Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/garmentspace https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGUYỄN NGỌC HÂN
NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA
CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO
LUẬN VĂN THẠC SĨ
SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Hà Nội - 2021

2. BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGUYỄN NGỌC HÂN
NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA
CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH
SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. TRẦN CẨM TÚ
2. TS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN
Hà Nội - 2021

3. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên
cứu của tôi, được thực hiện dựa trên những định hướng, góp ý của các cán bộ
hướng dẫn (Cô - TS. Trần Cẩm Tú và Cô - TS. Nguyễn Thị Thương Huyền). Các kết
quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được công bố ở bất cứ
công trình nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu và kết quả trong
luận văn này./.
Học viên
Nguyễn Ngọc Hân

4. ii
LỜI CẢM ƠN
Nhìn lại chặng đường học tập và nghiên cứu, với những kết quả đạt được hôm
nay, trước tiên, em xin cảm ơn Cô - TS. Trần Cẩm Tú và Cô - TS. Nguyễn Thị
Thương Huyền đã luôn dành nhiều thời gian tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến
thức, định hướng phương pháp nghiên cứu và cả kỹ năng, kinh nghiệm làm việc.
Trong thời gian qua, có đôi lúc em chưa thật sự quyết tâm nhưng được sự cảm
thông sâu sắc, động viên, chia sẻ của Cô, giúp em có thêm động lực để vượt qua
những khó khăn, áp lực để hoàn thành nghiên cứu này. Một lần nữa, với lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn Cô thật nhiều!
Trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo khoa, phòng Đào tạo, các phòng chức năng
của Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện cho tôi và tất cả các học viên
được tiếp cận với môi trường học tập tích cực, hiệu quả.
Xin cảm ơn quý Thầy Cô công tác tại Viện Sinh học nhiệt đới và quý Thầy Cô
công tác tại khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM đã giúp đỡ tôi trong
trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Chân thành cảm ơn em Trương Thị Thuý đã luôn nhiệt tình cùng đồng hành,
hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm Giải phẫu sinh lý
người và động vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM.
Lời tri ân sâu sắc nhất xin gửi đến gia đình vì đã luôn khích lệ, nâng đỡ, sẻ
chia công việc để tôi có thể chuyên tâm hoàn thành chương trình học!
Học viên
Nguyễn Ngọc Hân

5. iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
NỘI DUNG ................................................................................................................5
Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU..........................................................5
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ DA..................................................................................5
1.1.1. Cấu tạo da..............................................................................................5
1.1.2. Cấu trúc mô da ......................................................................................6
1.1.3. Dấu hiệu lão hoá da...............................................................................8
1.1.4. Nguyên nhân lão hoá da........................................................................9
1.2. TỔNG QUAN VỀ GIẢI PHẪU DA CHUỘT NHẮT TRẮNG MUS
MUSCULUS VAR. ALBINO ............................................................................11
1.2.1. Khái quát về chuột trắng Mus musculus var. albino...........................11
1.2.2. Cấu trúc da của chuột trắng Mus musculus var. albino ......................11
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ TIA UV ........................................................................13
1.3.1. Các loại tia UV....................................................................................13
1.3.2. Cơ chế tác động của tia UV đối với da ...............................................14
1.4. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN ...............................................................14
1.4.1. Cấu trúc ...............................................................................................15
1.4.2. Phân loại..............................................................................................15
1.4.3. Cơ chế tổng hợp collagen....................................................................16
1.5. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ ................................................16
1.6. DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO.............................................................17
1.6.1. Tổng quan cấu trúc và chức năng nhau thai heo.................................17
1.6.2. Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết nhau thai heo .................................18
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................19
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................19
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................19
2.3. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.................................................20
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................21
2.4.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và bảo quản tế bào .....................................23

6. iv
2.4.2. Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế bào gốc
trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời ..............................................................24
2.4.3. Khảo sát sự biểu hiện gene Collagen type IV (Col-IV) của tế bào gốc
trung mô ........................................................................................................26
2.4.4. Phƣơng pháp xây dựng mô hình chuột bị ảnh hƣởng bởi tia UV.......26
2.4.5. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản mô học.............................................28
2.4.6. Phƣơng pháp so sánh đối chiếu tiêu bản mô học................................29
2.4.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm về khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá
da chuột của dịch chiết nhau thai heo ...........................................................31
2.4.8. Phƣơng pháp xử lí số liệu ...................................................................32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................33
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO
LÊN SỰ TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ MÔ MỠ
NGƢỜI..............................................................................................................33
3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độ dịch chiết tối ƣu.........................................33
3.1.2. Sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ngƣời.37
3.1.3. Biện luận .............................................................................................38
3.2. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT LÃO HOÁ DA BỞI TIA UV........38
3.2.1. Ảnh hƣởng ở mức đại thể....................................................................38
3.2.2. Ảnh hƣởng cấu trúc vi thể của da .......................................................41
3.2.3. Biện luận .............................................................................................45
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA
DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO NỒNG ĐỘ 100 μg/mL..............................48
3.3.1. Kết quả ở mức đại thể .........................................................................48
3.3.2. Kết quả ở mức vi thể...........................................................................50
3.3.3. Biện luận: ............................................................................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

7. v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Tia UV: Tia cực tím
MSC: Tế bào gốc trung mô
ATMSC: Tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ ngƣời
ASC: Tế bào gốc trƣởng thành
DMEM: Môi trƣờng nuôi cấy tế bào
FBS: Huyết thanh nuôi cấy tế bào
PBS: Dung dịch đệm nuôi cấy tế bào
bFGF: Yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi
Col-IV/Col4: Collagen loại IV
HE: Phƣơng pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin
ECM: Cấu trúc ngoại bào
TGF: Yếu tố tăng trƣởng chuyển đổi
HPLC: Sắc kí lỏng cao áp
ROS: Gốc oxy hoá tự do
MMP: Enzyme thuỷ phân protein cấu trúc

8. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự tƣơng quan cấu tạo giữa da chuột và da ngƣời...........................12
Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ................................................19
Bảng 2.2. Đặc điểm cấu trúc da ở các mức độ lão hoá ....................................31
Bảng 3.1. Kết quả phân tích amino acid của dịch chiết nhau thai heo.............34
Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng có trong dịch chiết nhau
thai heo......................................................................................................................35
Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của mốc thời gian
chiếu UV ...................................................................................................................43
Bảng 3.4. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da chuột ở các nghiệm thức khảo sát......53

9. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Mô hình ba chiều của da ở động vật có vú.........................................5
Hình 1.2. Các lớp của biểu bì.............................................................................6
Hình 1.3. Bức xạ UV trong ánh sáng mặt trời..................................................13
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của nghiên cứu .............................21
Hình 2.2. Bố trí chuồng nuôi chuột thí nghiệm................................................27
Hình 2.3. Hình chuột sau khi đƣợc cạo lông....................................................28
Hình 2.4. Phƣơng pháp thu nhận mẫu da .........................................................29
Hình 2.5. Đo độ dày biểu bì dƣới kính hiển vi với phần mềm S-Eyes ............30
Hình 3.1. ATMSCs có hình dạng thoi dài đặc trƣng........................................33
Hình 3.2. ATMSCs biệt hoá thành tế bào mỡ và tế bào xƣơng .......................33
Hình 3.3. Hình thái ASC trƣớc và sau khi bổ sung dịch chiết 12h ..................36
Hình 3.4. Biểu đồ đƣờng cong tăng trƣởng của tế bào ATMSCs dƣới tác động
của dịch chiết nhau thai heo ở các nồng độ ..............................................................36
Hình 3.5. Kết quả biểu hiện gene Col-IV.........................................................37
Hình 3.6. Chuột đƣợc cạo lông trƣớc khi chiếu UV ........................................39
Hình 3.7. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV sau 8 tuần chiếu UV..................40
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì sau 8 tuần thí nghiệm .........41
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì dƣới tác động của UV ...................42
Hình 3.10. Cấu trúc collagen ở các mức độ lão hoá dƣới tác động của UV....42
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc
collagen dƣới tác động của UV.................................................................................43
Hình 3.12. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV và hiệu quả ngăn ngừa lão hoá
của các sản phẩm sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức .............................................48
Hình 3.13. Kết quả độ dày biểu bì da chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở các
nghiệm thức...............................................................................................................50
Hình 3.14. Biểu đồ độ dày biểu bì da chuột ở các nghiệm thức khảo sát........51
Hình 3.15 Cấu trúc Collagen ở các mức độ lão hoá trong thí nghiệm.............52
Hình 3.16. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc
collagen ở các nghiệm thức khảo sát ........................................................................53

10. 1
MỞ ĐẦU
Những năm gần đây, sự biến đổi khí hậu và tác động từ môi trƣờng sống ô
nhiễm đã gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe cũng nhƣ làm tăng nguy cơ lão hóa
da sớm. Do đó, nhu cầu làm đẹp cho da và điều trị những vấn đề về da ngày càng
đƣợc mọi ngƣời quan tâm. Đặc biệt, công nghệ làm đẹp hiện nay đang hƣớng tới
những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật, động vật. Nhằm đáp ứng nhu
cầu thẩm mỹ ngày càng cao, nhiều nghiên cứu tập trung vào nguồn nguyên liệu từ
nhau thai động vật nhƣ nhau thai cừu, nhau thai ngựa, nhau thai bò, nhau thai heo,...
So với các nguồn nhau thai từ động vật, nhau thai heo có nguồn cung cấp ổn định
hơn đáp ứng đƣợc việc cung cấp nguyên liệu ổn định, phục vụ nhu cầu sản xuất lâu
dài và bền vững do số lƣợng heo đƣợc chăn nuôi nhiều và thời gian mang thai, sinh
sản của heo ngắn hơn.
Chiết xuất nhau thai ngày nay đƣợc sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực lâm
sàng, mỹ phẩm do chứa các hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm kích thích tố,
protein, peptide, các yếu tố tăng trƣởng, axit nucleic, glycosaminoglycans và
polydeoxyribonucleotides rất quan trọng cho sự tăng trƣởng và phát triển của bào
thai [1]. Nhau thai chứa các enzyme nhƣ phosphatase kiềm axit và transaminase
oxit glutamic, cũng nhƣ axit nucleic, vitamin, axit amin, steroids, axit béo và
khoáng chất [2, 3]. Nhau thai là một loại thuốc truyền thống đƣợc sử dụng để chữa
lành vết thƣơng do đặc tính miễn dịch và chống viêm nên đƣợc sử dụng nhƣ là một
bổ sung mỹ phẩm ở nhiều nƣớc châu Á [2, 4].
Các nghiên cứu tập trung vào hai nguồn chính là nhau thai ngƣời và nhau thai
từ động vật. Mặc dù nhau thai ngƣời có hiệu quả trị liệu cao hơn so với nguồn nhau
thai từ các động vật khác nên rất đƣợc ƣa chuộng nhƣng việc thu thập nguồn nhau
thai ở ngƣời rất khó khăn. Do đó, hiện nay các nguồn nhau thai từ động vật nhƣ
nhau thai ngựa, nhau thai cừu, nhau thai bò, nhau thai heo,… đang dần đƣợc nghiên
cứu rộng rãi để phục vụ nhu cầu điều trị và chăm sóc sức khỏe, sắc đẹp. Chiết xuất
từ nhau thai heo so với nhau thai ngƣời có sự tƣơng đồng cao về DNA, lại có hiệu
quả vƣợt trội nên rất tƣơng thích với cơ thể ngƣời. Bởi vì nhau thai heo tƣơng đối
an toàn và hiệu quả nên nó đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một mỹ phẩm bổ sung [2].
Tuy nhiên, hiện nay nghiên cứu về hiệu quả của dịch chiết từ nhau thai heo
trong việc ngăn ngừa tổn thƣơng da do tia cực tím (UV) gây ra hiện nay chƣa đƣợc
nghiên cứu chi tiết. Trên cơ sở đó, đề tài: “Nghiên cứu hiệu quả ngăn ngừa lão hoá
da của dịch chiết nhau thai heo” đƣợc thực hiện.

11. 2
Mục đích nghiên cứu:
Đánh giá đƣợc hiệu quả chống lão hóa da của dịch chiết từ nhau thai heo từ
kết quả thử nghiệm in vitro và in vivo.
Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nhau thai heo với các nồng độ khác nhau
lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ngƣời và xác định nồng độ tối ƣu và
khảo sát sự biểu hiện của gene liên quan sự lão hoá dƣới tác động của dịch chiết ở
nồng độ tối ƣu.
- Tạo mô hình chuột lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của tia cực tím (UV).
- Khảo sát hiệu quả của dịch chiết nhau thai heo trên mô hình chuột nhắt trắng
bị gây lão hoá da.
Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài:
Các nghiên cứu về hại của tia UV đối với da đã đƣợc thực hiện trong nhiều
năm qua, trong đó phải kể đến một số công trình tiêu biểu sau:
Năm 2017, Bhattacharyya và cộng sự đã xây dựng mô hình để đánh giá các
đặc điểm mô học của da ở chuột dƣới sự ảnh hƣởng của UV và chế độ ăn. Mô hình
đƣợc thực hiện trên chuột cái không lông (độ tuổi 6 - 8 tuần). Da lƣng của chuột
đƣợc tiếp xúc với mô hình gồm 4 đèn UV đƣợc trang bị bộ điều khiển điện tử để
điều chỉnh liều lƣợng tia cực tím. Đèn phát ra tia UV (bƣớc sóng 314 nm). Việc
chiếu UV đƣợc thực hiện 3 lần một tuần trong 10 tuần cho những con chuột đƣợc di
chuyển tự do trong lồng. Lƣợng phóng xạ tăng dần từ 45 mJ/cm 2
- 180 mJ/cm 2
.
Sau 10 tuần thí nghiệm, nhiều đặc điểm mô bệnh học đƣợc quan sát thấy ở vùng da
tiếp xúc lâu dài với tia UV có sự dày lên của biểu bì, hình thành nếp nhăn và thay
đổi cấu trúc da, nhƣ tổn thƣơng collagen I, tăng sản xuất sợi đàn hồi và xơ hoá. Mặt
khác, nhóm này còn ghi nhận đƣợc cận nặng cơ thể chuột giảm khi bị chiếu UV so
với nhóm chuột không bị chiếu [5].
Năm 2016, Lan Wang và cộng sự có nghiên cứu về tác hại của UV lên da
chuột. Nhóm tiến hành chiếu UVB/UVA trên da chuột đƣợc cạo lông vùng lƣng
trong 10 tuần (5 ngày trong tuần), cƣờng độ tối thiểu 100 mJ/cm2
trong tuần đầu và
tăng dần từng tuần cho đến tuần thứ 4 đạt 400 mJ/cm2
thì duy trì đến hết thời gian
thí nghiệm. Kết quả cho thấy sau 10 tuần chiếu, da lƣng của chuột có hiện tƣợng
thô, dạng sóng, ban đỏ, phù nề và bỏng da; độ dày trung bình của biểu bì chuột ở
nhóm chiếu UV tăng gấp 4,63 lần so với nhóm đối chứng (không chiếu UV, 15,62

12. 3
µm). Sự xuất hiện những thay đổi bất thƣờng ở da đã chứng minh rằng mô hình
ảnh ở chuột đã đƣợc thiết lập thành công. Ngƣợc lại, những con chuột trong nhóm
chƣa đƣợc chiếu xạ cho thấy không có các vết nhăn cũng nhƣ tổn thƣơng, chứng
minh rằng hoạt động cạo lông không gây tổn thƣơng vĩ mô đối với da [6].
Năm 2015, Yoon Jung Kim và cộng sự nghiên cứu phƣơng pháp châm cứu ức
chế tác hại của tia UV gây lão hoá ở chuột không lông. Thí nghiệm thực hiện trên
chuột cái đã loại bỏ lông, n = 20, đƣợc bố trí thành 4 lô thí nghiệm, bình thƣờng,
đƣợc điều trị bằng châm cứu (TEA - Thread Embedding Acupuncture), đƣợc chiếu
xạ UV và kết hợp chiếu xạ với điều trị bằng TEA. Kết quả cho thấy, so với những
con chuột bình thƣờng, da của những con chuột đƣợc chiếu tia cực tím khô, thô ráp
và bong tróc. Các nếp nhăn của chuột bình thƣờng mỏng và nông, độ dày biểu bì
bình thƣờng; trong khi những con chuột chiếu tia cực tím cho thấy nếp nhăn dày và
sâu, độ dày biểu bì lớn hơn. Trong khi đó, nhóm chuột chiếu UV kết hợp với điều
trị TEA cho thấy sự phục hồi nếp nhăn theo tỉ lệ phần trăm vùng nhăn, chiều dài
nếp nhăn và độ sâu nếp nhăn so với những con chuột đƣợc điều trị bằng UVB đơn
thuần, tuy nhiên không có thay đổi đáng kể nào đƣợc quan sát thấy [7].
Năm 2014, Xue-Xuan Feng và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác hại của tia
UV lên da chuột với liều chiếu 15 mJ/cm2
trong 9 tuần (5 ngày trong tuần), diện tích
da đƣợc cạo lông 2,5 x 3 cm2
. Kết quả cho thấy sau 5 tuần chiếu da xuất hiện ban đỏ
nhẹ và có nếp nhăn thô; sau 9 tuần thí nghiệm, da hình thành nếp nhăn sâu, cấu trúc
da lỏng lẻo, ban đỏ nặng, bong da, bong vảy. Về cấu trúc vi thể cho thấy có sự sừng
hoá bất thƣờng: collagen bị rối, mật độ giảm và bị đứt gãy, thậm chí không còn giữ
đƣợc cấu trúc [8].
Năm 2009, Kim và cộng sự đã xây dựng mô hình liên quan đến tác dụng của
tia UV lên da chuột với các chỉ tiêu đánh giá bao gồm nếp nhăn da, độ dày của da
và độ đàn hồi của da. Chuột đực 6 tuần tuổi đƣợc chiếu xạ UVB loại 15 W với bƣớc
sóng 312 nm và cƣờng độ 100 W/cm2
(tƣơng ứng với cƣờng độ chiếu 36 mJ/cm2
).
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong 12 tuần với tần số chiếu xạ 3 lần/tuần và cƣờng độ
thay đổi qua các tuần: từ 54 mJ/cm2
; đến 122 mJ/cm2
. Nếp nhăn đƣợc đƣợc nhận
thấy ở mức độ vĩ mô từ tuần thứ 6 sau khi bắt đầu chiếu UVB. Sau 12 tuần chiếu
UV, độ dày biểu bì tăng đáng kể từ tuần 2 - 12; độ đàn hồi giảm nhanh kể từ tuần 8
- 12; từ tuần 6, bắt đầu xuất hiện các nếp nhăn trên diện rộng. Sự xuất hiện những
thay đổi bất thƣờng ở da đã chứng minh rằng mô hình ảnh ở chuột đã đƣợc thiết lập
thành công và là nền tảng để thực hiện các thí nghiệm khác [9].

13. 4
Nếp nhăn gây ra bởi lão hoá, di truyền, các yếu tố môi trƣờng nhƣ tia cực tím,
khói thuốc và sự suy giảm estrogen. Trong số này, tuổi tác là yếu tố có liên quan
mật thiết tới nếp nhăn quanh mắt. Da trở nên mỏng hơn, khô hơn và giảm dần tính
đàn hồi. Theo kết quả từ nhóm nghiên cứu của trƣờng Đại học Kanazawa (Nhật
Bản), chiết xuất nhau thai heo 100% là một lựa chọn tối ƣu để cải thiện nếp nhăn
quanh mắt nhờ khả năng kích thích sản sinh collagen từ nguyên bào sợi dƣới da và
ức chế sự tiết enzyme phân huỷ collagen - Metalloproteinase (MMP)-9 [2].
Rất nhiều nghiên cứu trên tạp chí Obstetrics & Gynecology đã chứng minh
chiết xuất nhau thai heo (tên thƣơng mại là Laennec P.O. Porcine) có hiệu quả cải
thiện đáng kể các dấu hiệu lão hoá trên da ở phụ nữ lớn tuổi mà không làm thay đổi
các chỉ số xét nghiệm máu. Điều này cho thấy chiết xuất từ nhau thai heo có hiệu
quả và an toàn đối với cơ thể ngƣời.
Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này vẫn chƣa có một nghiên cứu cụ thể đƣợc
tiến hành để đánh giá về mức độ lão hoá và tổn thƣơng do tia UV gây ra và hiệu quả
ngăn ngừa lão hóa da của dịch chiết nhau thai heo. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu hiệu
quả ngăn ngừa lão hoá da của dịch chiết nhau thai heo” đƣợc thực hiện. Đây là một
nghiên cứu cơ bản nhằm hƣớng tới các nghiên cứu tiếp theo ở mức sâu hơn để dần
tiến tới thƣơng mại hoá sản phẩm có thành phần từ dịch chiết nhau thai heo.

14. 5
NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ DA
1.1.1. Cấu tạo da
Da là mô lát tầng, là một loại mô liên kết biểu bì. Cấu trúc của da có nhiều lớp
tế bào, trong đó các lớp ngoài luôn bị thoái hoá, bong ra và thay thế bằng các lớp tế
bào bên dƣới. Nguồn gốc của sự thay mới thƣờng xuyên này là do một lớp tế bào
của da ở vị trí tiếp giáp với mô liên kết có khả năng thƣờng xuyên tạo tế bào mới
[10].
Ở động vật có vú nói chung và ở con ngƣời nói riêng, da có cấu tạo gồm 3 lớp
chính: biểu bì, trung bì và hạ bì (hình 1.1) [11].
Hình 1.1. Mô hình ba chiều của da ở động vật có vú [11]

15. 6
1.1.2. Cấu trúc mô da
1.1.2.1. Lớp biểu bì
Lớp ngoài cùng của da, gồm nhiều lớp tế bào mô xếp dính chặt với nhau, dày
từ 0,07 - 1,8 mm. Lớp biểu bì gồm 5 lớp tế bào: lớp mầm, lớp gai, lớp hạt, lớp bóng
và lớp tế bào sừng (hình 1.2) [11].
Hình 1.2. Các lớp của biểu bì [11]
Lớp đáy (Stratum germinatum): đƣợc tạo thành bởi một hàng tế bào khối
vuông và trụ có khả năng phân chia liên tục, sản sinh ra các tế bào cho lớp biểu bì.
Gồm các loại tế bào: tế bào sừng, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans và tế bào
Merkel [11].
Lớp gai (Stratum spinosum hoặc filamentosum): Gồm các tế bào có hình khối
đa diện, nhân tròn, nằm trên lớp đáy, có 7 - 15 tầng tế bào. Những khe trống giữa
các tế bào này chứa dịch nuôi đƣợc tạo ra từ lớp nhú của trung bì để trao đổi dinh
dƣỡng với tế bào biểu bì. Các khe trống này bảo đảm cho sự chuyển hoá, tăng
trƣởng và biệt hoá của các tế bào sừng. Các đầu tận cùng của dây thần kinh nhận
cảm giác đau cũng nằm rải rác trong các khe này [11].
Lớp hạt (stratum granilosum): Gồm những tế bào dẹt có nhân chứa các chất
sừng trong suốt. Các tế bào này không chỉ tổng hợp, biến hoá và nối tiếp chéo các
protein mới trong quá trình sừng hoá mà còn làm nhiệm vụ tự hủy theo chƣơng
trình để biến từ tế bào hạt thành tế bào sừng [11].

16. 7
Lớp bóng (stratum lucidum): Là lớp tế bào trong suốt, đƣợc hình thành tạo nên
từ lớp đáy, các lớp tế bào già đƣợc đẩy dần ra khỏi môi trƣờng nuôi dƣỡng và sự
biệt hoá cũng hoàn thành. Lớp bóng nằm ngay dƣới lớp tế bào sừng, có chức năng
giữ cho da không bị mất nƣớc và bảo vệ lớp tế bào phía dƣới đối với các tác động
cơ học [11].
Lớp sừng (Stratum corneum): Là lớp ngoài cùng có 15 - 20 tầng tế bào, có
hình khối dẹt rộng, hoặc hình đa diện. Các tế bào này đã mất khả năng sống, hoàn
toàn sừng hoá. Chúng dính chặt vào lớp tế bào trong suốt tạo thành một lớp bảo vệ
ngoài cùng của da [11].
1.1.2.2. Lớp trung bì
Trung bì nằm dƣới lớp biểu bì, dày từ 0,7 - 7 mm, dày hơn chiều dày của biểu
bì từ 15 - 40 lần. Trung bì là một lớp xơ rất chắc, đƣợc tạo nên từ các chất nền (chất
gian bào), các tế bào liên kết, bó sợi liên kết, sợi đàn hồi, các tuyến ống, cơ dựng
nang lông, mạch máu và dây thần kinh. Nguyên bào sợi đƣợc coi là tế bào chủ của
trung bì, chúng sản sinh ra chất keo mạng lƣới (reticular collagen), các sợi đàn hồi
và các chất nền của trung bì. Trung bì gồm hai lớp: lớp nhú và lớp dƣới [11].
Lớp nhú (Papillary dermis): Là một lớp tế bào mỏng, nằm sát ngay dƣới màng
nền và lớp tế bào mầm của lớp đáy hình thành nhiều gai nhú gồ lên hình làn sóng.
Lớp nhú có các sợi tơ tạo keo, sợi tơ đàn hồi, chất keo đặc giữa các sợi tơ và các tế
bào liên kết, bạch cầu, tế bào Langerhans... Lớp nhú là nơi trao đổi các yếu tố tăng
trƣởng, cytokine và các chất cơ bản của trung bì gắn kết với các tế bào biểu bì qua
thụ cảm xuyên màng [11].
Lớp lƣới (Reticular dermis): Có chiều dày 4 - 5 mm, có ít tế bào và mạch hơn
lớp nhú. Lớp lƣới chứa các bó sợi liên kết gồm các sợi tạo keo, sợi đàn hồi, các sợi
bắt màu bạc. Lớp lƣới chia làm hai vùng: vùng trên (nông) có nhiều tế bào liên kết,
nguyên bào sợi, tế bào viêm, các bó keo, các sợi chung dãn xếp theo hƣớng ngang
và vùng dƣới (sâu). Chức năng của lớp lƣới là làm nền cho da bền chắc [11].
1.1.2.3. Lớp hạ bì
Là một lớp mô liên kết - mỡ, dày 0,25 mm đến vài cm. Hạ bì gồm 3 lớp: lớp
mỡ, lớp chân nông và lớp tế bào dƣới da.
Lớp mỡ: các bó xơ dày, to, hình nón quây thành những khoang chứa các tế
bào mỡ. Chúng góp phần tạo hình, dự trữ năng lƣợng và cách nhiệt.
Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1 mm.

17. 8
Lớp tế bào dƣới da: là mô liên kết lỏng lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên
cơ, gân, xƣơng. Các tổ chức tế bào lỏng lẻo này có khả năng thấm nƣớc và các chất
hòa tan của dịch [12].
1.1.3. Dấu hiệu lão hoá da
1.1.3.1. Dấu hiệu bên ngoài
Có 3 biểu hiện chính của làn da lão hoá. Mỗi biểu hiện có ảnh hƣởng đến vẻ
ngoài của da bằng mỗi cách khác nhau [12, 13].
Nếp nhăn
Dấu hiệu đầu tiên có thể nhận biết lão hoá là các nếp nhỏ và nếp nhăn. Các
nếp này xuất hiện ở các vùng khác nhau của da và là dấu hiệu dễ nhận biết nhất của
lão hoá da. Xuất hiện đầu tiên là các nếp nhăn. Chúng đƣợc liên kết với sự chùng
xuống của da và thƣờng gắn liền với sự giảm thể tích da [12].
Sự giảm mật độ da
Một tình trạng da phổ biến của lão hoá da là giảm mật độ da, chúng biểu thị rõ
ràng trên bề mặt làm da mỏng và yếu hơn. Không giống nhƣ nếp nhăn hay sự giảm
thể tích, sự giảm mật độ da ảnh hƣởng đến làn da hơn là chỉ tập trung ở một vùng
nhất định. Chúng thƣờng gắn liền với các nếp nhăn sâu và có xu hƣớng làm da nhìn
có vẻ xỉn màu [12].
Sự giảm thể tích da
Sự giảm thể tích da thông thƣờng thì rất khó để nhận biết, và cũng đƣợc biết là
nhƣ là sự chảy xệ của da, sự mất đi các đƣờng nét. Không giống nhƣ sự giảm mật
độ hay nếp nhăn, chúng thay đổi toàn bộ vẻ bên ngoài da theo cách mà da bị biến
đổi nhƣng rất khó để xác định chính xác. Dễ nhận biết nhất là sự thu nhỏ thể tích da
và các đƣờng nét của làn da bị chùng xuống, lỏng lẻo [12].
1.1.3.2. Dấu hiệu bên trong
Những sự thay đổi trong các lớp da sẽ thể hiện lên bề mặt da nhƣ là các dấu
hiệu của lão hoá.
Lớp biểu bì
Quá trình tái tạo tế bào chậm hơn và sự sản sinh lipid bị suy giảm làm cho làn
da bị khô ráp và sần sùi. Khi có hiện tƣợng lão hoá xảy ra, lớp da này trở nên nhạy
cảm hơn với tia UV. Lúc này, vai trò của da trong việc tự lành vết thƣơng ít hiệu

18. 9
quả hơn và chức năng miễn dịch suy yếu, dẫn đến việc khả năng da bị nhiễm trùng
rất cao, và các vết thƣơng tự lành rất chậm [12].
Lớp trung bì
Mỗi năm, làn da bị mất đi lƣợng collagen tự nhiên, cùng với sự thiếu hụt chất
elastin đã làm cho các mô trung bì bị phá hủy. Lúc này cấu trúc của da bị tổn
thƣơng và xuất hiện các nếp nhăn. Kế đến, sự đàn hồi của da suy giảm, làn da có xu
hƣớng bị tổn thƣơng và các mao mạch bị phá vỡ, lƣu thông máu kém dẫn đến việc
vận chuyển các chất dinh dƣỡng và oxy đến bề mặt da không đƣợc hiệu quả. Kết
quả cuối cùng làm cho làn da không còn hồng hào và trở nên yếu hơn [12].
Lớp hạ bì
Ở các lớp da sâu hơn, các thay đổi đáng chú ý là về kích thƣớc và số lƣợng các
tế bào tạo lipid ở các lớp mỡ dƣới da. Chúng bị sụt giảm làm ảnh hƣởng rất lớn đến
việc giảm thể tích da, và có thể làm cho các nếp nhăn sâu hơn, da bị hõm vào và các
vết thƣơng khó tự lành đƣợc [12].
Lão hoá đƣợc gây ra bởi các sự thay đổi xảy ra ở mỗi lớp của da, ảnh hƣởng
đến cả hình dạng và cấu trúc các thành phần trong da.
1.1.4. Nguyên nhân lão hoá da
1.1.4.1. Nguyên nhân bên trong
Một số các nguyên nhân gây nên lão hoá da là không thể tránh đƣợc và không
thể thay đổi đƣợc. Tuổi sinh học của mỗi loài động vật có vú nói chung và con
ngƣời nói riêng quyết định sự thay đổi cấu trúc da và tính hiệu quả của chức năng
của các tế bào. Qua thời gian, những tác nhân bên ngoài, đặc biệt là ánh sáng mặt
trời sẽ tác động đến các mô liên kết, các sợi collagen, elastin bên trong da làm cho
da bị lão hoá [12].
Yếu tố di truyền (đột biến gen, sự biến dƣỡng của tế bào, sự thay đổi nội tiết
tố) đóng vai trò quan trọng trong việc lão hoá da. Sắc tộc và loại da mà chúng ta có
đƣợc từ lúc sinh ra tạo nên sự khác biệt về độ nhanh chậm mà các dấu hiệu lão hoá
xảy ra trên bề mặt của da. Ví dụ nhƣ làn da khá nhạy cảm thì có thiên hƣớng có nếp
nhăn ở độ tuổi sớm, trong khi làn da châu Á thì dễ bị chứng không đều màu da và
các nếp nhăn xuất hiện trễ hơn. Sự khô ráp da do tuổi tác cao có thể là do yếu tố di
truyền học của mỗi ngƣời [12, 14].

19. 10
1.1.4.2. Nguyên nhân bên ngoài
Các nhân tố bên ngoài đẩy nhanh sự lão hoá đều do sự oxy hoá da. Đây là sự
giải phóng các phân tử đƣợc gọi là các gốc tự do hay các loại phản ứng oxy trong cơ
thể. Thuyết các gốc tự do về quá trình lão hoá cho rằng chúng ta già đi là bởi sự
tích lũy của các gốc tự do gây hại theo thời gian. Gốc tự do là một nguyên tử rất dễ
bay hơi hay là phân tử có chứa các electron riêng lẻ ở lớp vỏ bên ngoài. Phần lớn
các gốc tự do có khả năng làm tổn thƣơng cấu trúc tế bào bao gồm lipid và protein.
Các gốc tự do bị giữ và trung hòa bởi các chất chống oxy hoá có trong da. Tuy
nhiên, theo thời gian, chức năng làm các gốc tự do không hoạt động đƣợc của da bị
suy yếu. Kết quả là gây tổn thƣơng đến các thành phần cấu thành tế bào. Sự oxy hoá
da còn bị ảnh hƣởng bởi các nhân tố về lối sống [12, 13].
Ánh nắng mặt trời
Tiếp xúc nhiều với ánh nắng mặt trời là nhân tố bên ngoài cơ bản gây ra việc
lão hoá da thông qua sự oxy hoá da. Da bị thƣơng tổn do phơi nắng quá nhiều và
tiếp xúc với tia UV mỗi ngày đƣợc gọi là chứng làm cho da mất cân bằng sắc tố [15].
Ô nhiễm
Việc da tiếp xúc với ô nhiễm môi trƣờng quá mức có thể làm cho giải phóng
các gốc tự do gây hại cho da. Đồng thời khi da tiếp xúc nhiều dƣới ánh nắng mặt
trời làm quá trình oxy hoá da nhanh hơn [13, 16].
Hút thuốc lá
Các chất hoá học và nicotin trong thuốc lá là nguyên nhân gây nên sự gia tăng
các gốc tự do ở da. Giống nhƣ ô nhiễm môi trƣờng, việc hút thuốc lá sẽ thúc đẩy
quá trình oxy hoá da nhanh hơn [12, 13].
Chế độ dinh dưỡng
Các chất chống oxy hoá là các phân tử với khả năng trung hòa các gốc tự do
gây hại và làm da nhanh lão hoá. Một chế độ ăn thiếu các chất chống oxy hoá sẽ gia
tăng quá trình lão hoá. Ăn nhiều trái cây và rau củ có chứa các chất chống oxy hoá
là một phần quan trọng của phƣơng pháp khoa học ngăn chặn quá trình lão hoá xảy
ra [12, 14].

20. 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ GIẢI PHẪU DA CHUỘT NHẮT TRẮNG MUS
MUSCULUS VAR. ALBINO
1.2.1. Khái quát về chuột trắng Mus musculus var. albino
Nòi: Chuột trắng Mus musculus var. albino Linnaeus, 1758
Loài: Chuột trắng Mus musculus Linnaeus, 1758
Giống: Chuột Mus Linnaeus,1758
Họ: Chuột Muridae
Phân bộ: Răng đơn hàng Simplicidentata
Bộ: Gặm nhấm Rodentia
Tổng bộ: Gặm nhấm Glires
Phân lớp: Thú nhau Placentalia
Lớp: Thú (Hữu nhũ có vú) Mammalia
Tổng lớp: Động vật có bốn chân Tetrapoda
Phân ngành: Có xƣơng sống Vertebrata hay có hộp sọ Craniota
Ngành: Có Dây sống Chordata
Giới: Động vật Animalia [17].
Chuột nhắt trắng tên Latinh là Mus musculus var. albino, hình dạng tƣơng tự
với chuột nhắt nhà. Chuột nhắt trắng có đặc điểm: lông trắng, mắt sáng, tai vểnh,
đuôi dài, miệng thuyền. Chuột mới sinh nặng 1 - 2 g, chuột trƣởng thành (8 - 12
tuần tuổi) dài 12 - 15 cm (tính từ mũi tới chóp đuôi), nặng từ 18 – 35 g [18, 19].
Chuột nhắt trắng thành thục giới tính sau khoảng 4 - 6 tuần tuổi, mang thai từ
19 - 21 ngày, chu kì động dục 3 - 5 ngày, đẻ 5 - 11 con/lứa, đẻ từ 5 - 10 lứa/năm và
số lƣợng con giảm dần theo độ tuổi. Chuột đực và chuột cái đƣợc phân biệt dựa vào
khoảng cách giữa lỗ hậu môn và lỗ sinh dục (khoảng cách này ở con đƣợc dài hơn ở
con cái), đặc điểm sinh dục ngoài (chuột cái có vú, chuột đực có hai tinh hoàn to)
[19, 20].
1.2.2. Cấu trúc da của chuột trắng Mus musculus var. albino
Ở chuột trắng da có cấu tạo tƣơng tự nhƣ ở ngƣời gồm 3 lớp chính: biểu bì,
trung bì và hạ bì. Sự tƣơng quan về mặt cấu tạo giữa da ngƣời và da chuột đƣợc thể
hiện qua bảng:

21. 12
Bảng 1.1. Sự tƣơng quan cấu tạo giữa da chuột và da ngƣời [21]
Đặc điểm Da chuột Da ngƣời
Độ dày bề mặt da cơ thể
(mỏng)
10 - 15 µm 50 - 100 µm
Độ dày bề mặt da dày
Đuôi: 70 - 80 µm
Chân: 150 - 400 µm
Miệng: 20 - 30 µm
Mí mắt: 50 - 60 µm
300 - 400 µm
(lòng bàn tay, lòng bàn chân)
Sự xuất hiện của lông
(tóc)
5 ngày sau sinh Tuần 19 - 21 của thai kì
Đuôi và lông đuôi Phát triển đầy đủ Tiêu biến
Tuyến bã nhờn Phát triển đầy đủ Phát triển đầy đủ
Tuyến mồ hôi Lòng bàn chân
Toàn bộ cơ thể bao gồm lòng
bàn tay và lòng bàn chân
Móng Đầu ngón chân Đầu ngón tay, chân
Ở chuột có một số đặc điểm cấu tạo khác biệt so với ngƣời:
Ở ngƣời, lớp gai bao gồm nhiều lớp keratinocytes; tuy nhiên, trong biểu bì loài
gặm nhấm lớp gai thƣờng là một lớp tế bào sâu. Biểu bì tế bào trở nên kéo dài hơn
khi chúng tiếp cận bề mặt của da [21].
Lớp biểu bì trên phần lớn cơ thể của loài gặm nhấm tƣơng đối dày tại thời
điểm sinh, nhƣng khi bộ lông bắt đầu phát triển, biểu bì nhanh chóng mỏng ra trong
2 tuần và độ dày không đổi trong suốt cuộc đời [21].
Có rất ít sự khác biệt về giải phẫu da ngoài độ dày giữa thành phần da của loài
gặm nhấm và con ngƣời. Ở loài gặm nhấm, vùng da thƣờng không thay đổi độ dày
khi chúng thay đổi về tuổi hoặc khi da đi qua chu trình mọc lông. Tuy nhiên, ở
ngƣời, lớp hạ bì cho thấy rõ ràng sự khác biệt trong các vùng da khi có sự thay đổi
về tuổi tác [21].

22. 13
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ TIA UV
1.3.1. Các loại tia UV
Bức xạ tia cực tím bao gồm các thành phần UVA, UVB và UVC dựa trên
bƣớc sóng photon chia làm 3 loại:
UVA có các bƣớc sóng dài nhất (315 - 400 nm), ánh sáng mặt trời xung quanh
bao gồm chủ yếu là UVA (90% - 95%). UVA có thể thâm nhập vào lớp hạ bì làm
tăng tốc độ oxy hoá da và gián tiếp gây ra đột biến DNA (hình 1.3) [22].
UVB là tầm trung (290 - 320 nm), UVB (5% - 10%) năng lƣợng ánh sáng mặt
trời. UVB có thể gây ra thiệt hại trực tiếp cho DNA và xuyên sâu đến lớp biểu bì
[22].
UVC là ngắn nhất bƣớc sóng (100 - 280 nm), hầu hết UVC mặt trời đƣợc hấp
thụ bởi tầng ozone. Do đó, mặc dù nó có hoạt tính sinh học cao, nhƣng các sinh vật
trên cạn không tiếp xúc với các mức UVC đáng kể [22].
Hình 1.3. Bức xạ UV trong ánh sáng mặt trời [22]

23. 14
1.3.2. Cơ chế tác động của tia UV đối với da
Bức xạ tia cực tím tự nhiên là tác nhân gây đột biến có tỉ lệ phần trăm lớn nhất
đối với các bệnh lí về da do môi trƣờng gây ra, bao gồm ban đỏ và viêm, thoái hoá,
thay đổi lão hoá và ung thƣ [23]. Con ngƣời tiếp xúc với bức xạ tia cực tím chủ yếu
là hậu quả của phơi nhiễm không đƣợc bảo vệ với ánh sáng mặt trời [10], [7]. Bức
xạ tia cực tím có nhiều tác dụng có hại trên các tế bào [24, 25].
Bức xạ tia cực tím cũng phá hủy các đại phân tử tế bào gián tiếp, thông qua
quá trình sản xuất các gốc tự do oxy hoá [26]. Một số thay đổi DNA có thể do chấn
thƣơng oxy hoá, bao gồm 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoguanine; 8-OH-dG),
thúc đẩy đột biến (đặc biệt là đột biến chuyển đổi GC-TA [27]). Cả hai thay đổi
DNA trực tiếp và gián tiếp can thiệp vào phiên mã và sao chép và làm cho các tế
bào da dễ bị đột biến [28].
UVB là nguyên nhân gây đột biến đặc trƣng và tạo ra các chứng ung thƣ da
[21], nhƣng các nghiên cứu gần đây đã liên quan đến vai trò ngày càng tăng của
UVA nhƣ một chất gây ung thƣ [25, 29, 30], có khả năng thông qua các tác dụng
oxy hoá và có thể thông qua các cơ chế khác nhƣ rút ngắn telomere [25]. Trong tự
nhiên, tiến bộ rút ngắn của telomere có thể đƣợc coi là một trong những cơ chế
chính của quá trình lão hoá tế bào ở da [21]. Telomeres và các thành phần tế bào
khác cũng duy trì các chất oxy hoá ở mức thấp, chuyển hoá tế bào hiếu khí, góp
phần làm chậm lão hoá từ bên trong cơ thể [31].
Ngoài ra, UVA ít có khả năng làm cơ thể ra sản xuất melanin so với UVB, nên
khả năng tự bảo vệ của da đối với UVA kém hơn.
1.4. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN
Khi xuất hiện lão hóa, quá trình phân hủy collagen-elastin diễn ra nhanh hơn
quá trình tổng hợp lại chúng khiến cấu trúc da không còn bền vững nữa. Khi đó, da
xuất hiện nếp nhăn, giảm đàn hồi, khô và chảy sệ, kèm theo sự sản sinh lipid giảm
khiến bề mặt da sần sùi, thô ráp, các mao mạch bị phá vớ khiến lƣu thông máu kém
làm quá trình vận chuyển dinh dƣỡng lên bề mặt da giảm hiệu quả dẫn đến da
không còn trẻ trung [12, 32].
Collagen là loại protein cấu trúc chủ yếu, chiếm khoảng 30% tổng lƣợng
protein trong cơ thể. Collagen có nhiều trong gân, da, xƣơng, hệ thống mạch máu và
có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ. Collagen có tác dụng nhƣ một
chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quan nền tảng

24. 15
trong cơ thể nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp có tính cấu trúc của
collagen [12, 32].
1.4.1. Cấu trúc
Phân tử collagen là một protein hình trụ, dài khoảng 300nm, đƣờng kính
khoảng 15nm. Gồm 3 chuỗi polypeptide (gọi là chuỗi α) cuộn lại với nhau. Mỗi
chuỗi α cuộn thành đƣờng xoắn ốc theo hƣớng từ phải sang trái với 3 gốc trên một
vòng xoắn, ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hƣớng từ trái sang phải tạo thành
đƣờng bộ ba xoắn ốc. Mỗi chuỗi polypeptide có khối lƣợng phân tử khoảng 100
kDa, tạo nên tổng khối lƣợng phân tử của collagen khoảng 300 kDa. Chuỗi α đƣợc
cấu tạo bởi khoảng 1000 amino acid. Các chuỗi α khác nhau (α1, α2 và α3) ở thành
phần amino acid. Sự phân bố của các chuỗi α1, α2, α3 trong các phân tử collagen
khác nhau tùy thuộc sự khác nhau về gene [12, 32].
Phần lớn collagen trong mạng lƣới ngoại bào đƣợc tìm thấy ở dạng sọi, bao
gồm những sợi mảnh, nhỏ. Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp
với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm 4-8 phân tử collagen hoặc
với số lƣợng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi fibril. Những sợi này có đƣờng kính 10-
500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển. Các sợi collagen sẽ thiết lập
nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là bó sợi (fiber bundle). Các chuỗi
collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất
định. Chúng đƣợc sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một số khoảng trống
khoảng 40 nm giữa các phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có thức bậc, độ bền
vốn có của các chuỗi xoắn ốc đƣợc chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các
mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng biệt [12, 32].
1.4.2. Phân loại
Hiện nay có khoảng 42 loại chuỗi polypeptide đƣợc nhân dạng. Chúng đƣợc
mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành gần 30 loại collagen. Collagen đƣợc
phân loại thành những họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các đại phân tử.
Hiện tại có khoảng 13 loại collagen đã đƣợc trích chiết. Chúng khác nhau về
chiều dài của mỗi chuỗi xoắn ốc cũng nhƣ bản chất và kích cỡ của những phần
không xoắn ốc. Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III, IV.
Collagen loại I: có trong gân, mạch máu, da, xƣơng, một số cơ quan
Collagen loại II: có trong sụn xƣơng
Collagen loại III: có trong bắp (cơ)

25. 16
Collagen loại IV: thành phần chính của lớp trung bì [12, 32].
1.4.3. Cơ chế tổng hợp collagen
Khi nguyên bào sợi di cƣ đến mô tổn thƣơng sẽ bắt đầu thay đổi hình thái,
định cƣ và tăng sinh để tổng hợp các thành phần của tổ chức hạt bao gồm collagen,
elastin, và fibronectin. Nguyên bào sợi đính với thành phần sợi của đệm fibril tạm
thời và bắt đầu sản xuất collagen. Collagen đƣợc tổng hợp cùng với các protein đệm
gian bào khác và các proteoglycan. Sau khi sao chép gene và nhận thông tin, RNA
vận chuyển gắn với polyrybosome nơi tạo ra các chuỗi collagen mới. Trong quá
trình này, giai đoạn quan trọng liên quan đến hydroxyl hóa prolin và lysine giúp 3
chuỗi protein kết hợp để tạo ra cấu trúc xoắn ốc (ba chuỗi thành một) của phân tử
collagen hình sợi (procollagen) và tiếp tục đƣợc sửa chữa hoàn thiện thêm.
Hydroxyproline trong collagen là quan trọng bởi nó giữ vai trò chủ yếu làm ổn định
hình dạng xoắn ốc ba của phân tử collagen. Nếu đủ hydroxyproline, collagen có
nhiệt độ tan chảy cao hơn. Khi lƣợng hydroxyproline bị thiếu nhƣ trong trƣờng hợp
thiếu vitamin C, cấu trúc xoắn ba của collagen sẽ bị biến tính rất nhanh ngay cả ở
nhiệt độ thấp. Sau cùng, phân tử procollagen đƣợc tế bào tiết ra khoảng trống gian
bào. Tại đây, các procollagen đƣợc xử lý bởi enzyme để phân cắt các thành phần
không xoắn ốc. Các phân tử collagen tự động sắp xếp theo trục dọc và liên kết cạnh
nhau để tạo ra các sợi nhỏ collagen và sau đó thành các bó sợi collagen. Trong
khoảng gian bào, enzyme quan trọng là lysyloxydase tác động lên phân tử collagen
để tạo ra một liên kết bền vững gọi là liên kết chéo. Khi collagen trƣởng thành và
trở nên già thì ngày càng nhiều các liên kết chéo trong và ngoài phân tử collagen
đƣợc tạo ra để giữ cho collagen có sức bền và ổn định và càng nhiều collagen thì
càng nhiều liên kết chéo đƣợc tạo ra [32].
Collagen có trong lớp trung bì sẽ tạo sự căng bền của da. Ở mô bình thƣờng,
collagen là phân tử bền vững và đƣợc tổ chức chặt chẽ. Đối ngƣợc với điều đó, các
sợi collagen ở mô sẹo lại nhỏ hơn nhiều và xắp sếp ngẫu nhiên nên mô sẹo thƣờng
yếu và dễ đứt gãy so với mô lành xung quanh [32].
1.5. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell - MSC) là loại tế bào gốc không
tạo máu, có khả năng biệt hoá thành các tế bào có nguồn gốc trung mô nhƣ xƣơng,
sụn, mỡ, cơ và nhiều loại tế bào khác. Tế bào gốc trung mô đƣợc tìm thấy tại tủy
xƣơng, mô mỡ, tủy răng và dây rốn. Do có tiềm năng biệt hoá kết hợp với việc dễ
dàng phân lập và nuôi cấy làm cho các MSC trở thành nguồn tế bào gốc ứng dụng

26. 17
rất quan trọng trong công nghệ mô và y học tái tạo. Sự tự làm mới và biệt hoá là hai
đặc tính quan trọng nhất của tế bào gốc. Sự tự làm mới có thể định nghĩa là quá
trình tạo ra những bản sao tế bào gốc, thông qua quá trình nguyên phân, có nghĩa là
ít nhất một tế bào chị em đƣợc tạo ra vẫn giữ đặc tính cùng với khả năng tự làm mới
và biệt hoá, chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào tiền thân để sau đó phát triển
thành tế bào chuyên biệt tham gia vào cấu trúc và chức năng của mô, cơ quan. Nhờ
đó mà số lƣợng tế bào gốc đƣợc duy trì hoặc tăng lên chứ không mất đi do quá trình
biệt hoá tế bào. Trong khả năng tự làm mới, sự phân chia tế bào đối xứng có thể tạo
ra hai tế bào gốc, sự phân chia không đối xứng có thể tạo ra một tế bào gốc, hay một
tế bào gốc có khả năng biệt hoá giới hạn. Mặc dù các MSC có rất nhiều tiềm năng
ứng dụng nhƣng chúng là quần thể tế bào rất hiếm, chiếm khoảng 0.001-0.01% của
toàn bộ tế bào đơn nhân tuỷ xƣơng. Do đó, MSC cần phải có một quy trình phù hợp
để phát triển in vitro trƣớc khi ứng dụng nghiên cứu [33].
Trong số các nguồn mô dùng để thu nhận MSC, phổ biến nhất là mô mỡ vì
đây là loại mô có các đặc điểm thuận lợi khi tiến hành thu nhận, nghiên cứu và ứng
dụng:
Thứ nhất, việc thu nhận mô mỡ đơn giản, ít xâm lấn nên ít gây đau đớn cho
bệnh nhân so với việc thu nhận từ tủy xƣơng.
Thứ hai, mô mỡ có chứa các tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội mô, nguyên
bào sợi,... và đặc biệt là các MSC. Các MSC này dễ dàng phân lập, nuôi cấy và tăng
sinh in vitro và có thể cảm ứng biệt hoá thành các tế bào của các dòng tế bào khác.
Thứ ba, mô mỡ chứa các MSC với tỷ lệ khá cao, mỗi gam mô mỡ chứa 105
MSC.
Thứ tƣ, khả năng đặc biệt đáng chú ý của các MSC thu từ mô mỡ là tiềm năng
biệt hoá của các tế bào này ít chịu ảnh hƣởng của ngƣời hiến mô, tế bào gốc mô mỡ
là một trong những dạng tế bào quan trọng di cƣ đến vùng tổn thƣơng để thực hiện
nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thƣơng [33].
1.6. DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO
1.6.1. Tổng quan cấu trúc và chức năng nhau thai heo
Nhau thai là cơ quan tạm thời xuất hiện trong thời gian mang thai ở ngƣời và
một số động vật có vú khác. Nhau thai cung cấp oxy và dinh dƣỡng cho thai nhi
phát triển hoàn chỉnh và bị thải ra ngoài cơ thể sau khi sinh. Nhau thai chứa nguồn
dồi dào protein, lipid, carbohydrate và các thành phần cần thiết cho hoạt động sinh
lý nhƣ vitamin, khoáng chất, các chất tăng trƣởng, hormone, enzyme,... [3].

27. 18
Nhau thai là một cơ quan độc lập, nhƣ chiếc đệm duy trì môi trƣờng sống để
bào thai phát triển khỏe mạnh ngoài việc cung cấp dinh dƣỡng từ mẹ vào thai. Nhau
thai có chức năng chính nhƣ sau:
- Chuyển oxy, máu, nguồn dinh dƣỡng cần thiết để nuôi thai.
- Loại bỏ các chất thải từ bên trong bào thai ra ngoài.
- Duy trì môi trƣờng sống, bảo vệ bào thai.
- Tiết các hormone cần thiết trong suốt các giai đoạn phát triển của bào thai
[3].
1.6.2. Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết nhau thai heo
Thu nhận mẫu nhau thai heo và rửa bằng PSB bổ sung kháng sinh, sau đó
nhau thai đƣợc bảo quản trong thùng đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu nhau thai đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất, sau đó
mẫu sẽ đƣợc cắt nhỏ trƣớc khi xay nhuyễn bằng máy xay. Bổ sung thêm nƣớc muối
sinh lý vào mẫu theo tỷ lệ mẫu:nƣớc muối sinh lý là 1:2 và đƣợc tiến hành thủy
phân.
Dung dịch thu đƣợc tiến hành ly tâm 10 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4o
C.
Thu dịch chiết, loại bỏ phần cặn.
Dịch chiết trƣớc khi sử dụng đƣợc lọc qua phin lọc vô khuẩn 0,2 μm.

28. 19
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Dòng tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời tại Nhật. Dòng tế bào
AT-MSCs đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đã đƣợc phân lập tại lab Tế bào gốc Đại
học Tsukuba Nhật Bản. Dòng ATMSCs đã đƣợc sàng lọc các marker bề mặt đặc
trƣng của tế bào gốc trung mô và khả năng biệt hoá. Dữ liệu dòng tế bào đã đƣợc
chuẩn hoá và công bố [34].
- Dịch chiết nhau thai heo đƣợc cung cấp từ phòng thí nghiệm Viện Sinh học
nhiệt đới. Dịch chiết đƣợc phân tích kiểm tra thành phần, nồng độ amino acid và
kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng đảm bảo hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn an toàn và
đƣợc sử dụng để tiến hành thí nghiệm. Kết quả đƣợc phân tích bởi Trung tâm dịch
vụ phân tích thí nghiệm Tp.Hồ Chí Minh (CASE). Dịch chiết nhau thai sau khi
kiểm tra nồng độ amino acid đƣợc kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng để đảm bảo
không gây ngộ độc tế bào và sức khỏe của con ngƣời (Bảng 3.1, Bảng 3.2). So sánh
với Thông tƣ số 06/2011/TT-BYT quy định về Quản lý mỹ phẩm về mức As cho
phép trong mỹ phẩm là 5 ppm. Dịch chiết hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn an toàn, và
đƣợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm.
- Chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino 6 - 8 tuần tuổi (18 - 22 gram) do
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
1 Tủ cấy vô trùng Sanyo Nhật
2 Tủ ấm CO2 Sanyo Nhật
3 Máy ly tâm HERMLE Z513K Đức
4 Máy Realtime-PCR IQ5, Biorad Mỹ
5 Buồng đếm hồng cầu Đức
6 Micropipette

29. 20
7 Flask 25cm2 Corning Mỹ
8 Đĩa 12 giếng Costar Mỹ
9 Kính hiển vi quang học Olympus Nhật
10 Cân phân tích Shimadzu Nhật
12 Lamen, lamelle Isolab Đức
13 Falcon 50 Kartell Spa Pháp
14 Đĩa petri Steriplan Đan Mạch
15 Chuồng nuôi chuột Việt Nam
16 Pipette Pasteur Volac Anh
17 Pipetman Isolab Đức
18 Chai đựng nƣớc uống chuột Việt Nam
19 Máy cạo lông chuột Philips Đức
20 Đèn chiếu UV 15W Philips Phần Lan
Hoá chất sử dụng cho thí nghiệm:
Formalin 10%, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lí, thuốc nhuộm H&E: Hematoxilin
và Eosin, các muối KH2PO4 và Na2HPO4.
DMEM (Gibeo), FBS (Atlanta), penicillin, trypsin (Gibeo), PBS, PCRBIO
Onestep RT-PCR kit, Cell banker (Nhật), bFGF (Sigma), mồi xuôi, mồi ngƣợc của
Col-IV và β-actin.
2.3. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực hiện thí nghiệm: từ tháng 07/2018 đến tháng 04/2019.
Bố trí mô hình thí nghiệm, thu nhận và phân tích kết quả tại Phòng thí nghiệm
Giải phẫu - sinh lí ngƣời và động vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm
Thành phố Hồ Chí Minh.

30. 21
Nhuộm H&E để đánh giá cấu trúc vi thể của các mẫu da ở các nghiệm thức tại
Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Quận 2 Tp. HCM.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Toàn bộ thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của nghiên cứu
Nhƣ vậy, đề tài có 3 thí nghiệm chính, mỗi thí nghiệm gồm các nghiệm thức
tƣơng ứng, cụ thể:
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế
bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ người
Thí nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS
và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 50 μg/mL
Thu nhận AT-MSCs
cấy chuyền
Nuôi cấy tăng sinh AT-
MSCs có bổ sung dịch
chiết nồng độ khác nhau
RT-PCR đánh giá biểu hiện
gene liên quan lão hóa của
AT-MSCs với nồng độ tối ƣu
Tạo mô hình chuột lão hóa
da do chiếu UV
Thoa dịch chiết có nồng độ
tối ƣu từ kết quả in vitro
điều trị chuột lão hóa da
Đánh giá hiệu quả dựa vào
kết quả nhuộm mô học
Thống kê, phân tích số liệu
Thử nghiệm in vitro Thử nghiệm in vivo
Xác định nồng độ
tối ƣu

31. 22
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 150 μg/mL
Cơ sở lựa chọn các nồng độ này dựa trên nghiên cứu của Yoshikawa và cộng
sự năm 2013 (Gynecol Obstet 2013, 3:6 DOI: 10.4172/2161-0932.1000186) “Effect
of Porcine Placental Extract on Collagen Production in Human Skin Fibroblasts In
Vitro”, đã áp dụng thang nồng độ các mức từ 0 đến 200 μg/mL và kết quả khảo sát
ở môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung nồng độ 200 μg/mL sự tăng sinh tế bào giảm
mạnh. Đồng thời, dựa kết quả khảo sát đối với dịch chiết nhau thai cừu và nhau thai
bò với các nồng độ khác nhau, chúng tôi chọn 3 nồng độ 50 μg/mL, 100 μg/mL và
150 μg/mL để thực hiện nghiên cứu này.
Thí nghiệm 2: Tạo mô hình chuột lão hoá da dưới tác dụng của UV nhân tạo
Cơ sở chọn cường độ đèn UV
Chọn đèn UV nhân tạo với công suất đèn 15 W x 2 đèn (UV bƣớc sóng 365
nm), 7 ngày/tuần và thực hiện liên tục trong 8 tuần. Khoảng cách từ đèn đến lƣng
chuột là 30 cm [6]. Cƣờng độ bóng đèn UV đƣợc xác định bằng thiết bị đo cƣờng
độ ánh sáng. Mắc 02 bóng: cƣờng độ đèn đo đƣợc là 0,4 mW/cm2
tƣơng ứng trong
một phút là 24 mJ/cm2
.
Cơ sở chọn chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày:
Khoảng thời gian trung bình một ngày có hàm lƣợng tia UV cao nhất thƣờng 3
giờ (vào khung giờ từ 11 giờ trƣa đến 14 giờ chiều). Đây chính là khung thời gian
mà những ngƣời làm việc văn phòng thƣờng tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Khoảng thời gian trung bình một ngày tia UV có khả năng thúc đẩy hiện
tƣợng lão hoá da là 6 giờ. Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động bình
thƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày;
Số giờ chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời trung bình một ngày khoảng 9 giờ.
Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động những công việc nặng dƣới các công
trƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày.
Vì vậy, đề tài chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày và một
nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), cụ thể các nghiệm thức lần lƣợt là: đối
chứng, 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ.

32. 23
Xây dựng mô hình thí nghiệm 2 bao gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 12
chuột:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): nuôi trong điều kiện ánh sáng phòng (12 con)
Nghiệm thức 2 (3 giờ): chiếu UV 3 giờ/ngày (12 con)
Nghiệm thức 3 (6 giờ): chiếu UV 6 giờ/ ngày (12 con)
Nghiệm thức 4 (9 giờ): chiếu UV 9 giờ/ngày (12 con)
Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết
nhau thai heo.
Cơ sở chọn nồng độ tế bào, tỉ lệ phối trộn, và mốc thời gian chiếu UV: Dựa
vào kết quả thí nghiệm 1: chọn ra nồng độ tế bào tăng sinh tối ƣu; dựa trên kết quả
thí nghiệm 2, chọn mốc thời gian chiếu có ảnh hƣởng trong 3 mốc thời gian để thực
hiện thí nghiệm 3. Nghĩa là bôi dịch chiết nhau thai heo với nồng độ tăng sinh tế
bào tối ƣu ở thí nghiệm 1 và chiếu UV với mốc thời gian ở thí nghiệm 2, từ đó khảo
sát hiệu quả của dịch chiết nhau thai heo lên khả năng ngăn ngừa lão hoá da.Thí
nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): không bôi dịch chiết nhau thai heo, không chiếu
UV
Nghiệm thức 2 (đối chứng âm): chiếu UV, không bôi dịch chiết nhau thai heo
Nghiệm thức 3 (đối chứng dƣơng): chiếu UV, bôi sản phẩm thƣơng mại - kem
chống lão hoá ban ngày
Nghiệm thức 4 (thí nghiệm): chiếu UV, bôi sản phẩm dịch chiết nhau thai heo.
Cơ sở chọn sản phẩm thương mại:
Pond’s là thƣơng hiệu trực thuộc tập đoàn Unilever chuyên sản xuất hàng tiêu
dùng, mỹ phẩm, sức khỏe… lớn nhất thế giới. Các dòng sản phẩm của Pond’s luôn
thuộc nhóm sản phẩm đƣợc ƣa chuộng hàng đầu tại Việt Nam. Sản phẩm kem
chống lão hóa ban ngày Pond’s Age Miracle có chỉ số chống nắng SPF 18 PA++, có
công dụng giúp kích thích sản sinh Collagen, thúc đẩy quá trình tái tạo da tại tầng
biểu bì ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa da, hạn chế các hắc sắc tố gây hại làm da lão
hóa. Lựa chọn sản phẩm Pond’s để làm nghiên cứu vì đây là sản phẩm phổ biến trên
thị trƣờng hiện nay, có công dụng tƣơng tự yêu cầu của sản phẩm thí nghiệm nhƣ:
ngăn ngừa lão hoá, có hiệu quả chống nắng, thúc đẩy tái tạo da, sản sinh collagen.
2.4.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và bảo quản tế bào

33. 24
Quy trình cấy chuyền tế bào:
AT-MSCs đƣợc nuôi cấy trong bình flask, khi tế bào phát triển đạt 80 - 90%
tiến hành cấy chuyền. Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS, sau đó bổ sung
1ml trypsin 0,05%, ủ ấm tế bào trong tủ ấm CO2 từ 3 - 5 phút. Bổ sung thêm 4 ml
DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml tiến
hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù, tiếp tục
bổ sung 5 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin vào ống và bổ sung thêm
1 μl bFGF. Cho dung dịch vào bình flask, nuôi cấy trong tủ ấm CO2 (CO2 5%,
37o
C)
Quy trình bảo quản tế bào
Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS 2 lần. Bổ sung 1 ml trypsin
0,05%, ủ ấm tế bào trong tủ ấm CO2 từ 3-5 phút. Bổ sung thêm 4 ml DMEM bổ
sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml và tiến hành ly tâm
1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1,5 ml cell banker, tái
huyền phù; chia vào 3 ống cryotube, mỗi ống 0,5 ml; bảo quản tủ lạnh -80o
C.
2.4.2. Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế
bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời
2.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào:
Cấy chuyền tế bào từ bình flask vào đĩa đƣờng kính 35 mm. Loại bỏ môi
trƣờng nuôi của bình flask, rửa bằng PBS 2 lần, cho vào 1 ml trypsin 0,05%, cho
bình flask vào tủ ấm từ 3-5 phút để tế bào bong ra. Bổ sung thêm 4 ml DEM bổ
sung 10% FBS và 1% penicililin, tính toán lƣợng tế bào cần thiết bằng cách đếm.
Sau đó, cho dung dịch vào ống falcon 15ml tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong
5 phút ở 4o
C. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào sau đó bổ sung thêm 12 ml
DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin. Mật độ tế bào ban đầu là 4x104
tế
bào/đĩa nuôi. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 đĩa để tính giá trị trung bình và sai số.
Tế bào đƣợc cấy trong các môi trƣờng nuôi có bổ sung nồng độ dịch chiết lần lƣợt
nhƣ sau: 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml. Cụ thể:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS
và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 50 μg/mL

34. 25
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch
chiết ở nồng độ 150 μg/mL
2.4.2.2. Phương pháp đếm tế bào:
Loại bỏ môi trƣờng ở các giếng sẽ đếm, rửa bằng PBS 2 lần, bổ sung 200 μl
trypsin, cho vào tủ ấm 2 phút để tế bào bong ra. Bổ sung 800 μl DMEM bổ sung
10% FBS và 1% penicililin. Hút ra eppendorf. Mỗi lần đếm lấy 10 μl cho một vi
trƣờng của buồng đếm hồng cầu 0,0025 mm3
(phƣơng pháp đếm bằng buồng đếm tế
bào cải tiến). Tế bào đƣợc đếm trong vòng 10 ngày và ghi nhận kết quả.
2.4.2.3. Phương pháp biệt hóa tế bào
Quy trình biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ thực hiện như
sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa tế bào mỡ gồm: DMEM, 0,2mM
indomethacin, 50µ axit ascorbic, 0,5µM dexamethasone.
- Khi tế bào đạt 70-80% diện tích đĩa nuôi, cho vào môi trƣờng cảm ứng biệt
hóa, thay môi trƣờng 2 ngày/lần. Theo dõi khả năng biệt hóa sau 2-3 tuần.
- Đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong bào tƣơng tế bào khi quan sát dƣới
kính hiển vi soi nổi, hoặc nhuộm Oil red O, thấy có sự hiển diện các giọt mỡ trong
bào tƣơng tế bào. Giọt mỡ thƣờng xuất hiện vào ngày 5-7 sau biệt hóa. Qui trình
dựa theo tác giả Shahdadfar A (2005).
Các dấu hiệu khẳng định MSC: Sau từ 3-5 ngày nuôi cấy, thu đƣợc quần thể
tƣơng đối thuần nhất. Thông thƣờng để khẳng định là MSC dựa vào các tiêu chí
sau:
- Hình thái, đặc điểm: các tế bào có hình dạng thoi dài đặc trƣng.
- Về marker bề mặt: biểu hiện dƣơng tính:CD44, CD9, biểu hiện âm tính:
CD34, CD14.
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào:
Về lý thuyết, các MSC đƣợc biệt hóa trong môi trƣờng có dexamethasone,
ascorbic, β – glycerolphosphatase sẽ biệt hóa thành tạo cốt bào. Sau biệt hóa (biệt
hóa thành công) định danh phát hiện yếu tố tạo xƣơng trong tế bào bằng các kỹ
thuật đặc hiệu nhƣ nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin, nhuộm alizarin

35. 26
red, quan sát tinh thể khoáng dƣới kính hiển vi điện tử quét. Quy trình biệt hóa tiến
hành nhƣ sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa: là môi trƣờng biệt hóa xƣơng bổ xung 10mM
β-glycerolphosphat (sigma), 50µg ascorbate (sigma), 10-7 M dexsamethasone
(sigma).
- Nuôi cấy tế bào khi đạt mật độ khoảng 10.000/ cm2 trong lớp đơn.
- Đƣa tế bào vào môi trƣờng biệt hóa. Thay môi trƣờng 2-3 ngày/lần.Thời gian
biệt hóa từ 14-21 ngày.
Sau biệt hóa 21 ngày, định danh tế bào. Các kỹ thuật định danh tế bào sau biệt
hóa: nhuộm Alizarin red, nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin, kỹ thuật
siêu cấu trúc.
2.4.3. Khảo sát sự biểu hiện gene Collagen type IV (Col-IV) của tế bào
gốc trung mô
Xác định sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô trƣớc và sau khi
bổ sung dịch chiết nhau thai heo ở nồng độ tối ƣu từ 3 nồng độ khảo sát ở mục
2.4.1.
Trình tự primer của b-actin và Col4.
Beta Actin
5’ CACCATTGGCAAGAGCGGTTC
3’ AGGTCTTGCGGATGTCCACGT
Col IV
5’ ATGGGGCCCCGGCTCAGC
3’ ATCCTCTTTCACTTTCAATAGC
Phƣơng pháp tiến hành: thí nghiệm tiến hành theo hƣớng dẫn của bộ kit RT-
PCR OneStep.
2.4.4. Phƣơng pháp xây dựng mô hình chuột bị ảnh hƣởng bởi tia UV
Chuột trắng Mus musculus var. albino cái 4 tuần tuổi (12 - 14 g) đƣợc mua từ
viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh về nuôi ổn định tại Phòng thí nghiệm tại Giải
phẫu - sinh lí ngƣời và động vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thành
phố Hồ Chí Minh 2 tuần để đạt (19 - 21 g) tƣơng ứng với 6 tuần tuổi.

36. 27
Chuột 6 tuần tuổi (19 - 21 g) đƣợc chia thành 4 nghiệm thức thí nghiệm, mỗi
nghiệm thức có 4 con lặp lại 3 lần (12 con/nghiệm thức), đƣợc nuôi trong 12
chuồng (mỗi chuồng 4 con) đƣợc đánh số thứ tự theo nghiệm thức thí nghiệm và
đánh dấu trên từng con (hình 2.2).
Hình 2.2. Bố trí chuồng nuôi chuột thí nghiệm
(a - đối chứng; b - nghiệm thức 1; c - nghiệm thức 2; d - nghiệm thức 3)
Chuột đƣợc cạo lông vào ngày trƣớc khi tiến hành chiếu đèn. Vị trí cạo lông
đƣợc xác định là một ô chữ nhật thuộc vùng lƣng có kích thƣớc tối thiểu là 9 cm2
, vị
trí cạo nằm giữa lƣng, cách đều 4 chi, sau khi định vị khu vực cần cạo, đánh dấu 4
góc trên lƣng chuột và tiến hành cạo lông. Sau khi cạo xong, đảm bảo da vùng đã
cạo sạch lông, lộ hoàn toàn vùng da lƣng với kích thƣớc tối thiểu là 9 cm2
, vùng da
cạo không hoặc ít bị tổn thƣơng do quá trình cạo, cần để da phục hồi 30 phút trƣớc
khi chiếu đèn (hình 2.3).
Tiến hành chiếu đèn và theo dõi tốc độ mọc lông của chuột, cạo lông lặp lại 3
ngày một lần đối với chuột mọc chậm và cạo lông lặp lại 2 ngày một lần đối với
chuột có tốc độ mọc lông nhanh vào mỗi buổi sáng trƣớc khi chiếu.

37. 28
Hình 2.3. Hình chuột sau khi đƣợc cạo lông
Chiếu đèn UV nhân tạo với cƣờng độ 24 mJ/cm2
(UV bƣớc sóng 365 nm), 7
ngày/tuần và thực hiện liên tục trong 8 tuần. Khoảng cách từ đèn đến lƣng chuột là
30 cm [6].
Theo dõi hàng ngày, mỗi ngày trƣớc khi chiếu UV, tiến hành ghi nhận các đặc
điểm: số chuột mọc lông trong từng nghiệm thức, vị trí mọc, tốc độ mọc, khoảng
cách thời gian giữa 2 lần cạo lông, sự thay đổi bề mặt da.
Sau mỗi 14 ngày chiếu đèn, tiến hành kiểm tra cân nặng vào sáng ngày thứ 14
và đánh giá một số đặc điểm đại thể trên da: độ đàn hồi, độ nhăn da, các tổn thƣơng
mới xuất hiện trên da và các đốm màu bất thƣờng.
2.4.5. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản mô học
Phương pháp thu nhận mẫu da
Sau 8 tuần thí nghiệm, mẫu da chuột đƣợc thu nhận với 4 mẫu trên 1 con và cố
định trong dung dịch formalin 10%.
Sau 8 tuần thí nghiệm, tiến hành giải phẫu chuột để thu nhận mẫu da lƣng.
Dùng tay kéo phần da lƣng ép sát vào tấm lót, sử dụng dao sinh thiết da chuyên
dụng (dao bấm) có đƣờng kính 0,3 cm (hình 2.4a) bấm theo chiều thẳng đứng từ
trên xuống để lấy mẫu da. Thu nhận 4 mẫu (tƣơng ứng 2 lần bấm) trên một con
chuột. Mẫu đƣợc cho vào lọ dung dịch formalin 10% có đánh số thứ tự chuột,
nghiệm thức lấy mẫu và ngày thu mẫu. Mẫu đƣợc ngâm trong formalin 10% bổ
sung KH2PO4 (4 g/1000 ml) và Na2HPO4 (6,5 g/1000 ml), ghi nhãn và kí hiệu cho

38. 29
từng nghiệm thức (hình 2.4b) và chuyển đến Khoa giải phẫu bệnh, bệnh viện Quận
2 Tp. HCM để thực hiện nhuộm H&E.
Hình 2.4. Phƣơng pháp thu nhận mẫu da
(a - dao sinh thiết da; b - mẫu được ngâm trong formalin 10%)
Phương pháp nhuộm mô da
Mẫu da đƣợc nhuộm H&E để đánh giá cấu trúc vi thể của da. Các bƣớc
nhuộm đƣợc tuân thủ theo quy trình tại bệnh viện và theo quy trình chung về nhuộm
hoá mô miễn dịch [34]. Sau khi cố định, mẫu vật đƣợc thực hiện qua các bƣớc kĩ
thuật: (1) chuyển mẫu vật, (2) vùi parafin, (3) đúc khối parafin (4) cắt và dán mảnh
cắt, (5) nhuộm.
2.4.6. Phƣơng pháp so sánh đối chiếu tiêu bản mô học
Sau khi thu nhận kết quả nhuộm mô học tiến hành so sánh, đối chiếu và đánh
giá về mức độ tổn thƣơng da và xác định thời gian chiếu UV gây tổn thƣơng.
Nhuộm và quan sát hình thái mô học da: nhân tế bào xanh đến xanh đen; bào
tƣơng tế bào hồng đến đỏ; hồng cầu hồng đậm; sợi tạo keo hồng nhạt [35].
Phương pháp đo độ dày biểu bì da chuột
Trên tiêu bản mô học tiến hành đo độ dày biểu bì, độ dày của lớp biểu bì đƣợc
xác định bằng phƣơng pháp đo trực tiếp trên hình ảnh quan sát dƣới kính hiển vi
quang học vật kính 40 (X40) với sự hỗ trợ của phần mềm S-Eye. Mẫu sau khi
nhuộm đƣợc quan sát tổng thể dƣới kính hiển vi và tiến hành đo độ dày trực tiếp,
với mỗi nghiệm thức đo 30 lát cắt, mỗi lát đo 10 lần và lấy độ dày trung bình của
từng lát để tiến hành so sánh. Quá trình đo độ dày mỗi lát cắt đƣợc thực hiện qua
các bƣớc nhƣ sau:

39. 30
Quan sát tổng thể mẫu và loại bỏ các lát cắt bị lỗi, không đầy đủ các lớp cấu
trúc cơ bản của da, lát cắt bị cuộn gấp và không bắt màu thuốc nhuộm.
Tiến hành đo độ dày biểu bì của từng lát cắt và thu nhận số liệu, độ dày biểu bì
đƣợc tính từ vùng tế bào tím đậm (lớp sừng) đến vùng sợi màu hồng nhạt không có
nhân (trung bì). Khoảng cách này đƣợc coi là tƣơng đối chính xác khi thanh ngang
của thƣớc trùng với lớp tế bào ngoài cùng của lớp sừng, thanh còn lại nằm ở phần
ranh giới giữa biểu bì và trung bì (hình 2.5).
Hình 2.5. Đo độ dày biểu bì dƣới kính hiển vi bằng phần mềm S-Eyes (X40)
Phương pháp đánh giá mức độ lão hoá da ở thông qua cấu trúc mô học
Qua hình thái mô học, mức độ lão hoá da chuột dƣới tác động của UV đƣợc
đánh giá cảm quang trên mẫu da đƣợc nhuộm HE và quan sát dƣới kính hiển vi,
đánh giá ở 4 mức độ lão hoá da thông qua đặc điểm cấu trúc của daở mỗi mức độ
theo nhóm tự phân chia dựa trên tham khảo của [6], chi tiết đƣợc mô tả ở bảng 2.2.

40. 31
Bảng 2.2. Đặc điểm cấu trúc da ở các mức độ lão hoá
Mức độ lão hoá Đặc điểm
Mức 0
(không lão hoá)
Collagen đồng nhất, nén chặt, sợi collagen nguyên vẹn,
không bị đứt gãy, các bó sợi cuộn xoắn, liên kết chặt
chẽ với nhau.
Biểu bì không có hoặc rất ít nếp nhăn [6]
Mức 1
(có dấu hiệu lão hoá)
Mật độ collagen bắt đầu không liên tục, xuất hiện một
số đứt gãy trong cấu trúc.
Mức 2
(lão hoá)
Cấu trúc collagen lỏng lẻo, sợi collagen đứt gãy, các bó
sợi rời rạc, mất sự liên kết.
Biểu bì bắt đầu bong tróc, có nếp nhăn trên bề mặt.
Mức 3
(lão hoá nặng)
Sự liên kết collagen hầu nhƣ không còn, mật độ
collagen thấp.
Nếp nhăn biểu bì xâm lấn sâu, bong tróc nhiều.
2.4.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm về khảo sát hiệu quả ngăn ngừa
lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo
48 chuột đƣợc cạo lông và chiếu UV với cƣờng độ 24 mJ/cm2
(6 giờ/ngày,
liên tục trong 8 tuần). Trƣớc khi chiếu UV, tiến hành bôi sản phẩm thƣơng mại
(kem chống lão hóa ban ngày Pond’s Age Miracle) ở nghiệm thức 3 (đối chứng
dƣơng) và sản phẩm dịch chiết nhau thai heo ở nghiệm thức 4 (SPTN). Sản phẩm
thí nghiệm đƣợc tách trong các eppendorf có thể tích đủ bôi cho mỗi ngày để vào
hộp nhỏ, bọc giấy bạc bên ngoài hộp đựng sản phẩm và đƣợc bảo quản trong ngăn
mát tủ lạnh (4 - 6o
C). Mỗi ngày bôi sản phẩm cho da chuột 2 lần: 7h30 giờ vào buổi
sáng và sau khi bôi lần một 3 tiếng.
Phƣơng pháp bôi sản phẩm: vào mỗi buổi sáng, sản phẩm thí nghiệm đƣợc lấy
ra ngoài, để 5 - 10 phút cho hết lạnh, sử dụng pipette hút 50 µL sản phẩm cần bôi
(Pond’s Age Miracle, dịch chiết nhau thai heo) thoa đều lên vùng da lƣng của chuột,
chờ khoảng 10 - 15 phút cho sản phẩm thấm vào da mới thả chuột vào chuồng để
tránh tình trạng sản phẩm bị dính trấu). Sau khi bôi 30 phút (8 giờ sáng), tiến hành

41. 32
chiếu UV. Sau khi chiếu UV đƣợc 3 giờ (11 giờ - khoảng khung giờ trƣa), tiếp tục
bôi sản phẩm lần 2 (cách chuẩn bị và cách bôi tƣơng tự nhƣ lần 1).
Quan sát, ghi nhận kết quả về mức độ lão hoá da của chuột nhƣ mô tả ở mục
2.4.4 - 2.4.6.
2.4.8. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Kết quả thí nghiệm đƣợc phân tích, xử lí bằng phần mềm Minitab 18.
Các số liệu trong bài đƣợc trình bày dƣới dạng x ± 95% CI. Dùng hàm Anova
- One Way, Anova - General Linear Model để kiểm định sự khác biệt về phân phối
tỉ lệ giữa các lô thí nghiệm.
Số liệu mức độ lão hoá thông qua mật độ collagen đƣợc thu thập và trình bày
dƣới dạng bảng với đơn vị số lƣợng mẫu đƣợc quy đổi thành tỉ lệ phần trăm lão hoá
theo công thức:

42. 33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DỊCH CHIẾT NHAU THAI
HEO LÊN SỰ TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ MÔ
MỠ NGƢỜI
3.1.1. Kết quả khảo sát nồng độ dịch chiết tối ƣu
3.1.1.1. Đặc điểm dòng tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ người
(ATMSCs)
Dòng ATMSCs sử dụng là AT78, là dòng phân lập sẵn tại Nhật Bản. Dòng
AT78 đảm bảo các đặc tính của tế bào gốc trung mô, thể hiện các marker đặc trƣng
của tế bào gốc cũng nhƣ khả năng biệt hoá ra các dòng trung mô.
Hình 3.1. ATMSCs có hình dạng thoi dài đặc trƣng (scale bar: 200 µm)
(A)
(B)
Hình 3.2. ATMSCs biệt hoá thành tế bào mỡ (A) và tế bào xƣơng (B)

43. 34
3.1.1.2. Dịch chiết nhau thai heo
- Nồng độ amino acid trong dịch chiết nhau thai heo:
Nhau thai heo đƣợc thu nhận, sau đó đƣợc thuỷ phân để thu dịch chiết. Dịch
chiết sau khi thủy phân sẽ đƣợc đem đi phân tích để kiểm tra nồng độ, nồng độ dịch
chiết nhau thai heo đƣợc phân tích bằng kĩ thuật HPLC (Sắc kí lỏng cao áp). Kết
quả đƣợc phân tích bởi Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp.Hồ Chí Minh
(CASE).
Bảng 3.1. Kết quả phân tích amino acid của dịch chiết nhau thai heo
Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
Alanine mg/100ml 32,22
Aspartic acid mg/100ml 27,34
Glutamic acid mg/100ml 91,61
Glycine mg/100ml 36,15
Histidine mg/100ml 17,19
Isoleucine mg/100ml 31,56
Leucine mg/100ml 41,15
Lysine mg/100ml 31,57
Methionine mg/100ml 19,25
Phenylalanine mg/100ml 18,29
Proline mg/100ml 24,47
Serine mg/100ml 34,04
Threonine mg/100ml 14,11
Tyrosine mg/100ml 21,43
Valine mg/100ml 41,96
Tổng mg/100ml 482,34

44. 35
- Hàm lượng kim loại nặng trong dịch chiết nhau thai heo:
Dịch chiết nhau thai sau khi kiểm tra nồng độ amino acid đƣợc kiểm tra hàm
lƣợng kim loại nặng để đảm bảo không gây ngộ độc tế bào và sức khỏe của con
ngƣời (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng trong dịch chiết nhau
thai heo
Chỉ tiêu kiểm nghiệm Đơn vị tính Kết quả
As Mg/Kg 0,03
Cd Mg/Kg Không phát hiện
Hg Mg/Kg Không phát hiện
Pb Mg/Kg Không phát hiện
So sánh với Thông tƣ số 06/2011/TT-BYT quy định về Quản lý mỹ phẩm về
mức As cho phép trong mỹ phẩm là 5 ppm. Dịch chiết hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn
an toàn, và đƣợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm.
3.1.1.3. Hình thái của ASC sau khi bổ sung dịch chiết nhau thai heo
Tế bào sau khi bổ sung dịch chiết nhau thai heo, sau 12 giờ đƣợc quan sát dƣới
kính hiển vi để kiểm tra hình thái. Quan sát thấy dƣới sự hiện diện của dịch chiết
nhau thai heo, tế bào vẫn giữ hình dạng thoi dài đặc trƣng với một nhân giống với
hình dạng của ASC trƣớc khi bổ sung dịch chiết. Sau những ngày nuôi cấy tiếp
theo, không có sự thay đổi nào về hình thái tế bào. Hình dạng này của ASC không
khác biệt với hình dạng của MSC thƣơng mại Điều đó chứng tỏ, sau một thời gian
tiếp xúc với dịch chiết nhau thai heo thì ASC có khả năng tăng sinh mà không bị
apotosis cũng nhƣ giữ đƣợc tính gốc.

45. 36
Hình 3.3. Hình thái ASC trƣớc và sau khi bổ sung dịch chiết 12h
(Hình A: Tế bào ATMSC đối chứng, Hình B: tế bào ATMSC có bổ sung dịch
chiết nhau thai heo sau 12h. Scale bar 200 µm)
3.1.1.4. Sự tăng sinh của ATMSC dưới tác dụng của dịch chiết nhau thai heo
Các tế bào ATMSCs đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết
nhau thai ở các nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL và 150 µg/mL. Số tế bào sẽ đƣợc
khảo sát số lƣợng vào các ngày 1 đến ngày 10. Sau đó tính toán giá trị trung bình,
sai số và so sánh sự khác biệt bằng thống kê T-test.
Hình 3.4. Biểu đồ đƣờng cong tăng trƣởng của tế bào ATMSCs dƣới tác động của
dịch chiết nhau thai heo ở các nồng độ 50, 100, 150µg/mL)

46. 37
Kết quả ở đồ thị 3.1 cho thấy sự tăng sinh của tế bào ở các nghiệm thức có sự
khác biệt.
Nghiêm thức 1: đối chứng (màu xanh dƣơng)
Nghiệm thức 2: đối chứng dƣơng (màu tím)
Nghiệm thức 3: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 50 µg/mL (màu xanh lá)
Nghiệm thức 4: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 100 µg/mL (màu đỏ)
Nghiệm thức 5: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 150 µg/mL (xanh biển)
Khi so với đối chứng, nghiệm thức 3 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê so với đối chứng. Tế bào đạt đỉnh ở ngày 8 là 5x104
tế bào và giảm số lƣợng tế
bào từ ngày 9, ngày 10. Tuy nhiên, nghiệm thức 4 có sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê so với đối chứng âm (p < 0,05) và đối chứng dƣơng (p < 0,05). Tế bào tăng cực
đại ở ngày 7 đạt 5.8x104
tế bào, còn đối chứng thì đạt 4,7x104
tế bào. Quan trọng, là
tế bào duy trì sự tăng sinh đến tận ngày 9 và giảm nhẹ vào ngày 10. Ở nghiệm thức
5, tế bào tăng cực đại tại ngày 6 đạt 5,1x104
tế bào. Tuy nhiên, tế bào lại gỉảm mạnh
ở ngày 8 và nhanh chóng giảm số lƣợng tế bào có ý nghĩa thống kê với đối chứng.
Nhƣ vậy, có thể thấy ở nghiệm thứ 4, khi có sử dụng dịch chiết ở nồng độ 100
µg/mL thì sự tăng sinh tế bào đạt tối ƣu.
3.1.2. Sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
ngƣời
ATMSCs đƣợc nuôi trong đĩa đƣờng kính 35mm, khi đạt tới gần bão hoà, thì bổ
sung dịch chiết nhau thai heo ở nồng độ 100 µg/ml vì đây là nồng độ tối ƣu để tăng sinh
AT-MSC. Sau 24h, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR theo hƣớng dẫn của nhà cung
cấp.
(A)
(B)
Hình 3.5. Kết quả biểu hiện gene Col-IV
-Actin
Col-4

47. 38
(A) (Cột màu trắng là ATMSCs, Cột màu đen là ATMSCs bổ sung dịch nhau thai heo ở
nồng độ 100 µg/m); (B) Hình chụp kết quả điện di. Vạch đầu là ATMSC, vạch kế là
ATMSCs bổ sung dịch chiết nhau thai heo
Biểu hiện gene Col-IV có sự tăng nhẹ nhƣng không có sự khác biệt về mặt
thống kê. Có thể cần khảo sát thêm ở các nồng độ khác và các mốc thời gian khác
để phân tích sâu hơn về việc thay đổi mức độ biểu hiện gene.
3.1.3. Biện luận
Dịch chiết nhau thai heo có hiệu quả tăng sinh tế bào ATMSCs:
Vai trò của dịch chiết nhau thai heo đã đƣợc một số tác giả nghiên cứu trƣớc
đây. Tiwary và cộng sự năm 2006, đã nghiên cứu về khả năng làm lành của dịch
chiết nhau thai với kết quả là dịch chiết hỗ trợ hồi phục những vết thƣơng khó phục
hồi nhờ có yếu tố tăng trƣởng biểu bì (EGF) [36]. Nghiên cứu của Sousa và cộng sự
năm 2008 chỉ ra rằng nhau thai heo có bFGF (yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi cơ
bản) đây yếu tố tăng trƣởng quan trọng để tế bào tăng sinh. bFGF còn liên quan tới
một số con đƣờng tín hiệu khác nhƣ PI3K-AKT, STAT. bFGF có vai trò quan trọng
trong các mô trƣởng thành, vì nhân tố này có thể điều hoà chức năng trao đổi chất,
sữa chửa tổn thƣơng mô, tái tạo mô và sự sống sót của tế bào [37].
Từ bảng 3.1 về thành phần acid amin của dịch chiết nhau thai heo và biểu đồ
hình 3.4 về sự tăng sinh ATMSCs qua các nghiệm thức, có thể nhận thấy các
nghiệm thức có bổ sung dịch chiết nhau thai heo đều có sự tăng sinh tế bào, có thể
lý giải rằng dịch chiết nhau thai đã cung cấp không chỉ các thành phần acid amin
cần cho sự tăng sinh tế bào mà còn là nguồn cung cấp các nhân tố tăng trƣởng,
hormone tăng trƣởng khác ví dụ bFGF. Nhƣ vậy, việc sử dụng dịch chiết nhau thai
heo tại nồng độ 100 µg/ml thích hợp cho khả năng tăng sinh tốt nhất cho tế bào gốc
trung mô thu từ mô mỡ. Tuy nhiên, khi khảo sát biểu hiện gene Col-IV của
ATMSCs với nồng độ tối ƣu chỉ có sự tăng nhẹ, không có sự khác biệt về mặt thống
kê. Có thể cần khảo sát thêm ở các nồng độ khác và các mốc thời gian khác để phân
tích sâu hơn về việc thay đổi mức độ biểu hiện gene.
3.2. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT LÃO HOÁ DA BỞI TIA UV
3.2.1. Ảnh hƣởng ở mức đại thể
Trƣớc khi tiến hành chiếu UV để bố trí thí nghiệm, đặc điểm da chuột ở các
nghiệm thức ban đầu đều có những đặc điểm bên ngoài tƣơng đồng nhau: bề mặt da

48. 39
đồng nhất về cấu trúc, độ đàn hồi tốt, màu da đồng đều, bề mặt da căng, mịn và lông
mỏng mịn, dễ cạo sạch lông (hình 3.6).
Hình 3.6. Chuột đƣợc cạo lông trƣớc khi chiếu UV
Sau khi chiếu UV, kết quả cho thấy cấu trúc bên ngoài của da ở các nghiệm
thức thí nghiệm có những thay đổi so với thời điểm trƣớc khi thí nghiệm, đặc biệt là
mốc thời gian bắt đầu từ tuần thứ 4 (sau 4 tuần chiếu). Ở nghiệm thức đối chứng
(không chiếu UV): hình dạng và cấu trúc bên ngoài của da không thấy có sự thay
đổi so với thời điểm trƣớc khi chiếu UV. Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ) và 2
(chiếu UV 6 giờ) chƣa thấy có đặc điểm gì khác biệt so với nghiệm thức đối chứng.
Riêng ở nghiệm thức 3 (chiếu UV 9 giờ) có sự xuất hiện các nếp nhăn nông và lớp
biểu bì bong tróc ở một số chuột, chân lông cứng hơn, sự đàn hồi của da lâu hơn so
với nghiệm thức đối chứng.
Kết thúc thí nghiệm (sau 8 tuần chiếu UV), kết quả thể hiện rõ ràng thông qua
quan sát tổng thể bên ngoài (hình 3.7) và mức độ cảm nhận sự đàn hồi của da.

49. 40
Hình 3.7. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Nghiệm thức đối chứng: bề mặt da nhẵn, mịn, không có nếp nhăn, toàn bộ
vùng da có màu trắng hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc
mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ
cạo sạch, không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị
tổn thƣơng khi cạo, tốc độ phục hồi nhanh (hình 3.7 a).
Nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày): bề mặt da tƣơng đối nhẵn, có dấu hiệu
khác biệt so với chuột ở nghiệm thức đối chứng; một số chuột xuất hiện nếp nhăn
nông và khó nhận biết, khi chuột di chuyển có xuất hiện một số nếp nhăn nông
nhƣng nhanh chóng trở lại trạng thái bình thƣờng, màu da trắng hồng và đều, sự đàn
hồi tốt, rất ít tế bào bị bong tróc, tốc độ phục hồi nhanh, khá tƣơng đồng so với
chuột đối chứng. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và
không để lại chân lông (hình 3.7 b).
Nghiệm thức 2 (6 giờ/ngày): màu da không đồng nhất, nhiều khu vực có màu
trắng đục, bề mặt da xuất hiện khá nhiều nếp nhăn nông, khi chuột di chuyển các
nếp nhăn trở nên sâu hơn và dễ nhận thấy bằng mắt thƣờng. Biểu bì bị bong tróc và
tạo nên một lớp vảy mỏng màu trắng trên bề mặt da. Da khô và dễ bị tổn thƣơng,
phần chân lông sau khi cạo trở nên cứng và tạo thành một lớp màu trắng đục, thô
ráp trên bề mặt da. Lông mới mọc có xu hƣớng cứng và chắc hơn so với chuột ở
nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1 ở cùng thời điểm quan sát. Sự đàn hồi của
da giảm (lâu hơn) so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1, da mất một
khoảng thời gian để phục hồi trạng thái ban đầu và có thể quan sát bằng mắt thƣờng
(hình 3.7 c).
Nghiệm thức 3 (9 giờ/ngày): da khô rõ, biểu bì bong tróc, bề mặt da thô ráp và
dễ tổn thƣơng, màu da không đồng đều, đa phần vùng lƣng bị cạo lông có màu
trắng đục, rất ít vùng có màu da trắng hồng nhƣ nghiệm thức đối chứng. Bề mặt
vùng da bị cạo xuất hiện các nếp nhăn sâu và nhiều hơn so với chuột ở nghiệm thức
2 và nếp nhăn trở nên sâu và rõ hơn khi chuột di chuyển. So với nghiệm thức 2, khả
năng đàn hồi của da kém, chạm tay vào có cảm giác da nhão và phải mất nhiều thời
gian hơn để trở lại trạng thái ban đầu. Phần chân lông sau khi cạo trở nên dày và
cứng khó thao tác cho các lần tiếp theo. Lớp lông mới mọc thƣờng thô, cứng và khó
cắt tỉa hơn so với lông của chuột đối chứng và nghiệm thức 1, 2 quan sát cùng thời
điểm (hình 3.7 d).

50. 41
3.2.2. Ảnh hƣởng cấu trúc vi thể của da
3.2.2.1. Độ dày biểu bì
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm
(X40)
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở mức vi thể
(hình 3.8) có độ dày biểu bì đƣợc thể hiện mức độ tuyến tính ở biểu đồ (hình 3.9).

51. 42
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì dƣới tác động của UV sau 8 tuần chiếu
Từ biểu đồ hình 3.9 nhận thấy, độ dày biểu bì của chuột bị ảnh hƣởng rõ rệt
dƣới tác dụng của các mốc thời gian chiếu UV. Cụ thể:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), độ dày trung bình của biểu bì là
14,50 µm, độ dày biểu bì ở các nghiệm thức còn lại (1, 2 và 3) đều tăng lên và có sự
cách biệt với độ tin cậy rất cao (p < 0,001) (xem phụ lục 3.1). Khi chiếu UV liên tục
3 giờ/ngày, độ dày biểu bì trung bình khoảng 18,17 µm (tăng 3,66 µm so với
nghiệm thức đối chứng); chiếu liên tục 6 giờ/ngày, độ dày biểu bì khoảng 24,06 µm
(tăng gấp gần 1,7 lần so với nghiệm thức đối chứng) và ở mốc chiếu 9 giờ/ngày
biểu bì có độ dày lớn nhất, trung bình khoảng 25,87 µm (tăng gấp gần 1,8 lần so với
nghiệm thức đối chứng). Tóm lại, độ dày biểu bì tăng dần theo ngƣỡng thời gian
chiếu UV. Điều này có thể do cơ chế tự bảo vệ của da để chống lại sức nóng của tia
UV. Tốc độ tăng không theo tuyến tính, nguyên nhân có thể do sự kích thích tác
động từ mức UV càng cao có thể làm cho độ dày càng tăng để chống lại sức nóng từ
tia UV, nhƣng khi đến ngƣỡng thì sự gia tăng này sẽ chậm lại và đƣợc duy trì.
3.2.2.2. Cấu trúc collagen
Sau khi nhuộm HE, mẫu da đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy cấu trúc
collagen với 4 mức độ khác nhau một cách rõ rệt (hình 3.10).
Hình 3.10. Cấu trúc collagen ở các mức độ lão hoá dƣới tác động của UV (X40)
(a - lão hoá mức 0; b - lão hoá mức 1; c - lão hoá mức 2; d - lão hoá mức 3)