Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc

Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
ĐỖ NGÔ THỤC ĐÀI
TÁC ĐỘNG CỦA ENZYME ALCALASE
ĐẾN HIỆU QUẢ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ
THỊT ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus Monodon)
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 12/2014

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:
TÁC ĐỘNG CỦA ENZYME ALCALASE
ĐẾN HIỆU QUẢ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ
THỊT ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus Monodon)
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGs. Ts. NGUYỄN VĂN MƢỜI ĐỖ NGÔ THỤC ĐÀI
MSSV: 2111595
Lớp: CB1108A1
Cần Thơ, 12/2014

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ
LỜI CAM ĐOAN

Em cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Đỗ Ngô Thục Đài với
sự hƣớng dẫn của PGs. Ts. Nguyễn Văn Mƣời. Các số liệu và kết quả trình bày
trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo
đây, với tên đề tài “Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân
protein từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon)” đã đƣợc hội đồng chấm luận văn
thông qua.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
Cán bộ hƣớng dẫn Ngƣời viết
PGs. Ts. Nguyễn Văn Mƣời Đỗ Ngô Thục Đài
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang i

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian học tập, nghiên cứu, nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô, các
bạn và nỗ lực của bản thân, đề tài tốt nghiệp của em đã hoàn thành.
Trƣớc tiên, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Mƣời và cô
Trần Thanh Trúc đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh
nghiệm vô cùng quý báu. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhƣng thầy cô
vẫn thƣờng xuyên theo dõi và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận
văn tốt nghiệp.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:
Thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng
dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian
học tập tại trƣờng.
Cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp
và Sinh học ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành tốt đề tài của mình.
Chị Võ Thị Anh Minh – học viên Cao học ngành Công nghệ thực phẩm khóa
19, anh Trần Bạch Long – học viên Cao học Công nghệ sinh học khóa 19, chị Phan
Thị Bích Ngọc – sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36, các anh chị đã nhiệt
tình đóng góp ý kiến và giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng nhƣ phƣơng pháp
học tập, nghiên cứu.
Các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 19, khóa 20, khóa 21 và các
bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 37 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và
động viên giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng xin gởi đến quý Thầy Cô và tất cả các bạn lời chúc sức khỏe và
thành công trong cuộc sống.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện
Đỗ Ngô Thục Đài
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang ii

TÓM TẮT

Chế biến phụ phẩm của ngành thủy sản thành những sản phẩm có giá trị gia
tăng sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất và tận dụng triệt để lƣợng
phụ phẩm từ quá trình chế biến thủy sản nhằm hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Đề tài
đƣợc thực hiện với mục tiêu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy
phân protein trên phụ phẩm thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) bằng enzyme
alcalase 2,4L. Nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của của pH môi trƣờng, tỉ
lệ enzyme, thời gian và nhiệt độ thủy phân thích hợp giúp hiệu suất thủy phân thịt
đầu tôm sú đạt cao nhất.
Kết quả khảo sát cho thấy, hiệu suất thủy phân cao nhất (24,55%) khi thịt đầu
tôm sú đƣợc tiến hành thủy phân bằng chế phẩm alcalase với tỉ lệ enzyme và
nguyên liệu là 1% (v/w) ở điều kiện pH môi trƣờng là 8 (tỉ lệ nguyên liệu và dung
môi là 1:1, w/v), kết hợp với thông số nhiệt độ và thời gian thủy phân thích hợp lần
lƣợt là 50C và 4 giờ.
Từ khóa: acalase, hiệu suất thủy phân, pH môi trường, thịt đầu tôm sú, thời
gian thủy phân, tỉ lệ enzyme.
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii
TÓM TẮT .................................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iv
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vi
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... vii
CHƢƠNG 1TỔNG QUAN ................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2
CHƢƠNG 2LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1 Thịt đầu tôm sú .................................................................................................. 3
2.1.1 Tôm sú ........................................................................................................ 3
2.1.2 Thực trạng xử lý - tiêu thụ đầu tôm sú và thịt đầu tôm sú ở nƣớc ta ......... 5
2.2 Khái quát về enzyme protease và hệ protease trong thủy sản ........................... 7
2.2.1 Tổng quan về protease ............................................................................... 7
2.2.2 Hệ serine protease ...................................................................................... 7
2.2.3 Protease của tôm sú .................................................................................... 8
2.2.4 Sự thủy phân protein từ đầu tôm ................................................................ 9
2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease
............................................................................................................................... 10
2.3.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .............................................................. 10
2.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme .............................................................. 10
2.3.3 Ảnh hƣởng của pH ................................................................................... 11
2.3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................... 11
2.3.5 Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ......................................................... 12
2.3.6 Ảnh hƣởng của chất hoạt hóa ................................................................... 12
2.3.7 Ảnh hƣởng của chất kìm hãm .................................................................. 13
2.4 Tổng quan về enzyme alcalase ........................................................................ 13
2.5 Các nghiên cứu có liên quan ........................................................................... 15
CHƢƠNG 3PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 17
3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm ................................................................................... 17
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm ................................................................. 17
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 17
3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm ............................................................... 17
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 18
3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ...................................................................... 18
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả ................................................ 18
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang iv

3.2.3 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả...................................................19
3.3 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................20
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.............................................................20
3.3.2 Xác định thành phần cơ bản của nguyên liệu thịt đầu tôm sú và hoạt tính
enzyme alcalase.................................................................................................20
3.3.3 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung alcalase đến hiệu suất
thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú .................................................................21
3.3.4 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu quả thủy phân
protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase ..............................................22
3.3.5 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thủy phân
protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme alcalase...................................................24
3.3.6 Thí nghiệm 4: Xác định tỉ lệ enzyme alcalase thích hợp đến hiệu suất
thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú .................................................................25
3.3.7 Thí nghiệm 5: Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến hiệu suất thủy
phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase .....................................26
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...............................................................27
4.1 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu thịt đầu tôm sú và hoạt tính
enzyme alcalase.....................................................................................................27
4.2. Tác động của việc bổ sung alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu
tôm sú....................................................................................................................28
4.3 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm
sú bằng enzyme alcalase .......................................................................................29
4.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu
tôm bằng enzyme alcalase.....................................................................................30
4.5 Xác định tỉ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân thịt đầu tôm sú bằng
enzyme alcalase.....................................................................................................32
4.6 Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt
đầu tôm sú bằng enzyme alcalase .........................................................................33
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................37
5.1 Kết luận ...........................................................................................................37
5.2 Đề nghị............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................38
PHỤ LỤC 1 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................44
PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ ..................................................................49
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang v

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Tôm sú Penaeus monodon......................................................................... 4
Hình 2.2: Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease ................. 7
Hình 2.3: Sơ đồ các bƣớc xúc tác cơ bản của nhóm serine protease ........................ 8
Hình 2.4: Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân của enzyme...10
Hình 2.5: Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân enzyme.........11
Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân enzyme ......................12
Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH (a) và nhiệt độ (b) lên hoạt động của alcalase ..........14
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................20
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..........................................................................23
Hình 4.1 Đồ thị so sánh hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme
nội bào và bổ sung chế phẩm alcalase thƣơng mại ..................................................28
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo tỉ lệ enzyme alcalase
(v/w) bổ sung.............................................................................................................32
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang vi

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần hóa học trong tôm sú ............................................................. 4
Bảng 2.2: Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú (đã tách vỏ)...................... 6
Bảng 2.3: Tính chất của alcalase...............................................................................13
Bảng 3.1: Phƣơng pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu.........................................19
Bảng 4.1: Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú và hoạt tính protease của
chế phẩm alcalase thƣơng mại..................................................................................27
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt đầu
tôm sú bằng alcalase..................................................................................................29
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thủy phân protein bằng
alcalase ......................................................................................................................31
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hiệu quả thủy phân thịt đầu tôm
sú khi bổ sung alcalase..............................................................................................34
Bảng 4.5: Thành phần acid amin trong dịch thủy phân thịt đầu tôm sú ở điều kiện
thủy phân tối ƣu của alcalase (% so với protein). ....................................................36
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang vii

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong những nƣớc có thế mạnh về sản xuất và xuất khẩu
thủy sản trên thế giới (bên cạnh Indonesia và Thái Lan). Thủy sản là mặt hàng
chiếm tỷ trọng cao trong các sản phẩm xuất khẩu. Trong đó, mặt hàng giáp xác
đông lạnh chiếm từ 70÷80% sản lƣợng và tôm sú là mặt hàng xuất khẩu chủ lực
của ngành.
Theo báo cáo của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam, tổng
sản lƣợng tôm năm 2013 ƣớc đạt 541.000 tấn, trong đó sản lƣợng tôm sú đạt
268.000 tấn (VASEP, Hội nghị Tổng kết Xuất khẩu tôm năm 2013). Do lƣợng
tôm đông lạnh xuất khẩu hàng năm tăng nhanh dẫn đến tình trạng một lƣợng lớn
tôm có phẩm chất kém, tôm thứ phẩm và phụ phẩm từ tôm đƣợc thải ra từ các
nhà máy rất khó đƣợc tiêu thụ. Lƣợng phế thải rắn bao gồm đầu tôm và vỏ tôm
thƣờng chiếm 50÷70% nguyên liệu ban đầu (Shahidi and Synowiecki, 1991) là
nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng. Hàng năm Việt Nam có khoảng 65.000
tấn đầu tôm đƣợc thải ra từ các nhà máy, chiếm khoảng 34% khối lƣợng nguyên
liệu (Schoemaker et al., 2005). Vì vậy, các phụ phế phẩm này cần đƣợc xử lý và
chế biến tiếp tục để tăng giá trị kinh tế và hạn chế ô nhiễm môi trƣờng.
Hiện nay, lƣợng đầu tôm chủ yếu dùng làm phân bón, thức ăn gia súc, thức
ăn thủy sản nhƣng giá trị thƣơng phẩm của các sản phẩm này chƣa cao. Nếu tận
dụng phế phẩm bằng cách tách riêng phần protein ở đầu tôm ra phục vụ chăn
nuôi, tách hợp chất màu (astaxanthin) để phục vụ công nghiệp nhuộm, chế biến
chitosan,… thì giá trị mang lại từ nguồn phế liệu tôm sẽ lớn hơn gấp nhiều lần.
Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm thời gian gần đây là một hƣớng
mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm, đƣợc ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực nhƣ y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…(Rinaudo et al., 2006).
Chitosan là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng nhƣ thực phẩm
mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng xung quanh (Trung và ctv, 2003).
Trong công nghệ sản xuất chitosan theo phƣơng pháp hóa học có 2 bƣớc
xử lý kiềm và acid nhằm loại bỏ protein ra khỏi hỗn hợp bán thành phẩm. Một số
hóa chất đƣợc áp dụng để thủy phân phụ phẩm tôm, ví dụ HCl (Ferrer et al.,
1996; Kjartansson et al., 2006), NaOH và KOH (Duarte de Holanda and Netto,
2006). Phƣơng pháp hóa học này không những gây lãng phí, mà lƣợng phế thải
hóa học và các chất phân giải protein thải ra vô cùng lớn, gây ô nhiễm môi
trƣờng sống. Vì vậy, thực hiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú theo phƣơng
pháp enzyme là một hƣớng đi đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Trong đó, thủy phân protein từ các nguyên liệu thủy sản đã trở thành phổ biến

Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 1

trong ngành công nghiệp thực phẩm do hàm lƣợng protein cao (Córdova-
Murueta et al., 2007). Thủy phân protein làm giảm kích thƣớc các peptide, dịch
thủy phân là nguồn acid amin có sẵn cho sinh tổng hợp protein (Gildberg and
Stenberg, 2001).
Phƣơng pháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình
thủy phân, tránh đƣợc việc dùng hóa chất và giảm thiểu các phản ứng không
mong muốn, giảm ô nhiễm môi trƣờng, có thể thu đƣợc sản phẩm phụ là dịch
thủy phân gồm các acid amin và các peptide. Tiến trình này có thể thực hiện bằng
cách bổ sung enzyme protease thƣơng mại, điển hình là enzyme alcalase (Cao et
al., 2011; Randriamahatody et al., 2011; Trần Thị Hồng Nghi và ctv, 2009). Trên
cơ sở đó, nghiên cứu thủy phân thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase đƣợc tiến
hành.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu khả năng thuỷ phân protein từ thịt đầu
tôm sú bằng enzyme alcalase. Để đạt đƣợc mục tiêu này, nghiên cứu đƣợc tiến
hành theo các nội dung chính sau đây:

Xác định pH môi trƣờng thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ thịt
đầu tôm sú bằng enzyme alcalase.



Xác định tỉ lệ enzyme alcalase phù hợp đến hiệu suất thủy phân thịt đầu tôm
sú.



Xác định nhiệt độ và thời gian thủy phân thích hợp giúp tăng hiệu suất thủy
phân thịt đầu tôm sú.


CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Thịt đầu tôm sú
2.1.1 Tôm sú
2.1.1.1 Tổng quan
Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon (Fabricius, 1798, trích dẫn bởi
Holthuis, 1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát ở độ sâu từ ven bờ đến 40 m
nƣớc. Khi tôm sú trƣởng thành thƣờng di chuyển xa bờ vì chúng thích sống
vùng nƣớc sâu.
Tôm sú đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda;
Phân ngành: Crustacea;
Lớp: Malacostraca;
Bộ: Decapoda;
Phân bộ: Dendrobranchiata;
Họ: Penaeidae;
Chi: Penaeus;
Loài: Penaeus monodon.
(Nguồn: Holthuis, 1980)
Trong tự nhiên tôm sú nƣớc mặn đến mùa sinh sản sẽ tiến vào gần bờ để đẻ
trứng, trứng nở ra ấu trùng và trải qua năm thời kỳ biến đổi: Naupilus, Zoea,
Mysis, Postlarvae, Juvenile. Từ đây ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sông nơi
nƣớc biển và nƣớc sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn. Đây chính là
điều kiện tốt cho ấu trùng phát triển. Tôm sú có đặc điểm sinh trƣởng nhanh,
trong 3÷4 tháng có thể đạt cỡ bình quân 40÷50 gam (Holthuis, 1980).

Hình 2.1: Tôm sú Penaeus monodon
(Nguồn: http://capeleman.blogspot.com/p/southeast-asia-crustacean-and-mollusca.html)
2.1.1.2 Thành phần hóa học của tôm sú
Thành phần hóa học của tôm sú bao gồm protein, nƣớc, lipid, glucid,
calcium, phosphate, sắt,... Các thành phần này khác nhau thay đổi phụ thuộc vào
giống, loài, giới tính, độ tuổi, thành phần thức ăn, điều kiện môi trƣờng sống và
những biến đổi sinh lý của tôm. Sự khác nhau về thành phần hóa học của tôm và
sự biến đổi của chúng ảnh hƣởng đến mùi vị, giá trị dinh dƣỡng, việc bảo quản
tƣơi nguyên liệu và quy trình chế biến.
Trong thịt tôm, nƣớc chiếm khoảng 80%, phần còn lại là protein, lipid,
glucid, vitamin, khoáng, trong đó protein chiếm khoảng 70÷80% chất khô
(Huỳnh Văn Nguyên, 2011).
Protein của thịt tôm chứa từ 18÷20 acid amin và hầu nhƣ gần đủ các acid
amin không thay thế. Đặc biệt là protein trong tôm chứa đầy đủ các acid amin
cần thiết (theonine, methyonine, phenylalanine, valine, tryptophane, lysine,
leucine, isoleucine) giống nhƣ thịt động vật trên cạn. Nhìn chung, thịt tôm là một
thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣng dễ bị hƣ, ƣơn, thối sau khi đánh bắt
do vi sinh vật. Đầu tôm tập trung các cơ quan nội tạng và chứa nhiều đạm hòa tan
nên sự hƣ hỏng tôm tập trung chủ yếu ở đầu, sau đó lan dần ra (Nguyễn Xuân
Phƣơng, 2003).
Bảng 2.1: Thành phần hóa học trong tôm sú
Thành phần g/16g N
Nƣớc 75,22±0,55
Protein 21,04±0,48
Lipid 1,83±0,06
Tro 1,91±0,05
(Nguồn: Nguyễn Xuân Phương, 2003)

2.1.1.3 Hiện trạng sản xuất và xuất khẩu tôm đông lạnh ở Việt Nam
Tôm đông lạnh đã và đang là mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt
Nam. Hiện nay, nguồn cung tôm thế giới bị hạn chế bởi sản lƣợng tôm từ Thái
Lan và Trung Quốc đang giảm mạnh do ảnh hƣởng của EMS (hội chứng tôm
chết sớm) khiến giá tôm tăng trên toàn cầu. Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt
Nam sang các thị trƣờng lớn tăng lên.
Số liệu của VASEP (quý III/2014) cho thấy, xuất khẩu thủy sản của cả
nƣớc tiếp tục tăng mạnh nhờ nhu cầu tăng và nguồn cung trong nƣớc khả quan,
thị trƣờng thế giới đang thiếu nguồn cung do dịch bệnh EMS. Số liệu của Tổng
cục Thống kê cũng cho thấy thủy sản là một trong những ngành có tốc độ tăng
trƣởng xuất khẩu cao nhất trong 9 tháng đầu năm 2014. Sản lƣợng thủy sản 9
tháng đầu năm ƣớc đạt 4,7 triệu tấn, tăng 4,9% so với cùng kì năm trƣớc. Trong
đó xuất khẩu tôm tăng trƣởng mạnh nhất (42%), chiếm tỉ trọng cao nhất (50,6%).
Xuất khẩu tôm Việt Nam 9 tháng đầu năm 2014 là 2,93 tỉ USD, tăng 42,3% so
với cùng kỳ năm 2013. Xuất khẩu tôm sang Đức - thị trƣờng tôm lớn nhất EU,
tăng 63,8% so với cùng kỳ năm 2013, thị trƣờng Hà Lan tăng 256% và thị
trƣờng Hàn Quốc tăng 84,8%. Theo Hiệp hội Chế biến Thủy sản Việt Nam, xuất
khẩu tôm năm 2014 có thể sẽ vƣợt quá 3,5 tỉ USD nếu dịch bệnh đƣợc kiểm soát
và nhu cầu tiêu thụ của thị trƣờng hiện nay vẫn còn mạnh.
Theo trang tin xúc tiến thƣơng mại – bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn Việt Nam (8/2014), tôm sú vẫn là mặt hàng xuất khẩu ƣu thế của Việt Nam
so với các nhà cung cấp khác bởi Việt Nam hiện đƣợc coi là nƣớc sản xuất tôm
sú lớn nhất trên thế giới với sản lƣợng ổn định. Nhờ giá tôm sú trên thị trƣờng
thế giới nói chung và trên thị trƣờng Nhật Bản nói riêng ở mức cao là cơ sở giúp
giá trị xuất khẩu tôm sú Việt Nam trên thị trƣờng Nhật Bản duy trì tăng trƣởng
mạnh, đồng thời khẳng định đây vẫn là thị trƣờng dẫn đầu, với mức tăng trƣởng
tốt (3%). Mặt hàng tôm sú bỏ đầu là sản phẩm đƣợc ƣa chuộng trên nhiều thị
trƣờng, đặc biệt trên thị trƣờng Nhật Bản. Điều này mở ra hƣớng khai thác
nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng,
nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam.
2.1.2 Thực trạng xử lý - tiêu thụ đầu tôm sú và thịt đầu tôm sú ở nƣớc ta
Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ
đầu – vỏ tôm bằng các phƣơng pháp sinh học (sử dụng Bromelanin trong dịch ép
vỏ dứa). Phạm Thị Đan Phƣợng và ctv (2008) cũng đã nghiên cứu xử lý
carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và bƣớc đầu thử nghiệm phối
trộn thức ăn cá. Trịnh Ngọc Vinh (2006) đã tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm
vi khuẩn Lactobacillus spp. giúp quá trình lên men đƣợc nhanh hơn, góp phần

tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lƣợng cao hơn, có tính phổ biến, giá trị
kinh tế cao và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Phan Thị Bích Trâm và Phạm Thu
Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đƣờng và
enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm.
Ngoài ra, một trong những ứng dụng phổ biến là sử dụng đầu tôm trong chế
biến chitin, chitosan. Trong quy trình này, việc thủy phân protein trong thịt đầu
tôm trƣớc khi tách chiết chitosan đƣợc xem là bƣớc xử lý cơ bản. Ngô Thị Hoài
Dƣơng và ctv (2008) cũng đã nghiên cứu đƣa ra giải pháp tiền xử lý bằng acid
formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu lƣợng hóa
chất và chất thải gây ô nhiễm môi trƣờng.
Tỷ lệ đầu tôm sú thu đƣợc từ các nhà máy chế biến thủy sản ở Sóc Trăng và
Cần Thơ chiếm trung bình 34,33÷0,85% (Huỳnh Văn Nguyên, 2011). Phần thịt
từ đầu tôm sú chiếm khoảng 15% khối lƣợng đầu tôm nguyên liệu (Nguyễn Văn
Mƣời và ctv, 2013). Nguyễn Văn Mƣời và ctv của Trƣờng Đại học Cần Thơ
(2013) đã nghiên cứu bổ sung thịt đầu tôm trong chế biến xúc xích từ tôm thịt
vụn. Nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả cũng cho thấy, tỉ lệ thu hồi thịt đầu
tôm là rất cao (6,5% nguyên liệu ban đầu), khi bổ sung với thịt tôm thứ phẩm
theo tỉ lệ 30% thịt đầu và 70% thịt tôm thứ phẩm sẽ tạo đƣợc khối paste có cấu
trúc không khác biệt so với paste đƣợc chế biến từ tôm thịt thứ phẩm (Nguyen et
al., 2011).
Thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (Bảng 2.2) cho thấy đây
chính là nguồn giàu protein.
Bảng 2.2: Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú (đã tách vỏ)
Thành phần Giá trị
Nƣớc (%) 82,30 ± 0,83
Protein (%) 14,82 ± 0,38
Lipid (%) 1,48 ± 0,48
Tro (%) 1,11 ± 0,03
pH 7,30 ± 0,10
(Nguồn: Huỳnh Văn Nguyên, 2011).
Từ kết quả phân tích của Huỳnh Văn Nguyên (2011) khi tiến hành tách
riêng thịt đầu tôm sú cho thấy, tỷ lệ protein thịt đầu tôm đƣợc thu nhận tại các
nhà máy chế biến thủy sản ở Sóc Trăng và Cần Thơ chiếm đến 14,82% hay
83÷84% tính theo căn bản khô. Thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3) khi so
sánh với pH của thịt tôm tƣơi (pH = 6,8÷6,9; Nguyễn Xuân Phƣơng, 2003). Điều
này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và các biến
đổi sinh hóa, hóa học gây hƣ hỏng (Tran et al., 2011).

Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ
enzyme protease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong
nguồn nguyên liệu đầu tôm này là cần thiết.
2.2 Khái quát về enzyme protease và hệ protease trong thủy sản
2.2.1 Tổng quan về protease
Protease hay peptide hydrolase là enzyme thuộc nhóm hydrolase - thủy
phân các liên kết peptide của protein hay polypeptide (–CO–NH–) tạo thành các
acid amin tự do, peptide, pepton, tri-dipeptide. Nhiều enzyme protease có khả
năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amid và phản ứng chuyển
vị gốc acid amin. Phản ứng thủy phân bởi protease có thể biểu diễn theo sơ đồ
Hình 2.2.
Hình 2.2: Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease
(Nguồn: Barrett, 2001)
Việc phân loại nhóm enzyme protease đƣợc thay đổi qua các thời kỳ
(Barrett, 2001). Theo Grassmann and Dyckerhoff (1928, trích dẫn bởi Barrett,
2001) protease phân chia thành proteinase và peptidase. Theo Bergmann and
Ross (1936, trích dẫn bởi Barrett, 2001) gọi chung việc thủy phân liên kết peptide
nên sử dụng danh từ peptidase và đƣợc chia thành hai nhóm là endopeptidase và
exopeptidase. Dựa trên việc phân tích nghĩa rộng và nghĩa hẹp của từ “peptidase”
nên để tránh nhầm lẫn, theo yêu cầu của IUBMB protease đƣợc coi là peptidase
nhƣng chia làm hai loại là endopeptidase (proteinase) và exopeptidase. Năm
1960, Hartley (trích dẫn bởi Phan Thị Bích Trâm, 2010) đã phân loại enzyme
thủy phân protein theo bốn nhóm dựa theo tên hóa học các acid amin tham gia
vào tâm vị trí xúc tác. Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo trung tâm hoạt động protease
đƣợc chia thành 4 nhóm: Serine peptidase (EC 3.4.21), Cystein peptidase (EC
3.4.22), Aspartic peptidase (EC 3.4.23), Metallo peptidase (còn gọi là protease
kim loại EC 3.4.24).
2.2.2 Hệ serine protease
Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và đƣợc phát hiện ở mọi
giới sinh vật nhƣ eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Serine protease (EC
3.4.21) là một trong số các enzyme đƣợc nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng
thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa của động vật phổ biến nhất là trypsine,

chymotrypsine và elastase. Serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tƣợng
sinh lý trong cơ thể nhƣ phá cục máu nghẽn và hoạt hóa các bổ thể (Phan Thị
Bích Trâm, 2011; Gupta et al., 2002).
Trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic,
histidin và serine, trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế
đƣợc trình bày ở Hình 2.3.
Hình 2.3: Sơ đồ các bƣớc xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
(Nguồn : Phan Thị Bích Trâm, 2011)
Cơ chế theo Hình 2.3 gồm 3 phản ứng:
Phản ứng 1: nhóm –OH của serine trong trung tâm hoạt động ezyme kết
hợp với nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp
chuyển tiếp tứ diện (tretahedral complex).
Phản ứng 2: ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thƣờng kém bền nên
chuyển diện tích lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng
mạch polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-emzyme
mới.
Phản ứng 3: với sự có mặt của nƣớc sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C
còn lại và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease.
2.2.3 Protease của tôm sú
Các protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B,
trypsine, chymotrypsine, cathepsin và collagenase (Hernandez–Cortes et al.,
1997)

Protease của tôm cũng nhƣ của các loài động vật thuỷ sản khác là các
protease nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó là nội tạng và cơ
thịt. Đặc biệt là ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ
enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu, sau đó đến các cơ quan khác.
Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsine hoặc protease
serine dạng trypsine và có khả năng hoạt động rất cao.
Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở
vùng trung tính pH 7 và giảm dần khi pH tăng trong vùng pH kiềm. Điều này phù
hợp với đặc điểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động trong môi
trƣờng acid (Baranowski et al. 1984).
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) cùng cộng tác
viên về protease đầu tôm biển cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các
enzyme hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng (1999)
thì protease từ tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trƣờng gần trung tính. Nhƣ
vậy, qua nghiên cứu của một số tác giả cho thấy, enzyme từ tôm nói chung là các
protease kiềm tính.
2.2.4 Sự thủy phân protein từ đầu tôm
Xu hƣớng sử dụng phụ phẩm tôm bằng cách thu hồi protein làm tăng giá trị
của các thành phần trong phụ phẩm. Protein thu hồi theo hình thức thủy phân có
thể đƣợc sử dụng nhƣ là chất mùi và đƣợc đƣa vào các loại thực phẩm có nguồn
gốc từ cá, thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản hoặc nguồn nitơ trong môi trƣờng cho
sự phát triển của các vi sinh vật (Cavalheiro et al., 2007). Ngoài ra, sản phẩm sau
thủy phân là nguồn peptide có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể
trong dƣợc phẩm (Gildberg and Stenberg, 2001).
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm tạo ra sản phẩm giá trị gia tăng
từ phế liệu trong chế biến tôm, bao gồm cả việc chiết xuất chitin sản xuất thủy
phân protein để sử dụng trong thực phẩm và thức ăn gia súc (Coward - Kelly et
al., 2006). Khả năng sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng thông qua
quá trình thủy phân phụ phẩm và phế liệu tôm cũng đang đƣợc nghiên cứu.
Thủy phân protein thƣờng phải đƣợc phân đoạn để có đƣợc những peptide
với chức năng cao hơn hoặc nâng cao giá trị dinh dƣỡng ở dạng tinh khiết hơn.
Trọng lƣợng phân tử của protein thủy phân là một trong những yếu tố quan trọng
nhất trong sản xuất thủy phân protein với các thuộc tính chức năng mong muốn
sử dụng chức năng của nguyên liệu. Thủy phân protein đƣợc sử dụng rộng rãi
trong sản xuất các chế phẩm sinh học, giống khởi đầu và các sản phẩm lên men.

2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme
protease
2.3.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng
độ cơ chất. Khi tăng nồng độ cơ chất, cơ hội cơ chất gặp đƣợc enzyme nhiều thì
tốc độ phản ứng tăng theo. Tuy nhiên sự liên hệ này chỉ giới hạn đến mức nào đó,
nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng hoặc ức
chế ngƣợc lại hoạt động xúc tác của enzyme.
Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng nhƣ với từng cơ chất,
nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng. Vì
vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những
điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme.
Vmax
O
Km [S]
Hình 2.4: Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng thủy phân của enzyme
(Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004)
2.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện dƣ thừa cơ chất, nghĩa là [S] >> [E] thì nồng độ enzyme
tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật
lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen. Nhìn chung tốc độ phản
ứng phụ thuộc tuyến tính với lƣợng enzyme. Nhƣng nếu tăng nồng độ enzyme
quá lớn, vận tốc phản ứng chậm.
Tốc độ phản ứng V=K[E] có dạng y=ax. Ngƣời ta đã đo [E] bằng cách đo
vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác.
Có nhiều trƣờng hợp trong môi trƣờng có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa
thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.

Hình 2.5: Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân enzyme
2.3.3 Ảnh hƣởng của pH
Giá trị pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân
vì nó ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của
protein – enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 5÷9, độ bền của enzyme
có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền nhƣ: cơ chất, coenzyme, Ca2+
…
Giá trị pH tối ƣu là khác nhau cho mỗi loại enzyme, giá trị này không cố
định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt
độ… Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhƣng cũng có
một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật,…)
hoặc khá cao nhƣ subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10.
Enzyme bị ảnh hƣởng bởi sự thay đổi pH. Giá trị pH giảm thấp hay quá cao
ngoài điểm tối ƣu thì tốc độ phản ứng thƣờng giảm nhanh và hoạt tính của hầu
hết enzyme giảm một phần hay hoàn toàn, có thể do enzyme bị biến tính hay bị
phân ly một cofactor quan trọng nào đó (Mai Xuân Lƣơng, 2005). Tại điểm đẳng
điện, enzyme bị biến tính dẫn đến không còn hoạt tính sinh học. Nếu có biện
pháp làm cho enzyme hòa tan trở lại thì khả năng hồi phục mt phần hoạt tính tối
đa của enzyme là có thể.
Thông qua nghiên cứu sự phụ thuộc vận tốc phản ứng của enzyme và pH
môi trƣờng có thể xác định đƣợc nhóm chức nào của phân tử enzyme đã tham
gia quá trình xúc tác. Vì các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme chỉ
có thể kết hợp với cơ chất khi ở trạng thái ion hóa thích hợp nhất định.
2.3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Ở khoảng
nhiệt độ 0÷41°C, vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc
này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng. Tuy nhiên, tốc độ phản

ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ
phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức
nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả
năng phục hồi lại hoạt tính. Hơn thế nữa, đa số enzyme bị mất hoạt tính ở
80÷100°C và một số enzyme bị mất hoạt tính ở chế độ cấp đông. Do đó, Nguyễn
Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011) cho rằng nên tồn trữ enzyme ở nhiệt
độ dƣới 5ºC. Bên cạnh đó, nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất
nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trƣờng.
Hình 2.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân enzyme
2.3.5 Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài
hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,…
Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo
thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân
đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích
hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lƣợng sản phẩm tốt.
Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh
nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể (Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2004).
2.3.6 Ảnh hƣởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái
không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh
hơn.
Các chất hoạt hóa thƣờng có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể
là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn
Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hydro,

các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phần tử tiền enzyme, các chất
có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme.
2.3.7 Ảnh hƣởng của chất kìm hãm
Chất kìm hãm (modulator) là chất có khả năng kết hợp với enzyme làm
giảm hoặc làm chấm dứt hoàn toàn hoạt động xúc tác của enzyme. Các chất kìm
hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ
hoặc protein.
Chất ức chế (inhibitor) là một chất kìm hãm mà chúng làm giảm hoạt tính
của enzyme. Các chất ức chế có khả năng ức chế thuận nghịch hoặc không thuận
nghịch. Trong ức chế thuận nghịch ta có thể phân biệt hai dạng ức chế cạnh tranh
và không cạnh tranh.
2.4 Tổng quan về enzyme alcalase
Alcalase là enzyme có đặc tính thủy phân protein, đƣợc sản xuất từ quá
trình lên men chìm (SmF) Bacillus lichenniformis.
Tính chất cơ bản của alcalase đƣợc tổng hợp ở Bảng 2.3
Bảng 2.3: Tính chất của alcalase
Tên thƣơng mại Alcalase
Tên chung Subtilisin Carlsberg
Nhóm xúc tác Endopeptidase
Bản chất của vị trí xúc tác Serine
Hoạt tính 2,4 AU-A/g
Điểm đẳng điện pI = 9,4
Hệ số lắng S20
Tỷ trọng chất lỏng 1,25 g / ml
Ức chế bởi:
DFP and PMSF(1) +
EDTA(2)& phosphate 0
Chất ức chế trypsine trong đậu nành 0
Vị trí liên kết của chuỗi insulin (B-chain of 4-5, 9-10, 11-12, 15-16, 26-27
insulin(3)) chịu sự tác động của protease
Khối lƣợng phân tử 27.300
(1):DFP= Di-isopropyl fluorophosphate; PMSF= Phenylmethylsulphonylfluoride
(2):EDTA = Ethylenediamine tetra-acetic acid
(3):NH2-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-CySO3H-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-
CySO3H-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-
(Nguồn: Johansen et al., 1968, trích dẫn bởi Novozymes, 2001)
Alcalase 2,4L có hoạt tính riêng là 2,4 AU/g (đơn vị Anson) và dễ tan trong
nƣớc ở tất cả các nồng độ. Thành phần chính của enzyme này là subtilisin A
thuộc nhóm serine S8 endopeptidase. Alcalase có tính đặc hiệu rộng, thủy phân

nhiều loại liên kết peptide cũng nhƣ các liên kết ester, nhất là những liên kết
đƣợc tạo thành từ các amino acid thơm. Hơn thế nữa, một số triglyceride cũng có
thể bị thủy phân nhƣ tripropionin và tributyrin.
Điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme này đƣợc dao động trong
khoảng 55÷70ºC tùy thuộc vào loại cơ chất và nhiệt độ tối ƣu của nó khoảng
60ºC, đồng thời pH tối ƣu cho hoạt động của alcalase dao động trong khoảng
6,5÷8,5. Theo Cao et al. (2011) điều kiện nhiệt độ và pH môi trƣờng tối ƣu cho
quá trình thủy phân protein bằng alcalase là 60ºC, pH 7,0. Tuy nhiên, enzyme sẽ
hoạt động kém khi hàm lƣợng muối tƣơng đƣơng 5% khối lƣợng nguyên liệu
(Phạm Khánh Phƣơng, 2013).
Đồ thị xác định giá trị nhiệt độ và pH tối thích cho hoạt động của alcalase
trên cơ chất là hemoglobin đƣợc thể hiện ở Hình 2.7.
Hình 2.7: Ảnh hƣởng của pH (a) và nhiệt độ (b) lên hoạt động của alcalase
(Nguồn: Neidhart and Petsko, 1988)
Enzyme này cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tiến hành đơn giản
do hoạt động trong môi trƣờng pH kiềm tự nhiên của đầu tôm. Chọn enzyme này
cũng dựa trên đặc tính của nó cho khả năng không hút nƣớc của các acid amin
vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler Nissen,
1986) đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu
(Kristinsson and Rasco, 2000).
Tuy vậy, Alcalase 2,4L dễ bị ảnh hƣởng bởi nhiệt. Tất cả protease có thể bị
bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 90C trong 10-20 phút; trong vòng 10-15 phút ở
85ºC hoặc cao hơn khi pH là 8 (Johansen et al., 1968, trích dẫn bởi Novozymes,

2001). Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ tức thời khó đạt đƣợc dƣới các điều kiện
công nghiệp, hơn nữa khó kiểm soát hiệu suất thủy phân protein do sự thủy phân
có thể vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt (Adler Nissen, 1986). Bên cạnh
đó, phản ứng thủy phân có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích
hợp nhƣ acid acetic, lactic, hydrochloric...
Hoạt tính của enzyme alcalase bị kìm hãm bởi các chất phản ứng: 3,4-DCI,
DFP, PMSF,… Giống nhƣ các serine protease khác, Ca2+
không ảnh hƣởng đến
độ bền của enzyme này (Zuidweg et al., 1972).
Enzyme dần mất đi hoạt tính theo thời gian tùy thuộc vào nhiệt độ bảo
quản. Điều kiện bảo quản mát đƣợc khuyến khích duy trì. Khi bảo quản ở 2÷8C,
nó duy trì hoạt tính ổn định ít nhất một năm kể từ ngày sản xuất và duy trì hoạt
tính ít nhất 3 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ 25C. Vì vậy, Neidhart and Petsko
(1988) đã đề nghị nhiệt độ bảo quản tốt nhất 0÷10C.
2.5 Các nghiên cứu có liên quan
Nghiên cứu thủy phân protein theo con đƣờng enzyme đã đƣợc quan tâm từ
rất sớm không chỉ ở các nƣớc trên thế giới mà ngay cả ở Việt Nam. Để thu nhận
chế phẩm acid amin, các nghiên cứu thủy phân protein từ các nguyên liệu khác
nhau đã đƣợc thực hiện với mục đích ứng dụng đa dạng, từ các nghiên cứu
truyền thống thủy phân protein trong sản xuất nƣớc mắm, nƣớc tƣơng (Trần Thị
Luyến, 1996) đến các nghiên cứu thủy phân protein với mục tiêu xử lý chất thải
hay tạo là công đoạn tiền xử lý nguyên liệu cho các quá trình chế biến tiếp theo.
Để cải tiến quy trình sản xuất nƣớc mắm, Phạm Khánh Phƣơng (2013) đã nghiên
cứu ứng dụng phƣơng pháp enzyme, cụ thể là bổ sung 0,06% alcalase và 0,06%
flavourzyme vào quy trình sản xuất, giúp tăng phản ứng thủy phân protein cá, rút
ngắn thời gian sản xuất nƣớc mắm và hàm lƣợng đạm thu đƣợc cao. Ngô Yến
Thủy (2012) đã ứng dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng trên đầu tôm thẻ chân
trắng để tối ƣu quá trình khử protein bằng alcalase.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu thủy phân protein từ các nguồn
nguyên liệu thịt và thủy sản khác nhau tạo nhóm sản phẩm thực phẩm chức năng
hay thu hồi protein từ các phụ phẩm nhằm đáp ứng yêu cầu chế biến thực phẩm
đang đƣợc quan tâm. Trần Thị Hồng Nghi và ctv (2009) đã nghiên cứu tìm điều
kiện tốt nhất cho việc thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra (đầu, xƣơng, vây,
đuôi, nội tạng và cả mỡ cá) bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis,
sau đó thử nghiệm sản xuất nƣớc mắm từ nguồn dịch đạm thu hồi đƣợc. Nguyễn
Thị Mỹ Hƣơng (2012) cũng đã đề xuất các thông số kỹ thuật thích hợp giúp gia
tăng hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme protamex
0,5% là nhiệt độ thủy phân 45°C trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ

nƣớc/nguyên liệu là 1:1, áp dụng điều kiện pH tự nhiên cho kết quả độ thủy phân
và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tăng lên cùng với sự tăng thời gian
thủy phân. Lý Thị Minh Phƣơng (2013) đã công bố khả năng sản xuất dịch chiết
protein từ thịt hàu do tác động của việc bổ sung enzyme ngoại bào. Trang Sĩ
Trung và ctv (2007) đã nghiên cứu kết hợp sử dụng protease trong sản xuất chitin
từ phế liệu tôm. Đến năm 2012, Trang Sĩ Trung và Phạm Thị Đan Phƣợng tiếp
tục nghiên cứu sản xuất và so sánh tính chất của chitin và chitosan chiết rút từ vỏ
tôm thẻ chân trắng (Penaeus vanamei) đƣợc khử protein bằng phƣơng pháp hóa
học và sinh học. Kết quả cho thấy khi sử dụng flavourzyme với tỷ lệ
enzyme:nguyên liệu là 0,2% (w/w) cho độ nhớt cao hơn so với chitin đƣợc khử
protein bằng NaOH 5%, tỷ lệ 1:5 (w/v). Ngô Thị Hoài Dƣơng và ctv (2013) vừa
công bố nghiên cứu thành công khả năng sử dụng enzyme pepsin để khử protein
kết hợp đồng thời với quá trình khử khoáng từ vỏ tôm thẻ chân trắng, qua đó rút
ngắn rút ngắn thời gian và giảm thiểu lƣợng hóa chất trong sản xuất chitin, đồng
thời sử dụng phƣơng pháp mặt đáp ứng để xác định điều kiện xử lý tối ƣu. Phạm
Thị Đan Phƣợng và Trang Sĩ Trung (2014) vừa công bố nghiên cứu tận dụng bã
đầu tôm từ quá trình chế biến bột đạm giàu carotenoid bằng phƣơng pháp kết
hợp hai enzyme protease nhằm thu hồi chitin và chitosan.
Ở ngoài nƣớc, các nghiên cứu thủy phân protein đã tiến hành rất sớm.
Ooshira et al. (1982) đã sử dụng protease thực vật từ dứa (bromelain) và đu đủ
(papain) với mục đích thúc đẩy quá trình lên men nƣớc mắm. Theo Salem et al.
(1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và
bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất
nƣớc mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả
cho thấy với 0,3% papain cho hàm lƣợng đạm tổng số cao nhất so với các
enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so
với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Nielsen (2001) nghiên cứu thủy
phân protein từ một loại tôm và đề xuất cải tiến phƣơng pháp xác định mức độ
thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Nghiên cứu của
Randriamahatody et al. (2011) còn xác định chi tiết có 14÷15 acid amin đƣợc
tìm thấy khi thủy phân protein từ đầu tôm bởi enzyme protease có tính kiềm hoặc
acid. Nhìn chung, các nghiên cứu thủy phân protein bằng phƣơng pháp enzyme
dựa trên việc bổ sung enzyme ngoại bào là chủ yếu.
Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng
enzyme alcalase nhằm tăng hiệu suất thủy phân và rút ngắn thời gian thủy phân
đƣợc tiến hành.

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm
Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại
phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học
ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ 8/8/2014 đến tháng 30/11/2014.
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g, Nhật.
- Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật.
- Máy ly tâm lạnh Hermle Labortechnik GmbH Siemensstr. 25 D-78564
Type: Z323K, Đức.
- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1o
C, Ý.
- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý.
- Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật).
- Máy khuấy từ nhiệt, model AHYQ 78-1, Trung Quốc
- Tủ đông Toshiba, model GR-45G-XS (Nhật), nhiệt độ ngăn đông
-40÷-50C.
- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ tủ từ -18÷-
25°C, Nhật.
- Bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chỉnh đến cận 100°C, độ chính xác
0,1°C).
- Máy xay sinh tố Big Sar Model PP179, 3 tốc độ, từ 2000 vòng/phút (rpm)
đến 4000 rpm.
- Máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc).
- Micropipet 1.000L (Isolab, Đức).
- Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm và một số dụng cụ khác có
liên quan.
3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm
- Chế phẩm protease thƣơng mại: Alcalase 2.4 L FG (subtilisin, hoạt tính
2,4 AU/g protein, nguồn gốc từ quá trình lên men chìm Bacilus
licheniformis, Novozyme, Đan Mạch).
- Glycine, độ tinh khiết 99,5%, Trung Quốc.
- Sodium hydroxide (NaOH), độ tinh khiết 99,5%, Trung Quốc.

- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), độ tinh
khiết 99%, Trung Quốc.
- Sodium dihydrogen phosphate, dihydrate (NaH2PO4.2H2O), độ tinh khiết
99%, Trung Quốc.
- Dodecyl sodium sulfate (SDS), độ tinh khiết 85%, Trung Quốc.
- Disodium tetraborate decahydrate (Na2B4O7.10H2O), độ tinh khiết
99,5%, Trung Quốc
- 1,4-Dithiothreitol (DTT) xuất xứ Canada
- O-Phthalaldehyde (OPA), độ tinh khiết 97%, Trung Quốc
- Các hóa chất có liên quan khác.
Tất cả các hóa chất đƣợc cung cấp bởi Công ty Trách nhiệm Hữu hạn
Thiết bị - Hóa chất Khoa học Kỹ thuật An Khánh (43, đƣờng 14, Khu tái định cƣ
Thới Nhựt, Phƣờng An Khánh, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ); enzyme
alcalase đƣợc nhập khẩu và phân phối bởi công ty Trách nhiệm Hữu hạn và
Thƣơng mại Phúc Hƣng (Phutraco, 364/37 Thoại Ngọc Hầu, Phƣờng Phú
Thạnh, Quận Tân Phú, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam).
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
Thịt đầu tôm sú (đã đƣợc tách sẵn phần thịt ở vị trí ngay đỉnh đầu, bỏ phần
chân hàm, chân ngực, râu và vỏ đầu ngực, chùy) đƣợc thu mua ở huyện Thới
Bình, tỉnh Cà Mau (bảo đảm mẫu đƣợc giữ lạnh ở nhiệt độ dƣới 4ºC và thời gian
tối đa 12 giờ từ công đoạn tách đầu đến khi thu nhận thịt đầu tôm). Nguyên liệu
đƣợc chứa trong các bao PE (2 lớp), cột chặt miệng bao và bảo quản trong thùng
xốp ở nhiệt độ từ 0÷4ºC bằng nƣớc đá, sau đó đem về phòng thí nghiệm bộ môn
Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa là 5
giờ. Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, đóng
gói với mỗi mẫu tiền xử lý có khối lƣợng 200 g và cấp đông ở nhiệt độ -40÷ -
45ºC (đảm bảo tâm nguyên liệu đạt -18ºC, thời gian trung bình 50-60 phút). Tiến
hành trữ đông ở nhiệt độ -18±2C trong suốt thời gian sử dụng (tối đa 6 tuần/đợt
mẫu).
3.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc kết quả
Các chỉ tiêu cơ bản đƣợc phân tích và đo đạc theo các phƣơng pháp tiêu
chuẩn đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Phƣơng pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Phƣơng pháp
pH Sử dụng pH kế, theo ISO 2917:1999 (E)
Độ ẩm (%) Sấy 105C đến khối lƣợng không đổi (AOAC 934.06)
Đạm tổng số (%) Phƣơng pháp Kjeldahl, TCVN 8125:2009
Hiệu suất thủy phân (%) Phƣơng pháp OPA (Nielsen et al., 2001)
Hoạt tính protease (UI/mL) Phƣơng pháp Anson cải tiến (1938)
3.2.3 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả
Khối lƣợng mỗi đơn vị thí nghiệm khoảng 200 g.
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Kết quả của thí
nghiệm trƣớc đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm kế tiếp. Số liệu
đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 16.1,
phần mềm Excel. Phân tích phƣơng sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận
về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.

3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu thịt đầu tôm sú
Xử lý sơ bộ
(rửa, loại tạp chất, để ráo)
Cấp đông nhanh
(Nhiệt độ tủ -40÷-45C, 50-60 phút)
Trữ đông (-18C)
Xay nhuyễn Phân tích thành phần nguyên liệu
Thí nghiệm 2: pH môi trƣờng
Thí nghiệm 1
Có/Không có bổ sung
Thủy phân
alcalase
Thí nghiệm 3: Nhiệt độ thủy phân (tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 1:1,v/w)
Thí nghiệm 5: Thời gian thủy phân Thí nghiệm 4
Vô hoạt enzyme Tỷ lệ enzyme : nguyên liệu
(90C, 20 phút)
(v/w)
Lọc
Ly tâm
(4C, 10000 rpm, 20 phút)
Bã bỏ Dịch trong
Xác định hiệu suất thủy phân
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
3.3.2 Xác định thành phần cơ bản của nguyên liệu thịt đầu tôm sú và hoạt
tính enzyme alcalase
3.3.2.1 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu thịt đầu tôm sú
Mục đích: Xác định đặc tính cơ bản của thịt đầu tôm sú ban đầu (độ ẩm,
hàm lƣợng protein), giá trị pH và hoạt tính protease có trong nguyên liệu, làm cơ
sở cho việc chuẩn bị nguồn nguyên liệu đồng đều đối với các khảo sát liên quan
đến hiệu quả thủy phân protein.

Cách tiến hành:
- Nguyên liệu thịt đầu tôm ở mỗi đợt thu mẫu đƣợc xử lý sơ bộ, để ráo
nƣớc và xay nhuyễn. Lấy ngẫu nhiên 200 g/mẫu đã xay nhuyễn (đối với 1 lần lặp
lại thí nghiệm) để tiến hành phân tích các thành phần cơ bản, bao gồm độ ẩm,
protein tổng số, pH và hoạt tính theo phƣơng pháp trình bày ở Bảng 3.1.
- Hoạt tính protease có trong nguyên liệu ban đầu đƣợc xác định sau quá
trình trích ly protease dựa trên kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lệ Hà (2011):
Thịt đầu tôm sú đông lạnh đƣợc phối trộn với nƣớc (đã đƣợc làm lạnh đến
2÷4C) theo tỷ lệ 1:3. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc nghiền xay trong thời gian 3 phút
để phá vỡ cấu trúc trƣớc khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu. Trong quá trình
nghiền, nhiệt độ không vƣợt quá 5C.
Sau khi nghiền, mẫu đƣợc đổ vào cốc thủy tinh, ủ ở điều kiện nhiệt độ và
thời gian khác nhau để chiết rút enzyme. Chú ý khuấy đảo mẫu 5 phút/lần. Dịch
chiết thu đƣợc bằng cách cho vải lọc có lỗ với kích thƣớc 1mm x 1mm để loại
lƣợng lớn phần chất khô không hòa tan (bã tôm), sau đó làm lạnh (bằng cách cho
dịch sau lọc vào tủ đông) trong 15 phút trƣớc khi chuyển sang ly tâm tốc độ
10000 vòng/phút (rpm) trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ 4C để loại bỏ phần
cặn, thu dịch chiết, gọi là dịch chiết protease thô, sử dụng để xác định hoạt tính.
Quá trình phân tích đƣợc thực hiện 3 lần lặp lại ứng với một chỉ tiêu khảo
sát.
Kết quả thu nhận: Đánh giá đặc điểm, thành phần của nguồn nguyên liệu
thịt đầu tôm sú (độ ẩm, giá trị pH, đạm tổng số ban đầu và hoạt tính protease nội
bào có trong nguyên liệu)
3.3.2.2 Xác định hoạt tính protease của chế phẩm alcalase thƣơng mại
Hoạt tính protease (UI/mL) của chế phẩm alcalase thƣơng mại đƣợc xác
định theo phƣơng pháp Anson cải tiến. Đây chính là cơ sở để dự đoán nồng độ
enzyme bổ sung tƣơng ứng vào quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú.
3.3.3 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung alcalase đến hiệu
suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú
Mục đích: So sánh, đánh giá vai trò của việc bổ sung chế phẩm alcalase
thƣơng mại đến quá trình thủy phân protein có trong thịt đầu tôm sú.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố A: Phƣơng thức thủy phân protein
A1: Thủy phân bằng protease nội bào
A2: Bổ sung 0,5% alcalase (so với khối lƣợng nguyên liệu)
Cố định tỉ lệ khối lƣợng nguyên liệu : dung môi ở giá trị 1:1 (w/v, g/mL),
thời gian thủy phân là 2 giờ (Adler Nissen, 1986), và nhiệt độ thủy phân 60C
(khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của protease, Neidhart and Petsko,
1988).
Số nghiệm thức: 2 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 2 nghiệm thức x 3 = 6 mẫu
Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 200 g.
Khối lƣợng mẫu sử dụng: 6 x 0,2 kg/mẫu = 1,2 kg
Tiến hành thí nghiệm:
Nguyên liệu thịt đầu tôm sú đƣợc tiến hành xay nhuyễn ngay bằng máy xay
sinh tố sau khi lấy ra từ tủ đông.
Cho 200 g mẫu đã xay mịn vào cốc thủy tinh 500mL và bổ sung 200 mL
nƣớc cất (tỉ lệ 1:1, v/w so với nguyên liệu). Đối với mẫu có sử dụng enzyme
thƣơng mại, bổ sung thêm 1 mL chế phẩm alcalase. Tiến hành thủy phân với
nhiệt độ cố định là 60°C và thời gian thủy phân cố định 2 giờ, khuấy đảo liên tục
bằng máy khuấy từ trong suốt quá trình thủy phân. Vô hoạt ngay enzyme ở 90ºC
trong thời gian 20 phút khi kết thúc quá trình thủy phân. Tiến hành lọc và ly tâm
lạnh ở 4ºC (tốc độ 10000 rpm, 20 phút) để thu dịch thủy phân. Ứng với từng
nghiệm thức khảo sát, tiến hành xác định hiệu suất thủy phân protein bằng
phƣơng pháp OPA.
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thủy phân protein (%)
Kết quả thu nhận: Xác định ảnh hƣởng của việc bổ sung chế phẩm alcalase
đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú.
3.3.4 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu quả thủy phân
protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase
Mục đích: Xác định đƣợc pH môi trƣờng thích hợp nhất giúp quá trình thủy
phân protein có trong thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase đạt hiệu quả tốt nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố B: pH của dung môi sử dụng để thủy phân protein, thay đổi theo 4
mức độ
B1: pH = 6 B2: pH = 7
B3: pH = 8 B4: pH = 9
Mẫu đối chứng (B0): sử dụng dung môi là nƣớc cất, có bổ sung alcalase
Cố định tỉ lệ khối lƣợng nguyên liệu:dung môi ở giá trị 1:1 (w/v, g/mL),
thời gian thủy phân là 2 giờ, tỉ lệ alcalase sử dụng là 0,5%, v/w (1 mL dịch
alcalase trong 200 g nguyên liệu) và nhiệt độ thủy phân 60C.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở Hình 3.2
Thịt đầu tôm sú
Cấp đông, trữ đông
Xay nhuyễn
Bổ sung alcalase trong các dung dịch đệm pH khác nhau
(Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch đệm = 1:1, g/mL)
B0 B
B2 B3
B
1 4
Thủy phân
(60C, 2 giờ)
Vô hoạt enzyme
(90C, 20 phút)
Lọc
Ly tâm
(4C, 10000 rpm, 20 phút)
Dịch lọc
Xác định hiệu suất protein thủy phân
Chọn ra giá trị pH thủy phân tối ƣu
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2

Ứng với mỗi nghiệm thức là một mẫu thử, lặp lại 3 lần
Số nghiệm thức: 1+4 = 5 nghiệm thức
Tiến hành thí nghiệm:
Nguyên liệu thịt đầu tôm sú cũng đƣợc xay nhuyễn ngay bằng máy xay sinh
tố sau khi lấy ra từ tủ đông.
Chuẩn bị 200 mL dung dịch đệm có pH khảo sát (pH 6, pH 7 và pH 8 sử
dụng đệm phosphate, pH 9 sử dụng đệm glycine NaOH), bổ sung 1 mL dung
dịch chế phẩm alcalase (tƣơng ứng tỉ lệ 0,5%). Sử dụng nƣớc cất ở mẫu đối
chứng (có và không có bổ sung alcalase).
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 1. Ứng với từng
nghiệm thức khảo sát, tiến hành xác định hiệu suất thủy phân protein bằng
phƣơng pháp OPA.
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thủy phân protein (%)
Kết quả thu nhận: Xác định điều kiện pH thích hợp giúp hiệu suất thủy
phân protein bằng enzyme alcalase đạt cao nhất.
3.3.5 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thủy
phân protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme alcalase
Mục đích: Xác định đƣợc nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất giúp tăng hiệu
suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme alcalase.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố.
Nhân tố C: Nhiệt độ thủy phân (C), thay đổi với 4 mức khảo sát
C1: 30 C3: 50
C2: 40 C4: 60
Tỉ lệ
thủy phân
trong 200
nguyên liệu và dung môi cố định ở giá trị 1:1 (w/v, g/mL), thời gian là
2 giờ, nồng độ alcalase sử dụng là 0,5%, v/w (1 mL dịch alcalase g
nguyên liệu).
Loại dung dịch đệm sử dụng đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 2.

Tiến hành thí nghiệm: Khảo sát đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 1,
tuy nhiên pH môi trƣờng đƣợc chọn dựa trên kết quả của thí nghiệm 2, nhiệt độ
thủy phân thay đổi theo các mức độ khảo sát.
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất thủy phân protein (%).
Kết quả thu nhận: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để quá trình thủy
phân protein bằng enzyme alcalase đạt cao nhất.
3.3.6 Thí nghiệm 4: Xác định tỉ lệ enzyme alcalase thích hợp đến hiệu suất
thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú
Mục đích: Xác định tỉ lệ enzyme alcalase bổ sung thích hợp cho quá trình
thủy phân đạt hiệu suất cao.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố D: tỉ lệ enzyme alcalase bổ sung (%, v/w)
D1: 0,5% D2: 2,0% D3: 1,0%
D4: 2,5% D5: 1,5% D6: 3,0%
Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi cố định ở giá trị 1:1 (w/v, g/mL)
Tiến hành thí nghiệm: Khảo sát đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 2
và 3 nhƣng pH môi trƣờng và nhiệt độ thủy phân đƣợc chọn dựa trên kết quả tối
ƣu của thí nghiệm 2 và 3. Tuy nhiên, nồng độ enzyme alcalase bổ sung thay đổi
ở 6 mức độ khảo sát.
Kết quả thu nhận: Tỉ lệ enzyme alcalase bổ sung thích hợp giúp hiệu suất
thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú đạt cao nhất.

3.3.7 Thí nghiệm 5: Xác định thời gian thủy phân thích hợp đến hiệu suất
thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme alcalase
Mục đích: Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân
protein từ thịt đầu tôm sú bằng chế phẩm alcalase đạt hiệu suất cao.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 1 nhân tố
Nhân tố E: Thời gian thủy phân, thay đổi 6 mức độ
E1: 1 giờ E4: 4 giờ
Số nghiệm thức khảo sát: 6 nghiệm thức
Số mẫu khảo sát: 6 x 3 = 18 mẫu
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc thực hiện dựa trên kết quả tối ƣu
của thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Tuy nhiên, thời gian thủy phân thay đổi ở 6 mức độ
khảo sát.
Kết quả thu nhận: Thời gian thủy phân thích hợp cho hiệu quả thủy phân
protein từ thịt đầu tôm sú bằng chế phẩm alcalase đạt tốt nhất.

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu thịt đầu tôm sú và hoạt
tính enzyme alcalase
Việc xác định các đặc điểm hóa lý ban đầu của thịt đầu tôm sú là cơ sở cho
việc chuẩn bị nguồn nguyên liệu đồng đều đối với các khảo sát hiệu quả thủy
phân protein tiếp theo. Chính vì vậy, giá trị độ ẩm, hàm lƣợng đạm tổng số, pH
ban đầu của nguyên liệu và hoạt tính alcalase bổ sung là các thông số cơ bản
đƣợc quan tâm.
Bảng 4.1: Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú và hoạt tính protease của chế
phẩm alcalase thƣơng mại
Chỉ tiêu Giá trị (*)
Độ ẩm (%) 85,42±0,69
Đạm tổng số (%):
Nguyên liệu thịt đầu tôm sú - theo căn bản ƣớt (cbƣ) 12,62±0,31
- theo căn bản khô (cbk) 86,75±6,24
pH 7,70±0,17
Hoạt tính protease (UI/g cknl**) 1,03±0,12**
Alcalase 2.4 L FG Hoạt tính protease (UI/ mL) 390,71±5,70
*Kết quả của 5 lần lấy mẫu, 3 lần lặp lại/mẫu và độ lệch chuẩn giữa các mẫu phân tích so với
giá trị trung bình, ** là kết quả của quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú ban đầu trước
khi cho vào bảo quản lạnh đông trong điều kiện: tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 3; dung môi ngâm
trích ly được sử dụng là nước cất 2 lần (pH=7); nhiệt độ phòng 30°C và kết hợp thời gian ngâm
30 phút.
Từ kết quả khảo sát cho thấy, nguồn nguyên liệu thịt đầu tôm sú sử dụng có
chất lƣợng ổn định, mức dao động về thành phần hóa lý ở 5 lần lấy mẫu ít. Điều
này có lẽ là do nguyên liệu đƣợc lấy cùng một điểm thu mua, đồng thời nguồn
con giống, điều kiện thức ăn cho tôm, phƣơng thức nuôi tôm ở khu vực đồng
bằng sông Cửu Long cũng tƣơng đồng (VASEP, 2014).
Kết quả phân tích cho thấy, thịt đầu tôm sú là nguồn nguyên liệu có hàm lƣợng
đạm khá cao (trung bình 12,62%, tính theo căn bản ƣớt và hơn 80% hàm lƣợng chất
khô trong nguyên liệu). So sánh với nghiên cứu trƣớc đó của Huỳnh Văn Nguyên
(2011), hàm lƣợng đạm tổng số trong nguồn nguyên liệu này cũng đạt giá trị xấp xỉ
- khoảng 83,72±3,14% (tính theo căn bản khô). Tuy nhiên, thịt đầu tôm sú này có
giá trị pH khá cao (trung bình 7,7), chứng tỏ nguyên liệu kém tƣơi. Thực tế khảo sát
cho thấy, trong quá trình sản xuất tôm sú đông lạnh tại các nhà máy sản xuất ở Thới
Bình (Cà Mau), chỉ có thành phẩm là thân tôm sú mới đƣợc chú ý kiểm soát nhiệt
độ trong toàn tiến trình chế biến. Đầu tôm sú phần lớn chỉ đƣợc ƣớp đá, đổ xõa và
sau mỗi ca sản xuất sẽ bán lại cho các thƣơng lái. Việc phân tách thịt đầu tôm sú và
vỏ tôm sú chỉ đƣợc thực hiện ở các phân xƣởng

phụ. Chính thời gian xử lý dài (thịt đầu tôm sú chỉ đƣợc thu mua lại từ thƣơng
lái trong khoảng 12÷15 giờ) cùng thời gian vận chuyển từ Cà Mau về đến Cần
Thơ khoảng 5 giờ chính là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi sinh hóa sau khi chết
của tôm sú xảy ra nhanh, đặc biệt với nguồn liệu thịt đầu tôm sú chứa các nội
tạng, gạch tôm sú là môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển (Seaqip,
2006). Chính vì vậy, việc nghiên cứu xác định các điều kiện thủy phân thích hợp
tạo dịch thủy phân protein có khả năng sử dụng trong chế biến thực phẩm là vấn
đề đầu tiên cần đƣợc quan tâm khảo sát.
Ngoài ra, kết quả khảo sát cũng cho thấy, chế phẩm alcalase thƣơng mại
(Alcalase 2.4 L FG, Novozymes) có hoạt tính rất cao (hơn 390 UI/mL dung
dịch enzyme). Điều này hứa hẹn việc bổ sung chế phẩm enzyme thƣơng mại
(trƣờng hợp khảo sát là alcalase) sẽ giúp nâng cao hiệu suất cũng nhƣ chất
lƣợng của dịch thủy phân.
4.2. Tác động của việc bổ sung alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ
thịt đầu tôm sú
Nghiên cứu tác động của việc bổ sung chế phẩm alcalase thƣơng mại
trong quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú đã khẳng định hiệu quả vƣợt
trội khi so sánh với quá trình tự thủy phân bằng protease nội bào. Kết quả đƣợc
thể hiện ở đồ thị Hình 4.1.
Hình 4.1 Đồ thị so sánh hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng enzyme nội
bào và bổ sung chế phẩm alcalase thƣơng mại
Kết quả khảo sát cho thấy, sự hiện diện của protease nội bào (1,03 UI/g
CKNL hay 30,03 UI/200g thịt đầu tôm sú) cũng có thể thúc đẩy quá trình tự thủy
phân của protein. Tuy nhiên, hiệu suất thủy phân đạt đƣợc rất thấp (0,72±0,13%)

khi so sánh với quá trình thủy phân có bổ sung 0,5% chế phẩm alcalase
(7,85±0,67%). Điều này cho thấy, với việc bổ sung 1 mL chế phẩm alcalase vào
quá trình thủy phân 200 g nguyên liệu đã thêm vào môi trƣờng thủy phân
390,71±5,70 UI protease, nhiều gấp 13 lần hoạt tính protease nội bào, nhờ đó
thúc đẩy hiệu suất thủy phân protein tăng gần 11 lần.
Các nghiên cứu trƣớc đó cũng cho thấy triển vọng của việc thủy phân
protein bằng protease nội tại, tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dài, thậm chí đến
18 giờ (Nielsen, 2001). Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh mùi,
dịch thủy phân không thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho thực phẩm. Điều
này cho thấy sự cần thiết của việc bổ sung enzyme ngoại bào vào quá trình thủy
phân protein từ thịt đầu tôm sú, tuy nhiên các điều kiện thích hợp giúp nâng cao
hiệu quả hoạt động của chế phẩm alcalase sử dụng cần phải đƣợc nghiên cứu một
cách tỉ mỉ.
4.3 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt
đầu tôm sú bằng enzyme alcalase
Sự thay đổi pH ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự
tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất. Dựa trên các nghiên cứu có liên quan, tỉ lệ
enzyme alcalase bổ sung thƣờng dao động từ 0,5 đến 1,5%, thời gian thủy phân
là 120 phút (See et al., 2011, Bhaskar et al., 2008). Tiến hành khảo sát sự ảnh
hƣởng của đệm pH đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú bằng
alcalase ở các pH khác nhau bằng cách cố định tỉ lệ alcalase bổ sung ở 0,5%, thời
gian thủy phân 2 giờ, nhiệt độ 60ºC ở các đệm pH dao động trong khoảng từ 6
đến 9, kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.2 (kết quả thống kê đƣợc trình bày ở phụ
lục 2).
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến hiệu suất thủy phân protein từ thịt
đầu tôm sú bằng alcalase
pH môi trƣờng Hiệu suất thủy phân (%DH)
Đối chứng 7,85a
±0,67
6 9,80b
±0,63
7 13,65c
±0,25
8 16,12d
±1,09
9 13,79c
±0,86
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức
khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)

Bảng 4.2 cho thấy, pH từ 7 đến 9 là môi trƣờng thích hợp cho hoạt động
của alcalase. Khi pH dung dịch đệm tăng từ 6÷8, hiệu suất thủy phân tăng từ
9,8% lên 16,12%. Tuy nhiên khi tăng pH đệm lên 9, hiệu suất thủy phân giảm từ
16,12% xuống 13,79%. Khi so sánh với mẫu đối chứng (sử dụng nƣớc cất là
dung môi cho quá trình thủy phân protein), hiệu suất thủy phân protein của mẫu
sử dụng nƣớc cất thấp hơn các mẫu có sử dụng dung dịch đệm, khác biệt có ý
nghĩa về mặt thống kê.
Bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân protein bằng alcalase đạt cao nhất ở điều
kiện pH đệm là 8 (16,12%) và có chiều hƣớng bắt đầu giảm nhẹ khi tăng pH đệm
lên 9 (13,79%).
Ảnh hƣởng của pH đến vận tốc phản ứng enzyme có liên quan đến sự thay
đổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, ảnh hƣởng tới tính bền của
enzyme. Kết quả thí nghiệm cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Lệ Hà
(2011), enzyme protease hoạt động tốt trong khoảng pH trung tính (pH=8). Kết
quả này phù hợp với nghiên cứu của Muzaifa et al. (2012) trên phụ phẩm cá,
Wróblewska et al. (2008) thủy phân protein sữa bò, Herpandi et al. (2012) trên cá
ngừ (Katsuwonus pelamis) bằng alcalase cũng sử dụng dung môi có pH 8.
Nghiên cứu thủy phân protein của See et al. (2011) trên da cá hồi bằng alcalase
có pH 8,39 là tối ƣu và pH 8,5 là tối thích cho quá trình thủy phân nội tạng cá
tầm bằng alcalase của Ovissipour et al. (2008). Nhìn chung, pH tối ƣu cho hoạt
động phân giải protein của thủy sản đều có phạm vi hoạt động trong khoảng pH
trung tính và kiềm (Kim et al., 1996; Amiza et al., 2011)
4.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu quả thủy phân protein từ
thịt đầu tôm bằng enzyme alcalase
Bên cạnh pH, nhiệt độ thủy phân cũng góp phần làm thay đổi hiệu suất thủy
phân protein do ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính xúc tác enzyme. Nhiệt độ thích hợp
của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của
môi trƣờng.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng đến hiệu suất thủy phân protein ở các
nhiệt độ từ 30C đến 60ºC đƣợc trình bày ở Bảng 4.3 (kết quả thống kê đƣợc
trình bày ở phụ lục 2).

Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc

Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc

Similar to Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tác động của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú (penaeus monodon).doc