Chương 1: TỔNG QUAN ENZYME

1. 1/21/2019
1
CÔNG NGHỆ ENZYME
(2 tín chỉ)
TS. Nguyễn Hoàng Minh
Bộ môn CNSH-K.Hóa-ĐHBK
nhminh@dut.udn.vn
0961544787
Tổng quan enzyme 2

2. 1/21/2019
2
Ứng dụng của enzyme
• Y học:
• Nattokinase tan huyết khối
• Protease: sx mt nuôi vsv sinh kháng sinh, thuốc hỗ trợ
tiêu hóa
• Urease định lượng ure
• Glucose oxidase xác định glucose trong nước tiểu
Tổng quan enzyme 3
Ứng dụng-hóa học
• Dùng enzyme cố định để tổng hợp các hợp chất mong muốn
(glutathion, acid béo, alcaloid, hormone…)
• Xử lý nước thải, sản xuất cồn, amino acid
• Làm thuốc thử trong hóa phân tích
Tổng quan enzyme 4

3. 1/21/2019
3
Ứng dụng công nghiệp
• Protease: làm mềm thịt
• Rennin- phomat
• Pectinase: nước trái cây, rượu vang, mứt…
• Cellulase: tăng giá trị của nguyên liệu (agar, đại mạch), phế liệu nông
nghiệp.
• Amylase: bánh mì, glucose, rượu, bia
Tổng quan enzyme 5

4. 1/21/2019
4
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
Chương 1: TỔNG QUAN ENZYME
• Định nghĩa enzyme
• Lịch sử
• Cách gọi tên và cách phân loại
• Bản chất hóa học của enzyme
• Cấu trúc
• Sinh tổng hợp và đặc điểm enzyme
• Đặc hiệu enzyme
• Cơ chế xúc tác của enzyme:
• Động học phản ứng enzyme
• Phương thức thực nghiệm xác định các tham số động học
• Nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme:
• Phương pháp khảo sát và phát hiện các nhóm chức năng của TTHĐ của enzyme
• Các dạng phân tử của enzyme
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME
• Động vật
• Thực vật
• Vi sinh vật
• Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme

5. 1/21/2019
5
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
Chương 3: SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM ENZYME TỪ VSV
• Nguyên lý điều hòa quá trình sinh tổng hợp enzyme.
• Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt lực cao.
• Phương pháp bảo quản giống VSV.
• Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme
• Tách và tinh chế enzyme từ VSV
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
Chương 4: ENZYME CỐ ĐỊNH
• Giới thiệu chung.
• Chất mang
• Enzyme
• Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme cố định
• Một số liên kết trong việc cố định enzyme
• Ảnh hưởng của sự cố định đến hoạt tính của enzyme
• Các reactor chứa enzyme cố định
• Sử dụng enzyme cố định trong y học và trong công nghiệp

6. 1/21/2019
6
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
Chương 5: NHỮNG XU HƢỚNG MỚI TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME
• Sàng lọc enzyme
• Công nghệ protein
Tài liệu tham khảo
• Trevor Palmer. Understanding enzymes. Ellis Horwood.1991.
• Bryan Cooper. Enzymes in Industry: Production and Applications. Wiley.
2007
• Đặng Thị Thu. Công nghệ enzym. NXB KH&KT.2004
• Nguyễn Đức Lượng. Công nghệ enzym. NXB ĐHQG TP HCM.2004
Tổng quan enzyme 12

7. 1/21/2019
7
Đánh giá học phần
• Chuyên cần: 10%
• Bài tập về nhà: 10%
• Seminar: 10%
• Giữa kỳ: 20%
• Cuối kỳ: 50%
Tổng quan enzyme 13
Yêu cầu về seminar
Mỗi nhóm (5-6 sv) chọn một Bài Báo Khoa Học liên quan đến enzyme
(lớp trưởng nộp danh sách tên bài báo trước khi làm để tránh trùng lặp)
• Tiểu luận (50%) : Tổng quan về enzyme (5-10 trang).
Trình bày tất cả thông tin liên quan đến enzyme quan tâm.
• Slide (20%) : 5 phần (đặt vấn đề, mục tiêu nghiên cứu, quy trình nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết
luận).
Yêu cầu trong phần đặt vấn đề, làm nổi bật phần ứng dụng nổi bật của enzyme. Hình ảnh rõ ràng, ít chữ và trình
bày logic.
• Thuyết trình (10% - 10 phút), trả lời câu hỏi (10% - 10 phút).
Mỗi nhóm cử ra một bạn nhóm trưởng. Mỗi nhóm sẽ bốc thăm thứ tự để làm MC cho nhóm khác.
Nôp bản mềm và bản cứng của tiểu luận và slide một tuần trước khi báo cáo.
Thời gian báo cáo: sau khi học xong 5 chương.
Tổng quan enzyme 14

8. 1/21/2019
8
Yêu cầu về seminar
Ý tưởng mới liên quan đến enzyme
Nhóm tự lên ý tưởng và thiết kế quy trình công nghệ.
Yêu cầu tính mới, sáng tạo, kinh tế.
• Tiểu luận (50%) : Tổng quan về enzyme (5-10 trang).
Trình bày tất cả thông tin liên quan đến enzyme quan tâm.
• Poster (20%): trình bày ý tưởng của nhóm trong 10 phút
• Thuyết trình (15% - 10 phút), trả lời câu hỏi (15% - 10 phút).
Tổng quan enzyme 15
Chƣơng 1
TỔNG QUAN ENZYME
• Được tạo ra như thế nào?
• Cấu trúc?
• Chức năng của enzyme trong tự nhiên?
• Điểm nổi bật của enzyme?
• Động học enzyme?

9. 1/21/2019
9
Định nghĩa
• Enzyme là chất xúc tác sinh học. Chúng được tạo ra trong
các tế bào sống.
• Chúng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào
sống, và nó không bị phá hủy hay biến mất sau phản ứng.
• Các chất tham gia phản ứng được xúc tác bởi enzyme được
gọi là cơ chất.
Tổng quan enzyme 17
Ưu điểm của enzyme
• Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, có tính đặc hiệu cao, tác
dụng trong điều kiện êm dịu, có ý nghĩa cao trong y học và thực
phẩm do tính an toàn sinh học.
• Tạo sản phẩm chất lượng cao, ít lẫn sản phẩm phụ, dễ tinh sạch
• Enzyme không độc và có khả năng bị phân giải (thân thiện với môi
trường).
• Có thể tạo ra dựa vào sự tổng hợp của vsv.
Tổng quan enzyme 18

10. 1/21/2019
10
Tổng quan enzyme 19
Tổng quan enzyme 20

11. 1/21/2019
11
Lịch sử phát triển enzyme
Tổng quan enzyme 21
Trước TK 17:
lên men rượu,
muối dưa, làm
tương và nước
chấm dựa vào
kinh nghiệm
Năm 1600:
-sự tiêu hóa là sự
chuyển hóa hóa học
của thức ăn
- Ferment: tác nhân gây
nên sự chuyển biến các
chất
Van Helmont Spalanzani
Năm 1783:
-Dịch dạ dày tiêu hóa
thức ăn
Năm 1814:
-nước chiết của mầm
đại mạch có khả năng
chuyển hóa tinh bột
thành đường ở nhiệt
độ thường
Gittlieb Kirhoff
Anselme Payen
Năm 1833:
-Thu nhận được
enzyme diastate (phân
giải tinh bột thành
đường)
Lịch sử phát triển enzyme
Tổng quan enzyme 22
1856:
Enzyme “có tổ
chức” và
enzyme “không
có tổ chức”
Louis PasteurNăm 1836:
-Tách được pepsin
Theodor Swann
Whilhem Kuhne
1877:
Sử dụng enzyme
để chỉ “enzyme
không có tổ
chức” và
ferment ~
Enzyme “có tổ
chức
1871:
enzyme như một
chất hóa học, xúc
tác không phụ
thuộc vào hoạt
động sống của vi
sinh vật
1897:
Dịch chiết nấm
men thu được
không chứa tế bào
và có khả năng lên
men rượu

12. 1/21/2019
12
Lịch sử phát triển enzyme
Tổng quan enzyme 23
1894:
Lock and Key Theory
1913:
Michaelis Menten Kinetics
1922:
làm thuần khiết enzyme
bằng phương pháp hấp
phụ chọn lọc
1926:
Tinh thể hóa
urease
Lịch sử phát triển enzyme
Tổng quan enzyme 24
1930
Tinh thể hóa pepsin
1931
Tinh thể hóa trypsin
1944:
DNA nhiễm sắc thể
chứa thông tin di
truyền, bắt đầu cho
công nghệ di truyền
(Avery)
1951:
trình tự amino acid
của chuỗi beta thuộc
insuline (enzyme có
cấu trúc bậc một) đã
được giải mã (Sanger
và Tuppy)
1953:
cấu trúc phân tử
DNA được khám
phá (Watson và
Crick)
1960:
Sản xuất glucose nhờ
ứng dụng enzyme
alpha-amylase
1960:
protease từ Bacillus
licheniformis - phương pháp
nuôi cấy chìm (Novozymes)
1965:
alcalase được sử dụng
như chất phụ gia trong
công nghệ tẩy rửa
(Novozymes)

13. 1/21/2019
13
Lịch sử phát triển enzyme
Tổng quan enzyme 25
1974:
sản xuất thành
công glucose
isomerase cố định
1982:
sản xuất insulin có
nguồn gốc từ người
bằng công nghệ tái tổ
hợp (genetech-Eli Lily)
1988:
enzyme Lipolase
thương mại đầu
tiên được sản xuất
từ chủng biến đổi
gen (Novo, Lion
Corporation)
Đầu những năm 1980:
công nghệ thông tin
được sử dụng mạnh
mẽ để phân tích cấu
trúc tinh thể của
protein
Cuối những năm 80:
công nghệ protein phát triển,
tạo ra nhiều sản phẩm protein
tái tổ hợp với chi phí sản xuất
thấp hơn, tạo tiền đề sử dụng
enzyme trong công nghiệp.
2010:
20% thị trường
hóa chất liên
quan đến công
nghệ sinh học
(biofuel)
1981: Ribozyme
Tổng quan enzyme 26

14. 1/21/2019
14
Tổng quan enzyme 27
Cách gọi tên và phân loại enzyme
• Tên thông thường: trypsin, pepsin, renin…
• Tên hệ thống: tên cơ chất đặc hiệu của nó + tên của kiểu phản
ứng mà nó xúc tác+ đuôi “ase”.
• ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có tên hệ thống
là Carbamid-aminohydrodase (tên thường dùng là urease)
Tổng quan enzyme 28

15. 1/21/2019
15
Cách gọi tên và phân loại enzyme
• Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-
khử
• Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị
• Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân
• Lyase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần
nước, loại nước tọ thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước
vào nối đôi
• Isomerase các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa
• Ligase xúc tác phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu
năng lượng ATP
Tổng quan enzyme 29
Cách gọi tên và phân loại enzyme
Tổng quan enzyme 30

16. 1/21/2019
16
Thành phần cấu tạo của enzyme
Tổng quan enzyme 31
Cofactor và coenzyme
Tổng quan enzyme 32
Quyết định:
 kiểu phản ứng
 Độ bền của enzyme
APOENZYME HOLOENZYME
Quyết định:
 Tính đặc hiệu
 Hoạt tính xúc tác của cofactor

17. 1/21/2019
17
Coenzyme
• Tác nhân chuyển nhóm
(Hydro, điện tử, các
nhóm khác)
• Có 2 loại:
• coenzyme tham gia quá
trình trao đổi chất (ATP, S-
adenosinemethionine, 5,6,7,8-
tetrahydrobiopterin)
• coenzyme được chuyển
đổi từ vitamin
Tổng quan enzyme 33
Ví dụ về cofactor của enzyme catalase
• Có 4 cofactor gắn chặt (heme)
• Xúc tác chuyển đổi H2O2 thành H2O và O2
Tổng quan enzyme 34

18. 1/21/2019
18
Tổng quan enzyme 35
Cấu trúc của enzyme
Enzyme là các protein hình cầu tan trong nước, có chứa ít nhất
một trung tâm hoạt động.
Tổng quan enzyme 36

19. 1/21/2019
19
Cấu trúc bậc bốn của enzyme
• Các enzyme có cấu trúc bậc bốn là enzyme oligomer hoặc
polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên được gọi là protomer
(tiểu phần dưới đơn vị), mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi
polypeptide.
• Các protomer: giống hoặc khác nhau về cấu tạo và chức năng.
• Các tiểu phần tương tác với nhau bằng các kiểu liên kết kỵ
nước, liên kết hydrogen, một số khác nhờ liên kết disulfide.
Tổng quan enzyme 37
Tổng quan enzyme 38

20. 1/21/2019
20
Trung tâm hoạt động
Vùng chứa vị trí gắn và vị trí xúc tác gọi là trung tâm hoạt động
của E. Đây là phần của phân tử E kết hợp với S, trực tiếp xúc tác
phản ứng hóa học chuyển hóa phức chất trung gian ES tạo
thành P. Sau phản ứng, TTHĐ được tiếp tục sử dụng.
Tổng quan enzyme 39
Trung tâm hoạt động
• Nhiều nhóm chức năng khác nhau của các amino acid, phân tử
nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor.
• Nhóm chức năng của các amino acid bao gồm:
• nhóm –SH của cysteine;
• -OH của serine, threonine, và tyrosine;
• ε-NH2 của lysine;
• -COOH của glutamic acid, aspartic;
• vòng imidazol của histidine;
• indol của tryptophan,;
• nhóm guanidine của arginine
Tổng quan enzyme 40

21. 1/21/2019
21
Tổng quan enzyme 41
Fructose-1,6-bisphosphate aldolase
Tổng quan enzyme 42
fructose-1,6-bisphosphate aldolase
grey for carbon, red for
oxygen, blue for
nitrogen, and orange for
phosphorus

22. 1/21/2019
22
Tổng quan enzyme 43
Cấu trúc dị lập thể
Tổng quan enzyme 44

23. 1/21/2019
23
Đặc điểm của enzyme
• Đặc điểm hóa học
• Đặc điểm acid-base
• Độ hòa tan
Tổng quan enzyme 45
Đặc điểm hóa học
• Phụ thuộc nhóm cạnh bên của các amino acid định lượng enzyme
• Ví dụ:
• arginine + α-naphthol (sodium hypochlorite) màu đỏ (phản ứng
Sakaguchi)
• trytophan + glyoxylic acid (H2SO4)màu tím (phản ứng Hopkins-Cole)
• Tyrosine + mercuric sulpate + sodium(gia nhiệt) màu đỏ (phản ứng
Millon).
Tổng quan enzyme 46

24. 1/21/2019
24
Đặc điểm acid-base
• Tổng điện tích của một phân tử protein phụ thuộc vào mức độ
phân ly của các nhóm ion hóa, do đó phụ thuộc vào pH.
• Enzyme sẽ tích điện dương tại mức pH thấp và tích điện âm tại
mức pH cao. Giá trị pH tại đó protein không tích điện được gọi
là điểm đẳng điện pI.
• Enzyme có hoạt tính xúc tác khi nhóm cạnh bên được ion hóa
ở dạng thích hợp, do đó hoạt động xúc tác của enzyme phụ
thuộc vào pH.
Tổng quan enzyme 47
Độ hòa tan
• Nồng độ muối: nhỏ tăng độ hòa tan, cao giảm độ hòa tan
• pH:
• quá cao hay thấp biến tính giảm độ hòa tan.
• pI kết tụ enzyme
• Nồng độ dung môi hữu cơ ethanol, aceton giảm độ hòa tan
• Nhiệt độ: tăng ở 40-50oC. Nếu cao hơn, giảm độ hòa tan.
Tổng quan enzyme 48

25. 1/21/2019
25
Đặc hiệu của enzyme
Mỗi enzyme chỉ xúc tác chuyển hóa được một hoặc một số cơ
chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, được gọi là
tính đặc hiệu của enzyme.
• Đặc hiệu kiểu phản ứng
• Đặc hiệu theo cơ chất
Tổng quan enzyme 49
Đặc hiệu phản ứng
 Chỉ xúc tác cho một loại phản ứng nhất định
Tổng quan enzyme 50

26. 1/21/2019
26
Đặc hiệu theo cơ chất
• Đặc hiệu liên kết (tính đặc hiệu thấp): cơ chất tương tự về cấu trúc và có
cùng loại liên kết
• Đặc hiệu nhóm hay cấu trúc (tính đặc hiệu trung bình): loại liên kết và cấu
trúc xung quanh nó
• Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối (tính đặc hiệu tuyệt đối): các enzyme xúc tác
trên một loại cơ chất duy nhất
• Đặc hiệu quang học: tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không
gian của cơ chất
Tổng quan enzyme 51
Đặc hiệu liên kết
Tổng quan enzyme 52

27. 1/21/2019
27
Đặc hiệu nhóm
Tổng quan enzyme 53
Đặc hiệu tuyệt đối
Tổng quan enzyme 54

28. 1/21/2019
28
Đặc hiệu quang học
Tổng quan enzyme 55
Đặc hiệu của enzyme
• Thuyết “ba điểm” của Ogston, 1894
• Thuyết “ổ khóa và chìa khóa” của Fisher, 1890
• Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” của Koshland, 1958
Tổng quan enzyme 56

29. 1/21/2019
29
Thuyết “ba điểm” của Ogston (1948)
• E+S: 3 điểm khác biệt (gắn
hoặc xúc tác).
• Vị trí gắn giữ E và S cố định,
khớp với nhau và giúp các
nhóm phản ứng của S ở gần
với vị trí xúc tác của E
Tổng quan enzyme 57
Thuyết “ba điểm” của Ogston (1948)
• Các amino acid trong TTHĐ không có chức năng gắn hay xúc
tác có thể có vai trò quan trọng trong tính đặc hiệu của
enzyme
(không ngăn cản sự gắn của cơ chất, nhưng lại ngăn cản sự gắn của các phân tử khác có
cấu trúc hóa học tương tự)
 chức năng của enzyme không chỉ phụ thuộc vào sự gắn và
xúc tác trong không gian, mà còn phụ thuộc vào môi trƣờng tại
TTHĐ hạn chế của thuyết “3 điểm”
Tổng quan enzyme 58

30. 1/21/2019
30
Thuyết “ổ khóa và chìa khóa” của Fisher (1890)
• tương tác giữa E và S tạo thành
phức hợp ES giống như quan
hệ của ổ khóa và chìa khóa
(hình dạng của E và S bổ sung cho nhau),
 nghĩa là enzyme nào chỉ xúc tác cho đúng cơ
chất đó.
• giải thích được tính đặc hiệu
tuyệt đối của E, nhưng không
giải thích được tính đặc hiệu
tương đối của E
Tổng quan enzyme 59
Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” của Koshland (1958)
Tổng quan enzyme 60
TTHĐ của E có tính mềm
dẻo và linh hoạt, có thể biến
đổi về cấu hình không gian
trong quá trình tương tác với
S sao cho phù hợp với S, để
có thể tạo thành phức hợp
ES.
Sự gắn của S vào E làm thay
đổi cấu hình không gian.

31. 1/21/2019
31
Cơ chế phản ứng
Nguyên tắc của Arrhenius và van’Hoff: phân tử chỉ có thể phản
ứng chỉ khi nó tiếp xúc với phân tử khác.
Tổng quan enzyme 61
Để một phản ứng có thể xảy ra, phân tử tham gia va chạm
phải có đủ năng lượng để vượt qua hàng rào thế năng hay còn
gọi là năng lượng hoạt hóa.
MỌI TIẾP XÚC ĐỀU XẢY RA
PHẢN ỨNG???
Cơ chế phản ứng
Tổng quan enzyme 62
• Năng lƣợng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu cần thiết để hình thành
trạng thái chuyển tiếp từ các chất tham gia phản ứng.
• Trạng thái chuyển tiếp (trạng thái trung gian có mức năng lượng tự do
cao nhất trong tất cả các phản ứng) không bền vững nên sẽ nhanh chóng
bị phá vỡ để hình thành sản phẩm

32. 1/21/2019
32
Tổng quan enzyme 63
Năng lượng hoạt hóa
Tổng quan enzyme 64
Năng lượng hoạt hóa được đo bằng
cách đo tốc độ phản ứng tại các
nhiệt độ khác nhau.
Ví dụ,
H2O2 H2O + O2
Không chất xúc tác: 18 kcal/mol
Platin : 11,7 kcal/mol
Catalase: 5 kcal/mol.

33. 1/21/2019
33
Cơ chế phản ứng
E làm giảm năng lƣợng hoạt
hóa bằng cách kết hợp với S để
hình thành trạng thái chuyển tiếp
khác có mức năng lƣợng thấp
hơn so với trạng thái chuyển tiếp
của phản ứng không có sự tham
gia của chất xúc tác. Vì thế E làm
gia tăng vận tốc phản ứng.
Sau phản ứng, E lại hồi phục về
trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc
tác.
Tổng quan enzyme 65
Mô hình phản ứng sinh học
Tổng quan enzyme 66

34. 1/21/2019
34
Quá trình tạo thành phức ES và sự biến đổi phức này thành
sản phẩm thường xảy ra qua ba giai đoạn:
• E gắn với S bằng các liên kết yếu (tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác
Van der Waals) tại TTHĐ tạo phức ES không bền. Phản ứng xảy ra
nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
• Các nhóm chức năng của các gốc amino acid trong TTHĐ tương tác
với S, xảy ra sự biến đổi S,  sự kéo căng và phá vỡ các liên kết
đồng hóa trị tham gia phản ứng S được hoạt hóa, dễ dàng tham
gia phản ứng hơn.
• Sự tách P ra khỏi vị trí gắn, đồng thời E được giải phóng ở dạng tự
do.
Tổng quan enzyme 67
Động học enzyme
• Động hóa học là môn khoa học nghiên cứu về tốc độ phản ứng
và các nhân tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng và cơ chế của
phản ứng hóa học
Tổng quan enzyme 68
• Tốc độ phản ứng là đại lượng đặc trưng cho diễn biến nhanh
hay chậm của một phản ứng. Nó được đo bằng độ biến thiên
nồng độ chất phản ứng trong một đơn vị thời gian
• Định luật tác dụng khối lƣợng (Guldberg và Waage, 1867):
tốc độ của phản ứng tại mỗi thời điểm tỷ lệ thuận với tích số
nồng độ của các tác chất.

35. 1/21/2019
35
Bậc phản ứng
• Bậc phản ứng là tổng số mũ của nồng độ các chất phản ứng ở
trong biểu thức tính tốc độ phản ứng.
aA + bB  cC + dD
Vận tốc của phản ứng: 𝑣 = 𝑘 𝐴 𝑥
[𝐵] 𝑦
Bậc phản ứng: n = x+y
Tổng quan enzyme 69
Lưu ý: Luật tốc độ được xác định dựa trên kết quả thực nghiệm.
Ví dụ về bậc phản ứng
Tổng quan enzyme 70

36. 1/21/2019
36
Ví dụ về bậc phản ứng
Tổng quan enzyme 71
Vận tốc đầu
• Mức độ hình thành sản phẩm
được xác định là một hàm của
thời gian đối với một loạt nồng
độ cơ chất.
• Vận tốc ban đầu (𝛝 𝟎) của một
phản ứng là tốc độ tăng sản
phẩm tại thời điểm t=0 khi
nồng độ sản phẩm thấp
Tổng quan enzyme 72

37. 1/21/2019
37
Vận tốc đầu
• 𝛝 𝟎 cho mỗi [S] được xác định là
đường dốc của đường cong tại
điểm bắt đầu của phản ứng khi
phản ứng nghịch chưa xảy ra.
• 𝛝 𝟎 được xác định bằng cách vẽ
một đường tiếp tuyến với đồ thị.
Từ đường tiếp tuyến này, ta có:
𝜗0 =
[𝑃]2−[𝑃]1
𝑡2 − 𝑡1
Tổng quan enzyme 73
Vận tốc đầu
Vận tốc đầu phụ thuộc vào nồng độ ban đầu của cơ chất tham
gia phản ứng.
• Đối với phản ứng bậc 1: 𝜗0 = 𝑘[𝐴0]
• Phản ứng bậc 2: 𝜗0 = 𝑘[𝐴0]2
• Phản ứng bậc 0: 𝜗0 = 𝑘[𝐴0]0
= 𝑘
Tổng quan enzyme 74

38. 1/21/2019
38
Mô hình Michaelis-Menten
Phức ES là trung gian cần thiết của phản ứng xúc tác
Tổng quan enzyme 75
Khi [S] thấp: tốc độ tăng khi [S] tăng
Khi [S] cao: tốc độ phụ thuộc vào [E]
E và S đạt trạng thái tiền-cân bằng nhanh
chóng với phức ES.
Mô hình Michaelis-Menten
Tổng quan enzyme 76

39. 1/21/2019
39
Tốc độ hình thành sản phẩm 𝑣 𝑜 = 𝑘2 × 𝐸𝑆 (1)
Tốc độ hình thành phức ES :𝑣1 = 𝑘1 𝐸 [𝑆]
Tốc độ phân giải phức ES 𝑣2 = 𝑘−1 𝐸𝑆
Giả thiết Michaelis Menten là một sự cân bằng giữa E, S và ES
đã được thiết lập và duy trì, sự phân giải phức để tạo ra sản
phẩm quá thấp để phá vỡ trạng thái cân bằng này.
𝒌 𝟏 𝑬 𝑺 = 𝒌−𝟏 𝑬𝑺
Suy ra, hằng số
𝐸 𝑆
𝐸𝑆
=
𝑘−1
𝑘1
= 𝑘 𝑎𝑙 (2)
Với 𝑘 𝑎𝑙 là hằng số phân ly của ES.
Tổng quan enzyme 77
Nồng độ ban đầu của enzyme [𝐸0] bằng tổng nồng độ của
enzyme tự do [E] và nồng độ của enzyme gắn với cơ chất [ES].
Từ đó, suy ra: [E]= [𝐸0]- [ES] (3)
Thay (3) vào (2), ta có:
[𝐸0 −[𝐸𝑆]) 𝑆
𝐸𝑆
=
𝒌−𝟏
𝒌 𝟏
= 𝒌 𝒂𝒍 = 𝑲 𝒎
𝐸𝑆 =
𝐸0 [𝑆]
𝑆 +𝑘 𝑎𝑙
(4)
Thay thế (4) vào (1), thu được 𝜗0 =
𝑘2 𝐸0 [𝑆]
𝑆 +𝑘 𝑎𝑙
(5)
Lưu ý, khi nồng độ cơ chất rất cao, tất cả enzyme sẽ tham gia
hình thành phức ES ([ES]= [𝐸0]). Khi đó thu được vận tốc cực
đại 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2[𝐸0] (6)
Thay (6) vào phương trình (5), ta có: 𝝑 𝟎 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙[𝑺]
𝑺 +𝑲 𝒔
(7)
Tổng quan enzyme 78

40. 1/21/2019
40
Mô hình Michaelis-Menten
• Trong mô hình đơn giản của Michaelis-Menten, hằng số
Michaelis-Menten Km tương ứng với hằng số phân ly của phức
ES.
• Giả thiết này đúng với thực nghiệm, nhưng không thể áp dụng
chung cho tất cả các phản ứng được xúc tác bởi enzyme (do
có những phản ứng được xúc tác bởi enzyme được thực hiện
với tốc độ đủ nhanh để phá vỡ cân bằng tạo ra sản phẩm).
Tổng quan enzyme 79
Điều chỉnh của Briggs-Haldane- trạng thái tĩnh
Tốc độ hình thành sản phẩm 𝜗0 = 𝑘2[𝐸𝑆] (1)
Tốc độ hình thành phức ES tại thời điểm t là 𝑣1 = 𝑘1 𝐸 [𝑆].
Suy ra, tốc độ phá vỡ phức ES tại thời điểm t 𝑣2 = 𝑘−1 𝐸𝑆 +
𝑘2[𝐸𝑆]
Sử dụng giả thiết trạng thái tĩnh (d[ES]/dt=0), nghĩa là tốc độ hình
thành phức ES bằng tốc độ phá vỡ phức ES tại thời điểm t:
𝒌 𝟏 𝑬 𝑺 = 𝒌−𝟏 𝑬𝑺 + 𝒌 𝟐 𝑬𝑺 = 𝑬𝑺 (𝒌−𝟏+𝒌 𝟐)
𝐸 𝑆
𝐸𝑆
=
𝒌−𝟏+𝒌 𝟐
𝒌 𝟏
= 𝑲 𝒎 (8)
Tương tự lý giải ở trên, ta có [E]= [𝐸0]- [ES] (3)
Tổng quan enzyme 80

41. 1/21/2019
41
Thay thế (3) vào (8):
[𝐸0 −[𝐸𝑆]) 𝑆
𝐸𝑆
= 𝐾 𝑚 (hằng số Michaelis)
𝐸𝑆 =
𝐸0 [𝑆]
𝑆 +𝐾 𝑚
(9)
Thay thế (9) vào (1), thu được 𝜗0 =
𝑘2 𝐸0 [𝑆]
𝑆 +𝐾 𝑚
(10)
Do [𝑆0]>>[ 𝐸0], nồng độ cơ chất giảm không đáng kể. Vận tốc đạt
giá trị lớn nhất khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là
[ES] = [𝐸0]. Từ đó, ta có 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2[𝐸0] (6)
Suy ra, 𝝑 𝟎 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙[𝑺]
[𝑺]+𝑲 𝒎
tại nồng độ enyme [ 𝐸0] không đổi (11)
• (11) là phƣơng trình Michaelis-Menten
Tổng quan enzyme 81
Đồ thị của 𝜗0 với [𝑆0] sẽ có
dạng hyperbol chữ nhật,
phù hợp với các kết quả
thí nghiệm trong nhiều
phản ứng đƣợc xúc tác
bởi enzyme.
Tổng quan enzyme 82
𝝑 𝟎 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙[𝑺]
[𝑺]+𝑲 𝒎
𝑉𝑚 𝑎𝑥 chính là vận tốc ban đầu tối đa tại giá trị [ 𝐸0], đặc biệt có thể được tính toán
và thu nhận từ biểu đồ trên và có cùng đơn vị với 𝜗0.

42. 1/21/2019
42
Tại [S] thấp ([S] ≪ 𝐾 𝑚): 𝒗 𝒐 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙[𝑺]
𝑲 𝒎
 tốc độ tỉ lệ thuận với [S]
Tại [S] cao ([S] ≫ 𝐾 𝑚): 𝒗 𝒐 = 𝑽 𝒎𝒂𝒙
đạt tốc độ tối đa, không phụ thuộc
vào [S].
Khi [S] = 𝐾 𝑚: 𝒗 𝒐 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙
𝟐
Như vậy, hằng số 𝐾 𝑚 có thể xác
định là giá trị của cơ chất mà tại đó
vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc
cực đại (có cùng đơn vị với [S]).
Tổng quan enzyme 83
𝝑 𝟎 =
𝑽 𝒎𝒂𝒙[𝑺]
[𝑺]+𝑲 𝒎
𝐾 𝑚
Ái lực giữa enzyme và cơ chất, giá trị 𝐾 𝑚 cao thì ái lực E và S cao và
ngược lại khi 𝑘2 ≪ 𝑘−1
Là giá trị của cơ chất mà tại đó vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc
cực đại (có cùng đơn vị với [S]).
Giá trị 𝐾 𝑚 nằm trong khoảng 10-2-10-6M
Phụ thuộc [S] và các yếu tố của môi trường như nhiệt độ, pH, nồng
độ ion…) và đặc trưng cho hệ thống đang được nghiên cứu
Tổng quan enzyme 84

43. 1/21/2019
43
Tổng quan enzyme 85
Ví dụ về Km
• 2 loại acetaldehyde dehydrogenase: Km thấp (ti thể), Km cao
(nguyên sinh chất).
• Người nhạy cảm với rượu: Km cao (ti thể) nhiều acetate được
chuyển vào máu gây ra hiện tượng đỏ mặt và tim đập nhanh
Tổng quan enzyme 86

44. 1/21/2019
44
𝒌 𝒄𝒂𝒕
Hằng số 𝒌 𝒄𝒂𝒕 (turnover number), đại diện cho số phân tử cơ
chất cực đại được chuyển đổi thành sản phẩm trên một phân tử
enzyme trong một đơn vị thời gian khi E bão hòa với S và tính
theo công thức 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘 𝑐𝑎𝑡 [𝐸0].
Tương ứng với tốc độ phá vỡ phức ES để hình thành sản phẩm,
do đó giá trị kcat càng cao nghĩa là tốc độ phá vỡ phức càng nhỏ.
𝑘 𝑐𝑎𝑡 cho hầu hết các enzyme nằm trong khoảng 1-104
Tổng quan enzyme 87
Tổng quan enzyme 88

45. 1/21/2019
45
Hằng số đặc hiệu
KA=
𝒌 𝒄𝒂𝒕
𝑲 𝒎
được gọi là hằng số đặc hiệu.
 đo lường tính đặc hiệu của enzyme.
Tổng quan enzyme 89
Pyranose Oxydase
• Nguồn: nấm phân hủy
lignocellulose
• Ứng dụng: sx đường
fructose, tagatose, sx
biofuel
Tổng quan enzyme 90

46. 1/21/2019
46
Cách xác định các hằng số động học
• Xác định vận tốc đầu của một dãy
nồng độ cơ chất
• Dựng đồ thị của v và [S], thu
được phương trình Michaelis-
Menten
• Có thể xác định được hai giá trị
Km và Vmax. Từ đó suy ra kcat.
Tổng quan enzyme 91
Phương thức thực nghiệm xác định các tham số động học
1
𝜗0
=
𝐾 𝑚
𝑉𝑚𝑎𝑥
×
1
[𝑆0]
+
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
Tổng quan enzyme 92
• Sự ngoại suy xuyên qua trục
1
𝜗0
để xác định giá trị −
1
𝐾 𝑚
đôi khi
chạm phải lề của giấy trước khi thu được giá trị
1
[𝑆0]
• Đường tuyến tính chưa rõ ràng
• Kết quả đôi khi không chính xác

47. 1/21/2019
47
Phương pháp đồ thị Hanes
• Ưu: dữ kiện phân phối đều
• Nhược: Không có sự tách biệt của biến số ([S]
xuất hiện trên cả hai trục đồ thị)
Tổng quan enzyme 93
Phương pháp đồ thị Eisenthal và Cornih-Bowden
• Ưu: sai số không biến đổi nhiều như ở
đồ thị Lineweaver-Burk
• Nhược: Không có sự tách biệt của
biến số (v xuất hiện trên cả hai trục đồ
thị)
Tổng quan enzyme 94

48. 1/21/2019
48
Nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme
• Nồng độ enzyme
• Nồng độ cơ chất
• Nhiệt độ
• Thời gian
• pH
• Chất ức chế và hoạt hóa
Tổng quan enzyme 95
Ảnh hưởng của [E] và [S]
• Nồng độ enzyme: tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận trực tiếp với
nồng độ enzyme khi điều kiện của phản ứng không đổi và cơ
chất bão hòa.
• Nồng độ cơ chất: tốc độ phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất
tăng cho đến khi phản ứng đạt đến vận tốc cực đại.
Tổng quan enzyme 96

49. 1/21/2019
49
Ảnh hưởng của nhiệt độ
• thấpbất hoạt.
• To
opt : mức nhiệt độ mà tại đó
enzyme đạt được hoạt tính cao
nhất (~37-40oC).
• T > to
opt  biến tính
Tổng quan enzyme 97
Ảnh hưởng của pH
• pH: mỗi enzyme có một giá trị pHopt tại đó enzyme đạt hoạt tính
tối đa.
• Ví dụ, pHopt của pepsin, pancreatic lipase, salivary amylase lần lượt là 1,5-2 (acidic);
7.5-8 (alkaline); 6.8 (slight acidic).
• Khi pH thay đổi  làm giảm tốc độ của hoạt động enzyme
Tổng quan enzyme 98

50. 1/21/2019
50
Ảnh hưởng của pH
• Chymotrypsin
• Histidine 57-proton hóa
• Mất chức năng xúc tác
Tổng quan enzyme 99
Ảnh hưởng của thời gian
• Ban đầu, tốc độ phản ứng tăng
• Sau đó tốc độ phản ứng giảm do:
(1) sự giảm nồng độ cơ chất;
(2) sự tích lũy sản phẩm cuối;
(3) sự thay đổi pH của phản ứng, tạo ra giá trị pH mới khác
biệt với giá trị pH tối thích của enzyme ở thời điểm ban đầu
Tổng quan enzyme 100

51. 1/21/2019
51
Ảnh hưởng của các chất khác
• Nồng độ của coenzyme: Đối với những enzyme có coenzyme,
sự tăng nồng độ của coenzyme làm tăng tốc độ phản ứng của
hoạt động enzyme.
• Nồng độ của các chất hoạt hóa ion kim loại: Sự tăng nồng
độ của các chất hoạt hóa ion kim loại làm tăng tốc độ hoạt động
enzyem. Nhiều enzyme được kích hoạt bởi các ion kim loại như
là ion cloride kích hoạt salivary amylase, ion Ca2+ kích hoạt
thrombokinase.
• Sự hiện diện của các chất kìm hãm làm giảm hoặc mất hoạt
tính enzyme.
Tổng quan enzyme 101
Sự kìm hãm
• Các chất kìm hãm là những chất làm giảm tốc độ của phản ứng
được xúc tác bởi enzyme.
• Chất kìm hãm thuận nghịch (reversible inhibitor) gắn vào enzyme
theo phương thức thuận nghịch và có thể được loại bỏ bằng thẩm
tích để tái tạo hoạt tính enzyme hoàn toàn.
Kìm hãm cạnh tranh, phi cạnh tranh, không cạnh tranh, hỗn hợp.
• Chất kìm hãm không thuận nghịch (irreversible inhibitor) không bị
loại bỏ ra khỏi phân tử enzyme bằng thẩm tích (do sản phẩm của
phản ứng hoặc do cơ chất thừa)
Tổng quan enzyme 102

52. 1/21/2019
52
Chất kìm hãm cạnh tranh
• I có cấu trúc tương tự với S, do đó
nó có thể cạnh tranh cùng vị trí gắn
trên phân tử E.
.
• Ví dụ, malonate (𝐶𝑂2
−
. 𝐶𝐻2. 𝐶𝑂2
−
)
Tổng quan enzyme 103
succinate fumarate
Chất kìm hãm cạnh tranh
• 𝐾 𝑚 tăng
• 𝑉𝑚𝑎𝑥 không thay đổi.
Tổng quan enzyme 104

53. 1/21/2019
53
Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitor)
• I chỉ gắn lên phức ES mà không gắn lên E tự do
Tổng quan enzyme 105
Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitor)
Tổng quan enzyme 106
• 𝐾 𝑚 giảm
• 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm

54. 1/21/2019
54
Chất kìm hãm không cạnh tranh (non-competitive inhibitor)
• I kết hợp với S (tự do
hoặc đang tạo phức với
cơ chất) tạo ra phức
điểm chết (dead-end
complex)
Tổng quan enzyme 107
Chất kìm hãm không cạnh tranh (non-competitive inhibitor)
• 𝐾 𝑚 không thay
đổi
• 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm
Tổng quan enzyme 108

55. 1/21/2019
55
Chất kìm hãm hỗn hợp
• I không những liên kết
với E tự do mà còn liên
kết với cả phức ES tạo
thành phức ESI không
tạo thành P.
Tổng quan enzyme 109
Chất kìm hãm hỗn hợp
• Km tăng
• 𝑉𝑚𝑎𝑥 giảm
Tổng quan enzyme 110

56. 1/21/2019
56
Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm đến Km và Vmax
Tổng quan enzyme 111
Kìm hãm bất thuận nghịch
Tổng quan enzyme 112

57. 1/21/2019
57
Đơn vị đo hoạt độ
• 1. Đơn vị IU (đơn vị quốc tế) : là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển
hóa 1 micromol cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1IU = 1 μM cơ chất (10-6 M / phút)
• 2. Đơn vị katal (kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác 1 mol
cơ chất sau thời gian 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat = 1 Mol cơ chất / giây
1IU = 1/60 x 10-6 kat = 16,67 nkat.
Đơn vị đo hoạt độ
• 3. Hoạt độ riêng : được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ enzyme
trên đơn vị khối lượng protein.
IU hoặc kat / 1 mg (ml) protein
• 4. Hoạt độ phân tử (hoạt độ riêng phân tử) : được biểu diễn bằng
số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme sau
một đơn vị thời gian (thường là phút).
• 5. Hoạt độ tâm xúc tác: là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi
trung tâm hoạt động sau 1 phút.

58. 1/21/2019
58
Tổng kết
• Enzyme – chất xúc tác sinh học- tăng vận tốc phản ứng bằng
cách giảm năng lượng hoạt hóa.
• Có tính đặc hiệu cao, hiệu quả xúc tác lớn.
• Trung tâm hoạt động chứa vị trí gắn và vị trí xúc tác
• Cơ chế xúc tác: làm giảm năng lượng hoạt hóa  tăng vận tốc
phản ứng
• Mô hình Michaelis-Menten là mô hình đơn giản nhất mô tả sự
phụ thuộc giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất
Tổng quan enzyme 115