Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME

1. 2/20/2019
1
Chương 2:
Nguồn nguyên liệu và
quy trình chung sản xuất chế
phẩm enzyme
Nguồn động vật
• 1. TỤY TẠNG:
- Lipase, trypsin, chymotrypsin.
- Làm mềm da, khử các vết nứt, sản xuất các chế phẩm dịch tụy y học, thực phẩm…
• 2. DẠ DÀY:
- Pepsin A, B, C, D; gastrisin; celulase; renin.
- Công nghệ sản xuất pho mát
• 3. CÁC LOẠI NỘI TẠNG KHÁC:
- Gan, tim lợn để tách aspartat – glutamat aminotransferase
- Huyết tương để tách trombia (protein chống đông máu)
Tổng quan enzyme 2

2. 2/20/2019
2
Nguồn thực vật
Tổng quan enzyme 3
Tổng quan enzyme 4

3. 2/20/2019
3
• Nhược điểm của nguồn động, thực vật
- Chu kỳ sinh trưởng dài
• - Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được.
• - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng
làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme
nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân
Tổng quan enzyme 5
Nguồn vi sinh vật
 Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh.
 Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao.
 Hệ enzyme của VSV rất phong phú.
 VSV thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.
 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản,
dễ tổ chức sản xuất.
Tổng quan enzyme 6

4. 2/20/2019
4
Vi khuẩn
Tổng quan enzyme 7
Baccilus
E. coli
Nấm sợi
Tổng quan enzyme 8
Aspergillus
Aminoaclylase
α -amylase
Catalase Pectinase
Protease
LactaseLipase
Glucoamylase

5. 2/20/2019
5
Nấm men
Tổng quan enzyme 9
SaccaromycesCandida Kluyveromyces
Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme
• Sinh tổng hợp enzyme
• Thu nhận enzyme: phá vỡ tế bào, tách enzyme, cô đặc enzyme
• Tinh sạch enzyme
• Hình thành công thức chế phẩm enzyme
Tổng quan enzyme 10

6. 2/20/2019
6
Tổng quan enzyme 11
Các dạng chế phẩm enzyme
• Chế phẩm thô
o Chế phẩm thô từ canh trường lỏng
o Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt
• Chế phẩm kỹ thuật: Là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó
một số protein và enzyme tạp chất đã được tách ra. Trong chế phẩm
kỹ thuật thường chứa hỗn hợp một vài enzyme chủ yếu.
• Chế phẩm enzyme tinh khiết: trong chế phẩm này đã loại bỏ hoàn
toàn các protein và enzyme tạp, chỉ còn lai duy nhất một enzyme
mong muốn. Các chế phẩm này chỉ dùng trong y học, nghiên cứu
khoa học và phân tích.
Tổng quan enzyme 12

7. 2/20/2019
7
Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
• pH: pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 ± 2).
• Nhiệt độ: cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (00C đến 50C)
Tổng quan enzyme 13
Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
• Tránh tạo bọt
• Không dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ
• Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, ethanol để kết tủa
enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp.
• Cần phải làm thí nghiệm nhanh (mẫu càng mới hoạt tính cao)
Tổng quan enzyme 14

8. 2/20/2019
8
Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
• Giữ nhiệt độ và pH của các thành phần tham gia phản ứng ổn
định trong khi thực hiện phản ứng
• Sử dụng pipette đúng cách để lấy lượng enzyme thật chính xác
• Tránh đánh rơi nguồn enzyme tạp vào mẫu
• Cần bảo quản chế phẩm enzyme ở nhiệt độ thấp hoặc sấy
chân không hoặc đông khô để bảo quản trong thời gian lâu
hơn.
Tổng quan enzyme 15
Thu nhận enzyme ngoại bào
• Ly tâm lạnh: Ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm
ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa
• Lọc: Lọc ép (thể tích nhỏ), lọc chân không, lọc theo dòng chảy
cắt ngang
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 16

9. 2/20/2019
9
Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 17
VK gram (+) Vk gram (-) Nấm Thực vật Động vật
Thành TB 1 lớp gồm
peptidoglycan,
teichoic acid và
polysaccharide
2 lớp gồm
peptidoglycan và
lớp
lipopolysaccharide
(hai khoang chu
chất)
glucan,
mannan, và
chitin
cellulose và các
polysaccharide
Không có
Màng TB phospholipid và
protein
phospholipid và
protein
phospholipid
và lipoprotein
phospholipid và
protein
phospholipid và
cholesterol,
protein
Thu nhận enzyme nội bào - Phá vỡ tế bào
• Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lý
• Phá vỡ tế bào bằng phương pháp hóa học
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 18

10. 2/20/2019
10
Các phương pháp vật lý
• Phương pháp nghiền hoặc khuấy với bột thủy tinh hoặc
thép
• Phá vỡ bằng rotor-stator mill
• French press
• Sóng siêu âm
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 19
Phương pháp nghiền với bột thủy tinh hoặc thép
• Khi huyền phù tế bào được lắc cùng với hạt
bằng thủy tinh hoặc bằng thép nhỏ (đường
kính khoảng 0,2 – 1,0 mm) thì tế bào sẽ bị
phá vỡ do lực cắt của chất lỏng cao và do
va chạm với các hạt này.
• Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme tùy
thuộc vào vận tốc lắc, kích cỡ của hạt và
đường kính của thiết bị.
• Nhược điểm của phương pháp là làm tăng
nhiệt và mức tiêu thụ năng lượng, vì vật cần
phải thiết kế các thiết bị làm lạnh thích hợp.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 20

11. 2/20/2019
11
Phương pháp nghiền với bột thủy tinh hoặc thép
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 21
Sự phá vỡ tế bào là quá trình ngẫu nhiên nên khó để mô tả. Để
có thể mô tả, có thể dùng phương trình sau:
𝐶
𝐶 𝑚𝑎𝑥
= 1 − exp −
1
𝜃
C: nồng độ của enzyme được giải phóng (kg/m3)
Cmax: nồng độ tối đa của vật chất được giải phóng ra (kg/m3)
Hằng số thời gian 𝜃 phụ thuộc vào điều kiện phá vỡ, thiết bị và
đặc điểm của tế bào.
Phương pháp nghiền với bột thủy tinh hoặc thép
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 22
Ví dụ. một mẻ tế bào nấm men được phá vỡ dùng phương pháp siêu âm , nồng độ của
enzyme được đo theo thời gian như sau:
3.49
𝐶 𝑚𝑎𝑥
= 1 − exp −
60
𝜃
4.56
𝐶 𝑚𝑎𝑥
= 1 − exp −
120
𝜃
Giải hệ hai phương trình trên, thu được C max=5 mg/ml, 𝜃=50 giây
Vì vậy, khi t=240 giây ta có
𝐶
5
= 1 − exp −
240
50
Suy ra, C = 4.96 mg/ml

12. 2/20/2019
12
Phá vỡ bằng rotor-stator mill
• Thiết bị gồm phần tĩnh ở dưới và phần động là rotor
hình nón cụt ở phía trên.
• Tốc độ quay của rotor là 10000 đến 50000 vòng.
• Dịch huyền phù của tế bào được cho vào từ khoảng
trống nhỏ giữa phần động và phần tĩnh.
• Dịch sau khi phá vỡ được đây ra ngoài do quá trình
ly tâm cũng như tốc độ phá vỡ cao tạo ra do không
gian giữa phần động và phần tĩnh.
• Thiết bị này được sử dụng phổ biến cho các đối với
tế bào động thực vật.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 23
French press
Thiết bị gồm một ống hình trụ tròn khớp với
một pittong đã được kết nối với bộ phận ép.
Dịch huyền phù tế bào được đặt giữa pittong
và ống trụ tròn.
Ống trụ tròn có một lỗ kết nối với vòi được
gắn trên đĩa, tại đây dịch được ép với vận tốc
lớn ra ngoài qua vòi phun.
Thể tích của thiết bị từ vài ml đến vài trăm ml.
Áp suất hoạt động 10000 đến 50000 psig.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 24

13. 2/20/2019
13
Siêu âm
Nguyên tắc:
• Sóng siêu âm tạo nên hiện tượng sủi bong bóng khi tần số âm thanh đủ
lớn để tạo nên vô số các vi bọt tại các vùng tập trung sinh khối trong
chất lỏng.
• Các bọt sẽ lớn lên trong pha giãn và xẹp đi trong pha nén của sóng âm
thanh. Việc xẹp bóng bọt sẽ chuyển năng lượng âm thanh thành năng
lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng
ngàn atm (300 MPa).
• Năng lượng này sẽ có tác dụng phá vỡ tế bào. Ngoài ra, các vi dòng có
các gradient vận tốc lớn cũng tăng khả năng phá vỡ tế bào.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 25
Siêu âm
• Quá trình phát sóng siêu âm có thể liên tục hoặc không
liên tục.
• Tần số phổ biến sử dụng là 25 kHz
• Sự phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm phụ thuộc vào loại
tế bào, thể tích mẫu và nồng độ tế bào.
• Đối với tế bào vi khuẩn như E. coli, sử dụng 30-60 giây
cho thể tích mẫu nhỏ. Đối với nấm men 2-10 phút.
• Ưu: đơn giản, phổ biến, hữu ích ở quy mô nhỏ. Nhược:
sinh nhiệt gây biến tính enzyme.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 26

14. 2/20/2019
14
Các phương pháp hóa học
• Chất tẩy rửa
• Dung môi hữu cơ
• Xử lý kiềm
• Sốc thẩm thấu
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 27
Chất tẩy rửa
Nguyên tắc: Trong điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion xác định, các
chất tẩy rửa phá vỡ cấu trúc của màng tế bào bằng cách hòa tan
phospholipid.
• Các hóa chất này được sử dụng chủ yếu để phá vỡ tế bào
động vật.
• Đối với vk, sử dụng chất tẩy rửa kết hợp với lysozyme.
• Đối với tế bào nấm mốc, thành tế bào phải được làm yếu trước
khi sử dụng chất tẩy rửa.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 28

15. 2/20/2019
15
Chất tẩy rửa
• Có thể phân chất tẩy rửa làm 3 loại: cationic, anionic (natri
laurysulfat) và non-ionic.
Chất tẩy rửa non-ionic (Triton – X hay Tween series) được ưa chuộng vì chúng ít gây
tổn thương đến protein và DNA.
Triton x – 100 sử dụng riêng rẽ hoặc cùng với các chất khác như guanidine – HCl được
dùng để trích ly các enzyme liên kết màng rất có hiệu quả
• Hạn chế: một lượng lớn protein bị biến tính hay kết tủa cần
được loại bỏ ra khỏi sản phẩm
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 29
Dung môi hữu cơ
• Nguyên tắc: hoạt động chủ yếu lên màng tế bào bằng cách hòa
tan phospholipid và biến tính các protein gắn trên đó.
• Một vài loại dung môi như toluene có thể phá vỡ thành tế bào.
• Hạn chế (tương tự với chất tẩy rửa): cần loại ra từ sản phẩm và
gây biến tính protein. So với chất tẩy rửa, dung môi dễ bay hơi
nên dễ được loại bỏ hơn.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 30

16. 2/20/2019
16
Xử lý kiềm
• Nguyên tắc: Xử lý kiềm ở pH giữa 11,5 và 12,5 sẽ làm thủy
phân màng tế bào và do đó sẽ giải phóng enzyme.
• Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho các enzyme bền trong
môi trường kiềm ít nhất trong khoảng 20 – 30 phút. Người ta
thường dùng phương pháp này để trích ly asparaginase từ
Erwinia chrysathemi.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 31
Sốc thẩm thấu
• Nguyên tắc: tao ra sự khác biệt về nồng độ chất tan xuyên qua
màng bán thấm. màng tế bao là màng bán thấm và sự chuyển tế
bào đột ngột từ môi trường đẳng trương (isotonic) sang môi trường
nươc (nhược trương – hypotonic) khiến nước tràn nhanh vào tế
bào, kết quả làm thể tích tế bào bị phồng to và sau đó bị vỡ.
• Phương pháp này dùng chủ yếu cho tế bào động vật có vú. Với tế
bào vi khuẩn và nấm , thành tế bào cần được làm yếu trước khi bị
phá vỡ bằng phương pháp sốc thẩm thấu.
• Phương pháp này được sử dụng để loại bỏ các chất ở khoang chu
chất (chủ yếu là protein) từ tế bào mà không cần sử dụng phương
pháp phá vỡ vật lý.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 32

17. 2/20/2019
17
Lysozyme
• Nguyên tắc: Lysozyme thường thủy phân lên kết β – (1,4) – glucosid
của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Lysozyme thường được liên kết với EDTA để
tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysaccarit và phá hủy
tế bào.
• Phá vỡ thành tế bào chủ yếu là vi khuẩn Gram dương.
• Sử dụng một mình lysozyme không thể phá vỡ được tế bào vì nó
không phân giải được màng plasma  kết hợp giữa lysozyme và
một chất tẩy rửa thường hay được sử dụng (tác dụng lên cả thành
và màng tb).
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 33
Lysozyme
• Lysozyme có trong nước bọt, lòng trắng trứng.
• Lysozyme từ lòng trắng trứng là enzyme dung giải duy nhất có
thể sử dụng ở quy mô thương mại.
• Hạn chế:
• chỉ áp dụng được ở quy mô nhỏ do các điều kiện thao tác kinh tế và
giá thành lysozyme cao, đồng thời cần loại lysozyme ra khỏi sản phẩm,
hiện diện của các enzyme khác như protease trong mẫu.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 34

18. 2/20/2019
18
Phương pháp cô đặc
- Làm tăng hoạt tính enzyme trong một khối dung dịch enzyme.
- Làm giảm chi phí và công sức và chi phí cho việc xử lý sau này.
- Tăng khả năng bảo quản enzyme.
- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản.
- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 35
Phương pháp cô đặc
• Kết tủa
• Biến tính chọn lọc
• Siêu lọc
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 36

19. 2/20/2019
19
Kết tủa
Có 2 loại kết tủa: kết tủa âm và kết tủa dương.
- Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần
thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần
thiết lại nằm trong phần tủa, còn protein tạp nằm trong phần
dung dịch
Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 37
Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4
• Nguyên tắc:
mỗi protein có một khoảng nồng độ muối mà tại đó protein enzyme sẽ bị kết tủa hoàn
toàn (khoảng nồng độ muối tích).
• Cách tiến hành:
Thêm vào dịch có chứa enzyme một lượng thể tích muối trung tính bão hòa hoặc
một lượng muối trung tính dạng rắn để có một độ phần trăm bão hòa nào đó của muối này
• Có thể dùng: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 ...
(NH4)2SO4 là tốt nhất vì an toàn, rẻ và phổ biến.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 38

20. 2/20/2019
20
Kết tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4
• Ưu điểm: đơn giản, dễ thu nhận chế phẩm enzyme
• Nhược điểm: cần loại bỏ muối (thẩm tích, sắc ký lọc gel)
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 39
Kết tủa dùng dung môi hữu cơ
• Nguyên tắc: giảm hằng số điện môi của dung dịch làm tăng lực hút tĩnh
điện giữa các phân tử protein làm cho các phân tử protein liên hợp tạo
thành kết tủa
• Mỗi enzyme được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau.
• Ưu điểm: không cần loại muối, và một số dung môi có thể chưng cất và thu hồi lại được.
• Nhược điểm: dễ làm vô hoạt enzyme,  tiến hành nhanh ở nhiệt độ thấp; chế phẩm có màu.
• Phương pháp này thường được sử dụng cho các enzyme ít bị biến tính
bởi dung môi hữu cơ, và ít được dùng ở quy mô lớn, do chi phí cao, dễ
gây cháy nổ.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 40

21. 2/20/2019
21
Kết tủa đẳng điện
• Một protein enzyme thường kết tủa ở điểm đẳng điện (pI) vì ở
pI các phân tử enzyme có tổng điện tích bằng 0 (không có lực
đẩy tĩnh điện), nên các phân tử enzyme sẽ kết hợp với nhau
tạo ra kết tủa.
• Có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các
enzyme và protein tạp khác Tiến hành lọc và li tâm để thu
hoặc loại bỏ các kết tủa
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 41
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 42

22. 2/20/2019
22
Tinh sạch enzyme
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 43
• Mục tiêu của quá trình tinh sạch
• Đặc điểm của enzyme và nguồn tạp
• Xây dựng phương pháp
Xác định mục tiêu
Lựa chọn phương pháp phù hợp đảm bảo thu nhận lượng
enzyme tinh sạch lớn với hoạt tính cao, đảm bảo tính kinh tế (chi
phí thấp, thời gian ngắn)
 Xác định mức độ tinh khiết cần đạt được của sản phẩm
Xác định nguồn tạp nhiễm quan trọng
Xác định bản chất của các nguồn tạp nhiễm còn lại ngay khi có thể.
Nguồn tạp nhiễm ảnh hưởng đến protein đích cần được loại bỏ đầu tiên (protease)
Mức độ tinh sạch càng cao càng tốt
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 44

23. 2/20/2019
23
Xác định đặc điểm của enzyme đích và nguồn tạp nhiễm
Mục đích: để lựa chọn phương pháp tinh sạch phù hợp và tránh làm
bất hoạt enzyme trong suốt quá trình tinh sạch
 Kích thước
 pI
 Tính kỵ nước
 Độ hòa tan
 Độ bền pH
 Độ bền nhiệt
 Ion
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 45
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 46

24. 2/20/2019
24
Sắc ký lọc gel
• Nguyên tắc: phân đoạn một số hỗn
hợp protein theo khối lượng phân tử
của chúng.
• Pha tĩnh là các hạt gel chứa đầy
trong cột (trơ, bền với các yếu tố về
cơ học cũng như sinh học. không có
tính đàn hồi và ưa nước)
 sephadex, polyacrylamide
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 47
Sắc ký lọc gel
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 48

25. 2/20/2019
25
Sắc ký trao đổi ion
• Nguyên tắc: dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các
protein enzyme.
- Nhựa trao đổi ion cationit
- Nhựa trao đổi ion anionit
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 49
Sắc ký trao đổi ion
Quá trình phân tách trên cột gồm 2 giai đoạn:
a) Hấp phụ thuận nghịch protein – enzyme cần tinh sạch vào
nhựa trao đổi ion.
b) Khử hấp phụ các protein đã hấp phụ bằng cách:
- Thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi ion hóa, do
đó thay đổi điện tích tổng của protein.
- Tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các
protein enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị
đẩy ra ngoài trước tiên và ngược lại.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 50

26. 2/20/2019
26
Sắc ký ái lực
Nguyên tắc: dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch
của một enzyme với một phân tử khác (phối tử), đã được gắn
bằng liên kết cộng hóa trị vào một chất mang không hòa tan
chứa trong cột.
Khi cho hỗn hợp protein chứa enzyme cần phân tách đi qua thì
chỉ có enzyme quan tâm bị giữ lại.
Tiếp đó, enzyme sẽ được rửa giải bằng các phương pháp khác
nhau.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 51
Sắc ký ái lực
• Kháng thể gắn kháng nguyên
• Niken- His tag
• GST tag (Glutathione-S-tranferase) ái lực cao với Glutathione
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 52

27. 2/20/2019
27
Sắc ký ái lực- chất mang
• hoàn toàn không hòa tan trong pha động.
• có độ bền về hóa học và sinh học.
• có độ cứng cơ học, có tính háo nước, tính thấm.
• không có các tương tác đặc hiệu.
• có chứa các nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa
trong điều kiện nhẹ nhàng.
 polyacrylamide, polystyrên, cross-linked dextran, agarose
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 53
Sắc ký ái lực
• Phối tử:
• những chất tương tự cơ chất của enzyme muốn làm
sạch
• đặc hiệu với enzyme, phải có một ái lực trung bình với
enzyme
• có nồng độ phù hợp nếu không nó sẽ gây ra những áng
ngữ không gian đáng kể.
• Cánh tay đòn:
• để phối tử tiếp cận dễ dàng với tâm hoạt động của
enzyme
• được cấu tạo từ hydrocacbon nhị chức có chiều dài từ
6 – 8 cacbon.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 54

28. 2/20/2019
28
Rửa giải enzyme
Dung dịch đệm rửa giải thường phải:
• Có chứa một phối tử (tự do) của enzyme có khả năng cạnh
tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với enzyme. Phối tử
cạnh tranh sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích.
• Dùng pH để gây biến tính thuận nghịch enzyme do đó làm biến
dạng tâm hoạt động của enzyme.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 55
SK ái lực
• Ưu: đơn giản, hiệu quả cao, tinh sạch trong thời gian ngắn
• Nhược: giá thành đắt
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 56

29. 2/20/2019
29
Chiến dịch tinh sạch 3 pha
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 57
Phát triển phương pháp phân tích
Mục tiêu: theo dõi tiến độ tinh sạch, đánh giá hiệu quả trong từng
bước (hoạt tính sinh học, hiệu suất thu hồi), từ đó tối ưu hóa quá
trình tinh sạch.
• Loại và lượng dung môi
• Lượng mẫu nạp vào (capacity)
• Độ phân giải (resolution)
• Phân đoạn nào chứa enzyme
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 58

30. 2/20/2019
30
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 59
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 60

31. 2/20/2019
31
Purification of GST-Blo t19 protein by using a Glutathione-
Sepharose 4B FF column and analyzed on an SDS-
polyacrylamide gel.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 61
Lanes M: standards (kDa)
1: flow-through sample
2: cell lysate supernatant
3: eluted protein fractions.
Thrombin cleavage of soluble GST-Blo t19 fusion protein (A)
and Blo t19 purification by FPLC (B).
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 62

32. 2/20/2019
32
Tạo sản phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme có thể tạo thành các loại sản phẩm sau:
enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù, enzyme dạng
bột khô, enzyme dạng viên nhỏ.
• Enzyme dạng dung dịch hay huyền phù có nhược điểm là
rất khó bảo quản. Do đó, người ta phải đưa chúng vào dung
dịch bảo quản và giữ ở nhiệt độ thấp ổn định.
• Enzyme dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ: thường dễ
bảo quản và khả năng bảo quản rất lâu.
Nguồn nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 63