Elektroforesis bahan presentasi

1. ELEKTROFORESIS
KIMIA ANALISIS LANJUT
PENDIDIKAN KIMIA PPS UNM

2. PENGERTIAN

3. PRINSIP PEMISAHAN ELEKTROFORESIS
(Andreas Manz dkk,2010)

4. Lanjutan.................
 Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau
molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik
ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni
elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan
elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).
 Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada
interaksi partikel-partikel bermuatan oleh medan listrik.
Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub
positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik
positif akan bergerak kekutub negative (katoda).
Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan
listrik menyebabkan pemisahan pada metode
elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)

5. JENIS-JENIS ELEKTROFORESIS
 Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak /
moving boundary)
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik
isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh
larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini
adalah mahal dan pemamfaatan kurang.
 Dengan pengemban padat atau matriks seperti:
A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)
B. Elektroforesis Kertas
C. Elektroforesis selulosa asetat
D.Elektroforesis gel
E. Elektroforesis Kapiler

6. Lanjutan.............
A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah):
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat,
penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan
penentuan perubahan mobilitas atau konformasi.
B. Elektroforesis Kertas :
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama
ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi
sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung
pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorbsivitas zat terlarut.
C. Elektroforesis Tirai (kontinyu):
Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara
kontinu

8. lanjutan................
D.Elektroforesis gel
 Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar
teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam
hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran
molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning,
sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih
lanjut.
 Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida
dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

9. Gambar Elektroforesis Gel

10. Gel Media
Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
 Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam
penanda oligonukleotida dan menganalisis
pemanjangan primer.
 Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan
rantai DNA yang berukuran besar.
 Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk
menyediakan sistem elektroforesis RNA pada Ukuran
Standar (Davis dkk. 1994: 151).

11. Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan
analit/DNA
 Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang
tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.
 Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA
sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran
kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah
molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
 Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat
melewati gel.

12. Lanjutan......
 Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul
dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit
volume molekul.
 Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,
sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.
 Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
 Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
migrasi DNA akan lebih cepat.

13. Elektroforesis Kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan
untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan
nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler
berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan pengembangan
konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis
kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai
partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun
bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada
larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion
bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Kation
menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda. Sifat kelistrikan
inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

14. Diagram Instrumen Elektroforesis Kapiler

15. APLIKASI GE
(produksi amplikasi PCR dari genomic DNA dari jenis starin bakteri Pseudomonas putida)

16. APLIKASI CE
(ANALISIS PEPTIDA)

17. APLIKASI LAIN ELEKTROFORESIS
 Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam
berbagai bidang, misalnya :
 Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk
pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik
khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi
dalam mengungkap sebuah kasus.
 Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis
merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan
keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
 Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada
sebuah DNA.

18. Lanjutan.............
 Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk
PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-
sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan
untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut.
 Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens
berbagai genom
 DNA Fingerprinting
 Mendeteksi kelainan genetik.
 Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
 Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan
perlakuan gen
 Mempelajari evolusi tingkat molecular
 Mengetahui variasi genetik yang ada di alam
 Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.
 Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
 Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid
 Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

19. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN ELEKTROFORESIS
 KELEBIHAN : Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan
peralatan sedrhana, digunakan untuk memisahkan suatu sampel
molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan
sederhana.
 KEKURANGAN : Memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi
yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku
untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya
karena kuat arus searah yang relative rendah, kecepatan
pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan listrik yang
searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan
noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda
oleh panas yang dihasilkan tegangan listrik searah yang tinggi
sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak
terlalu jelas memisah.