Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại quảng ninh 3562574

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------***------
BÙI THỊ HƯƠNG PHÚ
NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM (Morinda officinalis How)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
TẠI QUẢNG NINH
CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM SINH
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THỊ THU HÀ
THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

2. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tên tôi là: Bùi Thị Hương Phú
Học viên cao học khóa 18. Chuyên ngành: Lâm học. khóa 2010 - 2012.
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên.
Đến nay tôi đãhoàn thành luận văn nghiên cứu cuốikhóahọc. Tôixin camđoan:
- Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện.
- Số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan.
- Các kết luận khoa học của luận văn chưa từng ai công bố trong các nghiên
cứu khác.
- Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên.
Thái Nguyên, ngày..... tháng ..... năm 2012
Người làm cam đoan
Bùi Thị Hương Phú

3. NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
CT - Công thức
TN- Thí nghiệm
ĐHST – Điều tiết sinh trưởng
MS – Murashinge and Skoog, 1962
BAP – 6- benzylaminopurine
Kinetin – 6- furfurylaminopurine
NAA - ɑ- Napahlene axetic acid
IBA - Indol – 3- butyric acid
HSNC – Hệ số nhân chồi
TLCHH – Tỷ lệ chồi hữu hiệu

4. -1-
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................7
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................7
1.2 Mục tiêu của đề tài........................................................................................8
1.2.1. Mục tiêu chung.....................................................................................8
1.2.2.Mục tiêu cụ thể......................................................................................8
1.3. Ý nghĩa của đề tài........................................................................................9
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................................10
2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................10
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật .............10
2.2.1 Tính toàn năng của tế bào ....................................................................10
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào...........................................11
2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào ...................................................................................................13
2.3.1. Môi trường nuôi cấy ...........................................................................13
2.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng...................................................................18
2.3.3. Môi trường vật lý................................................................................20
2.3.4 Điều kiện vô trùng ...............................................................................21
2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống.........................................21
2.5. Những ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống............................................23
2.6. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào..................................................25
2.6.1. Trên thế giới .......................................................................................25
2.6.2. Ở Việt Nam ........................................................................................26
2.7. Tổng quan về cây Ba kích..........................................................................27
2.7.1. Đặc điểm thực vật học .......................................................................27

5. -2-
2.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái.................................................................28
2.7.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng..........................................................31
2.7.4. Nhân giống cây Ba kích......................................................................32
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................34
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu..............................................................34
3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................34
3.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................35
3.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................41
3.5. Thu thập số liệu xử lý số liệu.....................................................................41
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...............................43
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu
cấy....................................................................................................................43
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ
sống của mẫu cấy .........................................................................................43
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng bằng Clolox đến tỷ lệ
sống của mẫu cấy .........................................................................................45
4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng thủy ngân chlorua
đến tỷ lệ sống của mẫu cấy...........................................................................46
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số
nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .......................................................................49
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP
đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu....................................................50
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng Kinetin
đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu....................................................53

6. -3-
4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của chất điều tiết sinh
trưởng BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ..............56
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
ra rễ của chồi Ba kích .......................................................................................60
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng NAA
đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích .............................................................60
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến
khả năng ra rễ của chồi Ba kích tím..............................................................64
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
sinh trưởng chiều cao cây con Ba kích tím ở giai đoạn vườn ươm....................68
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ.......................................72
5.1. Kết luận.....................................................................................................72
5.2. Tồn tại .......................................................................................................72
5.3. Kiến nghị...................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................74
PHỤ LỤC ............................................................................................................77

7. -4-
DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu
chồi hữu hiệu
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của 2mg/lBAP + Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến sự ra rễ của chồi
Ba kích
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến khả năng ra rễ của
chồi Ba kích
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây
con ở giai đoạn vườn ươm
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.5. Ảnh hưởng của BAP đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.8. Ảnh hưởng của 2mg/l BAP + kinetin đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.9. Ảnh hưởng của 2mg/l BAP + Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.10. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới tỷ lệ chồi ra

8. -5-
rễ
Đồ thị 4.11. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới số rễ trung
bình (rễ/cây)
Đồ thị 4.12. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới chiều dài
trung bình rễ (cm)
Đồ thị 4.13. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA tới tỷ lệ chồi ra
rễ
Đồ thị 4.14. Ảnh hưởng của IBA tới số rễ trung bình (rễ/cây)
Đồi thị 4.15. Ảnh hưởng của IBA tới chiều dài trung bình rễ
Đồ thị 4.16. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống cây con ở giai
đoạn vườn ươm
Đồ thị 4.17. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới chiều cao trung bình cây
con ở giai đoạn vườn ươm
DANH MỤC ẢNH
Hình 4.1. Nuôi cấy khởi đầu
Hình 4.2. Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BAP
Hình 4.3. Chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung Kinetin
Hình 4.4. Chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP+ Kinetin.
Hình 4.5. Chồi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA
Hình 4.6. Chồi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung IBA
Hình 4.7. Chồi Ba kích nuôi cấy mô sinh trưởng trong giá thể ngoài vườn ươm

9. -6-
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện và hoàn thành theo chương trình đào tạo thạc sĩ
lâm nghiệp của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần
Thị Thu Hà. Người đã bồi dưỡng kiến thức quý báu và đã dành tình cảm tốt đẹp
cho tác giả từ khi hình thành, phát triển ý tưởng, xây dựng đề cương, tổ chức
triển khai và hoàn thiện luận văn.
Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được
sự quan tâm và giúp đỡ tận tình của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên,
đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy. Xin trân
trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng công nghệ sinh học trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên đã tư vấn, góp ý trong quá trình hoàn thiện bản luận văn này.
Đối với địa phương, tác giả chân thành cảm ơn các cán bộ công nhân viên
phòng công nghệ sinh học Trường Cao đẳng Nông lâm Đông Bắc. Nơi tác giả đã
tiến hành nghiên cứu, thu thập số liệu để hoàn thiện luận văn.
Xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình đã khuyến khích, giúp đỡ tác giả
trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Mặc dù đã làm việc nghiêm túc với tất cả nỗ lực, song luận văn không tránh
khỏi những thiếu sót nhất định. Tác giả rất mong nhận được những ý kiến đóng
góp quý báu của các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học, các bạn bè đồng nghiệp
và xin chân thành tiếp thu các ý kiến đóng góp đó.
Xin trân trọng cảm ơn!
Tác giả
BÙI THỊ HƯƠNG PHÚ

10. -7-
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Với mục tiêu phát triển của nghành Lâm nghiệp Việt Nam giai đoạn 2010 -
2020 là nâng cao tỷ lệ che phủ của rừng và chất lượng rừng trồng. Do vậy những
loài cây được trồng không chỉ là những cây lấy gỗ lâu năm phù hợp với hoàn
cảnh đất trồng rừng mà còn phải đảm bảo có năng suất cao, chu kỳ kinh doanh
ngắn có nhiều tác dụng đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay. Đặc biệt trong
những năm gần đây việc trồng cây lâm sản ngoài gỗ dưới tán rừng được xem
như là một chiến lược lớn nhằm đáp ứng cả hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện
tích trồng rừng và cải thiện môi trường cũng như tính đa dạng sinh học của rừng.
Một trong những loài cây dược liệu có giá trị kinh tế cao đang được đưa vào
trồng xen dưới tán rừng đó là cây Ba Kích.
Cây Ba kích có 2 loại là Ba kích trắng và Ba kích tím. Cây Ba kích tím
được sử dụng nhiều bởi hàm lượng dược liệu có trong củ tốt hơn so với cây Ba
kích trắng. Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê
Rubioceae. Cây Ba kích tím được xem là cây bản địa của tỉnh Quảng Ninh đây là
loài cây dược liệu quý hiếm có rất nhiều công dụng. Nước Ba kích sắc có tác
dụng hạ huyết áp, tăng sức dẻo dai, tăng cường đề kháng cơ thể, chống viêm,
chữa thận hư, tráng dương, phụ nữ khó thụ thai, tay chân đau nhức, chữa gân
xương yếu…. có giá trị xuất khẩu cao. Ngoài ra củ Ba kích còn được dùng ngâm
rượi là một loại đặc sản của Quảng Ninh.
Những năm gần đây Ba kích mọc tự nhiên trong rừng bị khai thác cạn kiệt
dẫn đến diện tích bị thu hẹp, nguồn giống cạn dần. Hiện nay nhiều hộ gia đình
tiến hành phát triển trồng cây Ba kích. Song từ trước đến nay chủ yếu dùng cây
giống nhân từ hạt và hom. Việc nhân giống bằng hạt không phải bao giờ cũng

11. -8-
thuận lợi và hợp lý, thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ nảy mầm thấp mặt khác cây
giống đem trồng có nguồn gốc từ hạt không đảm bảo do hiện tượng phân ly
trong sinh sản hữu tính nên quần thể cây rừng không còn giữ được phẩm chất ưu
việt của nguồn giống đem trồng. Đối với phương pháp giâm hom thì hệ số nhân
giống thấp, cây trồng bằng hom có sức sống kém, chất lượng củ kém.
Khó khăn lớn nhất hiện nay là nguồn giống có phẩm chất di truyền tốt phục
vụ cho trồng rừng đại trà còn hạn hẹp. Cùng với yêu cầu và sự phát triển của thị
trường hiện nay cần một lượng cây giống có chất lượng cao rất lớn. Để giải
quyết nhu cầu cây giống hiện nay và tương lai việc nhân giống cây Ba kích bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một hướng đi cần thiết bởi có thể nhân số
lượng cây lớn trong thời gian ngắn để cung cấp thị trường mặt khác cây nuôi cấy
mô mang nhiều ưu điểm, có sức trẻ hóa cao, cây con mang đuợc toàn bộ tiềm
năng di truyền quý của bố mẹ, tăng sự đồng đều rừng trồng, cây trồng có sức
sinh trưởng và phát triển cao có tuổi thọ lớn. Cây con được tạo ra từ công nghệ
nuôi cấy mô tế bào sẽ khắc phục được những nhược điểm của việc tạo cây con từ
hạt và giâm hom.
Để góp phần giải quyết các tồn tại trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu nhân giống vô tính cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào tại Quảng Ninh”.
1.2 Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phương pháp
nuôi cấy mô, nhằm góp phần phục vụ công tác duy trì và sản xuất giống cây Ba
kích bằng phương pháp nuôi cấy mô trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.
1.2.2.Mục tiêu cụ thể

12. -9-
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cây Ba
kích
- Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh của chồi Ba kích.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA tới khả năng ra rễ của chồi Ba kích .
- Xác định ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống và sinh trưởng
chiều cao cây con ở giai đoạn vườn ươm.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
* Ý nghĩa khoa học:
- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Ba
kích bằng phương pháp nuôi cấy mô. Đánh giá được tác động của một số chất
điều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây Ba kích.
- Đánh giá được tác động của các thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng cây con ở giai đoạn vườn ươm.
- Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản
xuất cây Ba kích.
* Ý nghĩa thực tiễn sản xuất:
Sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối
lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất.

13. -10-
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture): Là phương
pháp sản xuất hàng loạt cây con (bản sao) từ các bộ phận của cây (các cơ quan,
mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có
môi trường thích hợp và được kiểm soát (Ngô Xuân Bình, 2000) [1].
Vật liệu để nhân giống có thể là các cơ quan của cây: rễ, thân, lá, hoa, quả,
các tế bào được phát sinh từ các bộ phận của cây (mô sẹo - callus) hoặc các tế
bào đơn được tách từ các mô, các tế bào đã được loại bỏ phần vách (tế bào trần -
protoplast) [1].
Phương pháp nhân giống này sử dụng một bộ phận rất nhỏ của cơ thể sinh
vật làm vật liệu để nhân giống nên còn được gọi là vi nhân giống và thường được
thực hiện ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm có môi trường thích hợp và
được kiểm soát nên được gọi là nuôi cấy in vitro để phân biệt với quá trình nuôi
cấy trong điều kiện tự nhiên, ngoài ống nghiệm (in vivo) (Vũ Thị Huệ, 2008)
[18].
Phương pháp nhân giống này thường được gọi chung là nhân giống
bằng nuôi cấy mô và tế bào, là một trong những ngành kỹ thuật trẻ, mới được
hình thành từ những năm đầu của thế kỷ XX và được phát triển mạnh trong vài
chục năm gần đây. Ngày nay phương pháp này được coi là một công cụ đắc lực
để nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực có đối tượng sinh vật và là một
nội dung quan trọng không thể thiếu được của công nghệ sinh học hiện đại [18].
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

14. -11-
Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành
nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho
rằng mỗi tế bào của bất kỳ của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin
di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của
thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát
triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen
của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với
điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá
thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. [15]
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham, Unio) đã thành công khi thực
nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong
nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.[25]
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn
toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ.
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hóa và phản
phân hóa tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao
gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác
nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên
môn hóa nhất định nhờ sự phân hóa [16].
Phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân

15. -12-
hóa có thể diễn ra như sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng
Khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất
khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,
chúng lại có thể trở lại về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện
quá trình
phân hóa. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa của tế bào.
Hình 1.01: Tóm tắt quá trình sự phản phân hóa của tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa
phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một
số gen được hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt
động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc
của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị
ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi
thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương
trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994) [22].
Phân hóa
Tế bào phôi
sinh
Tế bào giãn Tế bào
chuyển hóa
Phản phân hóa

16. -13-
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô,
tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách
định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết
sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin [13].
2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.3.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô và tế bào, môi trường nuôi cấy và môi trường xung
quanh là hai vấn đề chính quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng và
phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Cơ sở của việc xây dựng các môi
trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và
phát triển của cây. Vì thế thời gian đầu các nhà cấy mô đã sử dụng các môi
trường tự nhiên có nguồn gốc thực vật như dịch chiết lá, nước nội nhũ... nên
không thành công. Cho đến nay, rất nhiều môi trường dinh dưỡng đã lần lượt
được tìm ra và chúng đều mang tên tác giả đề xuất như: White (1934), Knudson
(1964), Vacin and Went (1949), Murashige – Soog (MS 1962), Knop (1974)...
Tuy nhiên mỗi môi trường chỉ thích hợp vài loài cây nhất định cho nên trong
nuôi cấy in vitro, tùy thuộc vào quá trình phát triển mà chọn môi trường dinh

17. -14-
dưỡng cho phù hợp. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh thành phần,
hàm lượng các chất trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả
năng phát sinh hình thái của các bộ phận nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi, lá, rễ
của cây hoàn chỉnh cũng như sự sinh trưởng phát triển của toàn cây. Tùy từng
loại giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể
mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng là khác nhau. Trong môi
trường nuôi cấy số lượng và các loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối
tượng cụ thể.
Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm; các
loại muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cácbon, vitamin, các chất điều
hòa sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất nền.
* Khoáng đa lượng
Được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Những nguyên tố N,S, P, K, Mg, Ca
là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy. Riêng Na và Cl cũng được
sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng [18].
Nitơ (N): được sử dụng ở dạng NO3
-
và NH4
+
riêng rẽ hoặc phối hợp với
nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông
qua hệ thống nitrat reductase. Ammonium được tế bào thực vật đồng hóa trực
tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như axit amin. Nhưng điều đáng
lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào
giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Vì vậy hầu hết các loại môi trường đều dùng
nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài
cây đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp [18].
Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi
trường giàu kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất.

18. -15-
Phốt pho (P) là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất
cao, thường được đưa vào môi trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photphat.
Phốt pho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nuleic. Ngoài
ra khi phốt pho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng như một hệ thống đệm
làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
Lưu huỳnh (S) được sử dụng chủ yếu và tốt nhất là ở dạng muối SO4
-2
với
nồng độ thấp.
* Khoáng vi lượng
Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm, nhưng rất
nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự
phát triển của mô là: Sắt, Đồng, Kẽm, Mangan, Molybden, Bo, Coban, Iot. Các
nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym, chúng
được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng [3].
Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia. Thiếu Fe làm giảm lượng
ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng ADN và axit amin tự do
dẫn đến giảm phân bào. Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi
pH môi trường thay đổi, phức hợp này mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu
cầu trao đổi chất trong tế bào [3].
Mangan (Mn): thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các axitamin tự do và
ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp protêin giảm đến kém phân bào [3].
Bo (B): thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực
tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có
biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém
tái sinh.
Molypden (Mo): đóng vai trò co- factor trong hệ thống nitrat reductase, như

19. -16-
vậy Mo tác động trực tiếp nên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật.
* Nguồn cacbon
Cây invitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng
nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế
cho nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cácbon dưới dạng hữu cơ và
bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối [12].
Tùy thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp đặc biệt có
thể dùng các loại đường khác nhau: Sucrose, Maltose, Galactose và Lactose.
Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau nhưng
thường dùng với hàm lượng từ 20-40 g/l [20].
Việc trải qua nồi hấp điện gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân nhưng
không thể hiện điều bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật. Trong sản xuất đại
trà cây giống, người ta thường sử dụng đường sucrose có giá rẻ và sẵn có trên thị
trường.
* Vitamin
Các vitamin, các axitamin và các chất phụ gia hữu cơ thường được bổ sung
vào môi trường dinh dưỡng nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát triển của
mô nuôi cấy. Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả
năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về
lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
Tùy từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy mà các vitamin được bổ sung một lượng
thích hợp để mô đạt sinh trưởng tối ưu [23].
Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
cácbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy hóa khử
cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1 – 10 mg/l.

20. -17-
Vitamin B6 (piridoxin): tham gia vào thành phần các enzym khử cácbon và
thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1- 1mg/l.
Myo- inostol cần được bổ sung với lượng khá lớn từ 50 – 500 mg/l và tỏ ra có
tác dụng rất rõ rệt đến sự phân chia của mô.
* Chất nền
Để cố đinh mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy người ta thường sử dụng
chất làm đông cứng môi trường là thạch. Thạch là một loại polysaccharit của tảo
biển. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao 6- 12g thạch / l nước, ở 800
c thạch
ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400
c trở về trạng thái gel. Độ thoáng
khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rất rõ đến sinh trưởng của mô nuôi cấy.
Nồng độ của thạch dùng trong môi trường nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ
tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường từ 5-10g/l) [21].
Ngoài ra nước pha môi trường phải là loại nước hoàn toàn sạch ion. Thông
thường người ta sử dụng nước cất hai lần và tốt nhất sử dụng hệ thống cất nước
thủy tinh.
Độ pH của môi trường là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng hòa tan
các chất khoáng trong môi trường, sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ
chất dinh dưỡng của cây. Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối
với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh pH của môi trường về
mức ổn định ban đầu. Nếu pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao hơn (pH > 7,0) đều gây
ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy invitro [21].
* Các chất phụ gia
Cho đến nay thành phần môi trường ngày càng phong phú, đầy đủ và phức
tạp. Người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như:
Nước dừa được sử dụng từ năm 1941 để nuôi phôi của Datura. Kết quả phân tích

21. -18-
thành phần nước dừa của Tulecke và cộng tác viên (1961) cho thấy trong nước
dừa có: Amino acid tự do, amino acid dạng liên kết, axit hữu cơ, đường, ARN và
ADN [19].
Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): thành phần hóa học chưa được phân
tích kỹ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có họat tính điều
khiển sinh trưởng [23].
Dịch chiết nấm men (Yeast Extract): thành phần hóa học của dịch chiết nấm
men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa đường, nucleic acid, amino acid,
vitamin, auxin khoáng. Tác dụng của YE rất tốt, nhưng với mô sẹo không rõ
ràng [18].
2.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất
quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng. Tùy theo từng mục
đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng
phù hợp. Những chất điều hòa sinh trưởng thường dùng bao gồm.
* Auxin
Auxin do Went và Thimann (1937) phát hiện. Auxin có tác dụng kích thích
sự hình thành mô sẹo và xuất hiện rễ bất định, kích thích sự giãn của tế bào [29].
Các loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:
- Indol – 3- acetic acid (IAA): auxin tự nhiên
- Indol – 3- butyric acid (IBA)
- Naphthyl acetic acid (NAA).
* Cytokinin
Được phát hiện bởi Skoog (vào khoảng năm 1950) trong một thí nghiệm
chiết xuất acid nucleic. Đó là những cấu tử của nucleic acid bị phân hủy thành.

22. -19-
Các chất thuộc nhóm cytokinin thường được sử dụng là Kinetin, BAP, Zeatin.
Trong các chất này BAP và Kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao
và giá thành không đắt. BAP và Kinetin cùng có tác dụng kích thích phân chia tế
bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già
của tế bào. Cytokinin được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự
phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan
[29].
Tác động phối hợp của Auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự
phát triển và phát sinh hình thái tế bào và mô.Việc sử dụng tỷ lệ Auxin/cytokinin
trong môi trường nuôi cấy tác dụng quyết định đến sự phân hóa của mô theo
hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo. Cytokinin được tổng hợp ở rễ và hạt đang
phát triển, được vận chuyển từ dưới lên trên.
* Gibberellin
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bời nhà nghiên cứu người Nhật
Kurasawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây
ra. Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được gọi là
Gibbellin. Gibberellin kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự
vươn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích
đặc trưng của Gibberellin lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Tới nay đã phát
hiện được trên 60 loại chất khác nhau thuộc nhóm Gibberellin acid. Loại
Gibberelin thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 có tác dụng kích thích nảy
mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó
GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987).
Ngoài ra, còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác
dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây [28].

23. -20-
2.3.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm
đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
* Ánh sáng
Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường
độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng vai trò quan trọng
trong quá trình phát triển của mô.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi
cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường
độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng
thích hợp cho nuôi cấy mô từ 1000 – 7000 lux [27].
Bên cạnh thời gian chiếu sáng cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ
làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh
thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của mô
sẹo. Chính vì vậy mà phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đen huỳnh
quang với cường độ 1000 - 3000 lux.
* Nhiệt độ
Là nhân tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao
đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin,
do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Tùy thuộc vào xuất xứ của
mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích
hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250
C [27].
* Độ ẩm

24. -21-
Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không
cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
2.3.4 Điều kiện vô trùng
Thiết lập trạng thái vô trùng là tiền đề quan trọng hàng đầu cho thành công
của nuôi cấy mô thực vật. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi
cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Do đó, trong toàn bộ
quá trình nuôi cấy invitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối. Muốn đảm
bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương
tiện khử trùng hiện đại, phòng nuôi cấy vô trùng, chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh
trưởng nhanh.
Nồi hấp tiệt trùng: dùng áp suất hơi nước và nhiệt độ cao để tiệt trùng dụng
cụ và môi trường nuôi cấy.
Box cấy vô trùng: là một không gian tác nghiệp vô trùng tối đa cho các
hoạt động cấy chuyển. Đây là thiết bị lọc không khí vô trùng. Tạo buồng không
khí sạch để thực hiện các thao tác trong điều kiện vô trùng nhờ màng lọc ngăn
cản tất cả các vật có kích thước lớn hơn 0,2 - 0,3mm [23].
Dung dịch khử trùng: vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành
công ngay trong lần khử trùng đầu tiên. Tuy vậy nếu kiên trì tìm được nồng độ
thích hợp và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết
quả tốt. Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy ngươi ta thường sừ dụng các
dung dịch như HgCl2 (clrua thủy ngân), NaHCl 10%, nước Clolox, cồn 750
… để
khủ trùng. [23]
2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống
Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

25. -22-
Mục đích tạo ra được nhiều mẫu sạch nhất có khả năng sống cao nhất để từ
đó tạo ra được nhiều chồi nhân ban đầu nhất. Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải
đảm bảo các yêu cầu không bị thâm, dập nát, đảm bảo tiêu chuẩn của mẫu cấy,
tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tạo nhiều mẫu sạch, sinh trưởng phát triển bình
thường, không dị dạng [18].
Giai đoạn 2: Giai đoạn cấy khởi động
Nuôi cây đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu (cây
mẹ) tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu được chồi nhân ban
đầu.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển
của mô nuôi cấy từ đó tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy. Khi có nguồn nguyên
liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều kiện vô trùng.
Người ta thường dùng các loại hóa chất như HgCl2, H2O2, NaOCl… để khử
trùng mẫu cấy. Tùy thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hóa chất, nồng độ và
thời gian khử trùng thích hợp.
Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng
(tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên bên cạnh đó
cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy. Thường các mô non,
chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa [18].
Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Nhân nhanh chồi là quá trình kích thích chồi nhân ban đầu nảy mầm từ vật
liệu nuôi cấy phát sinh được nhiều chồi nhất trong thời gian ngắn nhất [18].
Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng, nó quyết định tốc độ và hiệu quả của
quá trình nhân giống invitro. Nguyên liệu của nhân nhanh chồi là các cụm chồi
và chồi non nảy mầm từ mẫu cấy và từ các cụm chồi và chồi non đã qua cấy

26. -23-
chuyển từ giai đoạn nhân nhanh chồi trước đó.
Mục đích giai đoạn nhân nhanh chồi nhằm tạo ra được lượng chồi nhiều
nhất trong thời gian ngắn nhất để cung cấp cho giai đoạn tạo rễ. Giai đoạn này
nhằm tìm ra được môi trường thích hợp cho khả năng nhân nhanh chồi và việc
hình thành cây từ thể chồi thuận lợi nhất.
Giai đoạn 4: Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Tạo cây hoàn chỉnh là giai đoạn cuối của quá trình vi nhân giống với mục
đích để tạo cây con hoàn chỉnh với yêu cầu cây khỏe mạnh, có bộ rễ cứng cáp để
có thể sinh trưởng, phát triển tốt khi đưa ra ngoài vườn ươm hoặc vườn sản xuất
[18].
Mục đích của tạo cây hoàn chỉnh là tạo được nhiều cây mô hoàn chỉnh trong
thời gian ngắn nhất. Tìm ra được môi trường ra rễ tồi ưu nhất cho chiều cao chồi,
độ tuổi của chồi phù hợp nhất để chồi có thể ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh trong thời
gian ngắn nhất. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi
cấy các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hormon thực vật
quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Gai đoạn 5: Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn
ươm. [18]
2.5. Những ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống
Theo Nguyễn Đức Thành [15], sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật đã mang lại ý nghĩa vô cùng to lớn. Nó đã chứng minh được tính toàn

27. -24-
năng của tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật góp phần giải
quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu quá trình phát
sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là một trong những giải pháp công
nghệ mới có ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học. Trên các môi trường
nhân tạo, từ các mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hóa và phát triển
thành cây hoàn chỉnh. Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương
pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính.
Ưu điểm của phương pháp nhân giống nuôi cấy mô là:
- Tạo ra một quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc tính tốt của cây mẹ. Về
cơ bản nuôi cấy mô là công nghệ nhân dòng, do đó có thể tạo ra một quần thể có
độ đồng đều cao.
- Có hệ số nhân giống cao: từ một cụm chồi sau một năm có thể tạo ra hàng vạn
cây con, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất để sớm phát huy được hiệu
quả kinh tế.
- Tiết kiệm được không gian: vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí
nghiệm nên không có sự ảnh hưởng của thời tiết, các vật liệu khởi đầu có kích
thước bé, mật độ cây tạo nên trên một đơn vị diện tích lớn hơn nhiều so với sản
xuất ngoài vườn ươm.
- Có tiềm năng công nghiệp hóa cao: nuôi cấy trong điều kiện chủ động hoàn
toàn về môi trường dinh dưỡng, chế độ chiếu sáng và nhiệt độ là tiền đề hoàn
toàn thoát khỏi sự lệ thuộc vào mùa vụ. Có thể công nghiệp hóa hoàn toàn công
việc sản xuất giống trong một dây chuyền sản xuất liên tục.
Bên cạnh những ưu điểm đó thì cũng có những nhược điểm mà công nghệ
nuôi cấy mô tế bào gặp phải như: đòi hỏi cơ sở vật chất khang trang, quy mô có

28. -25-
đầy đủ các phòng chức năng riêng
Công nghệ vi nhân giống đối với mỗi loài cây khác nhau là khác nhau. Mỗi
loài cây có yêu cầu về các loại khoáng đa lượng và vi lượng khác nhau, đòi hỏi
bổ sung nguồn cacbon, các vitamin và các chất bổ sung khác nhau. Đặc biệt là
yêu cầu về loại và nồng độ các loại chất điều hòa là rất khác nhau ở mỗi giai
đoạn nuôi cấy của mỗi loài thực vật. Kỹ thuật huấn luyện và chăm sóc cây mô
cũng khác nhau ở mỗi loài. Vì vậy đưa ra được công nghệ vi nhân giống cho một
loài cây cụ thể nào đó phải mất nhiều thời gian và hóa chất để nghiên cứu.
2.6. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào
2.6.1. Trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và
được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau:
Năm 1902, Harberland là người đầu tiên dựa trên thuyết tế bào của Schleiden và
Schwann đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tuy nhiên ông đã
không thành công trong các thí nghiệm nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ
lá của một số cây thuộc lớp một lá mầm (Nguyễn Đức Thành, 2002) [15].
Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công
trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh [2].
Năm 1934 với công trình của White (Mỹ) ông đã nuôi cấy thành công rễ cà chua
(Lycopersicum esculanum) trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và
dịch chiết nấm men. Năm 1935 Thimann đã phát hiện ra Auxin (IAA) trong mô
thực vật (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [19].
Trong những năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin
được tổng hợp thành công (NAA, 2,4D) và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng
trong nuôi cấy mô cùng với nước dừa, kết quả chúng có tác dụng kích thích tạo

29. -26-
mô sẹo, thúc đẩy phân chia tế bào rõ rệt [16]. Skoog và Mille (1956) đã tìm hiểu
ảnh hưởng của tỷ lệ Auxin/Xitokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình
thành cơ quan và tạo được chồi từ mô thuốc lá nuôi cấy [19].
Morel (1960) đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan cymbidim [1]. Guha và
cộng sự (1966) thành công trong nuôi cấy thể đơn bội ở cà độc dược từ bao phấn
[20]. Năm 1967-1968, lần lượt Nichokoi, Nakato và cộng sự tạo được cây đơn
bội từ bao phấn thuốc lá [15]. Takeb (1971) tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế
bào trần [16].
Từ năm 1980, hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được
công bố. Ngày nay nuôi cấy mô và tế bào không những là một cơ sở quan trọng
của công nghệ sinh học hiện đại, công cụ quan trọng trong chọn tạo và nhân
giống hiện đại mà còn đóng góp những cơ sở lý luận mới cho sinh học hiện đại
[1].
2.6.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, ngành công nghệ sinh học nói chung, công nghệ nuôi cấy mô
và tế bào nói riêng mới được hình thành trong vài chục năm gần đây và được
phát triển mạnh từ năm 1990 đến nay, nhưng đã có những bước tiến nhanh
chóng và bước đầu đã có một số ứng dụng vào sản xuất nông – lâm nghiệp.
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một
số giống Bạch đàn nhập nội, các song Bạch đàn lai và Keo lai có năng suất cao.
Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và
một số cây rừng khác. (Lê Đình Khả và cộng sự, 2003)[11].
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) đã thực hiện một số nghiên cứu bổ sung

30. -27-
cho một số dòng keo lai đã được đánh giá và thu được một số kết quả như sau:
khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 12 phút trong
tháng 2,5,8,10 và 12 cho thấy trong 8- 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hưởng của
điều tiết sinh trưởng đến khả năng nay chồi là BAP 2mg/l à BAP 2mg/l +
Kinetin 0,05mg/l và môi trường MS là công thức cho chồi đẻ nhiều nhất. Ảnh
hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng keo lai riêng biệt
là: IBA 3mg/l cho tỷ lệ ra rễ cao 80 – 90%. Đối với BV10, BV29, BV32, BV33.
Nồng độ 1mg/l ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%).
Đoàn Thị Nga nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN2 cho rằng,
môi trường thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l BAP + 0,25mg/l NAA. Môi
trường ra rễ tối ưu là 1/4MS + 1mg/ l IBA [24].
2.7. Tổng quan về cây Ba kích
Cây Ba kích có tên khoa học: Morinda officinalis How. Thuộc họ Cà phê
(Rubiaceae)
2.7.1. Đặc điểm thực vật học
Rễ dạng trụ tròn phân nhánh nhiều cấp thành bộ phận rễ phân bố tỏa tròn
xung quanh gốc, nhìn ngoài có vết thắt từng đoạn, thịt rễ dày, nạc, màu tím hoặc
trắng ngà. Cành non dạng bốn cạnh, màu tím hoặc xanh, có lông [8].
Lá mọc đối, khi non màu xanh hoặc màu tím, khi già màu xanh, cuống lá dài
từ 4- 8mm. Lá kèm màu nâu dạng mo, ôm thân. Phiến lá thường hình mác thuôn
nhọn, hình ellip thuôn dài nhọn hoặc hình mác ngược hay hình trứng. Hiếm khi
thấy hình mác hẹp dài. Phiến lá dài 3 - 16cm, rộng 1,9 - 6,5 cm đầu lá thuôn
nhọn hay nhọn sắc, gốc lá nhọn hình nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm
dạng tim [8].

31. -28-
Cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ít khi là cụm hoa tán đơn. Ở cụm sim tán
kép, hoa hầu như không cuống, cụm tán đơn hoa có cuống rõ ràng. Hoa nhỏ ống
đài dạng chén, có 3 - 4 răng nhỏ không đều. Tràng màu trắng, ống tràng dài 2 -
3mm, họng có lông, ở đầu có 3 - 4 cánh tràng dạng tam giác nhỏ. Nhị 3 - 4 bao
phấn nhọn đầu, hai ô, đính lưng, chỉ nhị cực ngắn. Vòi nhụy ngắn, đầu nhụy hai
thùy [8].
Ở cụm quả đơn, quả có cuống rõ ràng. Mỗi quả có 4 hạt. Hạt có lông màu
hồng, khi khô màu trắng. Mùa hoa quả tháng 4 - 5, quả chín tháng 10 - 11, cá
biệt có thể quả chín từ tháng 9 hoặc kéo dài tới đầu tháng 7.
2.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái
Cây ưa ẩm, ưa sáng và có khả năng chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ. Ba
kích thường mọc tự nhiên trong các kiểu rừng thường xanh nhưng đã trở nên thứ
sinh, bao gồm cả rừng xen tre nứa và rừng non phục hồi sau nương rẫy [7].
Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và
ẩm. Ra hoa quả hàng năm. Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt hoặc mọc cụm
chồi từ các phần còn lại sau khi chặt, phần rễ còn sót lại khi khai thác cũng có
thể nảy mầm thành cây mới.
Yêu cầu về nhiệt độ là nhiệt độ trung bình năm 22,50
C - 23,10
C. Độ ẩm
không khí trung bình năm từ 82 - 89%. Ba kích mọc tự nhiên trên các loại đất
feralit đỏ - vàng hay vàng - đỏ, tầng đất thịt ở trên tương đối dày, có kết cấu
tượng hạt và kết vón nhưng không có đá ong chặt. Đất luôn ẩm, hơi chua, pH từ
3,6 đến 4,1, hàm lượng mùn 3,78 - 5,91%. Hàm lượng tổng số các chất trong
100g đất lần lượt là: Nitơ 0,24 - 0,34mg, Lân 0,7 - 1,5mg và Kali 7mg. Ngoài ra
Ba kích có thể sống trên đất feralit đỏ sẫm. Tầng đất mặt ở đây tương đối dày

32. -29-
(tới 1m), thành phần cơ giới nặng, cấu tạo hạt chắc và tơi xốp, pH hơi chua đến
trung tính 4,5 - 6, hàm lượng mùn ở mức trung bình 3 - 4%. Tại Hoành Bồ -
Quảng Ninh và Sơn Động - Bắc Giang còn thấy Ba kích mọc trên đất bồi tụ, pha
cát ở chân núi. Loại đất này thường nghèo dinh dưỡng hơn so với loại đất trên.
Ba kích không thích hợp với đất phù sa và các loại đất khác ở đồng bằng.
Ánh sáng là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và
phát triển của Ba kích. Trong tự nhiên cây mọc xen lẫn với các loài cây khác
dưới tán rừng, độ che tán 20 - 60%. Tuy nhiên để sinh trưởng phát triển được,
cây thường leo lên các cây bụi hay cây gỗ nhỏ để tiếp cận với ánh sáng. Cây
được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả nhiều hơn và nhiều hạt chắc hơn cây bị che
bóng.
Ba kích là cây ưa ẩm nên nhu cầu về nước đối với Ba kích là một nhân tố
không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Có nước đầy đủ mới
đảm bảo được quá trình quang hợp, hô hấp và trao đổi chất. Ngoài ra nước còn
làm cho đất luôn ẩm, hệ thống lông hút được bảo vệ và bộ rễ nạc mới phát triển
tốt. Ngược lại cây Ba kích bị thiếu nước hạt sẽ bị lép nhiều, thậm chí cây tự vàng
úa, khô héo và có thể bị chết. Tuy nhiên, vào thời kỳ hoa nở, nếu gặp mưa liên
tục vài ngày sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng thụ phấn, tỷ lệ đậu quả thấp.
Ngoài ra, Ba kích là cây không chịu được ngập úng. Nếu bị ngập nước liên tục 5
- 7 ngày, cây cũng sẽ bị chết.
Cây Ba kích sử dụng các chất hữu cơ và khoáng có sẵn trong đất. Trong
tự nhiên, lá cây mục và các sản phẩm thứ cấp khác là nguồn cung cấp dinh
dưỡng cho đất. Trong trồng trọt, Ba kích được trồng trên các loại đất gần như
không còn các lớp phủ thực vật thì nguồn cung cấp này do phân bón. Thực tế

33. -30-
trồng Ba kích tại Hoành Bồ - Quảng Ninh và Đoan Hùng - Phú Thọ cho thấy
việc bón phân NPK - S. 1: 5:3:13 đã mang lại một số kết quả rõ rệt. Lân giúp cho
cây đậu quả tốt, hạt chắc. Kali làm cho bọ rễ nạc Ba kích phát triển mạnh hơn.
Ngoài ra, nếu trong đất thiếu Mg cũng gây ra cây bị bệnh vàng xung quanh lá và
có thể dẫn đến rụng lá [5].
Ở Việt Nam, Ba kích phân bố chủ yếu ở các tỉnh thuộc vùng núi thấp và
trung du phía Bắc, bao gồm: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Cạn, Phú
Thọ, Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa; phía nam có Đèo
Sương Mù Huyện Hướng Hóa (Quảng Trị), Tây Giang (Quảng Nam); Ở Trung
Quốc, Ba kích phân bố chủ yếu ở Vân Nam, Quảng Tây, Hải Nam [8].
Ở Quảng Ninh Ba kích tím phân bố nhiều ở hầu hết các khu vực đồi núi
thấp. Tuy nhiên 2 khu vực có cây Ba kích tím nhiều nhất là Hoành Bồ và Tiên
Yên. Vật liệu lấy mẫu tôi đã chọn cây mẹ từ khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn –
Kỳ Thượng – Hoành Bồ (Quảng Nình). Địa hình của Khu BTTN Đồng Sơn - Kỳ
Thượng là vùng đồi núi thấp và núi trung bình thuộc cánh cung Đông triều. Có
độ cao tuyệt đối không cao nhưng độ chênh cao khá lớn (cao nhất đỉnh Thiên
Sơn cao 1.090m, thấp nhất là mặt nước tại đập hồ Cao Vân 31m) và mức độ chia
cắt rất phức tạp với nhiều đỉnh núi, nhiều phụ lưu. Khu bảo tồn nằm trong vùng
khí hậu nhiệt đới gió mùa, hàng năm có 2 mùa rõ rệt là mùa nóng ẩm từ tháng 4
đến tháng 9 hàng năm, mùa hanh khô từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau, nhiệt độ
trung bình/năm là 230
C, nhiệt độ tối cao tuyệt đối 410
C vào tháng 6, nhiệt độ tối
thấp tuyệt đối 00
C vào tháng 1; lượng mưa trung bình/năm từ 2.000mm đến
2.400mm, tập trung vào các tháng 7,8 chiến 80%, ẩm độ không khí cao nhất vào
tháng 3 - 4 là 89 %, thấp nhất vào tháng 1 - 2 là 65 %. Đất Feralit có mùn trên

34. -31-
núi (độ cao trên 700m). Đất Feralit màu nâu vàng, vàng nhạt vùng đồi phát triển
trên đá Phiến thạch sét, Sa thạch, Phấn sa, Sạn kết.
2.7.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng
Rễ cây Ba kích có chứa các hợp chủ yếu như Antharaglucosid tectoquinon,
alizarin1 methul ether, lucidin metythyl ether 1, hydroxy 3 hydroxy
methyllanthraquinon. các iridoid glucosic, các sterolg sitosterol. Lacton: (4R,
5S) 5- hydroxy hexan-4-olid. Các chất vô cơ: K, Na, Mg, Al, Fe, P, Ba, Zn, Cu...
Ngoài ra còn có đường, nhựa, acid hữu cơ, tinh dầu. Rễ tươi còn có vitaminC [9].
Nước sắc rễ ba kích thử trên súc vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng, chuột
cống trắng) có tác dụng rõ nét về tăng lực, chống độc, chống viêm, làm tăng
cường co bóp ruột, hạ huyết áp và có độc tính thấp. Vì thế, Ba kích được dùng
chủ yếu làm thuốc bổ, tăng lực trong các trường hợp nam giới yếu về khả năng
sinh dục, làm tăng tính ham muốn. Ba kích còn dùng làm thuốc chống mệt mỏi,
kém ăn, kém ngủ và đau mỏi xương khớp ở người có tuổi.
Theo y học cổ truyền, Ba kích là vị thuốc có tác dụng bổ trí não, trợ dương,
ích tinh, mạnh gân cốt, chữa các bệnh về tình dục, người già mỏi mệt, kém ăn, ít
ngủ nhưng không có biểu hiện bệnh lý. Đặc biệt, tuy Ba kích có tác dụng giúp
bình thường hoá và cải thiện tình dục nhưng Ba kích không kích dục kiểu
androgen và không độc. Gần đây, thành phần hoá học và nhiều tác dụng dược lý
mới của Ba kích cũng đã được phát hiện như trống stress, chống trầm cảm và
chống oxy hoá [11].
Với phương châm “phòng bệnh hơn chữa bệnh” của ngành y tế, việc nghiên
cứu và sản xuất các loại thuốc bổ để tăng cường sức khoẻ thường xuyên của
cộng đồng, góp phần ngăn ngừa bệnh tật ngày càng được đẩy mạnh. Trong bối

35. -32-
cảnh đó, Ba kích đang trở thành một trong những cây thuốc bản địa độc đáo của
nước ta. Mặt khác, Ba kích lại là cây chỉ thích hợp để trồng xen ở đất đồi, không
phải cạnh tranh về đất với các cây trồng khác, vì vậy nó có ý nghĩa to lớn trong
việc tăng thu nhập cho đồng bào vùng cao.
2.7.4. Nhân giống cây Ba kích
Trước đây cây Ba kích chủ yếu được nhân giống bằng phương pháp truyền
thống là gieo hạt hoặc giâm cành từ cây mẹ để lại ở vụ trước. Qua thời gian
giống bị thoái hoá dẫn đến năng suất và phẩm chất bị giảm sút, nguồn gốc giống
không được kiểm soát, không có xuất xứ rõ ràng
Hiện nay, vấn đề nhân giống là một tồn tại, cản trở việc mở rộng diện tích
trồng Ba kích. Cây trồng sau 15 tháng mới có 3,5 - 5% số cây ra hoa và sau 22
tháng mới có 1,5% số cây đậu quả. Sau 3 năm tỷ lệ này cũng chỉ đạt khoảng 45 -
50% và hệ số nhân giống bằng hạt chỉ đạt 1,1 năm. Ba kích cũng có thể nhân
giống bằng giâm cành, nhưng hệ số nhân của phương pháp này chỉ đạt 0,61/năm,
mặc dù đã sử dụng các chất kích thích sinh trưởng [7]. Tóm lại, các phương pháp
nhân giống truyền thống như gieo hạt, giâm cành không thể đáp ứng nhu cầu về
cây giống để phát triển trồng Ba kích, ít nhất là trong vòng 10 - 15 năm tới, chưa
kể đến những hạn chế của phương pháp này đối sự sinh trưởng, phát triển, năng
suất và chất lượng của cây trồng. Để kiểm soát được nguồn gốc giống, nâng cao
chất lượng cây giống đem trồng, đồng thời nhân giống cây Ba kích theo quy mô
công nghiệp nhằm tiến tới cung cấp giống tại chỗ thì cần phải áp dụng phương
pháp nhân giống hiện đại là nuôi cấy mô. Ưu điểm nổi trội của phương pháp này
là khắc phục cơ bản những nhược điểm của các phương pháp trên, đồng thời sản
xuất ra số lượng lớn cây giống theo hướng công nghiệp, ổn định về mặt di truyền,
cho năng suất và chất lượng cao.

36. -33-
Tuy nhiên, những nghiên cứu nhân giống nuôi cấy mô cây Ba kích ở trong
nước còn khá mới mẻ, tuy đã được một số tác giả đề cập đến, song các nghiên
cứu chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nếu ứng dụng vào sản xuất còn gặp
nhiều hạn chế nhất định và mang lại hiệu quả kinh tế chưa cao.
Viện Khoa học Lâm nghiệp đã có công trình nghiên cứu về thử nghiệm
thuốc giâm hom cho cây Ba kích.
Đặng Ngọc Hùng, Ngô Xuân Bình, Nguyễn Thị Minh Trâm Bộ môn Công
nghệ tế bào – viện khoa học sự sống – Đại học nông lâm Thái Nguyên. Nghiên
cứu nhân giống cây Ba Kích bằng phương pháp nuôi cấy mô với các giai đoạn
nhân nhanh cho HSNC 1,68 lần với môi trường MS*
+ 4mg/l BAP + 2mg/l
Kinetin + 0,3 mg/l NAA. Và tỷ lệ chồi ra rễ 75% với 0,2mg/l IBA + MS*
[14].
Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào ở quy mô
lớn trong lâm nghiệp nước ta lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống
cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy
Phù Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, Trung tâm nghiên cứu
khoa học sản xuất và ứng dụng Lâm nông nghiệp Quảng Ninh, Trường đại học
lâm nghiệp, Trường đại học nông lâm Thái Nguyên... Hiện nay một số tỉnh và
địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây
trồng và đã đạt được những thành công bước đầu. Tuy nhiên, tất cả các công
trình nghiên cứu đã công bố ở hầu như chủ yếu tập trung vào cây gỗ bạch đàn,
cây keo chưa liên quan tới cây Ba kích. Vì vậy, việc sử dụng công nghệ tế bào
thực vật (hay gọi là nuôi cấy mô, tế bào) để nhân giống Ba kích là yêu cầu rất
cấp bách.

37. -34-
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu
Cây lấy mẫu là cây Ba kích tím mọc tự nhiên tại khu Bảo tồn thiên nhiên
Đồng sơn- Kỳ thượng – Hoành Bồ (Quảng Ninh).
Vật liệu nuôi cấy là chồi cây Ba kích tím đoạn thân bánh tẻ, sinh trưởng
tốt, không sâu bệnh.
* Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm và điều kiện tiến hành nghiên cứu:
Phần nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng thí nghiệm “Công nghệ
sinh học”, tổ công nghệ sinh học, khoa Nông Học, trường Cao đẳng nông lâm
Đông Bắc. Phòng thí nghiệm vô trùng với các điều kiện vật lý như sau: ánh sáng
2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 8 – 10 giờ/ ngày, nhiệt độ 25 ± 20
c, độ ẩm
60-70%.
Phân ra cây được thực hiện tại vườn ươm tại trường Cao đẳng nông lâm Đông
Bắc – Quảng Ninh.
* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/ 2011 đến tháng 5/ 2012
* Gới hạn các nội dung nghiên cứu:
Các nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Ba kích tím bằng phương pháp
nuôi cấy mô được tiến hành trong phòng thí nghiệm ở các giai đoạn: khử trùng
mẫu cấy, cấy khởi động, nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn ngoài vườn ươm được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời
gian huấn luyện đến sự sinh trưởng của cây con trong giai đoạn ra cây.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.

38. -35-
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Cytokinin (BAP,
Kinetin) đến khả năng nhân nhanh của chồi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của Auxin (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của chồi Ba
kích.
- Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng
chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu nhân giống nuôi cấy mô tế bào cây Ba Kích tím
Chọn mâu cấy
Khử trùng mẫu cấy
Cấy khở đầu
Nhân nhanh chồi
Tạo cây hoàn
chỉnh
Huấn luyện cây
mô
Ra cây ngoài vườn ươm

39. -36-
* Cấy khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy invitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt,
khử trùng mẫu bằng chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn.
Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Chồi Ba kích tím cắt bảo quản trong vải
ẩm, được đem rửa sạch bằng bột giặt dưới vòi nước 3 lần.Mẫu được cắt một
phần cuống lá và toàn bộ phiến lá. Rửa sạch bằng nước máy và tráng 3 lần bằng
nước cất. Đem ngâm trong nước cất 20 phút, tráng lại 3 lần bằng nước cất đã khử
vô trùng. Sau đó khử trùng bằng hóa chất khử trùng. Kết thúc khử mẫu được cắt
bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 – 3cm, đường
kính từ 2-3mm, mang 2-4 nách lá.
- Hóa chất khử trùng: Clolox, oxy già (H2O2), thủy ngân chlorua (HgCl2).
- Môi truờng nuôi cấy: MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 30g saccarose/
lít, 5g Aga / lít, pH= 5,8 - 6
Thí nghiệm 1: nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng bằng Clolox tới tỷ lệ
sống của mẫu cấy. Các công thức như sau:
CTTN Thời gian và nồng độ sử lý nước Clolox
CT 1 ĐC
CT2 5% + 10 phút
CT 3 5% + 20 phút
CT4 5% + 30 phút
Thí nghiệm 2: nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng bằng H2O2 tới tỷ lệ
sống của mẫu cấy. Các công thức như sau:

40. -37-
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nước oxy già
ĐC ĐC
CT2 5% + 10 phút
CT3 5% + 20 phút
CT4 5% + 30 phút
Thí nghiệm 3: nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng bằng thủy ngân clorua
(HgCl2) tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Các công thức thí nghiệm như sau:
CTTN Thời gian và nồng độ xử lý nước HgCl2
ĐC ĐC
CT2 0,1% HgCl2 trong 5 phút
CT3 0,1% HgCl2 trong 10 phút
CT4 0,1% HgCl2 trong 15 phút
* Giai đoạn nhân nhanh chồi
- Các chồi sinh trưởng bình thường có đầy đủ thân và lá (không bị dị
dạng) được sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh. Trong
giai đoạn này tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng
là BAP, Kinetin đến sự nhân nhanh của chồi cây Ba kích.
- Môi trường nền (MT nền) được sử dụng là MS bổ sung 30g saccarose/ lít,
6g Agar/ lít , pH = 5,8.
Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST BAP đến hệ số nhân chồi
và tỷ lệ chồi hữu hiệu.

41. -38-
CTTN Thành phần môi trường
ĐC ĐC
CT2 MS + 1mg/l BAP
CT3 MS + 2mg/ BAP
CT4 MS + 3mg/l BAP
Thí nghiệm 5: nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST Kinetin đến hiệu quả nhân
chồi
CTTN Thành phần môi trường
ĐC ĐC
CT 2 MS + 1mg/l Kinetin
CT 3 MS + 2 mg/l Kinetin
CT 4 MS + 3 mg/l Kinetin
Thí nghiệm 6: nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST BAP + Kinetin đến hệ số
nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.
CTTN Thành phần môi trường
ĐC ĐC
CT 2 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin
CT 3 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin
CT 4 MS + mg/l BAP + mg/l Kinetin
* Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
- Mẫu nuôi cấy: chồi Ba kích khỏe mạnh có từ 4- 6 lá thu được từ quá trình nhân
nhanh.

42. -39-
- Thí nghiệm 7: nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST NAA đến khả năng ra rễ
của chồi Ba kích.
CTTN Nồng độ và chất điều hòa sinh trưởng
ĐC ĐC
CT 2 1/2MS + 1mg/l NAA
CT 3 1/2MS + 2mg/l NAA
CT 4 1/2MS + 3mg/l NAA
Thí nghiệm 8: nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST IBA đến khả năng ra rễ
của chồi Ba kích.
CTTN Nồng độ và chất điều hòa sinh trưởng
ĐC ĐC
CT 2 1/2MS + 1mg/l IBA
CT 3 1/2MS + 2mg/l IBA
CT 4 1/2MS + 3mg/l IBA
* Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng chiều cao cây con ở giai đoạn vườn ươm.
Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra cấy ngoài vườn ươm, đề tài
chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh trong bình) ra môi trường bên ngoài, mục
đích để cây làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn
luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh
sáng từ 5000 - 10000 lux, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây.
Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo
dài so với sản xuất. Đề tài thử nghiệm 4 khoảng thời gian huấn luyện cây con.

43. -40-
+ Không huấn luyện (0 ngày)
+ 5 ngày
+10 ngày
+ 15 ngày
Sau khi huấn luyện, cây con được cấy ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành
đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của
thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai
đoạn vườn ươm.
- Tạo bầu cấy cây: dùng bầu nhựa PE có đường kính 5,5cm, cao 11cm, có đục lỗ
dưới đáy. Thành phần ruột bầu là đất tầng B + Trấu hun
- Xử lý bầu: trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng nấm bệnh
bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hòa thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới nên
bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm).
- Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây
ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh
hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giá thể. Chăm sóc cây sau khi cấy, cây
sau khi cấy được che bằng nilon trắng 15 – 20 ngày sau khi cấy.
* Điều kiện thí nghiệm
Quá trình nuôi cấy (nuôi cấy khởi đầu, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh)
được tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm duy trì
như sau:
+ Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ
2000- 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ ngày.
+ Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 25 ± 20
c
+ Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60 – 70%

44. -41-
3.4. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp lại.
- Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng, thí
nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm đánh
giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy).
- Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 6
bình, mỗi bình 10 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả
hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu sau 45 ngày nuôi cấy.
- Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi 30 chồi.
Môi trường được chứa trong bình trụ, đường kính 6cm chiều cao 10cm, với nắp
nhựa. Thu thập tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 3 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao
của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại
vườn ươm.
3.5. Thu thập số liệu xử lý số liệu
* Thu thập số liệu
- Các chỉ tiêu đo đếm trong thí nghiệm:
1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = 100
×
2. Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100
×
Tổng số mẫu nhiễm
Tổng số mẫu ban đầu
Tổng số mẫu sống
Tổng số mẫu ban đầu

45. -42-
3. Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = 100
×
4. Hệ số nhân chồi =
5. Tỉ lệ ra rễ (%) = 100
×
6. Chiều dài rễ trung bình (cm) =
8. Tỉ lệ cây sống (%) = 100
×
* Các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm excel và chương
trình xử lý Irristat 4.0. Để tính sai số thí nghiệm CV%, LSD0,05 độ tin cậy của thí
nghiệm.
Tổng số chồi hữu hiệu
Tổng số chồi thu được
Tổng số chồi mới hình thành
Tổng số chồi ban đầu
Tổng số chồi ra rễ
Tổng số chồi nuôi cấy
Tổng chiều dài rễ
Tổng số rễ đo đếm
Tổng số cây sống
Tổng số cây ban đầu

46. -43-
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của
mẫu cấy
Mỗi loại hóa chất khử trùng có tác dụng tiêu diệt đối với những loại vi
sinh vật (nấm, khuẩn) khác nhau. Tác dụng của mỗi loại hóa chất đối với vi sinh
vật tùy thuộc vào nồng độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất đó. Vì vậy, việc
lựa chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất đó cũng rất
quan trọng. Nó quyết đính đến sự thành công hay thất bại trong công tác khử
trùng. Việc tiến hành nghiên cứu hiệu quả khử trùng của một số hóa chất thường
sử dụng để khử trùng H2O2, Clolox, AgCl2 sẽ cho ta một quyết định đúng đắn về
loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp nhất.
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống
của mẫu cấy
H2O2 sát trùng do sự tạo thành ôxy nguyên tử, nó có tác dụng khuếch tán,
luồn sâu, kéo đẩy các vật dính bám theo kiểu hóa keo. Chất này dễ loại trừ tàn dư
sau xử lý.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
chồi Ba kích tím
Công
thức
Thời gian
khử trùng
(phút)
Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống
(%)
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
ĐC 1 0 100.00 0 0
CT 2 10 81.67 12.22 6.11
CT 3 20 71.67 23.33 5.00

47. -44-
CT 4 30 62.22 18.89 18.89
CV% 7.80
LSd 2.00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Tỷ lệ mẫu chết (%)
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
chồi Ba kích tím
Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1 cho thấy:
Tỷ lệ sống của các công thức giao động từ 0 đến 23%. Trong đó công thức
5 có số mẫu sống đạt giá trị cao nhất là 23,33%. Công thức đối chứng không xử
lý chất khử trùng thu được số mẫu có tỷ lệ sống là 0% có giá trị thấp nhất. Công
thức 1 thu được số mẫu có tỷ lệ sống là 12,22% và tỷ lệ mẫu sống ở công thức 3
là 18,89%. Đa phần ở các công thức, mẫu bị nhiễm sau đó bị chết. Công thức 2
đạt tỷ lệ mẫu sống cao nhất 23,33% với thời gian khử trùng 20 phút.
Kết quả thí nghiệm cho thấy oxy già khử trùng mẫu cấy cây Ba kích tốt
nhất ở nồng độ 5% trong thời gian 20 phút.

48. -45-
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng bằng Clolox đến tỷ lệ
sống của mẫu cấy
Clolox là chất khử trùng được sử dụng trong nhiều phòng thí ngiệm.
Clolox được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào với mục đích chủ yếu là tiêu diệt
nấm khuẩn. Đây là loại thuốc hoạt hóa bề mặt tiếp xúc, do đó rất dễ luồn lách,
loại trừ bọt khí. Tuy nhiên tác hại của nó làm tăng tổn thương mẫu cấy, do đó
phải thực hiện nghiêm ngặt thời gian và nồng độ sử dụng. Chúng tôi tiến hành
khử trùng Clolox đối với cây Ba kích.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Công
thức
Thời gian khử
trùng (phút)
Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu
sống (%)
Tỷ lệ mẫu
chết (%)
ĐC 1 0 100.0 0.0 0.0
CT 2 10 81.67 12.78 5.00
CT 3 20 71.67 21.67 6.67
CT 4 30 68.89 19.44 11.67
CV% 2.55
LSd 0.9
Tải bản FULL (91 trang): https://bit.ly/3fQM1u2
Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ

49. -46-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Tỷ lệ mẫu chết (%)
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
chồi Ba kích tím
Qua bảng 4.2 cho thấy khử trùng bằng Clolox khi tăng thời gian khử trùng
thì mẫu nhiễm giảm, số mẫu chết tăng do quá thời gian khử trùng. Tỷ lệ mẫu
sống cao nhất với thời gian khử trùng 20 phút (mẫu sống 21,67%), mẫu nhiễm
cao nhất là thời gian khử trùng 10 phút (mẫu nhiễm 81,67%). Bên cạnh đó thời
gian khử trùng ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu sống với thời gian khử trùng ngắn tỷ lệ
mẫu nhiễm tăng, tỷ lệ mẫu sống thấp công thức 1 tỷ lệ mẫu sống 13,33%. Đa
phần mẫu không xử dụng được do bị nhiễm nấm bệnh.
Đồ thị 4.2 cho thấy nước Clolox khử trùng mẫu cây Ba kích trong nuôi
cấy tốt nhất ở nồng độ 5% trong 20 phút.
4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng thủy ngân chlorua
đến tỷ lệ sống của mẫu cấy
Hiện nay, HgCl2 được sử dụng khá phổ biến để khử trùng mẫu trong nhân
giống in vitro các loài thực vật. Do đó đề tài cũng sử dụng HgCl2 0,1% để tiến
Tải bản FULL (91 trang): https://bit.ly/3fQM1u2
Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ

50. -47-
hành khử trùng mẫu cấy và thử nghiệm các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra
thời gian khử trùng thích hợp.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Công
thức
Thời gian
khử trùng
(phút)
Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu
sống (%)
Tỷ lệ mẫu chết
(%)
ĐC 1 0 100 0 0
CT 2 5 69.44 22.78 7.78
CT 3 10 40.00 49.44 10.56
CT 4 15 52.78 21.11 26.11
CV% 2.9
LSD 1.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Tỷ lệ mẫu chết (%)
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
3562574