Kromatografi merupakan teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Mikhail Tswett pada 1906 untuk memisahkan pigmen tumbuhan menjadi beberapa lapisan berwarna di sepanjang kolom yang diisi serbuk kalsium karbonat. Kemudian, teknik ini diterapkan oleh Richard Willstätter untuk penelitiannya mengenai klorofil. Sejak saat

1. KROMATOGRAFI, Michael Tswett (1906)
• Pemisahan zat hijau daun (chlorophyl) dari ekstrak
tumbuhan.
• Fasa gerak (eluen), petroleum eter
• Fasa diam, kalsium karbonat dalam kolom
• Pigmen yang semula satu warna  beberapa
warna
• Pigmen yang terserap lebih lemah  turun ke
bawah (komponen 2)

2. • Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semënovich
Tswet (1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan
serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan
campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter.
Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk
lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan
kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906).
• Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willstätter
(1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni
khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu
banyak perhatian diberikan pada kromatograf
Drs. H. Fathur Rahman, M.Si., Apt.

3. • Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.
• Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua
buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.
• Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan
melarutkan zat komponen campuran.
• Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal.
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak
lebih cepat.
Drs. H. Fathur Rahman, M.Si., Apt.

6. PERKEMBANGAN KROMATOGRAFI

7. KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) atau HPLC
(Csaba Horvath, 1970)
• HPLC = High Performance Liquid Chromatography.
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
• HPLC = High Pressure Liquid Chromatography
(Kromatografi Cair Tekanan Tinggi)

8. DIAGRAM BLOK KCKT SISTIM ISOKRATIK

9. Gambar Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

13. KCKT (LC 2010)

14. PERBEDAAN KROMATOGRAFI KONVENSIONAL DAN KCKT
KROMATOGRAFI
KONVENSIONAL
HPLC (KCKT)
Elusi Gravitasi  lama Tekanan tinggi  cepat
Packing Manual  sekali pakai
buang
Bisa dipakai berkali-kali
Peralatan Sederhana Modern: pompa,
injektor, detektor
Hasil ? Akurat dan teliti

15. KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
• TUJUAN
- Pemisahan
- Analisis Kualitatif
- Analisis Kuantitatif
• KEUNTUNGAN
- Dapat dilaksanakan pada suhu kamar
- Detektor dapat divariasi
- Fasa gerak dan kolom dapat dipakai berulang
- Ketepatan dan ketelitian yang tinggi

16. WAKTU RETENSI
Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk
bergerak melalui kolom menuju ke detektor.
Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel
diinjeksikan sampai pada titik dimana tampilan
menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa
itu.

17. 1. ANALISIS KUALITATIF
• Membandingkan Waktu retensi (tR) baku pembanding dengan
waktu retensi (tR) komponen cuplikan pada kondisi
kromatografi yang sama.
• Waktu retensi :
Waktu yang diperlukan suatu komponen keluar dari kolom
kromatografi dimulai saat penyuntikan sampai saat puncak
mencapai maksimum

18. PROFIL KROMATOGRAM KCKT

22. KLASIFIKASI KROMATOGRAFI
• BERDASARKAN JENIS FASA GERAK :
1. Kromatografi Gas
- Kromatografi gas - padat
- Kromatografi gas – cair
2. Kromatografi Cair
- Kromatografi cair - padat
- Kromatogtafi cair - cair

23. KROMATOGRAFI CAIR
• Berdasarkan mekanisme Interaksi :
1. Kromatografi Adsorpsi
2. Kromatografi Partisi : fasa normal dan fasa balik
3. Kromatografi Penukar Ion
4. Kromatografi Gel

24. KOLOM (FASA DIAM SILIKA)

28. PANJANG DAN DIAMTER KOLOM
JENIS PANJANG (cm) DIAMTER (cm) dp
(um)
Konvensional 10-20 4,5 10
Microbore 10 2,5 5
High Speed 6 4,6 3

29. KOLOM KCKT (HPLC)

30. KOLOM FASA TERBALIK (Reversed Phase Colomn)
Fasa diam silika (polar) di + klorosilan ( R= C18 atau oktadesil silika, ODS
 fasa diam silika (non polar).

31. KOLOM FASA TERBALIK (ODS)

32. MEKANISME INTERKASI
• Kromatografi Adsorpsi :
 Interaksi gugus polar dari senyawa dengan
bagian partikel yang polar dari fasa diam
silika.
• Kromatografi Partisi :
 Molekul zat terlarut mendistribusikan dirinya
diantara fasa gerak dan fasa diam

33. KROMATOGRAFI PARTISI
1. Kromatografi Fasa Normal (Normal Phase
Chromatography).
Fasa gerak kurang polar dibanding fasa diam.
- Molekul senyawa yang polar berinteraksi lebih
kuat dengan fasa diam yang polar  ditahan
lebih kuat pada fasa diam dibanding senyawa
non polar

34. • Fasa gerak: n- heksan, metilen klorida, kloroform,
dietil eter.
• Kolom : Gugus polar - NH2  u Bondapak NH2
- CN  Lichrosorb CN
- N(CH3)2 dan – OH
• Aplikasi : - Memisahkan senyawa polar
- Memisahkan campuran senyawa dimana
satu sama lain berbeda pada bagian polarnya

37. 2. Kromatografi Fasa Balik (Reversed Phase).
Fasa gerak lebih polar dari fasa diam.
- Molekul senyawa non polar berinteraksi lebih
kuat dengan fasa diam yang non polar 
ditahan lebih kuat dibanding senyawa polar
Fasa gerak:
- Air - metanol
- acetonitril - Isopropanol
- tetrahidrofuran - campuran pelarut

38. • Kolom :
Gugus C8 (Oktil silan)  Lichrosorb RP-8
Gugus C18 (Oktadesilsilan)  Bondapak C18
• Aplikasi :
- Memisahkan senyawa-senyawa yang kurang
polar.
- Memisahkan campuran senyawa-senyawa yang
satu sama lain berbeda pada bagian non-polar.

41. • Menghitung kuantitas analit pada
kromatogram :
1. Mengukur tinggi puncak kromatogram
2. Menentukan luas area kromatogram

44. • • Metoda kalibrasi eksternal
• Metoda kalibrasi internal
• Metoda adisi standar
+ Metoda koreksi normalisasi

45. Kalibrasi baku eksternal
pembuatan baku

46. Kalibrasi baku eksternal
Analisa vanilin

48. Kalibrasi baku internal

49. Keuntungan metoda kalibrasi
baku eksternal (baku luar)

50. Kekurangan metoda kalibrasi
baku eksternal

51. Keuntungan metoda kalibrasi
baku internal

52. Keuntungan metoda kalibrasi baku
internal

53. Kekurangan metoda kalibrasi
baku internal

56. Analisis Kuantitatif
1. Normalisasi Area
2. Metode Baku Eksternal (Baku Luar)
3. Metode Baku Internal (Baku Dalam)
4. Metode Adisi

57. Contoh perhitungan dengan normalisasi area dari 5 komponen dalam
suatu campuran

58. Contoh Data Normalisasi Area
Puncak Luas Area % Area %
Komposisi
1 167,8 35,9 35,9
2. 31,63 6,8 6,8
3. 108,3 23,2 23,2
4. 80,63 17,3 17,3
5. 78,38 16,8 16,8
Total 466,94 100 100

59. 2. Metode baku eksternal ( Baku Luar)

60. 2. Metode baku Internal (Baku Dalam)

61. Syarat-syarat baku internal
• Terpisah dengan baik dari senyawa yang ditentukan
• Mempunyai waktu retensi yang hampir berdekatan dengan
cuplikan.
• Tidak terdapat dalam sampel
• Mempunyai kemiripan sifat-sifat dengan analit yang ditentukan
• Tidak mempunyai kemiripan secara kimia dengan analit
• Tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian yang tinggi
• Stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fasa gerak
• Mempunyai respon detektor yang hampir sama dengan analit
pada konsentrasi yang digunakan

63. Contoh perhitungan metode baku internal
Kadar Parasetamol
(ppm) (x)
Luas puncak
parasetamol
Luas puncak
fenasetin
Luas puncak parasetamol
/luas puncak fenasetin (Y)
6,534 11672 8901 1,31129730
9,801 16868 9213 1,83093824
13,068 25930 9418 2,753275216
19,068 36877 8714 4,231929888
26,136 54384 9019 6,029886393
Persamaan garis regresi : Y = 0,2457 X – 0,4346 ; r = 0,995
Dari persamaan garis regresi dihitung konsentrasi parasetamol dalam sampel

64. 3. Standard Adisi

65. Resolusi Kromatogram
• Resolusi adalah perbedaan antara waktu retensi
2 puncak yang saling berdekatan.

66. Kapan komponen
dikatakan terpisah sempurna ?

67. Memperbaiki resolusi dengan mengatur
perbandingan fasa gerak

68. Penggunaan metode KCKT untuk analisis

71. PARAMETER KROMATOGRAFI
Kolom merupakan bagian yang terpenting dari
keseluruhan peralatan kromatografi, karena di
dalam kolom terjadi proses pemisahan
campuran komponen.
Parameter Kromatografi :
 Kapasitas
 Selektifitas
 Effesiensi
 Resolusi

72. Mengapa kolom dapat memisahkan suatu
campuran komponen ???
Hal ini disebabkan karena fasa diam yang
terdapat di dalam kolom dapat mengadakan
interaksi dengan berbagai komponen dengan
kekuatan yang cukup berbeda satu sama lain,
sehingga masing-masing komponen akan
keluar dari kolom dengan waktu retensi yang
juga berbeda.

73. Parameter apa yang dipakai untuk menyatakan
besar kecilnya interaksi tersebut di atas ???
Ukuran interaksi suatu senyawa dengan fasa
diam dinyatakan sebagai faktor kapasitas (k′)
komponen tersebut, yang dapat didefenisikan
melalui persamaan berikut ini
tr A – to
k′ =
to

74. Dimana :
tr A = Waktu retensi komponen A yang ditahan
oleh kolom
to = Waktu retensi komponen yang tidak
ditahan oleh kolom (misal: pelarut/eluen

75. Apa yang dimaksud dengan waktu retensi /tambat
(retention time) (tr) ???
• Waktu yang diperlukan untuk membawa
keluar suatu komponen dari dalam kolom
kromatografi dimulai saat penyuntikan
sampai saat puncak mencapai maksimum.

76. Faktor kapasitas yang relatif besar memberikan
indikasi adanya interaksi yang relatif kuat antara
komponen dengan fasa diam dan sebagai akibatnya
komponen tertahan kuat di dalam kolom.
Sebaliknya, faktor kapasitas yang relatif kecil ada
kaitannya dengan interaksi yang relatif lemah atau
dengan kata lain, komponen hanya sedikit saja
tertahan di dalam kolom.

77. Apa hubungan antara Faktor Kapasitas dari
berbagai komponen dengan Selektifitas dari
suatu kolom ?
Suatu kolom dikatakan selektif apabila kolom tersebut
mempunyai kemungkinan menahan berbagai komponen
dengan kekuatan yang cukup berbeda, sehingga faktor
kapasitas dari masing-masing komponen pada kolom
tersebut juga berbeda.
Dengan demikian dapat diharapkan suatu campuran
komponen akan dapat dipisahkan relatif sempurna di
dalam suatu kolom yang mempunyai selektifitas yang
cukup tinggi.

78. Secara bagaimana Selektifitas di atas
didefinisikan ?
Faktor Selektifitas (α) didefinisikan sebagai ukuran
pemisahan dua komponen dan dinyatakan melalui
persamaan berikut ini :
k’
B
α =
k’
A
k’
B = faktor kapasitas komponen B
k’
A = faktor kapasitas komponen A
Sebagai perjanjian, faktor kapasitas yang lebih besar
diletakkan sebagai pembilang.

79. Berapa besar harga selektifitas (α) yang
diharapkan agar dapat terjadi pemisahan ?
Selektifitas (α) hendaknya mempunyai harga
yang lebih besar dari pada satu, karena pada
harga α = 1 berarti k’
B = k’
A , yang berarti
komponen B dan A tidak terpisahkan.

80. Apakah harga α ini sudah dapat meramalkan
terjadinya pemisahan yang sempurna ?
Jawabnya : belum. Mengapa ????
Hal ini disebabkan karena harga α hanya
memberikan indikasi adanya pemisahan pada
bagian atas puncak kromatogram, tanpa
memperhitungkan terdapatnya “overlapping”
(tumpang-suh) yang mungkin terjadi di bagian
bawah puncak tadi.

81. • Gambar

82. Untuk suatu harga α yang sama terdapat
2 kemungkinan yang berbeda:
Jika demikian jelas permasalahannya terletak pada puncak
yang lebar dan puncak yang sempit.
Pemisahan yang sempurna dapat terjadi jika dihasilkan
puncak komponen yang relatif sempit.
Lebar atau sempitnya puncak suatu komponen ditentukan
antara lain oleh efisiensi kolom yang digunakan.

83. Apa yang dimaksud dengan efisiensi dari suatu
kolom ????
Efisiensi suatu kolom merupakan ukuran
kemampuan dari kolom tersebut untuk
mencegah/mengurangi terjadinya pelebaran
puncak komponen.
Suatu kolom yang efisiensi akan dapat
menghasilkan puncak-puncak komponen yang
relatif sempit, sehingga jumlah komponen yang
dapat terpisahkan di dalam kolom tersebut akan
menjadi relatif banyak.

84. Tolok ukur apa yang dapat dipakai untuk
menyatakan efisiensi dari suatu kolom???
Efisiensi suatu kolom dinyatakan secara kuantitatif
sebagai jumlah pelat teori (N) dari kolom tersebut.
Jumlah pelat teori ini dapat dihitung dari
persamaan berikut ini :
N = 16 (tr/W)2
Dimana :
tr = Jarak antara titik nol dan titik potong kedua garis singgung pada
sisi-sisi puncak komponen
W= Lebar puncak pada alasnya, diukur antara titik titik potong garis
singgung pada kedua sisi puncak komponen dengan poros
horisontal

85. .
Jika ditelaah secara menyeluruh, kelihatan jelas adanya
keterkaitan antara faktor kapasitas, selektifitas dan
efisiensi suatu kolom pada keberhasilan pemisahan.
Dengan demikian tentunya ada suatu parameter lain
yang dapat menggambarkan sekaligus keterlibatan
ketiga parameter di atas pada keberhasilan suatu
pemisahan.

86. Parameter apakah itu ???
Jawabnya : Resolusi
Ketergantungan Resolusi (Rs) pada ketiga
parameter di atas dinyatakan dengan persamaan
berikut ini :
Di mana:
a = faktor kapasitas
b = faktor selektiftas
c = faktor efisiensi

87. Untuk suatu pemisahan yang baik (dalam arti kata
kedua puncak komponen terpisah sempurna hingga
garis dasarnya) maka Rs hendaknya ≥ 1,5
Suatu kolom yang masih baru biasanya mempunyai daya
resolusi yang relatif besar (Rs ≥ 1,5).
Tetapi sesuai dengan umur pakai kolom, makin lama daya
resolusi tersebut makin kecil dan pada akhirnya puncak-
puncak komponen yang semula terpisah, akan menjadi
saling tumpang-suh (overlapping) satu sama lain

89. Di dalam prakteknya, apa yang menyebabkan
daya resolusi suatu kolom makin lama makin kecil
???
Bagaimana kita dapat mengkaitkan daya
resolusi yang semakin berkurang dengan umur
pemakaiannya ???
Resolusi tergantung dari faktor kapasitas,
selektifitas, dan efisiensi.
Berkurangnya resolusi berarti berkurangnya
faktor kapasitas, selektifitas dan jumlah pelat
teori (efisiensi)

90. Peristiwa-peristiwa apa saja di dalam
prakteknya, yang dapat mengakibatkan
menurunnya ketiga parameter di atas ???
1. Menurun Faktor Kapasitas (k′) dapat terjadi
pada suatu kolom yang belum cukup
setimbang (stabilisasi kolom masih kurang).
Peristiwa ini sering terjadi pada saat pergantian
komposisi eluen (fase gerak). Sebagai
perkiraan, untuk perioda stabilisasi, umumnya
dibutuhkan eluen sebanyak 10 hingga 80 kali
volume kolom

91. Kemungkinan yang lain, Larutan buffer sitrat yang
sering digunakan pada eluen dapat membentuk
komplek khelat dengan gugus-gugus silanol dari
fasa diam.
Pembentukan khelat tersebut dapat mengubah
sifat dari fasa diam dan sebagai akibatnya faktor
kapasitas komponen juga akan berubah.
2. Menurunnya faktor Selektifitas (α)
disebabkan karena terjadi proses deaktifasi
kolom, sebagai akibat kontaminasi beberapa
komponen “aktif” pada fasa diam.

92. Pada kromatografi fasa normal, penyebabnya
antara lain :
• Adsorpsi irreversibel dari komponen yang sangat
reaktif, misalnya saja adsorpsi senyawa-senyawa
amina pada gugus silanol dari fasa diam.
Terjadinya proses elusi yang sangat lambat dari
beberapa komponen yang tertahan sangat kuat
pada kolom, yang berasal dari analisa
kromatografi sebelumnya.
Fasa gerak terlalu banyak mengandung air.

93. Pada kromatografi fasa terbalik, penyebabnya
antara lain :
• Adsorpsi irreversibel dari bebrapa
ketidakmurnian yang berasal dari air yang
digunakan pada campuran eluen.
• Modifikasi dari tekstur fasa diam, yang terjadi
sebagai akibat digunakannya larutan buffer
sebagai eluen (terutama buffer phosphat)

94. Suatu kolom RP yang telah dialiri buffer
phosphat sebaiknya tidak dipakai kembali
untuk eluen yang terdiri dari pelarut organik
murni atau campuran pelarut organik murni
• Penggunaan eluen dengan nilai pH dari fasa
diam yang dipakai (biasanya eluen terlalu
basa).
Hindarkan misalnya penggunaan ammonium
karbonat.

95. 3. Menurunnya faktor efisiensi (N), disebabkan
karena terdapatnya kontaminasi pada kolom atau
memadatnya fasa diam pada bagian atas kolom,
sehingga membentuk “ruang kosong” pada ujung
atas kolom.
Untuk mencegah terjadinya peristiwa ini,
hendaknya selalu dihindarkan terjadinya
perubahan tekanan yang terlalu besar dan
mendadak pada kolom. Selain itu filter yang
terdapat pada ujung kolom hendaknya selalu
dibersihkan dan kalau perlu diganti

96. WAKTU RETENSI DIPENGARUHI OLEH :
• Laju aliran fasa gerak (flow rate)
• Suhu kolom
• Jenis fasa diam
• Keadaan kolom (Colomn history)
• Jumlah cuplikan
Bila pengaruh dapat dikendalikan  Identifikasi