượng dầu trong hạt (5,6%) và gia tăng năng suất lên
gấp nhiều lần so với đối chứng (45,4%). Tương tự 30 dòng vi khuẩn được phân lập từ
vùng rễ của cây lúa mì tại nhiều địa điểm khác nhau cho thấy có khả năng tổng hợp
IAA và khi tiến hành thí nghiệm chủng cho cây lúa thì cũng giúp gia tăng chiều dài
trọng lượng khô của rễ, tăng trọng lượng khô và số chồi ở các hạt được chủng, khi tiến
hành thí nghiệm trong nhà lưới và trong chậu thì cũng cho kết quả gia tăng năng suất
lên rất nhiều lần so với đối chứng hơn 20% (Khalid, 2004).
Cao Ngọc Điệp (2004) đã khảo sát ảnh hưởng của dòng vi khuẩn nốt rễ và vi khuẩn
Pseudomonas spp trên nhiều loại cây trồng khác nhau, ở vùng đất đồng bằng song cửu
long, có khả năng tổng hợp IAA cao, Kết quả cho thấy: như dòng P18 tổng hợp được
41,424 µg/ml IAA trong môi trường không có tryptophan, và dòng này có khả năng
tổng hợp IAA cao trên nhiều loại cây trồng khác nhau.
Hiện nay có nhiều công ty phân bón sử dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng
thực vật (PGPR) để xử lý cây trồng phát triển tốt, làm bộ rễ phát triển tốt và tăng năng
suất (Nguyễn Thị Quí Mùi, 2001). Tại Việt Nam Công ty sinh hoá hữu cơ đã đưa một
vài dòng vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật từ nước ngoài
vào Việt Nam để sản xuất phân bón dạng hữu cơ (Lê Văn Tri, 2000) và trong hội chợ
Khoa học Công nghệ năm 2003 (Tech-mart, 2003) tổ chức vào tháng 10/2003 tại Hà
Nội. Công ty cổ phần phân bón FITOHOOCMON do Tiến sĩ Lê Văn Tri làm tổng
giám đốc có trụ sở tại Hà Nội chào bán qui trình sản xuất vi sinh vật có khả năng tổng
12

13. hợp kích tố tăng trưởng thực vật dưới phân hữu cơ vi sinh FITOHOOCMON để các
công ty phân bón mua và bổ sung vào thành phần phân bón của họ.
Qui trình tổng hợp IAA của vi sinh vật
L- Tryptophan được xem như là tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA ở cả thực vật lẫn
vi sinh vật. Các qui trình tổng hợp IAA từ Tryptophan đã và đang được nhiều nhà
khoa học tập trung nghiên cứu. Theo Kosuge (1966) sự tổng hợp IAA của chủng
Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi bắt nguồn từ Tryptophan và theo con đường
indole-3-acetamid (IAM) với sự tham gia của 2 enzyme Tryptophan monooxygenase
và indoleacetamide hydrolase. Patten & Glick (2002) đã chứng minh chủng
Pseudomonas putida GR12-2 đã tổng hợp IAA theo con đường indolepyruvic acid và
tầm quan trọng của enzyme indolepyruvate decarboxylase trong việc chuyển
Tryptophan thành IAA. Khi nghiên cứu sự tổng hợp IAA của chủng Azospirillum
brasilense. Prinsen et al.,(1993) cho rằng có ít nhất 3 con đường tổng hợp IAA, trong
đó 2 lộ trình tổng hợp xuất phát từ Tryptophan là lộ trình indole-3-acetamide (IAM)
và lộ trình indole-3-pyruvate (IPyA) và một qui trình tổng hợp IAA không cần sự
tham gia của Tryptophan. Suzuki (2003) khi nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của
chủng Pseudomonas fluorescens HP72 bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy
với nhiều tiền chất khác nhau và đề ra một số lộ trình tổng hợp IAA của vi sinh vật
như sau:
- Lộ trình Indole-3-acetamide (A-B) có sự tham gia của enzyme Tryptophan
monooxygenase và enzyme indoleacetamid hydrolase.
- Lộ trình Indole-3-pyruvic acid (E-F-D) có vai trò của enzyme Tryptophan
transferase, Indole-3-pyruvate decarboxylase và Indole-3-acetaldehyde oxydase.
- Lộ trình Tryptophan side chain oxydase (C-D) với sự hiện diện của enzyme
Tryptophan side chain oxydase và enzyme Indole-3-acetaldehyde oxydase.
13

14. H
2
NH
2
CH CHCOOH
N
L-Tryptophan (Trp)
Indole-3-pyruvicacid(IpyA)
CH COCOOH
2
H
N
Indole-3-acetaldedyde(IAAld)
2
CH CHO
H
N
N
H
CH CNH
2 2
O
Indole-3-acetamide (IAM)
Indole-3-aceticacid(IAA)
2
CH COOH
H
N
A
B
C
D
E
F
Hình 1 : Các lộ trình tổng hợp IAA của vi sinh vật (Suzuki et al., 2003).
A : Tryptophan monooxygenase , B : Indoleacetamid hydrolase.
C : Tryptophan side chain oxydase, D : Indole-3-acetaldehyde oxydase.
E : Tryptophan transferase, F : Indole-3-pyruvate decarboxylase.
Các qui trình tổng hợp này cũng được Persello-Cartieaux (2003) chứng minh cụ
thể và cho rằng một số dòng vi khuẩncó thể tổng hợp IAA không phụ thuộc vào
Tryptophan, rất có thể IAA đã được tổng hợp từ một số hợp chất indole và Indole-3-
glycerol phosphate (IGP).
14

15. Hình 2 : Cơ chế tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) của vi sinh vật
(Nguồn: Persello-Cartieaux , 2003).
15

16. Sơ lược về cây rau muống
1.1.3 Đặc điểm thực vật học
Rau muống ( Ipomoea aquatica)
Cây rau muống thuộc họ bìm bìm ( Convolvulaceae)
+ Hệ rễ: Hệ rễ của rau muống thuộc loại rễ chùm. Hệ rễ rau muống ăn nông, chủ yếu
ở tầng mặt. Rễ mọc từ đốt trên thân thường ngắn. Rau muống là loại rau ưa nước, đối
với rau muống trồng từ hạt thì chịu hạn hơn rau muống nước.
+ Thân: Thân rau muống tròn, rỗng, trên thân có nhiều lóng. Độ dài lóng thay đổi theo
giồng và theo môi trường sống, màu sắc của thân được phân biệt bởi hai màu chủ yếu
là trắng xanh và đỏ tía.
Giống rau muống trắng ở cố đô Huế thân dài và trắng. Trên thân ít lá, lá lại nhỏ nên
khi xào ăn rất dòn và ngon.
+ Lá: Lấ rau muống có hình mũi mác, lá mọc cách trên thân. Độ lớn nhỏ của lá phụ
thuộc vào đặc điểm của giống và môi trường sống. Rau muống sống ở hồ, ao, đầm lấ
thường to hơn rau muống sống trên cạn.
+ Hoa, quả, hạt: Hoa rau muống là hoa tự thụ phấn, nhị và nhụy trên cùng một hoa.
Màu sắc hoa thay đổi theo giống. Rau muống trắng hoa màu trắng., rau muống đổ
cánh hoa phớt tím, ở giữa hoa màu tím sẳm. Quả rau muống con non màu xanh nhạc,
mỗi quả có 4 ô, mỗi ô chứa một hạt. khi chín hạt màu nâu, một gam hạt có khoảng 20-
30 hạt.
Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh
+ Nhiệt độ: Rau muống có nguồn gốc ở vùng nhiệt đối, ưa thích khí hậu nóng ẩm .
Rau muống sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-30o
C. Rau muống không chịu rét, nhiệt độ
thất cây sinh trưởng kém cằn cỗi. Ở sứ lạnh muốn có rau muống phải sản xuất trong
nhà kín, nhà lợp bằng polyetythlen, nhà lưới…
+ Ánh sáng: Rau muống yêu cầu thời gian chiếu sáng trong ngày ngắn để ra hoa.
Trong quá trình sinh trưởng nhu cầu ánh sáng trung bình, có thể sinh trưởng trong
điều kiện bóng răm ở buôn làng, dưới tán cây lớn. Nhiệt độ cao và cường độ ánh sáng
mạnh làm cho cây sinh trưởng kém, cằn cỗi và cứng, chất lượng giảm.
+ Nước: Nước có trong thân lá rất cao, hệ rễ ăn nông, vì vậy khả năng chịu hạn kém.
Rau muống có thể sinh trưởng tốt ở sông, ngòi, hồ, ao.
Rau muống cấn nước trong suốt quá trình sinh trưởng. thiếu nước cây còi cọc, lóng
ngắn, lá nhỏ, thân cứng, nhiều xơ, trong điều kiện như vậy sẽ làm cho chất lượng
giảm.
16

17. + Đất: Rau muống có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau, đồng thời có thể
sinh trưởng ở những nơi có mặt nước lớn như sông, ngòi, hồ ao, đầm…Tuy vậy khi
trồng rau muống nên chọn đất tơi xốp, độ pH hơi chua hoặc trung tính (pH= 5.5 -7),
nơi trồng phải tưới tiêu thuận lợi.
+ Chất dinh dưỡng: Rau muống là loại rau ăn thân lá, năng suất cao. Vì vậy loại rau
này cần nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt là đạm, đạm kích tích sự sinh trưởng thân, lá
do đó có tác dụng quyết định đối với năng suất và chất lượng rau muống. Lân và Kali
góp phần làm tăng chất lượng và làm tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất
lợi của môi trường.
1.1.4 Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế
+ Giá trị dinh dưỡng: Rau muống là loại rau ăn thân lá, loại rau rất phổ biến ở nước ta.
Là loại rau thông thường nhưng giá trị dinh dưỡng rất phong phú. Trong thân lá rau
muống có các chất quan trọng như: đạm, đường, các chất khoáng (canxi, photpho, sắt
và các loại vitamin A, B1, B2, C, PP) rau muống có thể dùng để luộc ,xào, nấu canh,
ăn sống. Ở miền Nam có nơi các bà nội trợ dùng rau muống để muối chua ăn dòn và
ngon.
+ Ý nghĩa kinh tế: Rau muống dễ trồng thời gian thu hoạch tương đối dài, số lứa thu
hoạch từ 8-10 lần, năng xuất cao 30-40 tấn/ha, thậm chí 50-60 tấn/ha. Là loại rau cần
ít vốn đầu tư nhưng lại cho hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt rau muống có giá trị vào
những lúc giáp vụ khan hiến rau, và rau muống trái vụ.
Ở Việt Nam, rau muống được trồng hầu hết ở các vùng làng quê, nông thôn. Có thể
nói, rau muống là món ăn gắn với truyền thống của người Việt Nam, từ các món bình
dân như rau muống luộc, rau muống xào, canh rau muống đến các món đã trở thành
đặc sản như rau muống xào trâu của Nam Định, nộm rau muống, rau muống sống
trang trí các món ăn... Những năm gần đây, nhu cầu rau muống tăng rất mạnh, đặc biệt
trong các dịp lễ Tết và cuối năm do nhu cầu ăn lẩu của bà con vào các thời điểm này
là rất cao. (Tạ Thu Cúc, 2007)
17

18. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương tiện
Vật liệu thí nghiệm
- Mẫu đất vùng rễ ở vùng đất trồng rau ở Tiền Giang
- Hạt giống rau muống
- Phân NPK
Thiết bị và dụng cụ
- Dụng cụ : dao, xẻng để lấy đất tại vùng rễ của các cây rau muống, túi nylon,
viết lông dầu, các ly nhựa nhỏ, ...
- Dụng cụ phòng thí nghiệm: Micropipete, eppendorf, kim cấy vi sinh, đèn cồn,
bình tam giác 250ml, đĩa Petri,ống nghiệm, ống đong, ....
- Buồng cấy, tủ ủ vi sinh (Incucell)
- Máy lắc (Ferrylab), máy ly tâm (Eppendorf centrifuge 5417R - của Đức),
Vortex mixture.
- Nồi khử trùng, tủ lạnh, cân điện có độ chính xác 0.1mg.
- Máy quang phổ (Ultrospec Plus Spectrophotometer- Pharmacia LKB của Mỹ).
- Hoá chất: cồn 900
, Proteose Pepton số 3, agar, glycerol, H2SO4, FeCl3, K2HPO4,
MgSO4, L – Tryptophan, IAA tinh khiết, môi trường phân lập vi sinh tổng hợp
phytohormon isolation agar (của Difco) , ....
Hóa chất
- Mannitol PA
- Proteose peptose số 3 Difco
- Pseudomonas isolation agar Difco
- Yeast Etract
- Acid Malic
- Glycerol
- Bacto tryptone
- Sodium Lactate
- Biotin
18

19. - PABA (p-aminobenzoic acid)
- Tryptophane
- IAA nguyên chất
- Acid sulfuric đậm đặt
- Cycloheximide
- Acid casamino
- Agar
- FeCl3
- K2HPO4 , KH2PO4 , CaCl2, MgSO4, NaCl, Ca CO3, KOH, CuSO4
- Khoáng vi lượng
- Nước cất vô trùng
Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian: Từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 6 năm 2009.
Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Cây Ăn Quả Miền Nam.
Phương pháp
Phân lập các dòng vi sinh từ đất vùng rễ của cây rau muống
Trong điều kiện thực hiện Luận án tốt nghịêp, chúng tôi thực hiện phân lập các dòng
từ đất vùng rễ (Rhizosphere) của một số cây họ rau muống tại Tiền Giang.
Đất từ vùng rễ được tách riêng ra và cho vào từng cốc nhỏ có đánh số thứ tự, sau đó
để khô trong điều kiện nhiệt độ phòng, sau đó nghiền mịn. Cân 1g đất cho vào 100ml
nước cất tiệt trùng để trên máy lắc khoảng 2-3 giờ cho các hạt đất rời ra và vi sinh vật
được phân tán đều trong nước sau đó tiến hành pha loãng nhiều lần bằng nước cất tiệt
trùng (hệ số pha loãng 10-6
). Lấy 0,1ml dịch pha loãng ở lần pha loãng cuối và cấy
trên môi trường phân lập đặc hiệu đó là môi trường isolation agar (của hãng Difco) có
bổ sung glycerol và chất kháng nấm (Cycloheximide 50mg/lít). Cấy bằng phương
pháp cấy trãi bằng đũa thuỷ tinh. Sau đó để khô và đặt các đĩa đã cấy vào tủ ủ và ủ ở
300
C trong 1 đến 2 ngày.
Từ đĩa cấy ban đầu tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc rời rạc có hình dạng khác nhau
sau đó cấy sang đĩa Petri khác chứa môi trường như trên bằng phương pháp cấy ria,
để phân lập từng dòng vi khuẩn, và tiến hành phân lập cho đến khi các khuẩn lạc tạo
ra có dạng đồng nhất, khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ có 1 dạng vi khuẩn thì chọn
lấy các khuẩn lạc rời rạc để trữ trong ống nghiệm chứa môi trường trên. Các vi khuẩn
19

20. thu được và trữ trong từng ống nghiệm được tạm xem như một dòng. Các ống nghiệm
dùng để trữ các dòng được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50
C để bảo quản.
Định lượng IAA
Vi sinh vật được nuôi trong môi trường King B để thử khả năng tổng hợp IAA của các
dòng phân lập được (Glickmann và Desseaux, 1995).
Thành phần môi trường King B (Glickmann & Desseaux, 1995) như sau:
20 g/l Proteose Pepton số 3
1,15 g/l K2HPO4.
1,5 g/l MgSO4.
1,5% Glycerol.
pH 7,2
Chia làm 2 thí nghiệm, một thí nghiệm môi trường King B có bổ sung 2,5mM (0,5 g/l)
L-Tryptophan và một thí nghiệm không bổ sung L-Tryptophan, để thử khả năng tổng
hợp IAA của các dòng vi sinh vật khi môi trường có L-Tryptophan làm mồi và không
có L-Tryptophan. Các dòng khác nhau sẽ được chủng vào trong các eppendorf chứa
1ml môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Cả 2 thí nghiệm thử khả năng tổng hợp IAA với nhiều dòng được ủ ở nhiệt độ phòng
trong 10 ngày. Với điều kiện trong tối không cho ánh sáng chiếu vào. cách 2 ngày lấy
ra 0.5 ml ly tâm các ống eppendorf nuôi vi sinh sẽ được đem ly tâm với tốc độ 13.000
vòng/phút trong thời gian 8 phút để làm lắng các tế bào của vi khuẩn. Sau đó dùng
micropipet rút lấy phần trong và cho tác dụng với thuốc thử Salkowski R2 với tỷ lệ
0,5ml môi trường + 1ml thuốc thử, để yên trong 15 phút-2 giờ (để cho phản ứng xảy
ra hoàn toàn) và đo trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm với đường chuẩn IAA
tinh khiết.
Các dòng vi sinh được nuôi trong môi trường chuyên biệt nêu trên có bổ sung L-
Tryptophan và không bổ sung L-Tryptophan và ủ trong thời gian và điều kiện thích
hợp được đo IAA theo phương pháp của Glickmann & Desseaux (1995) trên máy
quang phổ ở bước sóng 530 nm cùng với đường chuẩn của IAA tinh khiết với thuốc
thử Salkowski R2 (4,5 g/l FeCl3 trong 10,8 M H2SO4).
Đường chuẩn IAA tinh khiết được thiết lập với nồng độ IAA tăng dần 0µg/0,5ml,
5µg/0,5ml, 10µg/0,5ml, 15µg/0,5ml.
Mỗi thí nghiệm có một đường chuẩn IAA riêng gồm đường chuẩn IAA cho môi
trường có bổ sung L-Tryptophan, đường chuẩn IAA cho môi trường không bổ sung L-
Tryptophan.
20

21. Dựa vào đường chuẩn IAA tinh khiết để tính được lượng IAA do các dòng vi sinh
tổng hợp được trong môi trường có bổ sung L-Tryptophan và không có bổ sung L-
Tryptophan.
1.1.5 Khảo sát đặc tính sinh hóa
a. Phương pháp nhuộm Gram
- Sau khi chọn lọc các dòng vi khuẩn tổng hợp IAA cao, ta tiến hành nhuộm
Gram các vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp & Nguyễn Hữu Hiệp, 2000).
- Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
+ Lấy 10µ nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật.
+ Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải
đều lên kính mang vật.
+ Hơ mẫu tên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
+ Nhỏ từ một đến hai giọt crytal violet lên kính mang vật đã cố định mẫu vi
sinh vật và để 2 phút.
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng, dùng giấy thấm chậm nhẹ cho khô nước.
+ Nhỏ từ một đến hai giọt iod rồi trải đều trên vùng mẫu đã được cố định trong
một phút.
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
+ Rửa lại cồn thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến
giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
+ Nhỏ từ một đến hai giọt fusin rồi trải đều trên vùng chứa mẫu khoãng một
phút.
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến khi không còn màu của fushin.
+ Dùng giấy thấm chấm nhẹ cho khô kính mang vật.
+ Quan sát dưới kính hiển vi ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn
có màu tím xanh của crytal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của
fushin là mẫu Gram âm.
b. Quan sát hình dạng và khả năng di động
+ Dàn đều sinh khối vi khuẩn lên giọt nước trên lam kính sạch, quan sát sự di
động của tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi.
21

22. Thử nghiệm trên cây rau muống
* Thí nghiệm trong chậu
- Thử nghiệm tiến hành trên rau muống
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại và 8 nghiệm thức sau:
1. dòng vi khuẩn với mật số 109
tế bào/ml
2. dòng vi khuẩn với mật số 108
tế bào/ml
3. dòng vi khuẩn với mật số 107
tế bào/ml
4. dòng vi khuẩn với mật số 106
tế bào/ml
5. dòng vi khuẩn với mật số 105
tế bào/ml
6. Đối chứng (không chủng vi sinh vật, không bón phân)
7. Bón 100mg NPK/kg đất
8. Bón 50mg NPK/kg đất
Qui trình thí nghiệm:
- Cách bón phân và vi sinh vật: phân được chia là hai lần tưới, lần 1 tưới vào lúc 5
ngày khi gieo hạt, lần hai bón lúc 10 ngày sau khi gieo hạt, ở nghiệm thức 7 bón
100 % NPK (100 mg NPK), lần 1 bón 50 mg NPK và lần 2 bón 50 mg NPK,
nghiệm thức 8 bón lần 1 là 25 mg NPK và lần hai là 25 mg NPK. Các chậu bón vi
sinh cũng được bón hai lần, mỗi lần bón vứi mật độ của các ngiệm thức và thể tích
bón là 5ml/chậu.
- Thời gian tiến hành thí nghiệm:
Ngày 8 tháng 01 năm 2009: gieo hạt mồng tơi vào chậu.
Ngày 13 tháng 01 năm 2009 tưới phân và vi sinh vật lần 1.
Ngày 18 tháng 01 năm 2009 tưới phân và vi sinh lần 2.
Ngày 23 tháng 01 năm 2009 thu kết quả và phân tích thống kê.
* Thí nghiệm ngoài đồng
- Dòng vi khuẩn với mật số thích hợp (107
/ml) được chọn để tiến hành thử
nghiệm và đánh giá hiệu quả ở ngoài đồng trên rau muống.
- Hạt giống rau muống , phân dùng trong thí nghiệm là NPK.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên ở 2 địa điểm ở Tiền Giang, mỗi địa điểm
trồng 2 vụ, với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lập lại sau:
22

23. 1. Đối chứng âm (không bón phân)
2. Đối chứng dương (100 kg NPK/1000m2
)
3. dòng vi khuẩn (6 lit/1000m2
)
4. dòng vi khuẩn (6 lit/1000m2
) + 50 kg NPK/1000m2
5. dòng vi khuẩn (6 lit/1000m2
) + 25 kg NPK/1000m2
NPK được chia ra 2 lần tưới (lần 1: 5 – 7 ngày sau khi gieo, lần 2: 15 – 20 ngày
sau khi gieo). Vi sinh vật cũng được tưới 2 lần cùng với thời gian tưới đạm.
Cách làm đất: Đất được làm cỏ, cuốc lên lếp ( chiều ngang mỗi lếp 1m ), phơi
đất, băm đất nhỏ ra và làm sạch cỏ trước khi gieo hạt.
Cách gieo hạt: Hạt giống rau muống được ngâm nước trước khi gieo, gieo hạt
theo hàng, mỗi hàng cách nhau 20cm.(10kg hạt/1000m2
)(Nguyễn Mạnh Chinh &
Phạm Anh Cường, 2007).
Cách bón phân: Phân hóa học và dòng vi khuẩn được chia làm hai lần tưới trong
một vụ.
- lần 1: tưới vào lúc 6 ngày sau khi gieo hạt.
- Lần 2: tưới vào ngày thứ 15 sau khi gieo hạt.
- Địa điểm 1:
o Vụ 1: Gieo hạt ngày 3 tháng 3 năm 2009
- Ngày 9 tháng 3 năm 2009, tưới phân và vi sinh vật lần 1.
- ngày 17 thu thập số liệu lần 1
- ngày 18 tháng 3 năm 2009, tưới phân lần 2.
- ngày 27 tháng 3 năm 2009 thu thập số liệu lần 2.
- ngày 2 tháng 4 năm 2009 thu thập số liệu lần 3.
o Vụ 2: Gieo hạt ngày 14 tháng 4 năm 2009.
- Ngày 20 tháng 4 năm 2009, tưới phân và vi sinh vật lần 1.
- ngày 28 tháng 4 năm 2009 thu thập số liệu lần 1.
- ngày 29 tháng 4 năm 2009, tưới phân lần 2.
- ngày 8 tháng 5 năm 2009 thu thập số liệu lần 2.
- ngày 14 tháng 5 năm 2009 thu thập số liệu lần 3.
23

24. - Địa điểm 2:
o Vụ 1: Gieo hạt ngày 5 tháng 3 năm 2009
- Ngày 11 tháng 3 năm 2009, tưới phân và vi sinh vật lần 1.
- ngày 19 thu thập số liệu lần 1
- ngày 20 tháng 3 năm 2009, tưới phân lần 2.
- ngày 30 tháng 3 năm 2009 thu thập số liệu lần 2.
- ngày 4 tháng 4 năm 2009 thu thập số liệu lần 3.
Vụ 2: Gieo hạt ngày 16 tháng 4 năm 2009.
- Ngày 22 tháng 4 năm 2009, tưới phân và vi sinh vật lần 1.
- ngày 28 tháng 4 năm 2009 thu thập số liệu lần 1.
- ngày 29 tháng 4 năm 2009, tưới phân lần 2.
- ngày 10 tháng 5 năm 2009 thu thập số liệu lần 2.
- ngày 16 tháng 5 năm 2009 thu thập số liệu lần 3.
Thu thập các chỉ tiêu: chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá, đường kính thân, trọng
lượng cây. Dùng phương pháp thống kê để phân tích số liệu.
24

25. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp IAA
Bảng 3. Nguồn gốc của 40 dòng vi khuẩn phân lập trong đất trồng rau Tiền Giang
STT Dòng vi khuẩn Nguồn gốc
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
Ấp Thân Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Thân Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Cửu Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Cửu Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Long Định A, Long Hưng, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Long Định A, Long Hưng, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Trung, Long Định, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Trung, Long Định, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Keo, Long Định, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Keo, Long Định, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp 2, Đạo Thạnh, TP Mỹ Tho, Tiền Giang
Ấp 2, Đạo Thạnh, TP Mỹ Tho, Tiền Giang
Ấp Lương Phú B, Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Lương Phú B, Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Lương Phú C, Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Lương Phú C, Lương Hòa Lạc, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Phú Thạnh A, Phú Kiết, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Phú Thạnh A, Phú Kiết, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Phú Thạnh A, Phú Kiết, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Cửu Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Cửu Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Cửu Hòa, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Ngãi Lợi, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Ngãi Lợi, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Ngãi Lợi, Thân Cửu Nghĩa, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Đông B, Đông Hòa, Châu Thành, Tiền Giang
25

26. 27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
Ấp Đông B, Nhị Bình, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Đông B, Nhị Bình, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Đông B, Nhị Bình, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp 5, Tam Hiệp, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Hòa Ninh, Hòa Tịnh, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Hòa Ninh, Hòa Tịnh, Chợ Gạo, Tiền Giang
Ấp Thạnh Hưng, Phước Thạnh, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Thạnh Hưng, Phước Thạnh, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Long Hưng, Long An, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Long Mỹ, Long An, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp 4, Xã Trung An, TPMT, Tiền Giang
Ấp 4, Xã Trung An, TPMT, Tiền Giang
Ấp Long Tường, Long An, Châu Thành, Tiền Giang
Ấp Long Thạnh, Long An, Châu Thành, TIền Giang
40 dòng vi khuẩn Pseudomonas sp trên được phân lập từ các địa diểm khác nhau từ
vùng rễ của đất trồng rau tại tỉnh Tiền Giang, vi khuẩn trên được phân lập từ môi
trường King B, kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn trên có màu trắng đục, trắng sữa
lồi, rời rạc.
Kết quả trên cho thấy phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà (2008)
26

27. Hình 3. Colony
a.Các colony chủng P18
b. Các colony chủng P24
27
a b

28. Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của 40 dòng vi khuẩn được phân lập
STT
Dòng vi
khuẩn
Đặc điểm
Màu sắc Hình dạng Độ nổi Bìa
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
Trắng đục
Trắng đục
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng đục
Trắng đục
Trắng sữa
Trắng đục
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Tròn đều
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Tròn đều
Lồi
Lồi
Nổi
Nổi
Nổi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Nổi
Nổi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Nổi
Nổi
Nổi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Trơn
Trơn
Mép vỏ sò
Gợn sóng
Gợn sóng
Trơn
Trơn
Trơn
Trơn
Trơn
Trơn
Gợn sóng
Trơn
Trơn
Gợn sóng
Trơn
Trơn
Trơn
Gợn sóng
Mép vỏ sò
Mép vỏ sò
Trơn
Trơn
Trơn
Trơn
Trơn
28

29. 27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng đục
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng đục
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng sữa
Trắng đục
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Tròn đều
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Không đều, lan rộng
Lồi
Nổi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Lồi
Nổi
Nổi
Nổi
Nổi
Nổi
Trơn
Gợn sóng
Trơn
Mép vỏ sò
Trơn
Gợn sóng
Trơn
Gợn sóng
Trơn
Mép vỏ sò
Mép vỏ sò
Gợn sóng
Mép vỏ sò
Gợn sóng
Bảng 5. Tóm tắt các đặc điểm khuẩn lạc
Đặc điểm khuẩn lạc giải phóng IAA
Màu sắc Hình dạng Độ nổi Bìa
31/40 trắng sữa
77,5%
9/40 trắng đục 32,5%
22/40 tròn đều 55%
18/40 không đều, lan
rộng 45%
34/40 lồi
4/40 mặt phẳng nhẵn
2/40 nổi
23/40 trơn 57,5%
7/40 mép vỏ sò
17.5%
10/40 gợn sóng 25%
29

30. 1.2 Khảo sát đặc tính sinh hóa
Kết quả khảo xác về đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn thu thập được, và thử
với thuốc thử Salkowski các dòng đều phản ứng với thuốc thử và có màu hồng, màu
đặc trưng của thuốc thử Salkowski. Màu hồng có độ đậm nhạt khác nhau, đối với các
vi khuẩn được nuôi trong môi trường có thêm L- tryptophan thì ở dòng P10 có màu
hồng nhạt nhất và dòng P18 có màu hồng đậm nhất (hình 4). Còn đối với các vi
khuẩn được nuôi trong môi trường có không có L- tryptophan thì ở dòng P22 có màu
hồng nhạt nhất và dòng P24 có màu hồng đậm nhất (hình 5).
Hình 4. Phản ứng với thuốc thử Salkowski (Có trytophan)
Hình 5. Phản ứng với thuốc thử Salkowski (Không trytophan)
30

31. Bảng 6. Phản ứng với thuốc thử của các dòng vi khuẩn
Dòng vi
khuẩn
Thuốc thử Salkowski
Dòng vi
khuẩn
Thuốc thử Salkowski
Lặp lại Lặp lại
1 2 1 2
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Đường chuẩn IAA đo được
31

32. Hình 6. Đường chuẩn IAA tinh khiết
Bảng 7. Khả năng tổng hợp IAA của 40 dòng vi khuẩn
Dòng vi khuẩn µg/ml
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
8.11
8.40
10.78
2.66
5.57
7.25
9.93
5,05
7.78
3.32
8.03
3.76
4.32
5.08
6.71
5.19
10.61
32
Tải bản FULL (60 trang): https://bit.ly/3konjXs
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

33. P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P34
P35
P36
P37
P38
P39
P40
16.92
6.46
10.57
4.96
5.27
9.16
22.86
6.00
7.74
8.56
3.86
8.68
9.18
11.55
5.61
7.50
8.20
5.58
3.87
6.04
6.18
6.04
7.75
SE (N=4)
5%LSD
2.84
7.97
Kết quả ở bảng 7 cho thấy các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA, thống kê cho thấy
các trọng lượng IAA của các dòng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa và khoảng biến động về
trung bình trọng lượng IAA trong khoảng (2.66 - 22.86 µg/ml), trong đó dòng P4 có trung
bình vè trọng lượng nhỏ nhất 2.66 µg/ml và dòng P24 có trung bình về trọng lượng cao nhất
là 22. 86 µg/ml.
33

34. Hartmann et al. 1983. cũng đã thành công trong nguyên cứu về khả năng sản xuất IAA
của Azospirillum bằng thuốc thử Salkowki. Patten & Glick 2002, đã nguyên cứu về
khả năng sản xuất IAA của Pseudomonas, được nuôi cấy trong 48 giờ sau đó dùng
pipet hút 1ml và 4 ml thuocs thử Salkowki, sau đó lắc 20 phút ở nhiệt độ (26 ± 1o
C)
quan sát sự chuyển sang màu hồng và được đo ở máy quang phổ và xác định nồng độ
IAA mà vi khuẩn Pseudomonas tạo ra. Khaharova et al. (1999) cũng đã dùng thuốc
thử Salkowki để kiểm tra và định lượng lượng IAA tạo ra của các dòng vi khuẩn.
Farah Ahmad et al, (2004) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn (Azotobacter sp., 10
and fluorescent Pseudomonas sp., 11), được phân lập từ các vùng đất khác nhau ở
vùng gần thành phố Aligarh. Mức độ tổng hợp IAA thấp đối với các dòng không thêm
tryptophan. 7 dòng Azotobacter cho thấy khả năng tổng hợp IAA cao ( 7.3 – 32.8
mg/ml). Đối với fluorescent Pseudomonas có khả năng tổng hợp IAA cao cả trong
môi trường không có tryptophan, 5 dòng tổng hợp IAA cao nhất (41.0 – 53.2 mg/ml),
và 6 dòng có lượng IAA được tổng hợp ở mức (23.4 - 36.2mg/ml).
Hình 7. Hình nhuộm Gram
a. Dòng P18
b. Dòng P24
Kết quả nhuộm Gram 2 dòng P18 và P24 cho thấy dòng P18 và P24 đều có màu hồng đỏ của
fushin, như vậy dòng vi khuẩn trên là vi khuẩn Gram âm.
Quan sát hình dạng và khả năng di động:
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy dòng P18 và P24 có hình que và có khả
năng chuyển động chậm. Kết quả trên cho thấy phù hợp với nghiên cứu của Smidt &
Kousuge, 1978)
34
a b
Tải bản FULL (60 trang): https://bit.ly/3konjXs
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

35. Kết quả thử nghiệm trên rau muống
Thử nghiệm trong chậu
Bảng 8. Ảnh hưởng của các dòng N24 và phân hóa học lên thí nghiệm trong chậu
Nghiệm
thức
Số lá
Chiều cao
cây (cm)
Đường
kính
thân
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Trọng lượng
NT1
NT2
NT3
NT4
NT5
NT6
NT7
NT8
10.33
10.00
11.33
10.00
9.33
9.33
9.66
11.33
11.50
13.50
12.66
11.33
12.50
7.00
10.83
13.00
0.36
0.39
0.38
0.33
0.37
0.29
0.26
0.36
13.33
16.00
15.83
17.66
14.83
11.66
10.33
14.00
4.97
5.06
4.23
5.85
4.67
2.86
2.59
4.55
SE(=3)
5%LSD
1.06
3.17
0.82
2.48
0.30
0.91
1.29
3.88
0.66
1.99
Ghi chú : NT1 : chủng vi sinh mật độ 109
, NT2= chủng vi sinh mật độ 108
, NT3= chủng vi sinh mật độ 107
,
NT4= chủng vi sinh mật độ 106
, NT5= chủng vi sinh mật độ 105
, NT6= chỉ tưới nước, NT7= bón 50% phân
NPK ( ), NT8= bón 100% phân NPK.
Kết quả thống kê ở bảng 7 vê thử nghiệm trong chậu sau 14 ngày về số lá ta thấy
không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê, trong đó khoảng biến động của trung bình
số lá là (9.33- 11.33), trong đó nghiệm thức 2,3 và 5 có trung bình về số lá lớn nhất và
nghiệm thức 8 (bón 50% phân NPK) có số trung bình số lá ít nhất. Qua kết quả trên
cho thấy chủng vi khuẩn P24 có ảnh hưởng đến thí nghiệm trên.
Về chiều cao cây có sự khác biệt ý nghĩa thống kê, khoảng biến động là (7.00- 13.50
cm) trong đó nghiệm thức 6 (chỉ tưới nước) có trung bình về chiều cao thấp nhất (7.00
cm) và nghiệm thức 1(chủng vi khuẩn với mật độ 109
) có trung bình về chiều cao cao
nhất là (13.50 cm).
Về chiều dài rễ có sự khác biệt ý nghĩa thống kê, khoảng biến động là (10.33- 17.66
cm) trong đó nghiệm thức 7 (bón 50% phân NPK) có trung bình về chiều dài rễ thấp
35
5633338