Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THÙY LINH
Tên đề tài:
BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC
TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG
CẢM ỨNG (iPSC)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Ngành: Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành: CNSH - CNTP
Khóa học: 2015 – 2019
THÁI NGUYÊN, 2019

2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THÙY LINH
Tên đề tài:
BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC
TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG
CẢM ỨNG (iPSC)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo: Chính quy
Ngành: Công nghệ Sinh học
Lớp: K47 – CNSH
Chuyên ngành: CNSH - CNTP
Khóa học: 2015 – 2019
Giảng viên hướng dẫn: 1. TS Nguyễn Xuân Hưng
2. PGS.TS Dương Văn Cường
THÁI NGUYÊN, 2019

3. i
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng –
Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào
gốc và công nghệ gen Vinmec và PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh –
kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec, người đã trực
tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Viện nghiên cứu Tế bào gốc và
Công nghệ gen TS. Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan… đã hỗ trợ nhiệt
tình cho tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh
học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã
giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua.
Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thùy Linh

4. ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng ...................... 10
Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa .......................................... 11
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm.......................................................... 21
Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................... 23
Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm................................................ 24
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry.............................................. 28
Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O ..... 29
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR...................................................................... 35
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA.................................................... 35
Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm ................................................... 37
Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR ..................................................... 37
Bảng 4.1: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid mini........................ 39
Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi....................... 40
Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA .................................................... 50

5. iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc .................................................................................4
Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng........................................5
Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám
phá thuốc......................................................................................................9
Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4..............................................................12
Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 .......................................................13
Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4 ..............................................................14
Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC...............................................................15
Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 .............................................................16
Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 .............................................................17
Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC..............................................18
Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình ..................20
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài ..........................................................25
Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình...........................................................28
Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA ......................................................................36
Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR.......................................37
Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid mini......................................................39
Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid maxi .....................................................40
Hình 4.3: Tế bào CD34+
sau khi rã đông ..................................................................41
Hình 4.4: Tế bào CD34+
sau 6 ngày nuôi tăng sinh..................................................42
Hình 4.5: Tế bào CD34+
sau 2 ngày nuôi tăng sinh..................................................43
Hình 4.6: Tế bào CD34+
sau 5 ngày nuôi tăng sinh..................................................43
Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh
....................................................................................................................45
Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện.....................................................................47
Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau 3 ngày chuyển gen (B) và
sau 7 ngày chuyển gen (C).........................................................................48

6. iv
Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện.................................................................. 49
Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B),
sau 8 ngày chuyển gen (C)........................................................................ 49
Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4 và LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc
vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G..................................................... 51

7. v
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Từ đầy đủ
BSA Bovine serum albumin
cDNA complementary DNA
DMSO dimethylsulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
ESC Embryonic stem cell
hiPSC Human induced pluripotent stem cell
HMG High mobility group
HSC Hematopoietic stem cell
ICM Inner cell mass
iPSC Induced pluripotent stem cell
LB Laria Broth
mESC Mouse embryonic stem cell
PBMC Peripheral blood mononuclear cell
PCR Polymerase chain reaction
qRT-PCR Quantitative polymerase chain reaction
Ref Reference
RNA Ribonucleic acid
RT Reverse transcription
Tg Target

8. vi
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................iii
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT................................................................... v
Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1.Đặt vấn đề............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát............................................................................................ 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể................................................................................................. 2
1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................. 2
1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài .............................................................................. 2
1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài............................................................................... 3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 4
2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.................................................................... 4
2.1.1 Tế bào gốc ..........................................................................................................4
2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng............................................. 4
2.1.3. Phân loại tế bào gốc ......................................................................................... 5
2.2. Các nhân tố tái lập trình .................................................................................... 12
2.2.1. OCT4.............................................................................................................. 12
2.2.2. SOX2.............................................................................................................. 13
2.2.3. KLF4 .............................................................................................................. 14
2.2.4. MYC............................................................................................................... 15
2.2.5. LIN28 ............................................................................................................. 16
2.2.6. GLIS1............................................................................................................. 17
2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC......................................................................... 18
Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 21
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu.................................................. 21
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 21

9. vii
3.1.2. Địa điểm và thời gian......................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................21
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................21
3.3.1. Vật liệu............................................................................................................21
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................25
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................39
4.1 Kết quả nhân plasmid lần 1.................................................................................39
4.2. Kết quả nhân plasmid lần 2...............................................................................40
4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 ................................................41
4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 ................................................43
4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1.........................................46
4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2.........................................48
4.7. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen ..........................................................................50
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................53
5.1. Kết luận ..............................................................................................................53
5.2. Kiến nghị............................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO

11. 1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cell - ESC) là những tế bào vạn năng, có
khả năng tự làm mới và có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong (inner cell mass –
ICM) của phôi nang đang phát triển [44]. Tế bào gốc phôi có thể được nuôi cấy vô
thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và
do đó cung cấp một công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa bệnh ở người [8] tuy nhiên tế
bào gốc phôi vướng phải nhiều tranh cãi về đạo đức khi sử dụng trực tiếp nguồn
phôi người [3].
Việc Yamanaka khám phá ra rằng các tế bào trưởng thành nguyên vẹn có thể
được tái lập trình để trở thành các tế bào gốc vạn năng ngay lập tức được coi là một
bước đột phá lớn. Các tế bào gốc vạn năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell -
iPSC) là đại diện thay thế cho nguồn tế bào gốc phôi, không gây tranh cãi về đạo
đức và mang đầy đủ các đặc tính của một tế bào gốc phôi. Một lợi thế quan trọng
của iPSC là khả năng tương thích miễn dịch khi sử dụng liệu pháp tế bào tự thân
[30]. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào sinh
dưỡng khác nhau và có sự tương đồng cao với tế bào gốc phôi. Với các nguồn tế
bào sinh dưỡng dễ tiếp cận, iPSC từ người không chỉ loại bỏ các vấn đề về đạo đức
vướng phải khi sử dụng ESC mà còn cho phép tạo ra nguồn tế bào gốc vạn năng
đơn giản hơn, cũng như biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt cho từng bệnh
nhân. Tương tự như ESC, iPSC của người có khả năng tăng sinh mạnh mẽ trong
ống nghiệm trong khi vẫn giữ được tiềm năng phát triển và biệt hóa thành mọi tế
bào trong cơ thể. Do đó, các tế bào này có thể cung cấp một số lượng không giới
hạn nguồn tế bào biệt hóa dành riêng cho bệnh nhân để tạo mô hình nghiên cứu
bệnh, xét nghiệm độc tính, sàng lọc thuốc và sử dụng cho các liệu pháp cấy
ghép. Việc tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng bằng cách đưa các yếu tố tái lập
trình vào tế bào sinh dưỡng là một phương pháp đầy hứa hẹn cho liệu pháp tế
bào trong y học tái tạo.

12. 2
Các dòng iPSC từ người đã bắt đầu được phát triển, quan tâm và nghiên cứu
nhiều trên thế giới, tuy nhiên chủ yếu vẫn là các dòng được phát triển từ tế bào sinh
dưỡng có hệ gen của người da trắng, tính đến nay chưa có dòng iPSC của người
Việt Nam. Hệ gene của người Việt Nam khác với các nước trên thế giới do vị trí địa
lý, khí hậu, phong tục tập quán, chính vì thế chúng tôi tiến hành tạo các dòng iPSC
phù hợp với hệ gene của người Việt Nam, làm công cụ hữu ích để nghiên cứu cơ
chế bệnh, khám phá và sàng lọc độc tính các loại thuốc mới và đặc biệt là trở thành
một nguồn tế bào vô hạn sử dụng cho cấy ghép và y học tái tạo. Mặc dù tiến bộ
nhanh chóng, nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam vẫn đang giới hạn
trong việc sử dụng tế bào gốc đa năng với khả năng biệt hoá thành một số hữu hạn
dòng tế bào, các nghiên cứu về iPSC mới chỉ bắt đầu ở chuột từ năm 2016.
Từ các cơ sở khoa học nêu trên, tôi lựa chọn đề tài: “Biểu hiện hệ vector tái
lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm
ứng (iPSC)”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Biểu hiện thành công hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người.
- Điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2,
KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người.
- Kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo
máu sau khi điện biến nạp.
1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Là tiền đề để tạo thành công dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng đầu tiên từ
tế bào có hệ gen của người Việt Nam, đánh dấu một bước phát triển quan trọng
trong lĩnh vực này tại Việt Nam.

13. 3
- Tạo dòng iPSC đầu tiên của người Việt Nam để cung cấp một khối lượng
lớn tế bào làm mô hình cho nghiên cứu biệt hóa, nghiên cứu sàng lọc thuốc.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Chuyển gen thành công là bước đầu quan trọng và cần thiết trong quy trình
tạo dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng.

14. 4
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tế bào gốc
Tế bào gốc là một loại tế bào đặc biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm đặc trưng
của tế bào này là khả năng nhân đôi vô hạn và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế
bào sinh dưỡng khác [43]. Nhờ thế chúng có khả năng tái tạo, sửa chữa và thay thế
các tế bào chết, tổn thương trong cơ thể. Tên gọi tế bào gốc được hình thành cũng vì
khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau khiến người ta liên tưởng đến
hình ảnh gốc cây phân nhánh, mỗi nhánh hình thành cành, lá, quả.
Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc
2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng
- Năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành
của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều
này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình [3].
- Năm 1981, Martin Evans và Martin Kaufman, Gail Martin phân lập được tế
bào gốc phôi từ phôi của chuột [3].

15. 5
- Năm 1997, Sir Ian Wilmut và cộng sự đã chuyển nhân vào tế bào sinh
dưỡng để lập trình lại tế bào nhằm nhân bản cừu Dolly, loại động vật có vú đầu tiên
được tạo bằng nhân bản tế bào sinh dưỡng [3].
- Năm 1998, James Thomson phân lập được tế bào gốc phôi người [3].
- Năm 2001, Tada và cộng sự đã dung hợp tế bào sinh dưỡng với tế bào gốc
phôi để tạo ra các tế bào có khả năng biểu hiện gen liên quan đến các tế bào đa năng
cho thấy ESC có chứa một số yếu tố có thể lập trình lại các tế bào sinh dưỡng [3].
- Năm 2006, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ đã tạo ra tế bào gốc phôi hoàn
toàn mới từ tế bào trưởng thành. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này được tạo ra nhờ
chuyển bốn gen kích hoạt tái lập trình để tạo ra tế bào có đặc tính giống tế bào gốc
thu nhận ở phôi [3].
Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng
2.1.3. Phân loại tế bào gốc
Có thể phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa hoặc phân loại theo
nguồn gốc [48]. Theo tiềm năng biệt hóa (differentiation potency) đa dạng của tế
bào, các nhà nghiên cứu đã chia tế bào gốc thành 4 loại khác nhau [8]: tế bào gốc
toàn năng (Totipotent), tế bào gốc vạn năng (Pluripotent), tế bào gốc đa năng
(Multipotent) và tế bào gốc đơn năng (Unipotent).

16. 6
a. Tế bào gốc toàn năng
Các tế bào thuộc giai đoạn từ bốn đến tám tế bào trong quá trình phát triển
của phôi sau thụ tinh được gọi là tế bào gốc toàn năng, chúng chỉ tồn tại trong giai
đoạn phát triển phôi sớm. Với tế bào gốc toàn năng, mỗi tế bào ban đầu có thể hình
thành một cơ thể hoàn chỉnh. Chúng có tiềm năng cao nhất và nhiều nhất để có thể
trở thành tất cả các tế bào của cơ thể. Ở động vật có vú trưởng thành (bao gồm cả
người), có khoảng 200 loại tế bào thuộc các nhóm như tế bào thần kinh, tế bào cơ,
tế bào biểu mô, tế bào máu,…Những tế bào khác, bản chất cũng phát triển từ phôi,
nhưng không hợp nhất tạo cơ thể gồm: mô ngoài phôi, nhau thai, dây rốn. Các dạng
trên được tạo ra từ một tế bào toàn năng. Những tế bào ở giai đoạn phôi sớm đến
giai đoạn phôi nang cũng có tính toàn năng và cũng có thể tạo ra một cơ thể hoàn
chỉnh [1].
b. Tế bào gốc vạn năng
- Tế bào gốc phôi
Cuối thập niên 20 được đánh dấu bằng sự bùng nổ của một hướng nghiên
cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào gốc, với khởi điểm là việc
James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) [18]. Các tế bào
gốc phôi là các tế bào đa năng có thể được phân lập từ khối tế bào bên trong của
tiền phôi. Tế bào gốc phôi đã nổi lên như một ứng cử viên hấp dẫn cho các liệu
pháp dựa trên tế bào có khả năng phục hồi chức năng tế bào và mô bị mất. Những tế
bào độc đáo này có thể tự làm mới vô thời hạn và có khả năng biệt hóa thành cả ba
lớp mầm phôi (lá trong, lá giữa, lá ngoài). Ba lá mầm phôi này là nguồn gốc của tất
cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên
của tế bào gốc phôi để điều trị chấn thương tủy sống và thoái hóa điểm vàng trong
năm 2010 đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong y học tái tạo [40].
Tuy nhiên nghiên cứu này châm ngòi cho cuộc tranh luận về vấn đề đạo đức khi
nguồn sử dụng là phôi người.
Tế bào gốc phôi khi tiêm vào vị trí tổn thương có khả năng hình thành nên
khối u quái (teratomas) tại vị trí tiêm. Do đó tế bào gốc cần được định hướng biệt

17. 7
hóa thành các tế bào mong muốn trước khi được tiêm vào vị trí tổn thương. Hiện
nay có một số kỹ thuật được dùng để kiểm soát sự biệt hóa tế bào gốc trên nuôi cấy
thực nghiệm, ví dụ: thay đổi thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy, tác động
vào bề mặt của đĩa nuôi cấy (tạo các giá thể), hay gài các gen đặc hiệu vào những tế
bào này.
- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng
Vào năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành
của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều
này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình. Gurdon đã
phát hiện rằng có thể đảo ngược sự chuyên môn hóa của các tế bào. Trong một thí
nghiệm cổ điển, ông đã thay thế nhân tế bào chưa trưởng thành trong tế bào trứng
của ếch bằng nhân từ tế bào ruột trưởng thành. Tế bào trứng biến đổi này phát triển
thành một con nòng nọc bình thường. Kết quả thí nghiệm này chứng minh rằng
DNA của tế bào trưởng thành mang thông tin cần thiết để phát triển thành tất cả các
tế bào trong ếch và nguyên sinh chất của tế bào trứng chứa các tác nhân cảm ứng
quá trình phát triển đảo ngược từ tế bào trưởng thành [19].
Phát hiện mang tính bước ngoặt của Gurdon ban đầu bị hoài nghi nhưng đã
được chấp nhận khi các nhà khoa học khác xác nhận, dẫn tới khởi xướng nghiên
cứu mạnh mẽ và kỹ thuật này đã được phát triển hơn nữa, cuối cùng dẫn đến việc
nhân bản của động vật có vú. Nghiên cứu của Gurdon đã cho thấy hạt nhân của một
tế bào trưởng thành, chuyên biệt có thể được đưa trở lại trạng thái đa năng, chưa
trưởng thành. Nhưng thí nghiệm của ông liên quan đến việc loại bỏ nhân tế bào, sau
đó là việc đưa chúng vào các tế bào khác. Liệu có thể biến một tế bào nguyên vẹn
trở lại thành tế bào gốc đa năng không?
Shinya Yamanaka đã trả lời câu hỏi này trong một bước đột phá khoa học 40
năm sau phát hiện của Gurdon. Năm 2006 Shinya Yamanaka đã sử dụng các vector
retrovirus để biểu hiện rất nhiều yếu tố phiên mã, đơn lẻ và kết hợp, trong nguyên
bào sợi (fibroblasts) của chuột trong điều kiện nuôi cấy. Đáng lưu ý là ông đã phát
hiện ra rằng cả tế bào người và chuột có thể được lập trình lại về trạng thái vạn

18. 8
năng, được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng, tương tự như tế bào gốc phôi, sau
khi xâm nhiễm (transduction) bằng retrovirus chỉ mã hóa 4 yếu tố : KLF4, SOX2,
OCT4, và c-MYC [13]. Ngoài ra, James Thomson báo cáo rằng tổ hợp các yếu tố
khác (OCT4, SOX2, NANOG và LIN28) có khả năng tái lập trình các tế bào sinh
dưỡng của con người thành iPSC [28].
Các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới đã nhanh chóng sử dụng kỹ thuật
mang tính cách mạng này và đến năm 2009, chỉ sau 3 năm khi Yamanaka tạo thành
công iPSC, khoảng 300 bài báo về iPSC được xuất bản [15].
Giải Nobel về Y Sinh học năm 2012 đã vinh danh 2 nhà khoa học Gurdon và
Yamanaka với công trình tạo ra iPSC. Đến năm 2007, hai nhóm nghiên cứu độc lập
đã tạo ra iPSC từ nguyên bào sợi của người [28], [32]. Việc phát hiện ra công nghệ
tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mở ra những cơ hội chưa từng có trong y học tái
tạo, mô hình bệnh và khám phá thuốc [7].
Đối với mô hình bệnh, tế bào sinh dưỡng sở hữu đặc điểm của các tế bào bị
bệnh từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra iPSC và được tiếp tục sử dụng để nghiên
cứu các bệnh [7]. Các tế bào sinh dưỡng từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra các
iPSC. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này có thể được sửa chữa bằng liệu pháp gen
và tiếp tục được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng khỏe mạnh được cấy ghép
cho bệnh nhân, hoặc chúng có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng
chưa được chỉnh sửa để mô hình hóa bệnh hoặc sàng lọc thuốc [7]. Ví dụ, vào năm
2012, các tế bào gốc thần kinh được tạo ra từ những người mắc bệnh Familial
dysautonomia - một rối loạn di truyền hiếm gặp, ảnh hưởng đến các dòng tế bào
thần kinh, phát triển tế bào thần kinh đã được sử dụng để sàng lọc gần 7000 phân tử
nhỏ và xác định phân tử nhỏ sử dụng mô hình bệnh dựa trên iPSC có thể xác định
thuốc bổ trợ để can thiệp điều trị bệnh Familial dysautonomia [9]. Các nghiên cứu
phát triển thuốc trong đó gồm sàng lọc các phân tử nhỏ, kiểm tra độc tính để đánh
giá sự an toàn, đã khai thác thành công dựa trên kỹ thuật iPSC [7]. Công nghệ
này đã mở ra một trang sử mới đối với các liệu pháp tế bào gốc sử dụng tế bào
gốc vạn năng cảm ứng trên người (human induced pluripotent stem cell- hiPSC)

19. 9
của chính bệnh nhân do tránh được nguy cơ đào thải miễn dịch cũng như các vấn
đề đạo đức đi kèm với việc sử dụng tế bào gốc phôi [45].
Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và
khám phá thuốc
Năm 2014, Nhật Bản lần đầu tiên sử dụng các tế bào biểu mô sắc tố võng
mạc có nguồn gốc iPSC để điều trị thoái hóa điểm vàng [15]. Năm 2019, tại Nhật
Bản đã thử nghiệm liệu pháp iPSC cho chấn thương tủy sống. Liệu pháp này thu tế
bào đã biệt hóa từ bệnh nhân và tái lập trình chúng thành tế bào thần kinh thông qua
tế bào gốc vạn năng cảm ứng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ tiêm 2 triệu tế bào vào
vị trí tổn thương của mỗi bệnh nhân [53]. Hiện tại, có một nhu cầu được công nhận
để đảm bảo an toàn cho bất kỳ liệu pháp có nguồn gốc iPSC nào và cần phải xác
minh một cách có hệ thống các đặc điểm và sự an toàn của các dòng, bằng cách

20. 10
kiểm tra bộ gen và biểu hiện của gen [54]. Ví dụ, nghiên cứu của Bhutani và cộng
sự năm 2006 lần đầu tiên đánh giá sự an toàn của ba phương pháp tái lập trình phổ
biến (retroviral vector, non-integrating Sendai virus, synthetic mRNAs). Ưu điểm
quan trọng nhất của iPSC so với ESC là khả năng sử dụng tế bào sinh dưỡng trưởng
thành từ những bệnh nhân mắc bệnh do di truyền xác định [23],[6]. So sánh tế bào
gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng
Tế bào gốc vạn năng
Tế bào gốc phôi Tế bào gốc vạn năng cảm ứng
Nguồn thu nhận Phôi thai Tế bào sinh dưỡng
Vấn đề đạo đức Có Không
Tốc độ tăng sinh Cao Cao
Tính tiện dụng Cao Cao
Khả năng tự biệt hóa Có Có
Khả năng tạo dòng tế bào khác Cao Cao
Khả năng gây đào thải miễn dịch Có Không
c. Tế bào gốc đa năng
Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là những tế bào có khả năng biệt hóa thành
nhiều loại tế bào của cơ thể. Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có
liên quan mật thiết. Ví dụ như tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào
xương, sụn, mỡ. Các tế bào gốc đa năng có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
như mô mỡ, cuống rốn, tủy xương, tủy răng sữa,…
Mặc dù có giới hạn về khả năng biệt hóa, nhưng gần đây, loại tế bào này
cũng đã được y sinh học tập trung khai thác, và qua đó đã được ứng dụng rất thành
công trong nhiều liệu pháp dựa vào tế bào gốc (stem cell therapy). Tế bào gốc
trưởng thành có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào có chức năng khác
như thế bào gan, biểu bì, xương, giác mạc. Những tế bào này có thể rất hữu ích

21. 11
trong việc sửa chữa mô, cơ quan bị tổn thương một cách trực tiếp cho chính bệnh
nhân [1].
Các chức năng chính của tế bào gốc đa năng:
 Có mặt với số lượng nhỏ trong các mô chuyên biệt
 Chức năng chính là bổ sung các tế bào bị hư hỏng
 Vẫn hoạt động cho đến khi chúng nhận thấy tín hiệu để phân biệt thành
các các loại tế bào cụ thể
d. Tế bào gốc đơn năng
Tế bào gốc đơn năng còn được gọi là tế bào gốc định hướng đơn dòng hay tế
bào đầu dòng (progenitor cells) là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo
một dòng. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều tổ
chức đã biệt hóa thành một dòng tế bào. Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép
duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng
các tế bào phôi mới.
Tóm lại, theo tiềm năng biệt hóa, tế bào gốc được phân loại thành 4 loại, và
được tóm tắt tại bảng 2.1.
Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa
Tên gọi Số tế bào biệt hóa Ví dụ
Số kiểu tế bào
biệt hóa
Toàn năng
(Totipotent)
Tất cả
Hợp tử (trứng
được thụ tinh)
Tất cả những tế
bào trong cơ thể
Vạn năng
(Pluripotent)
Tất cả, trừ tế bào
màng phôi
Những tế bào thu
nhận từ lớp ICM
Những tế bào thu
nhận từ ba lớp
phôi
Đa năng
(Multipotent)
Nhiều
Tế bào gốc
tạo máu
Tất cả tế bào máu
Đơn năng
(Unipotent)
Một
Tiền thân dưỡng
bào (Mast cell
precursor)
Dưỡng bào

22. 12
2.2. Các nhân tố tái lập trình
2.2.1. OCT4
Miền protein của OCT4 được trình bày ở hình 2.4.
Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4
OCT4 (yếu tố phiên mã gắn với octamer 4) còn được gọi là POU5F1, là một
nhân tố phiên mã thuộc họ POU (POU trancription factor family), lớp 5, yếu tố
phiên mã 1, thuộc họ protein liên kết DNA POU (Pit, Oct, Unc). OCT4 nằm trên
NST số 6 ở người (6p21.33), gene dài 6.4 kbp. OCT4 chứa một trình tự nhận diện
octamer (8bp) được thấy trong promoter và enhancer của nhiều gen chuyên biệt và
biểu hiện thường xuyên [24]. OCT4 dường như chỉ biểu hiện ở các dòng tế bào vạn
năng [50]. OCT4 biểu hiện trong phôi chuột ở các giai đoạn phôi sớm từ 4-8 tế bào,
đến khi “ngoại phôi bì” bắt đầu biệt hóa. Phôi chuột đột biến OCT4 sẽ chết sau khi
làm tổ bởi thiếu khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) [24] và phôi này chỉ
có duy nhất một tế bào là tế bào túi phôi (trophoblast).
Tế bào gốc phôi ở chuột (mouse embryonic stem cell - mESC) bị giảm biểu
hiện của OCT4 sẽ biệt hóa thành tế bào túi phôi [16] và nếu gia tăng sự biểu hiện
của OCT4 trong mESC có thể làm các tế bào này biệt hóa. Có thể OCT4 ức chế biệt
hóa thành tế bào túi phôi và hoạt động cùng các nhân tố phiên mã khác hay các yếu
tố đồng điều hòa (co-regulator), và tỷ lệ giữa nồng độ của các nhân tố đó sẽ quyết
định số phận của tế bào [1]. Vai trò của OCT4 trong sự duy trì tính đa năng của tế
bào gốc phôi người (human embryonic stem cell - hESC) giống với vai trò của nó
trong mESC. Sự phiên mã OCT4 bị hạn chế ở tế bào gốc phôi và trong tế bào vạn
năng invitro. Sự biểu hiện ở mức độ thấp các marker OCT4 đã được phát hiện trong
nhiều dòng tế bào ngoại bì hay ngoại bì thần kinh (octoderm/neurooctoderm) cả ở
invitro và invivo. Thí nghiệm trên chuột loại bỏ gen OCT4 cho thấy, OCT4 giữ vai
trò quyết định trong sự thiết lập tính đồng nhất của tế bào gốc vạn năng [26].

23. 13
Hai tiểu phần của OCT4 được tổng hợp bằng cách cắt nối thay thế
(alternative splicing) Pou5f1 mRNA. Hai tiểu phần, OCT4-IA và OCT4-IB có kích
thước lần lượt là 360 và 265 axit amin, trong đó có 225 axit amin tại đầu C giống
hệt nhau, khác nhau về trình tự ở đầu N. OCT4-IA phải đạt đến ngưỡng nhất định
để duy trì khả năng tự đổi mới và toàn năng của tế bào gốc, OCT4-IB đã được
chứng minh không liên quan đến việc này. Trong cơ thể, mRNA của OCT4 có măt
trong các giai đoạn phôi sớm, từ noãn bào chưa được thụ tinh cho đến hình thái
chưa hoàn chỉnh (uncompacted morula). OCT4 có vai trò quyết định sự phân cực
của hợp tử bằng cách cùng với yếu tố phiên mã SOX2, KLF4 tạo thành phức hợp ba
trên DNA điều khiển sự biểu hiện của một số gene liên quan đến phát triển phôi như
YES1, FGF4, UTF1 và ZFP [24].
Cách hoạt hóa của các gen mục tiêu OCT4 và duy trì tính đa năng vẫn
chưa rõ. Bằng cách kết hợp với yếu tố đồng điều hòa khác, OCT4 có thể hoạt
động vừa như một nhân tố hoạt hóa phiên mã, vừa như một nhân tố ức chế phiên
mã.
2.2.2. SOX2
Miền protein của SOX2 được trình bày ở hình 2.5.
Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2
SOX2 là thành viên họ gen SOX (box HMG liên quan đến SRY), mã hóa
nhân tố phiên mã với một miền gắn DNA HMG đơn (singer high mobility group
DNA-binding domain), có vị trí 3q26.33 trên nhiễm sắc thể số 3 cánh q băng 26.33,
nằm ở sợi dương, kích thước gene 2513 bp và 317 axit amin [17], [30].
Giống với OCT4, SOX2 biểu hiện trong các tế bào đa năng của phôi chuột
trong giai đoạn phôi sớm, ICM, ngoại phôi bì và tế bào mầm sinh dục. Nhưng khác
với OCT4, SOX2 cũng biểu hiện trong nhiều tế bào ngoại bì và phôi, và trong các tế
bào tiền thân thần kinh, và quan trọng cho sự duy trì tính đồng nhất của chúng. Sự

24. 14
biểu hiện giảm của SOX2 liên quan đến quá trình biệt hóa. Phôi chuột loại bỏ gen
SOX2 sống bình thường ở giai đoạn phôi nang, nhưng chết nhanh sau khi phôi làm
tổ. Các phôi này thiếu cấu trúc xi lanh trứng (egg cylinder) và thiếu các tế bào biểu
mô. Khi nuôi cấy in vitro để thiết lập dòng gốc phôi, phôi nang loại bỏ gen SOX2
phát triển bình thường vào ngày đầu, nhưng sau đó biệt hóa thành tế bào tế bào túi
phôi (trophectoderm) và tế bào nội mô vách. Vai trò in vitro của SOX2 là duy trì
quần thể tế bào đa năng ở giai đoạn sớm của phôi [1].
Các phôi sớm biểu hiện ở mức cao các protein SOX2 có nguồn gốc từ mẹ.
Ngay trong chuột loại bỏ gen SOX2, các protein SOX2 từ mẹ vẫn được duy trì cho
đến giai đoạn phôi nang. Do đó, nguyên nhân mà các phôi đột biến vẫn sống sót đến
khi làm tổ có thể là do mức biểu hiện hiệu quả của SOX2 có nguồn gốc từ bố mẹ
đến giai đoạn đó.
Do vậy, có thể SOX2 không cần thiết cho sự duy trì hay tạo ra tính đa năng
trong các giai đoạn phôi sớm, nhưng không thể được phát hiện trong chuột bị loại
bỏ bởi vì sự hiện diện của SOX2 có nguồn gốc từ mẹ. Hơn nữa, SOX2 có vai trò
trong sự suy trì của các tế bào tế bào túi phôi [1].
2.2.3. KLF4
Miền protein KLF4 được trình bày ở hình 2.6.
Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4

25. 15
KLF4 mã hóa một loại protein thuộc họ yếu tố phiên mã Kruppel. Protein
ngón tay kẽm (zinc finger protein) được mã hóa là cần thiết cho sự phát triển
bình thường của chức năng bảo vệ cơ học của da, có vị trí 9q31.2, nhiễm sắc thể
số 9 cánh q băng số 31.2, có kích thước gene 5,631 bp, 513 axit amin và nằm ở
sợi âm.
Protein KLF4 kiểm soát quá trình chuyển đổi từ pha G1 sang pha S của chu
trình tế bào sau tổn thương DNA bằng cách làm trung gian gen ức chế khối u
p53. Chuột thiếu gen này có ngoại hình bình thường nhưng giảm cân nhanh chóng
và chết ngay sau khi sinh do bốc hơi chất lỏng do chức năng hàng rào biểu bì bị tổn
thương [29].
KLF4 có miền kích hoạt phiên mã đầu N, tiếp theo là miền ức chế phiên mã,
chứa hai gốc lysine K225 và K229. Các gốc này được acetyl hóa bởi p300/CBP,
tương tác với miền kích hoạt. Có một chuỗi PEST tiềm năng giữa các miền kích
hoạt. Đầu C có một miền liên kết DNA chứa ba ngón tay kẽm, nhận biết và liên kết
với các chuỗi mục tiêu của GC/CACCC trong nhân. Tín hiệu hướng nhân (Nuclear
Localization Signal - NLS) (6 aa) nằm giữa các miền liên kết và ức chế DNA, tạo
điều kiện cho việc vận chuyển KLF4 vào hạt nhân [14].
2.2.4. MYC
Cấu trúc miền protein của gen MYC được trình bày ở hình 2.7.
Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC
Họ MYC của các yếu tố sao chép dây kéo xoắn ốc xoắn ốc cơ bản bao gồm
MYC, MYCN và MYCL [21]. MYC (homelocytomatosis virus oncogene homolog)
đại diện cho một trong những mục tiêu thuốc được tìm kiếm nhiều nhất trong ung

26. 16
thư. Yếu tố phiên mã MYC là một yếu tố điều hòa thiết yếu cho sự phát triển của tế
bào, nhưng trong hầu hết các bệnh ung thư, nó được biểu hiện quá mức và liên quan
đến kết quả kháng trị và kháng thuốc. Gen MYC dài khoảng 6 kb, được tìm thấy tại
locus 8q24,21 trên nhiễm sắc thể 8 và có 439 axit amin. MYC chứa ba exon – exon
1 có kích thước lớn và không được dịch mã, tiếp theo là exon mã hóa 2 và 3, bốn
trình khởi động riêng biệt - P0, P1, P2 và P3 - điều khiển phiên mã MYC, hai bộ ba
mở đầu là (CTG và ATG), từ đó phát sinh hai protein MYC được biểu hiện [34].
Yếu tố phiên mã này kiểm soát sự biểu hiện của hàng trăm gen mục tiêu,
nhiều trong số đó cũng là gen gây ung thư hoặc ức chế khối u và có vai trò trong sự
tăng sinh tế bào và chu kỳ tế bào [9].
2.2.5. LIN28
Miền protein của LIN28 được trình bày ở hình 2.8.
Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28
LIN28 là protein liên kết với RNA có vai trò thúc đẩy tính đa năng thông qua
sự điều tiết của microRNA let-7 [25]. Ở động vật có vú, có hai loại gen LIN28 là
LIN28A và LIN28B. Các gen LIN28A và LIN28B của con người có 209 và 250
axit amin [20]. LIN28 nằm ở vị trí 1p36.11 có kích thước 18,951 bp và nằm ở sợi
dương [13]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LIN28A là một yếu tố đa năng của tế bào
gốc. Sử dụng OCT4, SOX2, NANOG và LIN28A, các nguyên bào sợi ở người
trưởng thành đã được tái lập trình lại thành công thành các tế bào gốc đa năng cảm

27. 17
ứng [14]. Đáng chú ý, ba trong số bốn yếu tố Yamanaka sử dụng để tái lập trình có
LIN28 [22].
2.2.6. GLIS1
Miền protein của GLIS1 được trình bày ở hình 2.9.
Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1
GLIS1 kết hợp với một số yếu tố tái lập trình khác, đã được chứng minh là
làm tăng đáng kể hiệu quả của việc tạo ra các tế bào gốc vạn năng cảm ứng từ các tế
bào sinh dưỡng [7]. GLIS1 có vị trí 1p32.3, kích thước 231 874 bp, 620 axit amin
và nằm trên sợi âm [11]. Sự biểu hiện quá mức ban đầu của OCT3/4 (POU5F1),
SOX2 và KLF4 (OSK) được sử dụng rộng rãi để tái lập trình các tế bào sinh dưỡng
thành iPSC. Tuy nhiên, hiệu quả của việc tạo ra iPSC rất thấp, điều này được cho là
do những khó khăn trong việc vượt qua các rào cản biểu sinh trong tế bào khởi đầu.
Sự biểu hiện của C-MYC làm tăng hiệu quả, nhưng cũng tăng cường khả năng gây
khối u tiềm tàng của các tế bào biệt hóa có nguồn gốc iPSC. GLIS1 làm tăng đáng
kể số lượng khuẩn lạc iPSC được tạo ra khi được biểu hiện với OSK (gọi là OSKG)
trong nguyên bào sợi của người hoặc chuột [39]. Ngược lại, giảm biểu
hiện GLIS1 bằng shRNA (short hairpin RNA) làm giảm hiệu suất tạo ra các khuẩn
lạc iPSC do OSK gây ra trong các nguyên bào sợi chuột, cho thấy GLIS1 nội sinh
có thể thúc đẩy quá trình tái lập trình qua trung gian OSK. Hơn nữa, cấy ghép gen
OSKG iPSC dưới da đã hình thành các khối u có chứa các tế bào biệt hóa từ cả ba
lớp mầm. Những dữ liệu này đã chứng minh rằng GLIS1 hoạt động như một công
cụ thúc đẩy mạnh mẽ việc lập trình lại tế bào sinh dưỡng. Hơn nữa GLIS1 được tinh
chế cùng với OCT3/4, SOX2 và KLF4 cho thấy rằng nó là một phần của phức hợp
lớn hơn của các protein này [7].
Sự gia tăng hiệu quả lập trình bởi GLIS1 cũng được thể hiện bởi
Yoshioka và cộng sự khi ông sử dụng một số thí nghiệm khác nhau để tạo ra iPSC
sử dụng virus RNA viêm não ngựa ở Venezuela (Venezuelan equine encephalitis)

28. 18
đã biểu hiện OCT4, SOX2, KLF4 và GLIS1 (OSKG) [42]. Các nghiên cứu gần đây
đã chứng minh rằng GLIS1 biểu hiện trong một số quần thể tế bào gốc và tế bào
tiền thân, cho thấy vai trò có thể có của các protein này trong việc điều hòa duy trì,
biệt hóa hoặc tự đổi mới của các tế bào này [7].
2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC
Hiện nay, rất nhiều loại tế bào đã được sử dụng để tạo dòng iPSC thành
công [9]. Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình như: tế bào đơn nhân máu ngoại
vi (Peripheral blood mononuclear cell - PBMC), nguyên bào sợi (Fibroblast), tế bào
gốc trung mô (Mesenchymal stem cell), tế bào gốc tủy răng sữa (Dental pulp stem
cells), tế bào gốc dây rốn (Cord blood cells), tế bào gan (hepatocytes), tế bào nước
ối (Amniotic fluid cells), tế bào mầm sinh dục (Germline stem cell).
Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình tế bào gốc vạn năng cảm ứng được
thể hiện tại hình 2.10.
Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC
Có nhiều nguồn thu nhận tế bào gốc vạn năng cảm ứng như nguyên bào sợi,
máu cuống rốn, máu ngoại vi. Nguyên bào sợi là một nguồn chủ yếu để tạo tế bào
gốc vạn năng cảm ứng với khả năng tăng sinh qua nhiều lần cấy chuyển trong nuôi
cấy, và khả năng tiếp nhận hiệu quả các virus biểu hiện tổ hợp các yếu tố phiên mã
cho tái lập trình [8]. Tuy nhiên, nguyên bào sợi sinh thiết từ da đòi hỏi các thủ thuật
xâm lấn, tốn nhiều công sức và lấy đủ số lượng tế bào để tái lập trình cần có thời

29. 19
gian. Ngoài ra, khả năng tạo iPSC từ da có tương quan nghịch với tuổi của người
hiến tặng do khả năng gây đột biến bên ngoài lớp da [12].
Cuống rốn là một bộ phận giúp cung cấp dinh dưỡng nuôi thai nhờ sự kết nối
thai nhi với nhau thai trong tử cung người mẹ. Máu cuống rốn là máu được lấy từ
cuống rốn và nhau thai sau khi sinh con và cắt rốn. Trước đây, cuống rốn và nhau
thai thường được bỏ đi sau mỗi ca sinh nở như một loại rác thải y tế. Tuy nhiên,
thực tế máu cuống rốn là nguồn cung cấp dồi dào tế bào gốc tạo máu. Lấy máu
cuống rốn được xem là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không gây đau cho cả mẹ
và bé, có thể áp dụng cho cả sinh mổ và sinh thường. Trong máu cuống rốn chứa
một lượng lớn tế bào gốc tạo máu có khả năng tái tạo các tế bào máu và tăng cường
hệ miễn dịch cho cơ thể.
Việc tái lập trình các tế bào CD34+
trong máu cuống rốn thành các tế bào gốc
vạn năng cảm ứng có các ứng dụng tiềm năng trong y học tái tạo bằng cách chuyển
đổi các ngân hàng máu cuống rốn thành ngân hàng iPSC để điều trị thay thế tế bào
dị ghép [49]. Tế bào CD34+
từ máu ngoại vi cũng đã tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm
ứng [49]
Một trong những dấu hiệu để nhận biết tế bào tạo máu (hematopoietic) là
protein bám màng (marker) - CD34. Nhiều dòng iPSC ở người được tạo ra từ máu
dây rốn đông lạnh từ tế bào CD34+
của các bệnh nhân khỏe mạnh và có thể được
chuyển hướng đến biệt hóa tạo máu [52]. CD34 được biểu hiện trên bề mặt tế bào
tủy xương ở người từ 1-5%, máu cuống rốn là ~1% và <0,1% từ máu ngoại vi [55].
Mặc dù CD34 được biểu hiện với cường độ cao ở tế bào tủy xương, nhưng việc lấy
tế bào gốc tủy xương cần thủ thuật xâm lấn gây ra những tác dụng phụ không mong
muốn cho bệnh nhân, vì thế trong thí nghiệm này tôi đã sử dụng tế bào CD34 được
phân lập từ máu cuống rốn.
Tế bào sinh dưỡng phải được biểu hiện các gene của tế bào gốc để tạo thành
iPSC. Hiện nay có nhiều biện pháp khác nhau để tế bào biểu hiện những gene mong
muốn như: lentivirus, excisable lentivirus, RNA, transposon, episomal vector, các
phân tử nhỏ (Small molecule, ví dụ: mi RNA), Protein. Lentivirus chèn vào hệ gene

30. 20
của tế bào nhận vì thế iPSC rất dễ bị thay đổi kiểu nhân, và lo ngại gây ra khối u khi
sử dụng iPSC trong liệu pháp tế bào. Tạo iPSC bằng protein có độ an toàn rất cao
nhưng hiệu quả lại thấp. Sử dụng mRNA có tính an toàn cao nhưng cần nhiều thời
gian để thao tác và hiệu suất thành công không cao. Episomal vector là một phương
pháp chuyển gene mà không chèn vào hệ gene của tế bào đích. Episomal vector là
vector DNA tồn tại trong nhân tế bào và có khả năng tự tái bản độc lập với DNA
của tế bào đích [41]. Các yếu tố tái lập trình có thể chuyển vào tế bào sinh dưỡng
bằng cách sử dụng episomal vector như plasmid hoặc DNA nhỏ dạng vòng
(minicircle DNA). Không như retrovirus và lentivirus, phương pháp này đơn giản
hơn, dễ tiến hành và gây biến đổi hệ gene của tế bào đích. Bên cạnh đó, RNA,
transposon, các phân tử nhỏ (Small molecule) là các phương pháp tạo iPSC mà
không tác động đến hệ gene của tế bào chủ nhưng lại có những nhược điểm như:
thời gian tiến hành thí nghiệm lâu hơn, hiệu suất thấp hơn, tỉ lệ thành công không
cao, chi phí đắt [51]. Chính vì thế chúng tôi đã sử dụng Episomal vector với tính an
toàn cao, giá thành rẻ, hiệu quả tốt và thời gian thao tác thí nghiệm nhanh [3]. Tuy
nhiên, biểu hiện của episomal không kéo dài, nên hiệu quả tái lập trình của nó thấp
khi so sánh với minicircle DNA.
Các phương pháp biểu hiện gen được trình bày ở hình 2.11.
Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình

31. 21
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tế bào gốc tạo máu CD34 (80% tinh sạch) trữ đông thu từ máu cuống rốn
được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec.
3.1.2. Địa điểm và thời gian
Địa điểm: Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec Time City
– Hà Nội
Thời gian thực hiện: 01/01/2019 – 31/5/2019.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nhận vector tái lập trình
- Nuôi cấy tế bào gốc tạo máu của người
- Biểu hiện hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT3/4, SOX2, KLF4,
L-MYC, LIN28, L-MYC, GLIS1 trên tế bào gốc tạo máu
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Vật liệu
3.3.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng
imMediaTM
Amp Blue for
lacZ+
AmpR
recombinant E.
coli strains
InvitrogenTM
life
technologies
Môi trường nuôi cấy chọn lọc
E. coli
imMediaTM
Amp Liquid for
AmpR
recombinant E. coli
strains
InvitrogenTM
life
technologies
Môi trường nuôi cấy tăng sinh
E. coli
QiAprepR
Spin Miniprep Kit QIAGEN Tinh sạch DNA
RedSafeTM
Nucleic Acid iNtRON Thuốc nhuộm DNA

32. 22
Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng
Staining Solution Biotechnology
10X FastDigest Green Buffer Themo Scientific DNA Loading dye
GeneRuler 1kb DNA Ladder Themo Scientific Thang DNA cho điện di
Agarose InvitrogenTM
life
technologies
Gel chạy điện di phân tích
DNA
TBE 0,5X Việt Nam Đệm cho chạy điện di
Isopropanol Emsure Tủa DNA trong quá trình phân
tách
Cồn 70 Việt Nam Khử trùng các dụng cụ thí
nghiệm
Tripan blue solution Gigma Life Science Dung dịch nhuộm để đếm tế
bào
Stem Kit Reagents Beckman coulter Xác định tỷ lệ tế bào CD34+
sau khi nuôi tăng sinh
7-AAD Beckman coulter Phân biệt tế bào sống chết
trong chạy flow cytometry
iPS Brew XF 50X
Supplement
Stem MACSTM
Các thành phần dinh dưỡng bổ
sung cho môi trường nuôi cấy
iPS Brew XF Stem MACSTM
Môi trường cơ bản để nuôi cấy
tế bào sau chuyển gene
Nuclease Free Water Themo Scientific Nước cất không chứa nuclease
sử dụng cho sinh học phân tử
QiAprepR
Spin Maxiprep Kit QIAGEN Kit tinh sạch DNA plasmid từ
vi khuẩn
Power SYBR™ Green PCR
Master Mix
Themo Scientific qRT-PCR kit sử dụng để xác
định biểu hiện của các gene tái
lập trình

33. 23
3.3.1.2. Thiết bị
Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị
Hãng sản
xuất
Công dụng
Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco, Mỹ Bảo vệ mẫu tế bào nuôi cấy khỏi các tác
nhân gây nhiễm
Tủ nuôi cấy tế bào Thermo
Scientific
Cung cấp nhiệt độ, nồng độ CO2 phù
hợp cho tế bào tăng sinh
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Quan sát tế bào trong quá trình nuôi cấy
Bể ổ nhiệt Memmert Rã đông hoặc làm ấm mẫu và môi
trường nuôi cấy
Pipet man Eppendorf Hút xả chất lỏng với thể tích xác định
Máy li tâm lạnh loại nhỏ Eppendorf Tách hỗn hợp hai pha rắn - lỏng hoặc
lỏng - lỏng thành các phần riêng biệt.
Vortex Eppendorf Trộn đều mẫu, hóa chất thí nghiệm
Máy lắc nhiệt nuôi vi
khuẩn
Thermo
Scientific
Nuôi tăng sinh vi khuẩn.
BD FACS Canto II: Flow
Cytometer
BD Xác định kích thước, độ hạt và các
kháng nguyên biểu hiện trên bề mặt tế
bào
Máy đo nồng độ
Nanodrop 2000
Thermo
Scientific
Xác định nồng độ và độ tinh sạch của
nucleic acid
Máy chuyển gen 4D X-
unit
Lonza Chuyển plasmid mang gen tái lập trình
vào tế bào đích
Máy li tâm lạnh loại nhỏ Beckman
Coulter
Sử dụng trong quá trình phân tách và
tinh sạch DNA, RNA
Máy điện di ngang Optima Kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch
Lò vi sóng Sharp Pha gel chứa agar sử dụng cho nuôi cấy
vi khuẩn
Nồi hấp khử trùng
Autoclave
Daihan Khử trùng, tiệt trùng dụng cụ thí
nghiệm.
Tủ sấy dụng cụ Memmert Sấy dụng cụ làm thí nghiệm sau khi khử
trùng hơi nước
Tủ lạnh 40
và -200
Toshiba Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm.
Tủ -800
Sanyo Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm.
Cân điện tử HR200 A&D Cân hóa chất có độ chính xác 0,001g trở
lên.
Máy soi gel Bio rad Phát hiện DNA dưới tia UV.
Máy 7500 Real time PCR
System
Thermo
Scientific
Xác định các biểu hiện của các gen tái
lập trình
PCR Proflex 3 block Thermo
Scientific
Tổng hợp cDNA cho phản ứng
Realtime PCR

34. 24
3.3.1.3.Dụng cụ vật tư tiêu hao
Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm
Tên Hãng sản xuất Công dụng
Micropipette loại 10μl, 20μl, 100μl,
200μl, 1000μl
Corning Hút, trộn đều dung dịch
Ống ly tâm 50 ml Corning Chứa tế bào, môi trường
nuôi cấy, hóa chất trong các
thí nghiệm
Ống ly tâm 15 ml Corning
Ống Eppendorf 2 ml Corning
Buồng đếm tế bào Incyto Đếm số lượng tế bào
Serological pipette 5 ml Thermo Fisher
Hút dung dịch
Serological pipette 10 ml Thermo Fisher
Serological pipette 25 ml Thermo Fisher
Gạc sạch/ giấy sạch Bảo Thạch Vệ sinh dụng cụ và khu vực
thí nghiệm bằng cồn 70
Ống 5 ml chạy Flow cytometry BD Science Đựng tế bào để chạy flow
cytometry
Que cấy trải vô trùng Sarstedt Cấy E. coli lên đĩa thạch
Đĩa peptri Biologix Đĩa nuôi cấy E. coli
Đĩa 6 giếng An Nhiên Đĩa nuôi cấy tế bào
Ống PCR 0.2 ml Bimetech Đựng phản ứng tổng hợp
cDNA
Dãy ống realtime PCR 0.2 ml Bimetech Đựng phản ứng realtime
PCR

35. 25
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài
3.3.2.2. Các phương pháp sử dụng trong đề tài
3.3.2.2.1 Tế bào gốc tạo máu CD34+
trữ đông thu từ máu cuống rốn của người
(CD34+
80%)
Tế bào CD34 trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (80% tế bào dương
tính với marker tế bào gốc tạo máu CD34+
sau khi tinh sạch bằng cột) được cung
cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec

36. 26
3.3.2.2.2. Rã đông và nuôi tăng sinh tế bào CD34+
a. Chuẩn bị:
Làm ấm môi trường cơ bản nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu
(StemSpan-ACF) và rã đông ống chứa hỗn hợp các cytokine bổ sung (StemSpan
CC110)
Tế bào gốc tạo máu trữ đông
Đĩa 6 giếng
b. Quy trình nuôi tăng sinh
- Pha môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách trộn đều StemSpan-ACF với
StemSpan CC110 với tỉ lệ phù hợp
- Cho 2 ml vào đĩa 6 giếng. Để vào tủ ấm.
- Lấy ống tế bào trữ đông ra khỏi tủ -800
C, làm ấm nhanh để dịch chứa tế bào
tan ra.
- Hút hết dịch tế bào cho vào ống falcon 15ml chứa môi trường đã ủ ấm
- Ly tâm falcon tế bào 400G/4 phút và đổ bỏ dịch nổi
- Hòa lại cặn tế bào trong 1ml môi trường và hút vào giếng có chứa môi
trường đã chuẩn bị sẵn
- Hút môi trường ở đĩa 6 giếng vào ống eppendorf 2 ml. Trộn nhẹ
- Cho vào đĩa 6 giếng/ lắc nhẹ sau đó để vào tủ ấm 370
, nồng độ CO2 5%.
c. Phương pháp thay môi trường tế bào
Trong quá trình nuôi tăng sinh tế bào, khi mật độ tế bào phủ trên đĩa nuôi cấy
70-80% (sau khoảng 24-48 giờ), môi trường cũ được thay bằng môi trường mới để
cung cấp dinh dưỡng cho tế bào phát triển.
Quy trình bổ sung môi trường trong quá trình nuôi cấy:
- Hút bỏ môi trường cũ.
- Thêm môi trường mới.
- Huyền phù và nuôi tiếp.
d. Phương pháp cấy chuyển tế bào

37. 27
Khi tế bào đạt mật độ 70-80% bề mặt diện tích bình nuôi, tế bào được cấy
chuyển để tạo không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh.
Quy trình cấy chuyển
- Hút hết môi trường cũ.
- Ly tâm 3000 vòng/ 5 phút loại môi trường.
- Huyền phù lại cặn tế bào trong môi trường mới và nuôi tiếp.
e. Phương pháp xác định tế bào sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue
- Hút 10 µl dung dịch tế bào, thêm vào 10 µl dung dịch Trypan Blue, trộn đều
bằng micropipette.
- Hút dịch đã trộn nạp vào buồng đếm hồng cầu.
- Đếm tế bào ở 4 vùng 16 ô ở 4 góc của buồng đếm, tính mật độ tế bào theo
công thức:
Số tế bào =
𝑠ố đế𝑚
4
x độ pha loãng x 104
3.3.2.2.3. Phân tích tỷ lệ tế bào CD34+
trong quần thể tế bào tăng sinh bằng
phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry)
“Cytometer” là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “κντοζ” nghĩa là cơ
thể (theo nghĩa hiện đại tức là tế bào), và “μετρον” mang nghĩa đo đạc. Phân tích tế
bào theo dòng chảy là một kỹ thuật phổ biến trong tế bào học dùng để đánh giá các
đặc điểm của tế bào như: đếm số lượng tế bào, đo kích thước, đánh giá độ phức tạp
bên trong tế bào, phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào khi được nhuộm
huỳnh quang. Khi dòng chảy đơn bào đi qua chùm laser, máy thu được hai loại ánh
sáng là tán xạ trước (forward scatter – FC) và ánh sáng tán xạ ngang (side scatter –
SC). FC dùng để xác định kích thước của tế bào; SC dùng để xác định độ phức tạp
bên trong tế bào và phát hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào qua ánh sáng
huỳnh quang [52].
Chuẩn bị:
Quy trình chuẩn bị ống và kháng thể chạy trong Flow cytometry:
- Tế bào được ly tâm 3000 G/5 phút thu cặn
- Huyền phù lại cặn tế bào trong 150 ul PBS

38. 28
- Bổ sung kháng thể
- Ủ tối 20 phút
- Bật máy phân tích dòng chảy tế bào
- Rửa lại máy bằng nước sạch
- Vontex ống trước khi đặt vào máy phân tích dòng chảy tế bào
- Chạy mẫu cần phân tích
Thiết kế thí nghiệm được trình bày bảng 3.4:
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry
Sau đó, kết quả được phân tích bằng phần mềm FlowJo.
3.3.2.2.4. Chuyển các vector chứa các nhân tố phiên mã cảm ứng tái lập trình vào
tế bào CD34+
bằng phương pháp Nucleofector
 Nhận vector từ Yamanaka (Nhật Bản)
Hai vector pCEB-hUL-G và pECB-hSK-O đã được thử nghiệm lâm sàng trên
bệnh thoái hóa điểm vàng do tuổi tác [51], chính vì thế mà nhóm nghiên cứu của
chúng tôi đã liên hệ với Yamanaka để mua 2 vector trên.
Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình
Ống 1
(ống đối chứng)
Ống 2
(CD45/CD34)
Ống 3
(CD45/IsoClonic
Control - PE)
CD45-FITC/CD34-PE X 10 ul X
CD45-FICT/IsoClonic
Control-PE
X
X
10 ul
7-AAD X 10 ul 10 ul
105
tế bào/ống 50 ul 50 ul 50 ul

39. 29
Các thành phần của vector pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O, vai trò và chức
năng của chúng được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O
Thành phần Mục đích
OriP Điểm khởi đầu sao chép
CAG
Promoter thúc đẩy mức độ biểu hiện gen cao trong các vector biểu
hiện
WPRE Vector WPRE làm tăng biểu hiện gen từ vector retroviral
CoIE1 ori Điểm khởi đầu sao chép có nguồn gốc từ vi khuẩn
Ampr Gene kháng kháng sinh
loxP
Thông qua việc định hướng của cặp loxP cho phép gen được kích
hoạt, trao đổi và ức chế các gen khác
pA
Đuôi polyA-bảo vệ m RNA khỏi tác dụng của nuclease trong tế bào
chất
EBNA-1
Protein liên kết trực tiếp với DNA và có một phần thì bám vào
chuỗi xoắn vòng xoắn của DNA
hGLIS1
Protein ngón tay kẽm (zinc finger protein) có chức năng như một
chất kích hoạt và ức chế phiên mã
hLin28 Yếu tố thúc đẩy tính đa năng
hL-MYC
Làm cho chất bị nhiễm sắc tạo ra để tạo thành các chỗ cho các
protein khác gắn vào
hSOX2 Phục hồi chức năng của tế bào, giúp cho tế bào bình thường biểu
hiện protein quan trọng cho tính gốc của tế bào, kích thích sự biểu
hiện của chính nó để tạo ra nhiều protein SOX2 và OCT3/4 hơn
OCT3/4
hKLF4 Kìm hãm sự chết có chương trình
a. Biến nạp
Có hai phương pháp để biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào khả biến đó là
xung điện và shock nhiệt. Xung điện có ưu điểm hơn shock nhiệt là có hiệu suất
biến nạp cao, tuy nhiên lại có nhược điểm làm chết nhiều tế bào. Tôi thực hiện quá trình
biến nạp plasmid dùng để tái lập trình vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt.
- Tế bào khả biến (Competent cell) ( 3 ống) ở tủ -80
cho vào khay đá
- Plasmid : PGEF (1 µg) vào ống tế bào khả biến (đối chứng)
SK- O (3 µg) vào ống tế bào khả biến

40. 30
UL- G (5 µg) vào ống tế bào khả biến
- Hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 420
/45 giây
- Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá
- Bổ sung 400 µg môi trường LB (không có kháng sinh). Hỗn hợp được nuôi
ở 370
/ lắc 170 vòng/phút trong vòng 1 giờ.
- Sử dụng que cấy trải vô trùng trải 200 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB
có agar (imMedia TM
Amp Liquid for AmpR
recombinant E. coli strains). Ủ đĩa
peptri ở 370
qua đêm.
Sau khi nuôi qua đêm ở 37 o
C, thu được khuẩn lạc. Chọn một khuẩn lạc phát
triển nhanh nhất để nuôi tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid.
b. Tách plasmid
Tiến hành tách chiết plasmid dựa trên nguyên lí của việc biến tính bằng kiềm
đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid
sau khi trung hòa dung dịch.
Cách tiến hành:
 Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR
Spin
Miniprep của QIAGEN.
- Ly tâm 6000 vòng/5 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 250 µl Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution
và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống
eppendorf mới.
- Bổ sung 300 µl vào mỗi ống eppendorf.
- Bổ sung 250 µl Buffer P2 vào mỗi ống, đảo ống 4-5 lần.
- Bổ sung 350 µl Buffer N3/ lắc nhẹ
- Ly tâm 15.000 vòng/10 phút/ 16 o
- Thu dịch nổi cho vào cột
- Ly tâm 15.000 vòng/1 phút/ loại dịch đi qua cột
- Lấy 2 ống epppendorf còn lại thu dịch nổi, bỏ tiếp lên 2 cột tương ứng
- Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó loại bỏ dịch đi qua cột

41. 31
- Bổ sung 750 µl Buffer PB. Ly tâm 15.000 vòng/1 phút. Đổ dịch qua cột
- Chuyển 2 cột sang 2 eppendorf sạch
- Cho 50 µl Elusion Buffer, để nhiệt độ phòng 5 phút
- Ly tâm 15.000 vòng/5 phút
- Bỏ cột, bổ sung 50 µl Elusion Buffer bảo quản 2 eppendorf chứa mẫu
 Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprepR
Spin
Maxiprep của hãng QIAGEN
- Ly tâm 6000 G/15 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 10 ml Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution
và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống
eppendorf mới.
- Bổ sung 10 ml Buffer P2, đảo ống 4-5 lần.
- Bổ sung 350 µl Buffer P3/ lắc nhẹ. Để ở tủ 4 o
/20 phút
- Ly tâm 11.000G/30 phút/ 4 o
Hút dịch trong
- Ly tâm 11.000G/30 phút/4 o
. Thu dịch nổi
- Cho 10 ml Buffer QBT vào cột để rửa cột
- Thu dịch nổi cho vào cột. Bỏ dịch, giữ lại cột
- Bổ sung 60 ml Buffer QC. Giữ cột, thay ống mới
- Bổ sung 15 ml Buffer QF
- Bổ sung 10,5 ml isopropanol. Trộn nhẹ
- Ly tâm 11.000 G/30 phút/ loại dịch đi qua cột
- Rửa bằng 5 ml cồn 70 o
. Ly tâm 11.000G/10 phút
- Bổ sung 500 µl Nuclease Free Water và bảo quản mẫu.
Phương pháp định tính, định lượng DNA
Phương pháp định lượng DNA bằng máy quang phổ.
Sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop 2000 để kiểm tra độ tinh sạch và nồng
độ DNA sau khi tách chiết ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm.
Nguyên lý: Máy kiểm tra độ tinh sạch NanoDrop 2000 hoạt động dựa vào sự
hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purine và

42. 32
pyrimidine. Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm của các mẫu đó cho phép
xác định nồng độ ADN trong các mẫu dựa vào mối tương quan sau:
- Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, đo giá trị OD ở bước
sóng 280. OD280 là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các
protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 như các phân tử acid nucleic do đó
có thể làm sai lệch giá trị nồng độ thật của acid nucleic.
- Để đảm bảo chính xác nồng độ CDNA người ta sử dụng giá trị A260/280.
Khi giá trị A260/280 =1,8 – 2,0 dịch chiết DNA được coi là tinh sạch [54].
Phương pháp điện di agarose.
Phương pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử
tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ
thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương pháp điện
di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ
gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực
dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể
sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
Chuẩn bị gel
- Cân 0,5 gam agarose cho vào 50 ml dung dịch TBE 0,5X, đun sôi trong lò vi
sóng sao cho agarose tan hoàn toàn.
- Để gel nguội đến 60 o
C, cho 2,5 µl Redsafe. Đổ hỗn hợp vào khuôn đã cài
sẵn lược và đợi cho gel đông lại.
- Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
- Đổ dung dịch đệm TBE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Tra mẫu điện di
- Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 2,5 µl mẫu, 1,5 µl ladder
1 µl Green Buffer
- Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 135 V trong 30 phút (khi vị trí
vạch màu chạy được khoảng 2/3 bản gel).

43. 33
- Kiểm tra gel bằng máy chụp ảnh gel Bio-Rad.
c. Phương pháp xung điện
Phương pháp xung điện hay còn được gọi là điện biến nạp (electroporation).
Phương pháp xung điện là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân
tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một
xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn
cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử
DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
Xung điện theo quy trình Lonza Nucleofector
- Chuẩn bị đĩa 6 giếng bằng cách đổ đầy số lượng giếng thích hợp với 1,5 ml
môi trường nuôi cấy bổ sung vào đĩa trước khi ủ trong tủ ấm 370
/5% CO2.
- Đếm tế bào và xác định mật độ tế bào.
- Ly tâm ở 200G/10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần nổi thu cặn.
- Để cặn cẩn thận trong dung dịch Nucleofection.
- Cho 100 µl tế bào với 1 µg DNA.
- Chuyển tế bào/ DNA vào cuvette.
Chạy máy chuyển gen 4D-Nucleofactor.
Thêm 500 µl môi trường nuôi cấy vào cuvette một cách nhẹ nhàng sau đó
chuyển sang đĩa 6 giếng (đã phủ bề mặt nuôi cấy với cơ chất với tỷ lệ CELLstart
1:50 PBS)
3.3.2.2.5. Cảm ứng tái lập trình bằng cách chuyển đổi từ từ môi trường chuyên biệt
Môi trường chuyên biệt: iPS Brew XF 50X Supplement và iPS Brew XF
được trộn đều. Bảo quản môi trường ở nhiệt độ 4℃ có thể sử dụng được 2 tuần, -
20℃ có thể sử dụng được trong 1 tháng.
3.3.2.2.6. Thu một phần tế bào để kiểm tra hiệu suất chuyển gen bằng phương pháp
Real time PCR
3.3.2.2.6.1 Tách RNA
RNeasy Mini là bộ kit tách RNA tổng số trên vi khuẩn có chứa Guanidine
isothiocyanate để làm bất hoạt RNase, được sử dụng cho hầu hết các phương pháp

44. 34
ly giải ban đầu khác nhau. Ethanol sau đó được thêm vào lysate để RNA liên kết
với màng silica-gel của các cột. Lysate sau đó được thêm vào cột và ly tâm. RNA
liên kết với cột được rửa với đệm thứ nhất và hai lần đệm thứ hai, một lần nữa ly
tâm loại bỏ dịch nổi. Cuối cùng RNA được rửa bằng cách thêm nước không có
Rnase [55].
Phương pháp tách RNA theo bộ kit của QIAGEN
- Ly tâm 2000 vòng/ 10 phút thu cặn tế bào.
- Pha 1 ml RLT buffer + 10 µl B – mercaptoehanol. Thêm 350 µl hỗn hợp rồi
vontex kỹ.
- Ly tâm 15.000 vòng/ 3 phút.
- Cho 350 µl dung dịch sang ống mới. Bổ sung 350 µl cồn 700
. Trộn đều và
cho qua cột.
- Ly tâm 15.000 vòng/15 giây.
- Bỏ dịch dưới cột. Giữ cột.
- Thêm 700 µl Buffer RW1. Ly tâm 15.000 vòng/15 giây. Bỏ dịch ở dưới cột.
- Bổ sung 500 µl RPE buffer.
- Ly tâm 15.000 vòng/2 phút. Bỏ dịch ở dưới cột.
- Ly tâm 15.000 vòng/10 giây. Bỏ dịch.
- Bổ sung 30 µl RNase – free water. Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó đi
kiểm tra nồng độ RNA và độ tinh sạch bằng máy đo nồng độ NanoDrop 2000.
Mức độ tinh sạch của RNA được xác định bằng giá trị A260/280. Khi giá trị
A260/280 =1,8 – 2,1 dịch chiết RNA được coi là tinh sạch [59].
3.3.2.2.6.2 Phương pháp Realtime quantitive RT-PCR
3.3.2.2.6.2.1 Enzyme phiên mã ngược
Giai đoạn phiên mã ngược (reverse transcription – RT) là một giai đoạn hết
sức quan trọng quyết định sự thành công của real time PCR. Enzyme được sử dụng
trong giai đoạn này là Reverse transcriptase được tách chiết từ Moloney murien
leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu trên chuột, hay từ Avian
myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy trên gia cầm. Enzyme reverse

45. 35
transcriptase là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA
đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng
mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (complementary
DNA – cDNA), do vậy giai đoạn phiên mã ngược còn được gọi là giai đoạn tổng
hợp cDNA.
Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn là
mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần
dNTP để enzyme reverse trancriptase khi trượt lên mạch khuôn RNA có thể kéo dài
được mạch cDNA.
Các thành phần để kết hợp phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
50 ng/ µl random hexamers 1 µl
10 mM dNTP mix (10 mM each) 1 µl
mRNA Up to 11 µl
H20 To 13 µl
Các hỗn hợp trên được ủ 650
trong 5 phút, sau đó hỗn hợp được ủ trên đá 1 phút.
Các thành phần tổng hợp cDNA được trình bày tại bảng 3.7.
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
5X SSIV Buffer 4 µl
100 mM DTT 1 µl
Ribonuclease Inhibitor 1 µl
SuperScript™ IV Reverse Transcriptase (200 U/ µl) 1 µl
Thành phần kết hợp phản ứng PCR (bảng 3.6) và các thành phần tổng hợp
cDNA (bảng 3.7) được trộn đều và cài chu trình nhiệt PCR cDNA như hình 3.3 và
chạy máy PCR Proflex 3 block.

46. 36
Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA
Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng Real time PCR.
3.3.2.2.6.2.2. Real time PCR sử dụng SYBR Green phát hiện và định lượng tế bào
chuyển gen.
Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong phòng
thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR),
nhằm khuếch đại và cùng lúc định lượng được số lượng của phân tử DNA mong
muốn. Áp dụng kỹ thuật Real time PCR người dùng không cần thiết phải thực hiện
thao tác điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch
đại. Kỹ thuật Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA
bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn
DNA tạo thành. SYBR Green là nguyên nhân phát huỳnh quang, có thể liên kết với
mạch đôi DNA và phát huỳnh quang với cường độ mạnh mẽ hơn dạng tự do trong
dung dịch. Do đó, quá trình nhân bản DNA thể hiện trực tiếp trên máy luân nhiệt
qua từng chu kỳ. Tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ tỉ lệ với lượng sản
phẩm tạo thành qua mỗi chu kỳ đó [57].

47. 37
Ct (cycle threshold) được định nghĩa là số chu kỳ cần thiết để tín hiệu huỳnh
quang vượt qua ngưỡng (tức là vượt quá mức nền). Các mức độ Ct tỷ lệ nghịch với
lượng axit nucleic mục tiêu trong mẫu (tức là mức độ Ct càng thấp thì lượng axit
nucleic mục tiêu trong mẫu càng lớn) [60].
Các trình tự mồi được sử dụng được trình bày dưới bảng 3.8.
Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên mồi Trình tự mồi
Cặp mồi 1
hSOX2-S875-F 5’-TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA-3’
hKLF4-82-R 5’-CTTGACGCAGTGTCTTCTCCCT-3’
Cặp mồi 2
hMYCL1-S861-F 5’-CTTCCTGGAGCGCAAGA-3’
hLIN28-AS150-R 5’-GCGCACGTTGAACCACTTAC-3’
Thành phần phản ứng với thể tích như bảng 3.9.
Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR
2X SYBR Green Master Mix 10 µl
Mồi 3 µl
Nước 5 µl
cDNA 2 µl
Chu trình nhiệt chạy Real-time PCR được trình bày dưới hình 3.3.
Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR

48. 38
Xử lí số liệu Realtime:
Phương pháp 2-ΔΔCt
của Livak [33]:
Phương pháp này có thể dùng để nghiên cứu biểu hiện một gene trong mẫu
cấy tế bào ung thư, so với mẫu cấy tế bào bình thường, hay cũng có thể nghiên cứu
biểu hiện một gene nào đó trên cấy tế bào có thử chất gây ung thư X so với cấy tế
bào không thử X. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm sẽ định lượng
không chỉ gene cần nghiên cứu (Target = Tg) mà cả một gene tham chiếu (reference
= Ref) tức là gene mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau
giữa hai mẫu tế bào (Ví dụ: tế bào ung thư hay có thử chất X, gọi là mẫu T. Đối
chứng: tế bào không ung thư hay không thử chất X, gọi là mẫu C). Như vậy ứng với
mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gene Tg và gene Ref qua các
thông số:
Ct(T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu thử (T),
Ct(T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T),
Ct(C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gene đích (Tg) trong mẫu chứng (C),
Ct(C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gene tham chiếu (Ref) trong mẫu chứng (C).
Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa (normalized) chu kỳ
ngưỡng của gene đích trên mẫu thử (T) và mẫu chứng (C) bằng cách tính hiệu số
chênh lệch Ct của gene đích với gene tham chiểu trên các mẫu:
Mẫu thử: ΔCt(T) = Ct(T/Tg) - Ct(T/Ref)
Mẫu đối chứng: ΔCt(C) = Ct(C/Tg) - Ct(C/Ref)
Sau đó sẽ thường hóa ΔCt mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ΔCt(T) với ΔCt
ΔΔCt = ΔCt (T) - ΔCt (C)
Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gene đích trên mẫu thử so với mẫu chứng
nội, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2-ΔΔCt
Sau đó vẽ biểu đồ và đánh giá.

49. 39
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1 Kết quả tách chiết plasmid bằng KIT Qiagen Miniprep
Để có thể sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen tái lập trình, DNA plasmid cần
đạt yêu cầu theo cả hai tiêu chí về nồng độ (>400 ng/µl) và độ tinh sạch (A260/280
trong khoảng 1.8-2). Hai plasmid SK-O và UL-G được biến nạp vào tế bào khả biến
E. coli chủng DH5𝛼, chọn lọc dòng, nuôi tăng sinh và tách chiết bằng KIT
Miniprep của hãng QIAGEN. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của hai
vector bằng phương pháp quang phổ được trình bày tại bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA plasmid
OD SK-O UL-G
A260/280 1.85 1.81
Conc (ng/µl) 243 370
Kết quả cho thấy nồng độ DNA đạt được ở mức 243 ng/µl và 370 ng/µl còn
thấp hơn so với mức tối ưu được khuyến nghị là 400 ng/µl. Về mức độ tinh sạch,
giá trị A260/280 nằm ở trong khoảng chấp nhận được.
Tiếp theo, DNA plasmid được kiểm tra mức độ nguyên vẹn bằng phương
pháp điện di trên gel agarose. Kết quả được trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid sử dụng KIT Qiagen Miniprep

50. 40
Kết quả trên hình 4.1 cho thấy 2 plasmid SK-O (đường chạy 2) và UL-G
(đường chạy 3) thu được đều chứa mạch vòng (vạch trên) và siêu soắn (vạch dưới).
Tuy nhiên, DNA plasmid bị đứt gãy thể hiện ở các vệt (smear). Nguyên nhân DNA
plasmid bị đứt gãy có thể do thao tác chưa đúng kỹ thuật và KIT miniprep chưa phù
hợp để sử dụng cho mục đích thu lượng lớn DNA.
Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm tách chiết plasmid lần 2 sử dụng bộ
KIT Qiagen Maxiprep với mục tiêu thu được DNA plasmid có nồng độ cao hơn và
ít bị đứt gãy.
4.2. Kết quả tách chiết DNA plasmid bằng KIT Qiagen Maxiprep
Thí nghiệm được tiến hành thí nghiệm theo tài liệu hướng dẫn của KIT
Qiagen Maxiprep. Nồng độ và độ tinh sạch của hai vector được kiểm tra trên máy
NanoDrop 2000 và được trình bày tại bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi
OD SK-O UL-G
A260/280 1.9 1.91
Conc (ng/µl) 450,6 419.1
Kết quả cho thấy nồng độ DNA đạt được ở mức 450,6 ng/µl và 419,1 ng/µl
đã đạt mức tối ưu được khuyến nghị là 400 ng/µl. Về mức độ tinh sạch, giá trị
A260/280 nằm ở trong khoảng chấp nhận được.
Tiếp theo, DNA plasmid được kiểm tra mức độ nguyên vẹn bằng phương
pháp điện di trên gel agarose. Kết quả được trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid sử dụng KIT Qiagen Maxiprep

51. 41
Kết quả trên hình 4.2 cho thấy 2 plasmid SK-O (đường chạy 2), UL-G
(đường chạy 3) thu được đều chứa 2 dạng là mạch vòng (vạch trên) và siêu
xoắn (vạch dưới) và không lẫn DNA hệ gen.
Như vậy, chúng tôi đã thu được DNA plasmid đạt yêu cầu cả về số lượng và
chất lượng để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen tái lập trình.
4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1
Để thực hiện chuyển vector tái lập trình thì cần có 106
tế bào CD34+
(tế bào
gốc tạo máu). Tế bào gốc tạo máu được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Tế bào gốc
và Công nghệ gen Vinmec và được nuôi tăng sinh 6 ngày để tế bào phục hồi sau rã
đông và đạt được số lượng tế bào cần thiết cho chuyển gen.
Hình 4.3: Tế bào CD34+
sau khi rã đông
Ở ngày 0 (hình 4.3) tế bào sau khi rã đông và cho vào môi trường nuôi tăng
sinh thì tất cả tế bào quan sát được đều có hình dạng tròn, sáng, là các đặc điểm
điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy huyền phù, mật độ 5-10%
trôi nổi trong môi trường.

52. 42
Hình 4.4: Tế bào CD34+
sau 6 ngày nuôi tăng sinh
Sau 6 ngày nuôi cấy (hình 4.4) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ
tế bào đạt được thuộc khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Tổng số tế bào đạt được là
1,78 x 106
tế bào. Trong tổng số lượng tế bào khoảng 1 triệu tế bào được đông
lạnh trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và BSA
(Bovine serum albumin). 5 x 105
tế bào trong tất cả số tế bào còn lại được sử
dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng, nuôi cấy trong 3 ngày để đạt số lượng tế
bào để điện biến nạp.
Khoảng 3 x 105
tế bào còn lại cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm
tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng
chảy tế bào (Flow cytometry). Tuy nhiên do làm thiếu bước phần bù tín hiệu trên
máy Flow cytometry nên đã không có kết quả cho đợt kiểm lượng tế bào CD34+
trên bề mặt quần thể tế bào gốc tạo máu.
Do đó, chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh tế bào CD34+
lần 2 với mong
muốn kiểm tra lượng tế bào có chất lượng tế bào tốt hơn và phân tích tỷ lệ tế bào

53. 43
CD34+
trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế
bào (Flow cytometry).
4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2
Hình 4.5: Tế bào CD34+
sau 2 ngày nuôi tăng sinh
Ở hình 4.5, chúng ta có thể thấy tế bào sau khi rã đông và cho vào môi trường
nuôi tăng sinh thì sau 2 ngày, tất cả tế bào quan sát được đều có hình dạng tròn,
sáng, là các đặc điểm điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy
huyền phù, mật độ tế bào đạt khoảng 10-20% bề mặt đĩa nuôi cấy.
Hình 4.6: Tế bào CD34+
sau 5 ngày nuôi tăng sinh

54. 44
Sau 5 ngày nuôi cấy (hình 4.6) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ
tế bào bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy. Kết quả đếm số lượng tế bào cho
thấy tổng số lượng tế bào đạt được là 1,57 x 106
tế bào. Trong đó, khoảng 1 triệu tế
bào được trữ đông trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide)
và 7,5 % BSA (Bovine serum albumin). 2,7 x 105
tế bào được sử dụng để nuôi cấy
tiếp trong đĩa 6 giếng với thời gian 3 ngày với mục đích đạt số lượng tế bào để điện
biến nạp. Khoảng 3 x 105
tế bào cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế
bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy
tế bào (Flow cytometry) để kiểm tra. Tác dụng của các kháng thể như sau.
Kháng nguyên CD34 thuộc họ glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng, biểu
hiện hầu như tất cả trên các tế bào tiền thân tạo máu bao gồm cả tế bào gốc đa năng.
Kháng thể CD45 nhận diện các kháng nguyên CD45 trên bề mặt các tế bào
bạch cầu với trọng lượng phân tử 180, 190, 210 và 220 KD. Nó còn được gọi là
kháng nguyên bạch cầu chung (leukocyte common antigen – LCA) được biểu hiện
trên mọi loại tế bào tạo máu ngoại trừ hồng cầu trưởng thành và các tế bào tiền thân
của chúng.
Thuốc nhuộm 7AAD là một đồng phân của Actinomycin D có chứa một
nhóm amino thay thế ở vị trí 7 của chromophore. Các tế bào chết là nguồn gây
nhiễu trong phân tích các tế bào bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy. Các
tế bào chết sẽ được đánh giá và phân biệt bằng cách bắt màu nhuộm 7AAD trong
khi các tế bào sống thì không.
Kết quả chạy Flow cytometry được biểu hiện trên hình 4.7.

55. 45
Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào
nuôi tăng sinh

56. 46
Theo hình 4.7, trục tung thể hiện mức độ phức tạp của tế bào. Trục hoành là
tín hiệu huỳnh quang thu được. Mầu sắc thể hiện mật độ tế bào với mầu đỏ, xanh lá
cây và xanh dương lần lượt đại diện cho mật độ cao, trung bình và thấp.
Hàng trên cùng là đối chứng chỉ có tế bào CD34. Hàng thứ hai là tế bào
CD34 được bổ sung kháng thể CD45 và nhuộm bởi 7AAD. Hàng thứ ba là tế bào
CD34 được bổ sung đồng thời hai loại kháng thể CD34, CD45 và nhuộm bởi 7AAD.
Đối với hàng trên cùng, cột bên trái là tín hiệu huỳnh quang cho thấy tỉ lệ tế
bào sống đạt mức 99,9%. Cột ở giữa là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD45,
do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào nên
không thu được tín hiệu. Cột bên phải là tín hiệu huỳnh quang tương ứng với CD34,
do không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên CD34 trên bề mặt tế bào nên
không thu được tín hiệu.
Đối với hàng thứ hai, cột bên trái vẫn cho thấy tỉ lệ tế bào sống cao ở mức
97,7%. Cột ở giữa cho thấy khi bổ sung kháng thể CD45 gắn huỳnh quang, kháng
thể sẽ bắt cặp với kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào và phát sáng. Tín hiệu thu
được đạt mức cao 99,7% chứng tỏ các thành phần trong thí nghiệm hoạt động tốt. Ở
cột bên phải, khoảng 5% tín hiệu thu được ở bước sóng tương ứng với CD34 là tín
hiệu giao thoa bởi bước sóng của CD45.
Đối với hàng thứ ba, cột bên trái và ở giữa được giải thích tương tự như hàng
thứ hai. Ở cột cuối cùng, tín hiệu thu được là do sự bắt cặp của kháng thể và kháng
nguyên CD34. Mức độ dương tính với CD34 56,6%. Fukuda và cộng sự đã dùng
lượng tế bào CD34+
là 78% để tái lập trình [27]. Tuy nhiên lượng dương tính với
CD34 trên 50% nên lượng CD34+
còn lại vẫn có thể sử dụng cho tái lập trình.
4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1
Có nhiều phương pháp chuyển gen từ episomal vector tuy nhiên chúng tôi sử
dụng phương pháp điện biến nạp do chương trình và kit của hãng Lonza đã lập trình
sẵn các chương trình để chuyển gen cho tế bào gốc tạo máu.

57. 47
Tế bào CD34+
sau khi nuôi tăng sinh 3 ngày đạt được tổng số tế bào là 0,46 x
106
tế bào. Tổng cộng 1 µg plasmid (500 ng plasmid ULG và 500 ng plasmid SKO)
được chuyển vào 106
tế bào bằng phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình
Dz-100 của máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza). Tế bào sau chuyển gen nuôi trên
đĩa 6 giếng được phủ bởi chất nền ngoại bào thương mại (CELLstart) và nuôi trong
điều kiện 37o
/5 % CO2.
Tế bào 1 ngày sau chuyển gen được biểu hiện ở hình 4.8. Có 2 dạng tế bào
điển hình xuất hiện:
Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện
i. Dạng thứ nhất quan sát được là những tế bào tròn, sáng chiếm phần lớn số
lượng tế bào trong đĩa (mũi tên vàng). Có thể là quần thể tế bào gốc tạo máu
ii. Dạng thứ hai quan sát được là những tế bào có hình dạng tương tự như
nguyên bào sợi có hình dạng hình thoi thuôn dài (mũi tên đen). Có thể là quần thể
các tế bào gốc trung mô có lẫn trong quần thể tế bào ban đầu vì độ tinh sạch của
quần thể tế bào trước khi chuyển gen không đạt 100%.

58. 48
Tế bào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 7 sau chuyển gen được thể hiện trên hình 4.9.
Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau sau 3 ngày chuyển
gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C)
Có thể thấy số lượng tế bào tròn, sáng tăng lên và tạo thành các cụm tế bào,
rõ ràng nhất ở ngày 7. Số lượng tế bào hình thoi dài bắt đầu từ ngày thứ 2 sau khi
chuyển gen đã xuất hiện rất nhiều và mọc trải đều trên khắp bề mặt giếng nuôi cấy.
Điều này cho thấy những tế bào này đã tồn tại sẵn trong quần thể tế bào được
chuyển gen và chất nền sử dụng để phủ đĩa là điều kiện thuận lợi để chúng bám và
tăng sinh, chúng tôi dự đoán những tế bào này không phải tế bào mong muốn vì
trong hình thái tế bào gốc tạo máu không có tế bào thuôn dài mà chỉ có quần thể tế
bào tròn, sáng. Tuy nhiên chúng tôi vẫn tách RNA để kiểm tra biểu hiện gene.
Do đó, chúng tôi tiếp tục chuyển gen lần thứ 2 với lượng DNA plasmid và
lượng tế bào cao hơn để mong muốn đạt được chất lượng tế bào tốt hơn.
4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2
106
tế bào được chuyển gen lần 2 với 2 µg plasmid (1 µg plasmid chứa các
yếu tố phiên mã ULG và 1 µg plasmid chứa các yếu tố phiên mã SKO) bằng
phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 của máy 4D-Nucleofector
X Unit (Lonza). Tế bào sau chuyển gen nuôi trên 3 giếng của đĩa 6 giếng (3,3 x 105
tế bào/giếng) được phủ bởi chất nền ngoại bào thương mại (CELLstart) và nuôi
trong điều kiện 37℃/5 % CO2.

59. 49
Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện
Hình ảnh chụp tế bào bằng kính hiển vi quang học 1 ngày sau chuyển gen
được trình bày ở hình 4.10. Phần lớn tế bào quan sát được trong đĩa vẫn là những tế
bào tròn, sáng điển hình của tế bào gốc tạo máu. Dạng thứ hai quan sát được là
những tế bào chết có hình tròn, màu đen và là kết quả được dự đoán trước do sử
dụng xung điện với cường độ cao. Tỉ lệ tế bào chết được xác định bằng cách đếm
với thuốc nhuộm Trypan blue và cho thấy chúng chiếm khoảng 20% so với tổng số
tế bào.
Tế bào ngày thứ 4, thứ 5 và ngày 8 sau chuyển gen được thể hiện trên
hình 4.11.
Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen
(B), sau 8 ngày chuyển gen (C).