praktikum

1. LAPORAN
PRAKTIKUM PEMISAHAN DAN PENGUKURAN
PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN
KAFEIN DENGAN TEKNIK HPLC
Diajukan untuk memenuhi mata kuliah Praktikum Pemisahan dan Pengukuran
Dosen Pengampu :
Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si
Disusun oleh :
Hesti Kusumaningtyas (1307031)
Ida Khoerunnisah (1302021)
Ikhlas Fathurohman (1301508)
Jurusan Pendidikan Kimia
Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG

2. 2014
Tanggal Praktikum : 17 Februari 2015
Judul Praktikum :
Penentuan Kadar Paracetamol dan Kafein dengan Menggunakan Metode HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)
1. Tujuan
1.1 Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC
1.2 Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat mengikuti
manual pengoperasian HPLC.
1.3 Dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan kafein dalam sampel obat.
2. Tinjauan Pustaka
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi
elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan oleh para
kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau
senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran
dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya
dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis
fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:
a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair
b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion
d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
e) Kromatografi Afinitas
f) Kromatografi Kiral
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis
dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau
2

3. campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik.
Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu
sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan
efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC
modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan
cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara
terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven
yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai,
yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan
di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang
menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila
3

4. detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan
akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh
tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga
sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom
berikatan dengan NH2).
(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:
• Reservoir (wadah pelarut / cairan)
• Pompa
• Sistem injeksi sampel
• Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
• Detektor
• Komputer (Pengolah data)
4

5. Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan
dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.
Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa
yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang ‘reproducible’
2) Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004: 172)
Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume
0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa
gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari
loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30
mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel
silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai
tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan
performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material
partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari
itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-
5

6. masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam
yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5
mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard
digunakan sebagai “tumbal” dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-
detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
• Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
• Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index
refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-
komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)
Keuntungan KCKT/HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam
banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau
tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis
laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain:
6

7. Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat
yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena
itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi
penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit
7

8. dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,
pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar.
Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva
kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet
obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18
dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.
(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)
Paracetamol
Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan sebagai penawar rasa
sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini dikenal sebagai analgesik dan
antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171
. Daya larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3
, tetapi jauh lebih larut dalam air
panas yakni 5 g/100 cm3
dan dalam etanol kelarutannya 14 g/100 cm3
.
(Frank Ellis dkk, 2002: 1)
Kafein
8

9. Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik yang majemuk,
yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan lingkar pirimidin). Dengan
rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji kopi dan daun teh. Kristal
kafein berbentuk jarum-jarum berwarna putih, tidak berbau, dan berasa pahit. Kafein
yang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 238 . Kafein larut dalam larutan
pirol dan tetrahidrofuran. Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asam-
asam organik.
(Damin Sumardjo, 2009: 447)
Asetonitril
Metil Sianida CH3CN, zat cair toksik, disediakan dari asetilena dan amonia atau oleh
dihidrasi asetamida, digunakan untuk melarutkan senyawa organik ataupun anorganik.
(Hadyana Pudjaatmaka, 2002: 76)
Isopropil Alkohol
Propil Alkohol mempunyai rumus CH3CH2CH2OH . Isopropil alkohol merupakan
isomer propil alkohol dengan rumus (CH3)2CHOH. Banyak digunakan untuk
membuat minyak wangi, pelitur dan sebagai pelarut.
(Hadiat Moejadi,dkk, 2004: 179)
9

10. Alat dan Bahan Praktikum
2.1 Alat Praktikum
• Perangkat HPLC 1 set
• Spatula 1 buah
• Labu ukur 50 mL 1 buah
• Labu ukur 10 mL 6 buah
• Neraca analitik terkalibrasi 1 set
• Corong pendek 1 buah
• Pipet tetes 2 buah
• Gelas kimia 50 mL 3 buah
• Ultrasonic vibrator 1 set
• Pipet Ukur1 ml 1 buah
• Pipet Ukur2 ml 1 buah
• Pipet Ukur3 ml 1 buah
• Pipet Ukur4 ml 1 buah
• Pipet Ukur5 ml 1 buah
• Pipet Ukur6 ml 1 buah
• Ball Filler 1 buah
• Filter Membran Selulosa Nitrat 1 set
• Botol Vial 2 buah
2.2 Bahan Praktikum
• Parasetamol p.a 25 mg
• Kafein 12,5 mg
• Asetonitril 30 ml
• KH2PO4 420 ml
• Iso propil alkohol 30 ml
• Metanol secukupnya
10

11. • Sampel obat Bodrex 4,1 mg
• Aquades secukupnya
• Aquabides secukupnya
• Membran PTFE/selulosa nitrat buah
• Kertas saring 1 buah
3. Prosedur Kerja Praktikum
3.1 Pembuatan fasa gerak (Pelarut).
Sebanyak 420 mL KH2PO4- 0,01 M, ditambahkan metanol 20 mL, ditambahkan
asetonitril 30 mL, ditambahkan isopropil alkohol 30 mL, disaring menggunakan
membran whatman filter PTFE 0,2 μm, disonikasi selama 30 menit. (Larutan Fasa
Gerak sudah tersedia)
3.2 Pembuatan larutan induk parasetamol
• Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a dan 12,5 mg kafein
p.a dimasukkan kedalam labu 50 mL
• Tambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi selama 15 menit,
diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda batas..
• Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan kafein
3.3 Pembuatan deret larutan standar parasetamol + kafein
• Pipet larutan induk parasetamol dan kafein masing-masing sebanyak 1 ; 2 ; 3 ;
4 ;5 dan 6 mL, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL.
• Tambahkan pelarut(fasa gerak yang tersedia)hingga tanda batas
• Lakukan sonikasi selama 5 menit.
• Dilakukan degassing apabila masih terdapat gelembung dalam larutan
• Injeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 μl
• Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi
11

12. 3.4 Pembuatan larutan sampel obat bodrex
• Tentukan berat rerata tablet(10 tablet)
• Menimbang 4,1 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan
pelarut(aquabides) hingga setengah volume labu ukur), disonikasi selama 5
menit,
• Encerkan dengan pelarut(aquabides) hingga garis tanda, dikocok lalu disaring
menggunakan kertas saring
• Dipindahkan ke dalam botol vial
• Kemudian proses melakukan penyaringan kedua menggunakan membran
whatman PTFE 0,2 μm (filtrat pertama dibuang(digunaakan untuk membilas
filter/injektor, kemudian ditampung filtrat selanjutnya).
• Injeksikan sampel obat ke dalam HPLC.
3.5 Penyiapan Instrumen HPLC
Kondisi Analisis parasetamol dan kafein
Fasa gerak : KH2PO4 0,01 M 420mL, 20 ml metanol, 30 asetonitril
30 mL isopropil alkohol
Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)
Panjang gelombang : 215 nm
Laju alir : 1 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL
• Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
• Tekan tombol “ON” pada sakelar listrik.
• Isi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan botol
penampung.
• Tekan tombol “ON” pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan
pompa.
• Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti langkahnya sesuai instruksi
dalam komputer.
12

13. • Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
instrumen.
• Alirkan fasa gerak.
• Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah
menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan.
• Injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi terendah), dan
terakhir larutan sampel
• Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya.
• Setelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti tanda pompa
dalam computer.
• Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
• Untuk mematikan, tekan tombol “Off” pada pompa, detector dan power secara
berurutan. Putuskan sambungan listrik.
3.6 Perhitungan hasil analisis
Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva kalibrasi
diperoleh dengan koefisien regresi > 0,997 anda boleh melanjutkan perhitungan
kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah kadarnya dalam satuan % b/b. Bila
tidak diperoleh kurva yang linier, maka lakukan diskusi untuk mencari
penyebabnya.
13

14. Hasil dan Analisis Data
 Tabel Penimbangan 1 Tablet Obat Bodrex
No Berat Setiap 1 Tablet Obat
Bodrex
1. 0,8321 g
2. 0,8530 g
3. 0,8407 g
4. 0,8326 g
5. 0,8350 g
6. 0,8315 g
7. 0,8418 g
8. 0,8568 g
9. 0,8321 g
10. 0,8427 g
Rata-
rata
0,84016 g
 Sampel Obat
Diduga zat yang terkandung Waktu Retensi (menit) Luas Area
Paracetamol 2.38 11705288
14

15. Kafein 3.62 2164128
 Deret Standar Paracetamol
Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
50 2252106 2.38
100 4239085 2.38
150 6208253 2.38
200 7979072 2.38
250 10093086 2.39
300 12261550 2.38
Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga
paracetamol (11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol (10093086-
12261550). Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan
garis
y = 39646 x + 234188
Sehingga,
y = 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
x =
39646
234188-11705288
x = 289,3381 ppm
15

16. mg paracetamol = ppm V (L)
= 289,3381 ppm 0,01 L
= 2,8934 mg
Bobot sampel = 4,1 mg
Berat Rata- rata penimbangan obat bodrex = 840,16 mg
Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan
mg/tablet907092,5lParacetamo
1,4
mg840,16xmg2,8934
x
16,840
mgx
lmg,14
mg2,8934
=
=
=
mg
mg
 Deret Standar Kafein
Konsentrasi (ppm) Luas Area Waktu Retensi (menit)
25 2164416 3.64
50 4252400 3.62
75 6242196 3.6
100 7989484 3.58
125 10033548 3.59
150 12097707 3.56
16

17. Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga kafein
(2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar kafein
dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel, yaitu
konsentrasi dan luas areanya.
=
StandarAreaLuas
SampelAreaLuas
[Sampel] =
StandarAreaLuas
SampelAreaLuas[Standar].
[Sampel] =
216416
216412ppm.25
[Sampel] = 24,9967 ppm
Mg kafein = ppm V (L)
= 24,9967 ppm 0,01 L
= 0,2500 mg
Kadar mg Kafein dalam Hasil percobaan
mg/tablet1,22935Kafein
1,4
mg840,16xmg0,2500
x
16,840
mgx
lmg,14
mg0,2500
=
=
=
mg
mg
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar paracetamol dan kafein
dalam sampel obat menggunakan instrumen HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi komponen-
komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase diam. Fase gerak yang
digunakan berupa campuran senyawa KH2PO4, methanol, asetonitril, dan isopropyl
alkohol dengan perbandingan 42 : 2 : 2 : 3. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah
17

18. kolom C-18 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan
metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan
fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis
digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.
Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan menggunakan
aquabidest. Digunakan aquabidest karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan
pelarut dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan dianalisis
jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20µl) sehingga apabila digunakan pelarut dengan
kemurnian kurang akan dapat mengganggu hasil pemisahan. Sebelum pengenceran
sampel sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua komponen dalam
sampel larut dan homogen. Setelah diencerkan sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan
sampel disaring sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan menggunakan kertas
saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam obat tidak hanya mengandung
paracetamol dan kafein, namun terdapat zat penyusun lain yang belum larut seluruhnya
yang masih berupa partikel-partikel padat dalam larutan. Selanjutnya filtrate disaring
kembali menggunakan membran selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa
ada partikel-partikel pengganggu /pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan.
Apabila langsung dilakukan penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat,
dikhawatirkan partikel-partikel yang tidak larut dalam larutan sampel akan menyumbat
pori-pori membran sehingga penyaringan akan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum
ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang dimaksudkan untuk membilas
membran agar dapat dipastikan tidak ada zat kontaminan dari membran yang dapat ikut
tertampung.
Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam sampel
dengan waktu reteensi standar. Puncak yang akan muncul pada kromatogram adalah
puncak komponen paracetamol terlebih dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan
struktur kimia dari masing-masing komponen.
18

19. Gambar Struktur Paracetamol
Gambar Struktur Kafein
Dapat dilihat bahwa paracetamol memiliki gugus hidroksi (-OH) yang dapat membentuk
ikatan hidrogen dengan air sehingga lebih mudah larut dalam air atau senyawa polar
lainnya sedangkan kafein memiliki struktur yang relatif lebih non polar dibandingkan
dengan paracetamol sehingga akan tertahan lebih lama di kolom yang sifatnya non polar.
Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan kafein
dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan
derat standar yang dibuat dari pengenceran 1-6 ml larutan induk paracetamol 500 ppm
dan kafein 250 ppm dalam 10 ml larutan. Kadar analit dapat ditentukan dengan
menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis y = mx + b yang diperoleh
dari kurva kalibrasi deret standar. Namun, apabila luas area puncak analit tidak masuk
dalam area deret standar maka digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret
standar dengan sampel.
Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada
keadaan optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik. Kemudian baik sampel
19

20. maupun deret standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing
untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat terkumpul di
kepala pompa ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.
Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam
sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil
tersebut mendekati data kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu paracetamol
sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.
Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di
antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang yang tidak ikut dilarutkan
sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih terdapat gelembung setelah
dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga
mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, diperoleh kadar paracetamol
dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293
mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu
paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.
Daftar Pustaka
Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International (p) Ltd.
David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill
De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi
Jurnal, hlm. 5-8.
Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom :
Royal Society of Chemistry
Moejadi, Hadiat. (2004). Kamus Sains . Jakarta : Balai Pustaka
Pudjaatmaka, Hadyana. (2002). Kamus Kimia. Jakarta : Balai Pustaka
Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson Brooks/Cole
Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran. Jakarta : EGC
20

21. Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015). Instruksi Kerja Penentuan
Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI
21

22. Lampiran
 Langkah Kerja & Tabel Pengamatan
No Langkah Kerja Data Pengamatan
1. -Fasa Gerak Sudah
disediakan
-Fasa Gerak : Cairan
Tidak Berwarna
2. Pembuatan Larutan Induk Paracetamol & Kafein
-Paracetamol : Serbuk
berwarna putih keruh
-Kafein : Serbuk
berwarna putih keruh
-Fasa Gerak : Cairan
tidak berwarna
-Disonifikasi agar
larutan menjadi
homogen
-Larutan Induk
Paracetamol + kafein :
Tidak berwarna
- Konsentrasi
Paracetamol : 500 ppm
- Konsentrasi Kafein :
250 ppm
22
Pembuatan Fasa Gerak (Pelarut)
-diambil 420 mL KH2PO4 0,01 M pada gelas kimia
- ditambahkan Metanol 20 mL
- ditambahkan Asetonitril 30 mL
- ditambahkan Isopropil Alkohol 30 Ml
- disaring menggunakan membran whatman filter
PTFE 0,2 m
- disonifikasi selama 30 menit
Fasa Gerak (Pelarut)
Paracetamol
- ditimbang sebanyak 12,5 mg
Kafein
- ditimbang sebanyak 25 mg
Kafein + Paracetamol
- keduanya dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL
- ditambahkan pelarut (fasa gerak)
- disonifikasi selama +/- 5 menit
- diencerkan dengan pelarut (fasa gerak) hingga
tanda batas
Larutan Induk Kafein + Paracetamol
- disonifikasi selama 5 menit
- dihitung konsentrasi larutan induk paracetamol &
kafein
Konsentrasi Larutan Induk

23. 3. Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein & Paracetamol
-disonifikasi agar
homogen
- didegasing dengan
membuka tutup labu
ukur,agar gelembung yg
ada dapat hilang
- deret larutan standar =
tidak berwarna
23
Larutan Induk Kafein + Paracetamol
- dipipet sebanyak 1ml;2ml;3ml;4ml;5ml;6ml
- dimasukkan masing-masing ke dalam labu ukur 10
ml
- ditambahkan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas
- disonifikasi selama 5 menit
- didegasing
Deret Larutan Standar
- diinjeksikan larutan sebnayak 20 L
- dibuat kurva kalibrasi
Kurva Kalibrasi

24. 4. Pembuatan Larutan Sampel
-Obat Bodrex : Serbuk
Berwarna jingga
- Data Sampel Obat
pada kemasan
mengandung
paracetamol 800 mg
dan kafein 50 mg
-Rata-rata berat
penimbangan sampel
obat = 0,84016 g
-Berat Kertas Timbang
= 0,1219 g
- Hasil penimbangan
Kertas Timbang +
Sampel Obat = 0,1260 g
- Massa Obat = 0,0041
g/ 0,41 mg
- Pelarut = Aquabides
- Larutan sampel saat
penambahan hingga
setengah volume labu
ukur = berwarna jingga
- Larutan sampel saat
ditanda bataskan = tidak
berwarna
-Kertas Saring =
Berwarna Putih
-Membran Selulosa
Nitrat = Berwarna Putih
- Volume yg
diinjeksikan = 20 L
24
Serbuk Tablet Obat
- ditambahkan pelarut hingga setengah volume labu
ukur
- disonifikasi selama 5 menit
- ditambahkan pelarut hingga tanda batas
- dikocok
- disaring menggunakan kertas saring
Labu Ukur 10 ml
- ditentukan berat rata-rata tablet obat
- ditimbang sebanyak 4 mg
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
Hasil Filtrat
- ditampung dalam botol vial
- disaring menggunakan membran selulosa nitrat
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
Hasil Filtrat ke-2
- 1ml filtrat dibuang (digunakan untuk membilas
injeksi, botol vial)
- 1 ml berikutnya ditampung
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
- siap untuk diinjeksikan
Sampel Siap untuk Diinjeksikan

25. 5. Penyiapan Instrumen HPLC
Kondisi Analisis Paracetamol & Kafein
25
Fasa Gerak
- KH2PO4 0,01 M 420ml
- 20 ml metanol
- 30 ml asetonitril
- 30 ml Iso Propil Alkohol
Kolom (Fasa Diam)
- panjang 15 cm
- C-18
- panjang gelombang 215 nm
- laju alir 1 ml/menit
-Volume injeksi 20 L
Preparasi Sistem HPLC
- dipastikan kabel penghubung listrik telah
tersambung dengan benar
- ditekan tombol “on” pada sakelar listrik
- diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai
dan kosongkan botol penampung
- ditekan tombol on pada alat, berturut-turut untuk
power, detektor dan pompa
-dilakukan pemrograman alat dengan komputer, ikuti
langkahnya sesuai instruksi dalam komputer
-dipilih mode yg akan digunakan sesuai dengan
parameter kondisi instrumen
- dialirkan fasa gerak
- apabila respon kromatogram tidak muncul lagi,
artinya alat telah menunjukkan base line yang
mendatar, maka instrumen siap digunakan
- injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari
konsentrasi rendah) dan terakhir larutan sampel
- dicetak hasil pengukuran, catat kondisi
percobaannya
- setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan
menyoroti tanda pompa dalam komputer
- tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan komputer
- untuk mematikan, tekan tombol off pada pompa,
detector dan power secara berurutan
-putuskan sambungan listrik
Analisis dilakukan
oleh operator dan
praktikan

26. Perhitungan
 Pembuatan Larutan Induk
• Larutan Induk
[ ]
[ ] ppm
L
mg
Kafein
ppm
L
mg
lParacetamo
250
05,0
5,12
500
05,0
25
[
==
==
• Larutan Deret Standar Paracetamol
a. 1 ml larutan induk
ppm50
ml10
ppm500.ml1
x
x.ml10ppm500.ml1
==
=
b. 2 ml larutan induk
ppm100
ml10
ppm500.ml2
x
x.ml10ppm500.ml2
==
=
c. 3 ml larutan induk
ppm150
ml10
ppm500.ml3
x
x.ml10ppm500.ml3
==
=
d. 4 ml larutan induk
ppm200
ml10
ppm500.ml4
x
x.ml10ppm500.ml4
==
=
e. 5 ml larutan induk
ppm250
ml10
ppm500.ml5
x
x.ml10ppm500.ml5
==
=
f. 6 ml larutan induk
ppm300
ml10
ppm500.ml6
x
x.ml10ppm500.ml6
==
=
• Larutan Deret Standar Kafein
a. 1 ml larutan induk
26

27. ppm25
ml10
ppm250.ml1
x
x.ml10ppm250.ml1
==
=
b. 2 ml larutan induk
ppm50
ml10
ppm250.ml2
x
x.ml10ppm250.ml2
==
=
c. 3 ml larutan induk
ppm75
ml10
ppm250.ml3
x
x.ml10ppm250.ml3
==
=
d. 4 ml larutan induk
ppm100
ml10
ppm250.ml4
x
x.ml10ppm250.ml4
==
=
e. 5 ml larutan induk
ppm125
ml10
ppm250.ml5
x
x.ml10ppm250.ml5
==
=
f. 6 ml larutan induk
ppm150
ml10
ppm250.ml6
x
x.ml10ppm250.ml6
==
=
27

28. Lampiran Foto Selana Praktikum
1. Alat yang dibutuhkan selama
praktikum
2. Pelarut/ Fasa Gerak
3. Pelarut/ Aquabides
4. Instrumen HPLC
5. Instrumen HPLC tampak
samping
6. Penimbangan Sampel untuk
membuat larutan Induk dan
Larutan sampel
7. Sampel Obat Bodrex
28

29. 8. Data pnimbangan 10 tablet obat
bodrex
9. Penambahan pelarut(aquabides/
fasa gerak)untuk membuat
larutan induk, larutan sampel
10. Hasil pembuatan deret larutan
standar 1 mL;2 mL; 3 mL;4 mL ;
5 mL ; 6 mL
11. Hail penambahan pelarut
(aquabides) pada sampel obat,
hingga setengah volume ukuran
labu ukur
12. Proses Sonifikasi pada Ultrasonic
Vibrator
13. Larutan Sampel Obat
29

30. 14. Penyaringan Sampel Obat
menggunakan kertas saring
15. Hasil Penyaringan menggunakan
kertas saring
16. Penyaringan kedua menggunakan
membran selulosa nitrat
17. Hasil penyaringan menggunakan
membran selusosa nitrat
18. Penginkjeksian Deret larutan
standar/ Larutan sampel
19. Deret Larutan Standar/ Larutan
sampel siap diinjeksikan, sudah
tidak terdapat gelembung dalam
syringe.
20. Proses Penginjeksian
30

31. 21. Hasil Pemisahan ditunjukan
dalam bentuk kromatogram
dalam komputer
31