Makalah ini membahas tentang instrumen kimia HPLC dan cara kerjanya. Instrumen HPLC terdiri atas wadah fase gerak, pompa, injektor, kolom, dan detektor. Cara kerjanya adalah dengan memisahkan analit berdasarkan kepolarannya menggunakan tekanan tinggi pada fase gerak, sehingga terbentuk puncak-puncak yang terpisah pada detektor.

1. INSTRUMEN KIMIA HPLC
MAKALAH
Disusun untuk memenuhi tugas
Mata Kuliah : Praktikum Kimia Pemisahan
Dosen pengampu : Fachri Hakim, M.Pd
Oleh :
Ahmad Ikhwan Habibi (133711030)
JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI WALISONGO
SEMARANG
2015

2. I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Kromatografi ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903. D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett
lah yang pertama diakui sebagai penemu. Dasar kromatografi lapisan tipis (KLT)
ditetapkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian disempurnakan
oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada
tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) untuk pengembangan kromatografi
gas dan kromatografi kertas.Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan
makalah pertama mengenai kromatografi gas.Pada akhir tahun 1960 an, semakin
banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik
mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kromatografi merupakan teknik yang mana solute
atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini
melewati suatu kolom kromatografi.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut
dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-
an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima
secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
ke detektor(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorokarbon < golongan
hidrokarbon <

3. senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan
alcohol < golongan asam. Kegunaan dari HPLC bermacam-macam diantaranya :
1. Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionic, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sedikit (trace elements), dalam jumlah
banyak dan dalam skala proses industri.
HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai
polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat
dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran
berlapiskan zat berpori. Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan
kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer
dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap
metode kolom kromatografi. Oleh karena itu dalam makalah ini akan dibahas tentang
Instrumen kimia HPLC dan cara kerjanya.
B. RUMUSAN MASALAH
1. Apa saja bagian-bagian dari instrumen HPLC?
2. Bagaimana cara kerja dari instrumen HPLC?

4. II. PEMBAHASAN
A. BAGIAN-BAGIAN INSTRUMEN HPLC
Adapun bagian-bagian dari instrumen HPLC yaitu:
1. Wadah fase gerak dan fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yan secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementra untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari fase gerak), kemampuan
elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan
harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu
adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab gas akan berkumpul
dengan komonen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analsis.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fas gerak. Bahan
yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja than karat, teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
3. Injektor

5. Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan
agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama
aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:
a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system
tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir.
Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c. Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi
load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan,
maka sampel akan masuk dalam kolom.
4. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi kolom analitik dan kolom pengaman. Kolom kromatogram yang biasa
digunakan adalah jenis C-18 yang digunakan sebagai fase diam yang mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi.
Sedangkan kolom pengaman untuk menyaring kotoran dan menjenuhkan fase diam.
5. Detektor
Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen
kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak
berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detektor : UV/Vis, Retraktif indeks (RI) detector, Konduktifitas
decetor, Elektroimia detector, PDA, ELSD dan MS dectetor

6. Gambar instrumen dan cara kerja HPLC.
B. CARA KERJA INSTRUMEN HPLC
Pertama, semua komponen dari HPLC dihubungkan terlebih dahulu ke power supply.
Pompa atau kompresor dinyalakan. Detektor dinyalakan, komputer dinyalakan, printer
juga dinyalakan karena untuk pengeprinan hasil langsung. Ditunggu hingga 15 menit
terlebih dahulu, lampu yang berwarna merah menyala pada saat dinyalakan, ketika sudah
menyala barulah berwarna hijau. Setelah komponen menyala, LC solution yang terdapat
dalam komputer dibuka, karena hanya ada 1 LC, maka klik LC nomor 1. Setelah itu akan
muncul bagian pengaturannya, cara pengaturannya yaitu klik metode, kemudian
instrumen, parameter seperti komposisi eluen, laju aliran, detektor, dan lamanya waktu
analisis diatur. Dalam pengaturan, diatur secara bertahap tidak boleh langsung sesuai
yang diingankan. Mode pa software LC solution terdapat 2 pilihan yaitu, pertama iso
kratik, iso kratik adalah pengaturan dimana eluen dari awal sampai akhir penggunaan
eluen akan sama. Kedua adalah gradien, yaitu ada tingkatan dimana eluen untuk elusinya
dirubah. Klik detektor uv pada panjang gelombang 254 nm, klik end time. Perhatikan
pembacaan detektor. Selain mengenalkan cara penghidupan HPLC, cara penginjeksian
sampel dilakukan. Penginjeksian sampel dimulai dengan syringe atau alat penginjeksian
dibersihkan terlebih dahulu, setelah bersih dicuci dengan pelarut yang akan digunakan,
klik single star, injeksi run lalu equation information. Terdapat dua pilihan dalam
penginjeksian yaitu automatic sample atau pengambilan sendiri sampel, atau menginjek

7. dengan sendirinya, dan yang kedua adalah injection volume (jumlah sampel yang ingin
diinjeksikan). Pada proses penginjeksian syringe dimasukkan pada bagian injeksi secara
tegak dan jangan sampai jarumnya bengkok. Kemudian tombol pada tempat injeksi
diputar kearah load, keluarkan cairan, yang terakhir putar ke arah injek, lalu keluarkan
jarum secara hati-hati.
III. PENUTUP
A. KESIMPULAN
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
ke detektor(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat
untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Hal-hal yag perlu dketahui
adalah waktu retensi, panjang gelombang, dan berapa flownya.

8. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, KCKT/HPLC.Bandung : UPI.2001. PDF file diakses pada tanggal 13 Oktober 2015
pukul 13.23
http://www.lansida.blogspot.com/HPLC(High Performance Liquid Chromatography) diakses
pada tanggal 13 Oktober 2015 pukul 13.27