Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Nguyễn Thị Thu Hương
NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ
GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2020

10
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ
GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM
Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 8420103
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Đỗ Thị Tuyên
2. TS. Nguyễn Thị Trung
Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu tinh sạch
enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức
năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản
phẩm” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là
trung thực và chưa được công bố trong các công trình khoa học khác. Nếu như
không đúng như nêu trên tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về luận văn của mình.
Người cam đoan

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trước tiên
tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên - Trưởng
phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học, người thầy đã lên ý
tưởng, định hướng nghiên cứu và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị Trung – Trưởng phòng
đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ không những đã chỉ dạy cho tôi rất nhiều
kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện và luôn động viên, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình tôi hoàn thiện luận văn.
Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của dự án phát triển sản phẩm
thương mại cấp viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Phát triển sản
phẩm lumbrokinase chất lượng cao làm nguyên liệu thực phẩm chức năng hỗ
trợ điều trị chống tắc nghẽn mạch máu” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm.
Xin gửi lời cảm ơn tới các quý thầy cô của Học viện Khoa học và Công nghệ
đã chỉ dạy và truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học
viện. Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả các anh chị em cán bộ, học viên,
sinh viên phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã luôn
giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các đồng nghiệp yêu quý của tôi tại
Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương đã luôn hỗ trợ, tạo điều kiện
cho tôi trong công việc để tôi yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân luôn ở bên
động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Do kiến thức và thời gian còn hạn chế nên luận văn còn nhiều khiếm khuyết,
rất mong được sự đóng góp chỉ bảo thêm của các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè để
luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2020
Học viên

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................................... 23
Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu............................................................. 24
Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật................................................. 25
Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh.................. 27
Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 28
Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%................................................................. 35
Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm......................... 36
Bảng 2. 8. Hướng dẫn đọc kết quả kit API 20 E ......................................................................40
Bảng 3. 1. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu
được bằng kết tủa phân đoạn............................................................................................................ 43
Bảng 3. 2. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa
amonium sulphate ................................................................................................................................. 45
Bảng 3. 3. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn
enzyme sau khi qua cột sephadex G100...................................................................................... 48
Bảng 3. 4. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế.................. 51
Bảng 3. 5. Hoạt tính thủy phân casein của các mẫu trước và sau khi tinh sạch ........ 51
Bảng 3. 6. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm enzyme lumbrokinase............... 52
Bảng 3. 7. Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) của sản phẩm sau............................... 54
Bảng 3. 8. Tổng số vi nấm (CFU/g) của sản phẩm sau thời gian bảo quản................. 55
Bảng 3. 9. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt
Nam 5 dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên.............................................................. 64

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hoá plasminogen....................................................................................... 9
Hình 1. 2. Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông........................ 9
Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất................ 13
Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase........................................................................14
Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin.................................................................................................... 32
Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA.......................................................................................................... 33
Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine ....................................................................................................34
Hình 3. 1. (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng trong nghiên cứu; (B)
Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin của mẫu dịch nghiền.............................................................. 42
Hình 3. 2. (A) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa
phân đoạn; (B) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn................. 44
Hình 3. 3. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate ; (B) Hoạt tính thủy
phân fibrin của mẫu enzyme tủa amonium sulphate pha loãng 10 lần.......................... 46
Hình 3. 4. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex
G100............................................................................................................................................................ 47
Hình 3. 5. Hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau
khi qua cột sephadex G100............................................................................................................... 47
Hình 3. 6. Điện di đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex
G100............................................................................................................................................................ 49
Hình 3. 7. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch qua cột cut – off ; (B): Hình ảnh
đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D........................................................................................... 50
Hình 3. 8. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm lumbrokinase mẻ 1 ở thời điểm
ban đầu....................................................................................................................................................... 53
Hình 3. 9. Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch casein đậu tương ở
nồng độ 10-3
của sản phẩm mẻ 2 sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng .................. 54
Hình 3. 10. Tổng số vi nấm trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở nồng độ
10-1
của sản phẩm mẻ 1 sau bảo quản 1 tháng ở 40
C........................................................... 55
Hình 3. 11. Hình ảnh mẫu thử trong môi trường tăng sinh Enterobacteria –Mossel 56
Hình 3. 12. Mẫu thử trên môi trường muối mật violet-red................................................. 57
Hình 3. 13. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường Mac-Conkey agar.......... 58

Hình 3. 14. Hình ảnh tế bào vi sinh vật trên môi trường Mac-conkey ở .................. 58
Hình 3. 15. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Levine - eosin -
xanh methylen ........................................................................................................... 59
Hình 3. 16. Hình ảnh vi sinh vật trên kit API 20E .................................................... 59
Hình 3. 17. Kết quả kit API 20 E trên phần mềm API WEB .................................... 60
Hình 3. 18. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối Manitol ...... 61
Hình 3. 19. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối xylose – lysin
– desoxycholat ........................................................................................................... 62
Hình 3. 20. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch xanh brilliant ...... 62
Hình 3. 21. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường ...................................... 63

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ
APS
BSA
Cs
CFU
EDTA
kDa
M
OD
LK
SDS
SDS- PAGE
TCA
t-PA
TEMED
u-PA
WHO
Ammonium persulfate
Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)
Cộng sự
Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)
Ethylene diamine tetraacetic acid
Kilo dalton
Marker (Thang chuẩn)
Optical density (Mật độ quang học)
Lumbrokinase
Sodium dodecyl sulfate
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Trichloroacetic acid
Tisue plasminogen activator
N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine
Urokinase plasminogen activator
World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

1
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MỤC LỤC................................................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................................................... 5
1.1. CÁC BỆNH TẮC MẠCH MÁU NÃO ............................................................................ 5
1.1.1. Sơ lược tình hình chung về bệnh tắc nghẽn mạch máu..................................... 5
1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu..................................... 5
1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối............................................................ 7
1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối ...............................................................................10
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE...................................................12
1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase.............................12
1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới...........................14
1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam.............................17
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI.............................................................18
CHƯƠNG 2..............................................................................................................................................23
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................23
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU............................................................................................................23
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................23
2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................................23
2.1.3. Các dung dịch và đệm....................................................................................................23
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ................................................................................25
2.1.5. Chủng vi sinh vật .............................................................................................................27
2.1.6. Máy móc và thiết bị ........................................................................................................27
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................................28
2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô..........................28

2
2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase............................................................29
2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin.........................................................................31
2.2.4. Xác định hàm lượng protein........................................................................................32
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein........................................................................33
2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide.............................................34
2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn...........................................................................................35
2.2.8. Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E .................................................................39
2.2.9. Xử lý số liệu.......................................................................................................................41
CHƯƠNG 3..............................................................................................................................................42
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................................................42
3.1. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX
ESCAVATUS ....................................................................................................................................42
3.2. NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE . 43
3.2.1. Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ ...................................................................43
3.2.2. Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate .....................................44
3.2.3. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel ........................................................46
3.2.5. Thử hoạt tính thủy phân casein..................................................................................51
3.3. KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME
LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC
NHAU.....................................................................................................................................................53
3.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm...................................................................53
3.3.2. Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật............................................................56
3.3.3. Tìm vi khuẩn gây bệnh..................................................................................................57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................................................................65
KÊT LUẬN..........................................................................................................................................65
KIẾN NGHỊ.........................................................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................66
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

3
MỞ ĐẦU
Rối loạn tim mạch và mạch máu dẫn đến khoảng 26 triệu ca tử vong
mỗi năm trên toàn thế giới. Các rối loạn tim mạch và não không chỉ có tỷ lệ tử
vong cao trên toàn cầu mà còn dẫn đến các biến chứng sau đó như tan huyết
khối có thể ảnh hưởng xấu hoặc đe dọa tính mạng như nhồi máu cơ tim, huyết
khối tĩnh mạch não và huyết khối tĩnh mạch [1]. Trên 80% các ca tử vong xảy
ra tại các nước có thu nhập thấp và trung bình. Tại các nước đang phát triển
bệnh tim mạch ngày càng gia tăng cùng với sự phát triển của xã hội [2]. Tại
Việt Nam, theo thống kê của hội tim mạch, có khoảng 16% dân số mắc các
bệnh tim mạch và đột quỵ. Có nhiều nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch
như: cao huyết áp, tràn mạch máu não, xơ cứng động mạch. Trong số các
bệnh nhân bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng
bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% bệnh nhân sống và làm việc bình
thường. Nguyên nhân chủ yếu là do cục máu đông gây tắc động mạch và cản
trở lưu thông máu, do đó việc làm tan cục máu đông đóng vai trò rất quan
trọng trong việc điều trị các bệnh này. Việc nghiên cứu, bào chế các thuốc để
phục vụ điều trị các bệnh tim mạch là nhiệm vụ cấp thiết và vô cùng quan
trọng. Các thuốc tan huyết khối hiện nay chủ yếu là nhập ngoại, một số dạng
là thuốc tiêm, gây khó khăn cho người sử dụng, giá thành cao và có nhiều tác
dụng phụ không mong muốn, nên việc nghiên cứu, bào chế tạo ra một sản
phẩm sử dụng đường uống, an toàn, hiệu quả, giá thành rẻ là nhu cầu cấp
thiết.
Mihara và cs (1991) đã nghiên cứu và thu nhận thành công một enzyme
có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6
izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase. Lumbrokinase có khả năng thủy
phân rất mạnh các sợi fibrin - một loại protein có trong máu để làm tan cục
máu đông. Lumbrokinase được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng
làm thuốc uống vì có thể hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin
nội sinh [3], [4], [5]. Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều
trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác là không có tác dụng phụ, không
gây chảy máu hệ thống.

4
Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu
đông, trong khi các chất hoạt hóa khác vẫn đang được sử dụng như tPA (tisue
plasminogen activator) để có tác dụng phải hoạt hóa plasminogen thành
plasmin, sau đó plasmin mới có khả năng thủy phân fibrin, ngoài ra
lumbrokinase cũng có tác dụng hoạt hóa như tPA. Nhờ có tác dụng kép như
vậy nên lumbrokinase cho hiệu quả cao.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên
liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật
trong quá trình bảo quản sản phẩm” với mục tiêu tạo ra được sản phẩm
lumbrokinase chất lượng cao và đánh giá độ an toàn của sản phẩm. Với đề tài
trên, chúng tôi tập trung giải quyết các vấn đề sau:
(1)Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun
quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng.
(2) Tạo nguyên liệu và xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm
lumbrokinase trong quá trình tạo sản phẩm

5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO
1.1.1. Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu
Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây ra rối loạn tim mạch và tai biến mạch
máu não là mộttrong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Liên đoàn tim
mạch thế giới đưa ra thống kê cứ ba người thì có mộtngười tử vong trong đó có mộtngười tử
vong vì bệnh tim mạch. Ở Mỹ cứ 29 giây có mộtngười bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có
mộtngười tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộcác ca tử vong, phí tổn do
bệnh này chiếm 128 tỉ USD mỗi năm. Theo thống kê của Hội Đột quỵ Mỹ, cứ mỗi 45 giây trôi
qua, trên thế giới có ít nhất một người bị đột quỵ. Và cứ 3 phút trôi qua, thế giới lại có một
người tử vong do đột quỵ. Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ,
khoảng 50% trong số đó tử vong. Nếu như trước đây, đột quỵ thường gặp ở những người tuổi
từ 50 trở lên thì hiện nay, bệnh ngày càng trẻ hóa. Theo thống kê tại các bệnh viện, tỷ lệ đột
quỵ ở người trẻ tuổi đang có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2% mỗi năm.
Hiện nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biết mạch máu não ngày càng
gia tăng, nhất là các nước đang phát triển. Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như:tràn máu não, nhồi
máu cơtim, tắc động mạch phổi. Nguyên nhân chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn
chế thấp nhất tỉ lệtử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi theo hướng xử lý các huyết khối hình
thành trong thành mạch. Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch.
1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân của hội chứng tắc nghẽn mạch máu
Hội chứng tắc nghẽn mạch máu là mộtchứng bệnh cục máu đông được

6
tạo thành do fibrin bị đóng cục lưu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở lưu
thông máu. Hội chứng huyết khối tác động lên cả hệ thống tĩnh mạch (thuyên tắc
- huyết khối tĩnh mạch) và hệ thống động mạch (huyết khối động mạch do xơ
vữa) [6].
Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch
Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, là sự tắc nghẽn tĩnh mạch do máu
cục máu đông, là bệnh tim mạch phổ biến thứ ba ở những nước phương Tây.
Hàng năm có 0,1% dân số thế giới mắc bệnh này. Biểu hiện phổ biến nhất của
thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch là huyết khối tĩnh mạch sâu, hiện tượng này
xảy ra khi có một cục máu đông hình thành trong lòng các tĩnh mạch sâu của
chi dưới. Đây là một bệnh lý phổ biến ở những bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt
giường, những bệnh nhân sau phẫu thuật không thể cử động trong một thời
gian dài cũng như những bệnh nhân vừa trải qua một cuộc đại phẫu, hay phẫu
thuật chỉnh hình. Bệnh này cũng có thể xảy ra ở những bệnh nhân có bệnh di
truyền dẫn đến đông máu bất thường, xảy ra ở người già, những phụ nữ trẻ
cũng không miễn nhiễm, đặc biệt trong thời kì sinh đẻ [7]. Hậu quả nghiêm
trọng nhất của huyết khối tĩnh mạch sâu là thuyên tắc động mạch phổi. Tắc
mạch phổi xảy ra khi cục máu đông hay một mảnh của nó bong ra và di
chuyển đến phổi và gây ra tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi. Thuyên tắc
phổi là bệnh lý rất nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong rất cao.
Huyết khối động mạch do xơ vữa
Huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra khi cục máu đông hình thành
trên nền của một mảng xơ vữa ở thành động mạch. Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra,
tại những chỗ đó máu sẽ bị hoạt hóa và đông cục gây tắc động mạch [6]. Đây
là một bệnh rất nguy hiểm vì nếu cục máu đông này phát triển và làm tắc
nghẽn hoàn toàn, động mạch bị tổn thương, thì máu qua động mạch này sẽ
ngừng chảy và mô bên dưới do động mạch này cung cấp máu sẽ rơi vào nguy
cơ bị thiếu máu, đôi khi dẫn đến hậu quả là đe dọa tính mạng người bệnh. Nếu
huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra tại những động mạch cung cấp máu
cho tim, hiện tượng này tạo ra hội chứng động mạch vành cấp hoặc

7
những cơn đau tim. Tương tự, nếu bệnh lý này xảy ra tại những động mạch
cung cấp máu cho não thì những cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ sẽ xảy ra.
Bệnh động mạch ngoại biên xảy ra khi huyết khối động mạch do xơ vữa tác
động lên các động mạch chi dưới. Bệnh huyết khối động mạch do xơ vữa
đang gia tăng chủ yếu do lối sống hiện đại của chúng ta.
1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối
Sinh lý học hoàn chỉnh của sự hình thành cục máu đông fibrin là một
quá trình tương đối dễ hiểu. Một cục máu đông hoặc huyết khối bao gồm các
tế bào máu được chứa trong một ma trận của protein fibrin. Huyết khối hoặc
tiêu sợi huyết là quá trình điều hòa enzyme để hòa tan cục máu đông. Trong
tuần hoàn động vật có vú, enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tiêu sợi
huyết là plasmin, một protease serine giống như trypsin [8].
Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi
thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che
phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết. Quá trình đông máu diễn ra
gồm một chuỗi các phản ứng theo kiểu bậc thang bao gồm ba giai đoạn: (1)
giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua hai con đường nội sinh và
ngoại sinh, (2) giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và (3) giai đoạn
tạo thành mạng lưới fibrin từ fibrinogen tạo thành cục máu đông [9].
Hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần là tế bào (tiểu cầu) và
protein (các yếu tố đông máu). Khi rối loạn một trong hai yếu tố trên đều ảnh
hưởng đến quá trình đông máu. Phản ứng đông máu ngay lập tức được kích
hoạt khi tổn thương xảy ra làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Bước đầu của
quá trình đông máu, tiểu cầu tạo nút chặn để cầm máu vết thương sau đó các
yếu tố đông máu có trong huyết tương sẽ đáp ứng một loạt các phản ứng tạo
ra sợi huyết, củng cố nút chặn tiểu cầu. Sợi huyết được tạo thành đó là do quá
trình tạo fibrin từ fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Tiểu cầu cùng với sợi
huyết tạo thành cục máu đông gắn vào thành mạch máu để ngăn ngừa sự mất
máu và giúp liền vết thương.

8
Ngược với quá trình đông máu là quá trình tan huyết khối, giúp tái lưu
thông tuần hoàn máu. Có hai cơ chế tan huyết khối là: cơ chế thủy phân fibrin
thông qua hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin và cơ chế thủy phân trực
tiếp fibrin.
Với sự có mặt của chất hoạt hóa, plasmin có hoạt tính thủy phân fibrin
được sản xuất từ plasminogen không hoạt động có trong hệ thống tuần hoàn.
Sự chuyển đổi sinh hóa của plasminogen không hoạt động thành plasmin liên
quan đến sự phân cắt protein do các chất kích hoạt plasminogen khác nhau
[10].
Cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen chỉ xảy ra khi
tuyệt đối cần thiết và theo một quy trình rất kĩ càng, lúc đầu chỉ ở khu trú ở
khu vực có cục máu đông (tức là nơi có fibrin). Bình thường khi máu đang
lưu thông thì không có sự xuất hiện của plasmin. Khi có cục máu đông lập tức
xảy ra quá trình kích hoạt plasminogen, như vậy fibrin chính là tác nhân chủ
yếu và quan trọng nhất để khởi phát cho sự hoạt hóa plasminogen và từ đó
dẫn đến quá trình tiêu fibrin. Các chất hoạt hóa (t-PA, urokinase,
streptokinase…) đều thực hiện việc hoạt hóa bằng cách cắt phân tử
plasminogen qua mối liên kết với arginine (acid amin số 561) và valine (acid
amin số 562). Plasminogen bị cắt thành hai chuỗi: chuỗi A là chuỗi nặng,
trọng lượng phân tử 6.000 kDa, và chuỗi B là chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử
là 2.600 kDa, hai chuỗi được kết nối với nhau bằng một cầu disulfua. Về mặt
cấu trúc plasmin chỉ khác plasminogen ở chỗ có hai chuỗi, trình tự acid amin
vẫn giống nhau, và có cầu disulfua nối hai chuỗi nên trọng lượng phân tử và
tính kháng nguyên vẫn như nhau. Plasmin sau khi được tạo ra xúc tác cho quá
trình cắt fibrin thành các sản phẩm tan được gọi là sản phẩm thoái giáng của
fibrin (FDPs), các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm
chậm quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nên làm chậm tạo thành
cục máu đông (Hình 1.1).

9
Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hoá plasminogen
Trong các chất hoạt hóa plasminogen thì t-PA có vai trò quan trọng, nó
thường phát huy tác dụng sớm nhất và mạnh nhất, hiệu lực hoạt hóa tăng lên
rất nhiều khi có mặt của fibrin. Trong máu người bình thường plasmin tồn tại
song song với yếu tố ức chế là antiplasmin, nó có nồng độ cao gấp 30 lần so
với plasmin, có tác dụng ngăn chặn việc tác động của plasmin tới việc phân
hủy các protein trong huyết tương [11]. Hai yếu tố hoạt hóa plasminogen tự
nhiên trong máu là urokinase (u-PA) và yếu tố hoạt hóa mô (t-PA), hoạt động
tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi các chất ức chế plasmin (a1- antiplasmin,
a2- macroglobulin), các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (PAL-I:
plasminogen activator inhibitor -1, một chất ức chế nhanh tác dụng của t-PA
và u-PA) [12]. Nhờ cơ chế trên mà cơ thể giữ được sự cân bằng, ổn định,
không có sự đông máu hoặc chảy máu bất thường (Hình 1. 2).
Hình 1. 2. Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông

10
Cơ chế tan huyết khối thông qua sự thủy phân trực tiếp fibrin an toàn
hơn cơ chế thủy phân bằng quá trình hoạt hóa plasminogen vì plasmin liên
quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasmin được tạo ra mất
cân bằng với lượng antiplasmin thì sẽ rất nguy hiểm với các vết thương chảy
máu, có thể gây ra chảy máu ồ ạt và nguy hiểm đến tính mạng. Ngoài các yếu
tố lumbrokinase, t-PA, u-PA không có yếu tố nào có thể thủy phân trực tiếp
fibrin mà đều phải thông qua quá trình hoạt hóa plasminogen [1].
1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối
Hiện nay nhu cầu về các thuốc điều trị huyết khối ngày càng tăng cao
do bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, huyết khối trên thế giới
ngày càng gia tăng theo tốc độ phát triển của xã hội và lối sống hiện đại.
Việc điều trị các bệnh huyết khối chủ yếu tập trung vào việc kìm hãm
sự tạo thành fibrin hoặc sử dụng các nhân tố tác động vào sự chuyển hóa
plasminogen thành plasmin.
1.1.4.1. Các thuốc có bản chất hóa học
Các thuốc điều trị huyết khối có bản chất hóa học thường được sử dụng
là coumarin và heparin, các thuốc này có tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục
fibrin [2]. Heparin có tác dụng tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát
triển của huyết khối, nó có thể tác dụng kéo dài trong vòng 3-4 giờ trước khi
bị phá hủy bởi heparinase trong máu. Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg
trọng lượng cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút.
Coumarin khi được tiêm vào cơ thể sẽ cạnh tranh với vitamin K ở những vị trí
hoạt động trong các phản ứng enzyme dẫn đến tạo thành bốn yếu tố II, VII,
IX, X. Sau khi tiêm 12 giờ hoạt tính đông máu giảm xuống còn 50%, sau 24
giờ còn khoảng 20%, sau khoảng 3 ngày chấm dứt điều trị với coumarin thời
gian đông máu sẽ trở lại trạng thái bình thường [9].
Vào đầu những năm 1950, aspirin được sử dụng trong việc ngăn ngừa
nhồi máu cơ tim [13], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính
không được chứng minh. Các thuốc heparin, atropine, papaverine và
nitroglycerin cũng thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm

11
co thắt mạch vành. Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều
trị chỉ là giảm nhẹ chứ không phải điều trị [14], [15].
1.1.4.2. Các thuốc có bản chất enzyme
Hiện nay, các enzyme tiêu sợi huyết được sản xuất bởi các vi sinh vật,
rắn, giun đất, côn trùng, thực vật và các sinh vật khác đang được sử dụng
thành công trong việc điều trị cục máu đông, đặc biệt là phân hủy trực tiếp
fibrin với chi phí thấp hơn và ít tác dụng phụ [16].
Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị
nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển hóa
plasminogen thành plasmin. Các enzyme đang được sử dụng rộng rãi trong
việc điều trị là streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus),
urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của
mô) tái tổ hợp [16].
Streptokinase: là mộtprotein có khối lượng phân tử 47 kDa, do liên cầu khuẩn tan huyết I nhóm A sinh ra. Nó tác động
theo mộtcơchế phức tạp với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để tạo thành mộtphức hợp hoạt
hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen còn dư thành plasmin bằng cách thủy phân liên kết L-arginine-L-valine, có tác dụng tiêu
fibrin và có thể làm tan các cục máu đồng trong lòng mạch. Streptokinase được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh
mạch sâu. Bên cạnh những ưu điểm trên thì streptokinase cũng có những tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài nhưđau cơ,buồn nôn, sốt,
hạ huyết áp, loạn nhịp tim [17], [18].
Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi
trường lên men của vi khuẩn Bacillus natto. Nattokinase làm tan fibrin gấp 4
lần plasmin nội sinh trong cơ thể. Nattokinase giúp duy trì và tăng cường khả
năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng
ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên
não, đột quỵ [19], [20].
t-PA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp
nhưng giá thành cao. Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào
plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin

12
[21], [22]. Tác dụng phụ của t-PA là gây chảy máu nhưở nơitiêm, đường tiêu
hóa, trong não, hạ huyết áp [6].
Urokinase: được tổng hợp bởi tế bào biểu mô hình ống trong thận người và
thu được trong nước tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác lâm sàng bị hạn chế
(2300 lít nước tiểu mới thu được 29 mg urokinase tinh khiết) [23]. Enzyme này
cũng hoạt động như một chất hoạt hóa plasminogen, thủy phân liên kết ester ở L-
valine và L-arginine [18]. Nó thường được dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, điều
trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu. Tác dụng phụ của urokinase là giảm
huyết áp, loạn nhịp, sưng quanh hố mát, chảy máu ở nơichấn thương xuyên da [24].
Mặc dù việc sử dụng các enzyme này trong điều trị đã thu được những
kết quả tích cực, tuy nhiên vẫn tồn tại một số vấn đề phát sinh trong quá trình
điều trị như giá thành cao (t-PA tái tổ hợp, urokinase), khó xác định liều phù
hợp (streptokinase), sốt, tăng chảy máu, tạo kháng nguyên, không hiệu quả
khi uống qua đường miệng [25].
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE
1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase
Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác
dụng thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông. Khối lượng phân tử trung bình
của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [1]. Lumbrokinase là những chuỗi
polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin,
không chứa thành phần đường. Chúng được xếp vào serine protease kiềm
giống trypsin. Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với
các serine protease khác đã biết.
Lumbrokinase (LK) được tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của
rất nhiều loài giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải
thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn
là những mảnh vụn thực vật và các chất hữu cơ trong đất nên chúng sản xuất
enzyme LK như một serine protease [1].

13
Ưu điểm lớn nhất của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất là có thể hấp
thụ qua đường ruột vào máu. Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng
hoạt hóa hệ thống thủy phân fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hòa tan trực tiếp
fibrin. Đây chính là những cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy
phân fibrin từ giun đất làm thuốc uống chữa bệnh tim mạch [18], [19], [3].
Từ việc phân tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3
của các isoenzyme lumbrokinase từ loài L. rubellus có rất nhiều điểm giống
nhau so với các protein từ loài E. fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn
cuộn xoắn [1]. Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino
acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase,
yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [18] (Hình 1.3).
Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất
Giống như các yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác, LK cũng có cơ chế hoạt động là kích hoạt sự chuyển
hóa plasminogen tạo thành plasmin và phân hủy trực tiếp fibrin mà không phân hủy các protein huyết tương
khác bao gồm plasminogen và albumin (Hình 1.4). Các enzyme LK có hoạt động tiêu sợi huyết rất mạnh mẽ,
ổn định trong pH rộng và sự ổn định cao chống lại sự thay đổi nhiệtđộ.Chúng là serine protease kiềm giống
trypsin nhưng được đánh giá có sự ổn định và khả năng chịu đựng dung môi cao hơn. Vilhardt (1986) bằng
phản ứng miễn dịch đã chứng minh 10-15% LK được hấp thụ hoàn toàn qua các mô và đường ruột. Do vậy
LK được đánh giá cao hơn các chất khác trong hoạt động phân hủy các cục máu đông [3], [4].

14
Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase
Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã
được chứng minh. Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm Krebs-
Henseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã được
đưa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác
nhau (30, 60, 120 phút). Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch
bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin
theo dõi vòng hoạt tính. Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vòng hoạt tính
trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4; 11,8 ± 31,977 mm2. Khi nhỏ
trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vòng
hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng với 14,7; 8,7 và
11,5% lumbrokinase được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột
non. Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase được hấp thu hiệu quả qua thành
ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn
mạch máu qua đường uống [5].
LK cũng đã được chứng minh mặc dù có khả năng phân hủy protein
nhưng không gây ra phân hủy hồng cầu, cũng không gây ra sự tập kết tiểu cầu
tự phát bởi Shim và cộng sự năm 1998 [26].
Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh được nhiều đặc tính có lợi
của LK trong việc chống viêm, chống oxy hóa, chống xơ hóa, chống vi khuẩn,
chống ung thư [27], [28].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về LK nhưng chủ yếu là tách chiết
enzyme này từ những loài giun đất.

15
Loài giun đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại Nhật, có khả
năng thủy phân mạnh fibrin. Năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết được
enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus,
một thành phần chính để chữa những cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này
gồm có 6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase.
Các phân đoạn nhóm tác giả thu được là F-I-0, F-I-1, F-I-2, F-II, F-III-1, F-
III-2 bằng quá trình tủa amonisulphate 60% và qua quá trình tinh sạch bằng
các cột sephadex G200, DEAE-cellulose, sephadex G75, toyopearl HW-55
cân bằng với 30% amonisulphate, cột sắc ký ái lực sepharose, sephadex G97.
Đây là những enzyme bền nhiệt và thích ứng với khoảng pH rộng, pH tối ưu
7-9 [29].
Năm 1998, Shim và cs đã tách chiết và tinh sạch thành công LK từ giun
đất Lumbricus rubellus bằng cách tủa dịch thô bằng muối amonisulphat 30%
và 60%, sau đó tinh sạch qua cột DEAE-cellulose, cột sepharose 6B, thu được
enzyme lumbrokinase có khối lượng phân tử 34,2 kDa, không phụ thuộc vào
các ion kim loại, bền nhiệt và có phạm vi pH tối ưu rất rộng [26].
Một số nghiên cứu cho rằng các enzyme thủy phân fibrin có thể hòa tan
cục máu đông và hạn chế được khả năng vón cục [30], [31]. Tuy nhiên, hầu hết
các nghiên cứu đều vẫn là đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa
và ứng dụng lâm sàng của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất L. rubellus, L.
bimastus, E. fetida hoặc E. andrei [5], [32], [33]. Một số tác giả thử nghiệm
tác dụng chống tắc nghẽn mạch ở mức độ sâu trên động vật thí nghiệm, nghiên
cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn, nghiên cứu các đặc
tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đưa vào cơ thể [18].
Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết
được enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài giun E. fetida. Họ đã
chứng minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một
số thuốc chữa bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và
tPA [34], [35].
Đến năm 2004, Cho và cs đã tinh sạch được 6 phân đoạn lumbrokinase
(F1 đến F6) từ giun đất L. rubellus có hoạt tính thủy phân fibrin bằng phương

16
pháp tủa muối amoni sulfate và sắc ký cột. Hoạt tính thủy phân protein trên cơ
chất casein của 6 isoenzyme này đạt được từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo thứ tự
hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4. Hoạt tính thủy phân fibrin của 6 phân đoạn
này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương ứng
F6>F2>F5>F3>F1>F4. Khối lượng phân tử của các isozyme được xác định
bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3); 25,4
(F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6). Nhiệt độ tối ưu của 6 isozyme là 50C, và
pH tối ưu trong vùng pH 4-12. Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế bởi
PMSF. Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-L-
lysine chloromethyl ketone, N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,
soybean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor và leupeptin [36].
Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase
chống lại chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ
chế của nó. LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều
khác nhau. Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng
tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2%. Các nghiên cứu về điện tâm đồ cho
rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50 µl ở +10 mV, dòng canxi dạng L (ICa-
L) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ -14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4
pA/pF (giảm tới 21,4%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31
pA/pF (giảm 36,5%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01). Cơ chế chống chứng
thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim ở tâm thất
chuột nhắt trắng [37].
Năm 2015, Lee và cs đã đánh giá hiệu quả điều trị của LK trong tái tạo
thần kinh ngoại biên trên chuột bằng cách sử dụng mô hình tổn thương thần
kinh tọa được xác định rõ ở chuột bị tiểu đường do tiêm streptozotocin. Nhóm
nghiên cứu đã thấy rằng liệu pháp LK có thể cải thiện lưu lượng máu tuần
hoàn của chuột và thúc đẩy tái tạo sợi trục trong ống dẫn cao su silicon sau
khi chuyển dây thần kinh, điều trị bằng LK cũng có thể cải thiện các chức
năng thần kinh cơ với hiệu suất dẫn truyền thần kinh tốt hơn, ngoài ra LK
cũng có thể kích thích bài tiết interleukin -1, yếu tố tăng trưởng thần kinh, yếu

17
tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu và biến đổi yếu tố tăng trưởng β trong
bệnh đái tháo đường bị cắt bỏ đoạn thần kinh [38].
Năm 2016, Tang và cs cũng đã tách LK từ giun đất Pheretima
Praepinguis bằng phương pháp tủa muối và nghiên cứu tính chất enzyme.
Nhóm tác giả đã thử hoạt tính của LK bằng phương pháp đĩa thạch casein, thu
được hoạt tính tương đối cao, hoạt tính của LK trong môi trường trung tính
hoặc hơi kiềm cao hơn, có khả năng chịu nhiệt độ cao, hoạt tính enzyme đạt
cao ở nhiệt độ dưới 600
C và phạm vi thích nghi nhiệt độ rộng [39].
Cũng trong năm 2016, Tingming và cs cũng đã tách chiết lumbrokinase
từ giun đất bằng cách sử dụng cột sợi rỗng cut – off 50 kDa và 6 kDa sau khi
nghiền đồng thể giun để thu dịch thô, sau đó tinh chế qua cột sephadex G75,
thu được ba phân đoạn protein có độ tinh khiết cao, một trong số ba phân
đoạn này đã được thử cho hoạt tính tiêu sợi huyết cao [40].
Năm 2017, Mahendra và cs đã nghiên cứu và thu nhận thành công một
enzyme phân hủy fibrin từ giun đất Ấn Độ Pheretima posthumous có trình
tự acid amin tương đồng với lumbrokinase P2 của giun đất Lumbricus
rubellus bằng phương pháp tủa muối amonium sulphate và sắc ký trao đổi
ion. Trọng lượng phân tử protein thu được là 29,5 kDa bằng maldi-TOF/MS.
Enzyme thể hiện khả năng phân giải protein tối đa 1,2 U/ml với hoạt tính
riêng là 17,65 U/mg ở pH 8,0 và nhiệt độ là 400
C. Nghiên cứu cho thấy
enzyme có hoạt động phân giải protein trong phạm vi pH rộng từ 4 đến 12 và
nhiệt độ từ 20 đến 600
C [41].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng ẩm, rất phù hợp cho sự sinh sản
và phát triển của rất nhiều loài giun, vì vậy số lượng các loài giun rất đa dạng
[42]. Nhờ việc ứng dụng sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có nhiều
công trình nghiên cứu các sản phẩm chống đông máu đăc biệt là các sản phẩm
tách chiết từ các loài giun trong nước.
Trên cơ sở khai thác và tìm kiếm nguồn enzyme thủy phân fibrin ở một
loài giun đất Việt Nam (nhánh đề tài KC04-17: “Nghiên cứu các giải pháp

18
công nghệ sinh học sản xuất các chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ
sức khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam” năm 2002-2004),
Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự (2006) đã thực hiện đề tài cấp cơ sở viện
Công nghệ sinh học: “Tách dòng và tìm điều kiện biểu hiện gen mã hóa
cho enzyme lumbrokinase từ giun quế”. Trong nghiên cứu này, nhóm tác
giả đã sàng lọc được các loài giun đất có hoạt tính thủy phân fibrin cao và
bước đầu tìm cách nhân dòng trình tự gen mã hóa LK từ loài giun quế
Perionyx excavatus.
Lý Thị Bích Thủy và cs (2006) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy
phân fibrin từ P. excavatus và đánh giá được một số tính chất của nó [43].
Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2008) cũng đã tách chiết và tinh sạch
enzyme thủy phân fibrin từ P. excavatus và tách chiết được 8 phân đoạn có
hoạt tính thủy phân fibrin cao [44].
Nguyễn Văn Rư (2015) đã tinh sạch lumbrokinase từ giun quế
Peryonyx excavatus bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng ethanol
50%, 80% và sắc ký lọc gel sephadex G75, đã xác định được hoạt độ enzyme
của chế phẩm và khảo sát được một số đặc tính sinh học và các yếu tố ảnh
hưởng tới hoạt tính enzyme như nhiệt độ, pH, các ion kim loại đặc biệt là khả
năng hòa tan cục máu đông và fibrin invitro, ngoài ra nghiên cứu của tác giả
cũng đã tạo được bột đông khô lumbrokinase có hoạt độ protease 30,60
IU/mg dùng để làm nguyên liệu sản xuất enzyme làm thuốc [45].
Hầu hết các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào nghiên cứu
tách chiết, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hoá của LK.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI
Hiện nay trên thị trường các thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều
trị bệnh huyết khối đang có xu hướng phát triển rất mạnh để đáp ứng nhu cầu
điều trị các căn bệnh nguy hiểm này. Song song với việc nghiên cứu phát triển
các chế phẩm mới thì việc giám sát chất lượng thuốc để đáp ứng đúng các yêu
cầu và bảo vệ sức khỏe cho người bệnh là công tác quan trọng hàng đầu.

19
Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thuốc phải đáp ứng các yêu cầu của
dược điển Việt Nam hiện hành (dược điển Việt Nam 4, dược điển Việt Nam
5) hoặc các dược điển hiện hành trên thế giới theo quy định của ngành kiểm
nghiệm. Các chỉ tiêu về vi sinh vật được yêu cầu theo dược điển là xác định
tổng số vi khuẩn hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc, tống số vi
khuẩn Gram âm dung nạp mật, xác định sự có mặt của một số vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli, Staphhylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans trong 1 g chế phẩm, xác định Salmonella
trong 10 g chế phẩm.
Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thực phẩm chức năng phải đáp ứng
đầy đủ các yêu cầu của các tiêu chuẩn TCVN và các tiêu chuẩn ISO, các tiêu
chuẩn cũng tương tự như trong dược điển Việt Nam 5 với các chỉ tiêu: xác
định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc và định
danh một số vi sinh vật gây bệnh không được phép có mặt trong chế phẩm
[46].
Tuy nhiên các công bố về các nghiên cứu về chỉ tiêu vi sinh trong các
chế phẩm này còn rất hạn chế.
Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men thu nattokinase tái tổ
hợp trong Bacillus subtilis và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ
ngăn ngừa sự hình thành huyết khối” do PGS.TS Trần Cát Đông làm chủ
nhiệm vừa được Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM nghiệm thu năm 2018.
Nhóm nghiên cứu đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu
nattokinase, xây dựng quy trình bào chế viên nang thực phẩm chức năng chứa
nattokinase đạt tiêu chuẩn cơ sở theo Dược điển Việt Nam IV. Công thức viên
nang cứng nattokinase 1.000 FU với hệ tá dược gồm calci carbonat, MCC
PH101, mannitol, talc, magnesi stearat, aerosil, povidone K30, natri
croscarmellose đã được xây dựng. Trong đó, tỷ lệ calci carbonat, MCC
PH101, mannitol đã được khảo sát và tối ưu hóa với phần mềm Design
Expert® v 11.0.0 để giúp ổn định hoạt tính nattokinase và pH của viên nang
đạt 8,5. Quy trình bào chế được lưa chọn là phương pháp xát hạt từng phần
đảm bảo cho enzym không bị mất hoạt tính bởi ẩm và nhiệt trong quá trình

20
bào chế. Viên nang nattokinase đạt các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam
IV về độ đồng đều khối lượng, độ rã, độ hòa tan, pH, định tính và định lượng.
Tuổi thọ của viên nang nghiên cứu trên 24 tháng, khi theo dõi ở các điều kiện
khác nhau. Đánh giá sinh khả dụng và tác động dược lý của sản phẩm cho
thấy, thử nghiệm độc tính cấp trên chuột (LD50 > 100.000 FU/kg thể trọng),
không có chuột chết. Thử độc tính bán trường diễn, sau khi cho chuột uống
nattokinase liều 2.000 FU/kg và 4.000 FU/kg liên tục trong 60 ngày không
gây độc tính trên chuột, chuột tăng trọng bình thường, các chỉ số xét nghiệm
huyết học và đa số thông số sinh hóa đều nằm trong giới hạn bình thường
[47].
Ngoài ra, nhóm nghiên cứu đã xây dựng mô hình gây huyết khối cảm
ứng với carragenan trên chuột nhắt trắng, khảo sát được tác động ngăn ngừa
huyết khối đối với viên nang chứa nattokinase cho hiệu quả ngăn ngừa huyết
khối tương tự nattokinase thương mại. Đồng thời nhóm đã tiến hành đăng ký
giải pháp hữu ích với sản phẩm đăng ký là “Quy trình lên men thu nhận vượt
mức nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis” [47].
Giai đoạn 2011- 2015, nhóm nghiên cứu của viện Công nghệ sinh học
do cố PGS. TS. Quyền Đình Thi và ThS. Lê Thanh Hoàng đã nghiên cứu sản
xuất thành công chế phẩm lumbrokinase tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này
enzyme lumbrokinase đã được nhân dòng từ giun đất Eisenia fetida và biểu
hiện trong Pichia pastoris với hoạt tính đạt >3000 IU/mg protein. Chế phẩm
lumbrokinase tái tổ hợp ở liều 200 mg/kg có tác dụng tốt trong điều trị nhồi
máu não trên mô hình thực nghiệm, làm giảm mức độ tổn thương vận động
(cả vận động cưỡng bức và vận động tự nhiên), làm tăng khả năng phối hợp
vận động khi thử trên rotarod, tăng khả năng ghi nhớ và học tập khi thử trên
mê lộ nước. Thuốc tác dụng tốt cả trong giai đoạn cấp (3 ngày đầu sau gây
nhồi máu) và trong dùng điều trị kéo dài. Các tác dụng này của Lumbrokinase
tái tổ hợp tương đương với thuốc chuẩn Boluoke (lumbrokinase) của Canada.
Năm 2018, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hoàng và cộng sự
cũng đã xác định độc tính cấp và bán trường diễn của lumbrokinase tái tổ hợp.
Kết quả cho thấy lumbrokinase không gây độc trên động vật thực nghiệm. Giá

21
trị LD 50 của lumbrokinase tái tổ hợp trên chuột nhắt trắng qua đường tiêu
hoá khi theo dõi 7 ngày là không xác định được, 100% chuột sống sót sau 7
ngày uống lumbrokinase với liều lượng 50 mg/kg thể trọng. Sản phẩm
lumbrokinase tái tổ hợp không gây ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ thí
nghiệm cũng như hình ảnh vi đại thể của tế bào gan chuột sau khi uống chế
phẩm 45 ngày [48].
Các nghiên cứu về quy trình kiểm tra giám sát chất lượng các thuốc và
thực phẩm chức năng điều trị các bệnh huyết khối cũng đã được công bố.
Năm 2010, Nguyễn Thanh Thảo - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã nghiên cứu và xây dựng thành công phương pháp xác định hoạt tính
của streptokinase trong chế phẩm chứa đồng thời hai enzyme là streptokinase
và streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải trên đĩa thạch agarose.
Phương pháp có độ đúng, độ lặp lại cao và độ tuyến tính nằm trong khoảng từ
9 đến 28050 đơn vị streptokinase/ml. Phương pháp này có tác dụng thiết thực
trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp cả hai enzyme này
với trang thiết bị và các hóa chất thông dụng, kỹ thuật không phức tạp, có thể
thực hiện được ở các cơ sở kiểm nghiệm cấp tỉnh, thành phố và các doanh
nghiệp [49].
Năm 2019, Nguyễn Thị Hằng và cs đã tiến hành thẩm định quy trình
xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang. Các kết
quả thực nghiệm của nhóm tác giả chứng minh rằng quy trình xác định hoạt
lực nattokinase bằng phương pháp đo quang có độ đặc hiệu, độ chính xác và
độ đúng nằm trong giới hạn cho phép về thẩm định phương pháp phân tích
các hoạt chất sinh học, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ
enzyme đem phản ứng và chênh lệch độ hấp thụ của hỗn hợp enzyme cơ chất
sau phản ứng trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,69 đến 1,34 FU/ml. Từ đó
cho thấy rằng có thể áp dụng phương pháp đo quang để xác định hoạt lực của
nattokinase trong các chế phẩm có chứa enzyme này [50].
Mặc dù cả trong nước và trên thế giới đều đã có nhiều công trình
nghiên cứu về lumbrokinase cả chế phẩm tự nhiên lẫn chế phẩm tái tổ hợp,
tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu dừng lại ở mức độ tinh sạch, thử hoạt tính

22
và đánh giá các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này. Các
nghiên cứu về độ ổn định và các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm này
còn hạn chế. Xuất phát từ tình hình đó chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài
này nhằm mục tiêu tạo chế phẩm lumbrokinase chất lượng cao và an toàn, góp
phần vào công tác sản xuất các chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng phục
vụ hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối, một căn bệnh rất nguy hiểm và đáng
quan tâm hiện nay.

23
CHƯƠNG 2
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu
Giun quế (Perionyx escavatus) được thu mua từ trang trại giun quế
GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều là các hóa chất tinh khiết, của các
hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính được kê ở bảng 2.1.
Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất (nước)
Acrylamide, temed, bộ thuốc nhuộm Gram, thuốc thử N, Merck (Đức)
N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid
Acetone, butanol, ethanol, methanol, amonium sulphate Xilong (Trung Quốc)
Bộ Kit API 20E, regent kit Biomerieux (Pháp)
SDS, thrombin, plasmin, fibrinogen Sigma (Mỹ)
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Schalau (Tây Ban
Nha)
Thang protein chuẩn Fermentas (Latvia)
Cột cut off 10 kda và 50 kDa Millipore (Đức)
2.1.3. Các dung dịch và đệm
Các loại dung dịch và đệm dùng trong thí nghiệm đều được pha theo
hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn, có thành phần và nồng độ theo bảng
2.2.

24
Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Dung dịch APS
Dung dich Bradford gốc
Dung dịch Bradford
working
Dung dịch A
Dung dịch B
Dung dịch C
Dung dịch D
Dung dịch đệm phosphate
pH 7,2 gốc
Dung dịch đệm phosphate
pH 7,2 working
Dung dịch đệm hoạt hóa túi
thẩm tích
Dung dịch đệm potassium
phosphate 1M
Dung dịch đệm potassium
phosphate 20 mM
10% ammonium persulfate
100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue
G250, 200 ml 88% phosphoric acid
425 ml H2O, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88%
phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc
Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8,8
Đệm 0,5 M tris HCl, pH 6,8
30% acrylamide, 0,8% bis- acrylamide
10% SDS, 10 mM EDTA
34 g KH2PO4 trong 1000 ml nước cất
Pha loãng dung dịch đệm pH 7,2 gốc 800 lần
10 mM NaHCO3, 1 mM EDTA
K2HPO4 1 M, KH2PO4 1 M pha trong nước cất,
pH 7,4
Pha loãng đệm potassium phosphate 1 M 50 lần
Dung dịch nhuộm PAGE
0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

25
methanol; 10% (v/v) acid acetic
Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic
Đệm điện di protein 20 mM tris HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,8
Đệm 5x tra mẫu protein
0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M
tris HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Các môi trường nuôi cấy đều được pha dựa trên công thức chuẩn của
Dược Điển Việt Nam 5 và một số Dược Điển nước ngoài [51], [52]. Công
thức pha chế môi trường theo bảng 2.3.
Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường Thành phần
Môi trường thạch
Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g; bột đậu tương thủy phân
bởi papain 5,0 g; natri chloride 5,0 g; thạch 15,0 g, nước tinh
casein đậu tương
khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2.
Casein thủy phân bởi pancreatin 17,0 g; dikali hydrophosphate
Môi trường lỏng 2,5 g; bột đậu tương thuỷ phân bởi papain 3,0 g; glucose 2,5 g;
casein đậu tương natri chloride 5,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt
khuẩn 7,3 ± 0,2.
Glucose monohydrate 40,0 g; peptone 5,0 g; casein thủy
phân bởi pancreatine 5,0 g; thạch 15,0 g; cloramphenicol
Sabouraud –
50 mg; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt
dextrose
khuẩn 5,6 ± 0,2.
Môi trường lỏng
tăng sinh
Enterobacteria -
Mossel
Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; glucose monohydrate
5,0 g; mật bò khô 20,0 g; kali dihydrophosphate 2,0 g; dinatri
hydrophosphate 8,0 g; xanh briliant 15 mg; nnước tinh khiết
1000 ml; pH sau tiệt khuẩn 7,2± 0,2. Đun sôi trong 30 phút và

26
làm lạnh ngay.
Cao nấm men 3,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatine 7,0
Môi trường muối
g; muối mật 1,5 g; natri clorid 5,0 g; glucose monohydrat 10,0 g;
đỏ trung tính 30 mg; tím tinh thể 2 mg; thạch 15,0 g; nước tinh
mật violet-red
khiết 1000 ml; pH sau tiệt trùng 7,2± 0,2. Môi trường được đun
sôi để tiệt trùng.
Môi trường lỏng
Gelatin thủy phân từ pancreatin 20,0 g; llactose monohydrate
10,0 g; mật bò khô 5,0 g; tía bromocresol 10,0 g; nước tinh khiết
Mac-Conkey
1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2
Natri clorid: 5,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatin: 17,0 g;
Môi trường thạch thạch: 13,5 g; pepton: 3,0 g; đỏ trung tính: 30,0 mg; lactose: 10,0
Mac - Conkey g; tím tinh thể: 1,0 mg; muối mật: 1,5 g; nước tinh khiết 1000
ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,1 ± 0,2
Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; dikali hydrophosphat
2,0 g; thạch 10,0 g; lactose 10,0 g; eosin Y 0,4 g; xanh
Levine - eosin -
methylene 0,065 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt
xanh methylen
khuẩn 7,1 ± 0,2.
Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; thạch 15,0 g; pepton 5,0
Môi trường thạch g; đỏ phenol 0,025 g; cao thịt bò 1,0 g; natri clorid 75,0 g; D-
muối - manitol manitol; 10,0 g; nước cất 1000 ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,4 ±
0,2.
Xylose 3,5 g; L-lysin 5,0 g; lactose monohydrate 7,5 sucrose 7,5
Môi trường thạch g; natri chloride 5,0 g; cao nấm men 3,0 g; đỏ phenol 80 mg;
xylose – lysin – thạch 13,5 g, natri desoxycholat 2,5 g; natri thiosulphate 6,8 g;
desoxycholat sắt amoni citrate 0,8 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau
tiệt khuẩn 7,4 ± 0,2. Tiệt khuẩn bằng cách đun sôi.
Môi trường lỏng Peptone đậu tương 4,5 g; magnesi clorid hexahydrate 29,0 g;
tăng sinh natri chloride 8,0 g; dikali phosphate 0,4 g; kali
Salmonella dihydrophosphate 0,6 g; xanh malachite 0,036 g; nước tinh khiết

27
Rappaport
Vassiliadis
vừa đủ 1000 ml, pH sau khi tiệt khuẩn 5,2 ± 0,2
Peptone 5,0 g; đường trắng 10,0 g; cao men bia 3,0 g; đỏ phenol
Môi trường thạch 80 mg; casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; lactose 10,0 g;
xanh Brilliant xanh brilliant 12,5 g; natri chloride 5,0 g; thạch 20,0 g; nước tinh
khiết vừa đủ 1000 ml. pH sau khi tiệt khuẩn 6,9 ± 0,2
Casein thủy phân từ pancreatin 10,0 g; sắt (II) amonisulfat 0,3 g;
peptone 20,0 g; natri chloride 5,0 g; lactose 20 g; natri thiosulfat
Môi trường thạch –
0,3 g; đường trắng 10,0 g; thạch 12,0 g; D-glucose monohydrate
sắt – ba đường
1,0 g; đỏ phenol 0,025 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml. pH
sau khi tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2
2.1.5. Chủng vi sinh vật
Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh
Tên chủng Hãng sản xuất (nước)
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739 Biologic (Mỹ)
Salmonella tiphymurium ATCC 14028
2.1.6. Máy móc và thiết bị
Các máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu hiện đại và có độ chính
xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học
và Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (Bảng 2.5). toàn bộ
phép thử vi sinh được tiến hành trong phòng thí nghiệm vi sinh của Viện
Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP,
ISO/IEC 17025 và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm tiền đánh giá của WHO.

28
Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Cân phân tích BL10S
Hệ thống điên di ngang
Hệ thống lọc nước RO
Hệ thống tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật
Máy đo pH
Máy Votex OSI
Máy li tâm lạnh Hettich Mikro
22R Máy li tâm lạnh CF1 RXII
Máy quang phổ UV 200
Nồi hấp tiệt trùng
Tủ an toàn sinh học Safe fast
lite Tủ ổn nhiệt MIR 12
Tủ lạnh 4o
C GR N4 VTV Tủ
lạnh sâu -20o
C VCF 280 Tủ
lạnh sâu -84o
C MDF 192
Xuất xứ (hãng, nước sản xuất)
Sartorius (Đức)
Biorad (Mỹ)
Merck (Đức)
Memmert (Đức)
Metler Toleto (Trung Quốc)
Rotolab (Đức)
Hettich (Đức)
Hitachi (Nhật Bản)
Labomed (Mỹ)
Tomy Kygyo, Hyrayama (Nhật)
Faster (Ý)
Sanyo (Nhật)
Toshiba (Nhật)
Deawoo (Hàn quốc)
Sanyo (Nhật Bản)
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô
Giun quế Perionyx excavatus được thu mua từ trại nuôi giun quế
GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội. Sau khi ngâm và rửa sạch nhiều lần
bằng nước cất để loại hết các chất cặn bã trong đường tiêu hóa, lựa chọn
những cá thể còn sống, khỏe mạnh, đang trong thời kì sinh sản, có đai sinh
dục để sử dụng cho thí nghiệm.
Nghiền đồng thể 100 g giun đã rửa sạch với 400 ml NaCl 0,9%, ly tâm
4000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên. Dịch trên tiếp tục được ly tâm

29
12000 vòng/phút, trong 15 phút, thu được dịch enzyme thô. Sử dụng dịch
enzyme thô này cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase
2.2.2.1. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ
Nguyên tắc của phương pháp này là khi thêm dung môi hữu cơ vào môi
trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm vì thế
tạo ra kết tủa.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn loại dung môi là acetone,
butanol, ethanol và methanol. Sử dụng 5 ml dịch thô, thêm 20 ml dung môi (tỉ
lệ 1:4), tủa ở -200
C trong 30 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa.
Hòa tủa bằng đệm potassium phosphate 20 mM pH 7,4.
2.2.2.2. Phương pháp tủa muối amonium sulphate
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa và sự khác nhau về khả năng
kết tủa của các protein (trong đó có enzyme) ở một nồng độ muối xác định
(tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch
enzyme thô ban đầu.
Dịch enzyme thô được tủa muối amonium sulphate ở các nồng độ:
30%, 40%, 50%, 60% và 70%, các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 40
C.
Lượng muối amonium sulphate được thêm vào các dung dịch tủa được
tính theo công thức [53]:
G = 515 x (X – X0)/100 – 0,27 x X
Trong đó:
G: Số gram muối amonium sulphate cần thêm vào dịch enzyme
X: Độ bão hòa cần thiết
X0: Độ bão hòa cho trước
Tủa protein thu được hòa tan trong đệm potassium phosphate 20 mM,
pH 7,4 và được loại muối bằng phương pháp thẩm tích.

30
Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm tích sau đó
cho dịch tủa thu được vào túi, đặt túi thẩm tích trong nước cất lạnh, khuấy nhẹ
trên máy khuấy từ để loại muối, trong quá trình thẩm tích thay nước cất lạnh
khoảng 2h/lần. Toàn bộ quá trình thẩm tích được thực hiện ở 40
C.
Dịch enzyme sau khi tủa và thẩm tích loại muối được đo hàm lượng
protein và xác định hoạt tính thủy phân fibrin. Phân đoạn có hoạt tính riêng
cao nhất sẽ tiếp tục được tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100.
2.2.2.3. Phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G100
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của
enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra, dựa trên mức độdi chuyển khác nhau của các phân tử đó trong hệthống lưới
phân tử của gel sắc ký.
Mẫu được nạp vào đầu một cột có chứa các hạt làm từ polymer không
tan nhưng có tính hydrate hóa cao. Sephadex là một loại gel phổ biến trên thị
trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100 μm, được tạo
thành bởi liên kết ngang giữa dextran và epichlorohydrin. Những phân tử nhỏ
có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi những phân tử lớn hơn chỉ có
thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn hơn trong
cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước. Phân tử có kích thước trung bình có
thể thỉnh thoảng đi được vào bên trong hạt sẽ rời cột ở vị trí giữa và những
phân tử nhỏ sẽ phải đi đoạn đường dài hơn nên sẽ ra khỏi cột sau cùng [54].
Cột có kích thước 26 x 0,6 cm được cân bằng với đệm 20 mM
potassium phosphate pH 7,4. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ,
thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml, thu được 24 phân đoạn các phân đoạn thu được
được đo hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân fibrin, và điện di
trên gel polyacrylamide 12,5 %.
2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch bằng cột cut off
Sử dụng cột cut off 10 kDa và 50 kDa để tinh sạch mẫu. Phân đoạn
enzyme có hoạt tính riêng cao nhất sau khi qua cột sephadex G100 được
chuyển lên cột cut off 10 kDa, ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, thu toàn

31
bộ pha trên. Phần dịch pha trên được chuyển lên cột cut off 50 kDa ly tâm
4000 vòng/ phút trong 15 phút để tách các protein có kích thước lớn hơn hoặc
bằng 50 kDa ra khỏi hỗ hợp. Sản phẩm sau đó được kiểm tra hàm lượng
protein, xác định hoạt tính thủy phân casein, hoạt tính thủy phân fibrin và điện
di kiểm tra trên gel SDS-PAGE.
2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin
Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp đĩa fibrin của
Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ
thể người) làm chuẩn [55].
Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân fibrin bằng LK tạo vòng tròn trong
suốt. Đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Hoạt tính thủy phân fibrin
của LK được xác định dựa trên đường chuẩn plasmin.
Tiến hành:
Chuẩn bị đĩa: Mỗi đĩa petri đường kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch
fibrinogen tinh khiết trong NaCl 0,9% (nồng độ 0,2%) được ngưng kết bằng
15 µl thrombin (100 UI/ml). Chú ý, đĩa đặt ở vị trí phẳng, dung dịch được đổ
cho đồng đều, tránh tạo bọt khí. Đĩa được để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để
fibrin đông tụ hoàn toàn.
Ủ phản ứng: Nhỏ từng giọt 10 μl dịch enzyme lên đĩa (giọt phải tròn),
ủ 37o
C trong 5 giờ. Khi đông tụ, fibrin có màu trắng đục, do đó, các vùng bị
thủy phân trở nên trong suốt, dễ dàng quan sát bằng mắt thường. Sau 5 giờ, đo
đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần để lấy
giá trị trung bình.
Xây dựng đường chuẩn plasmin: Để xác định chính xác hoạt tính
của enzyme nghiên cứu cần xây dựng đường chuẩn hoạt tính. Hoạt tính của
enzyme thủy phân fibrin thường được so sánh với hoạt tính của plasmin, là
enzyme thủy phân fibrin trong cơ thể. Plasmin được pha trong đệm potassium
phosphate 20 mM; pH 7,4. Nhỏ dung dịch enzyme lên đĩa fibrin (0,75- 2,4
IU), ủ 37o
C trong 5 giờ, đo đường kính và tính diện tích vòng phản ứng.
Đường chuẩn plasmin chỉ tuyến tính trong dải hoạt độ từ 0,75- 2,4 IU.
Do đó, chúng tôi chọn dải này để xác định hoạt tính thủy phân fibrin của

32
enzyme trong quá trình thí nghiệm. Đường chuẩn có phương trình : y=
49,215x + 24,493 (Hình 2.1). Trong đó, y là diện tích vòng phản ứng (mm2
)
và x là hoạt tính enzyme (IU).
Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin
2.2.4. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [56].
Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức
hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm.
Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng
protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch
bovine serum albumin huyết thanh bò (Hình 2. 2).
Tiến hành:
Ống thí nghiệm: 100 μl dịch mẫu được bổ sung 0,9 ml dung dịch
bradford working. Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm sau
2 phút.
Ống đối chứng: Thay dung dịch cần định lượng protein bằng nước cất.
Dựng đường chuẩn: Bovine serum albumin huyết thanh bò (BSA)
được pha trong nước cất với dải nồng độ từ 3-30 μg/ml. 100 μl dung dịch
BSA chuẩn được bổ sung 0,9 ml dung dịch Bradford working, đảo đều và tiến
hành so màu ở bước sóng 595 nm.

33
Đường chuẩn có phương trình y = 0,031x + 0,1298. Trong đó, y là độ
hấp phụ ở bước sóng 595 nm (OD595nm) và x là hàm lượng protein (μg/ml).
1.2
1 y = 0.031x + 0.1298
0.8 R² = 0.9839
0.6
0.4
0.2
0 5 10 15 20 25 30 35
0
Nồng độ BSA (μg/ml)
Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein
Nguyên lý: Hoạt tính thủy phân casein được xác định dựa theo phương
pháp Anson cải tiến [57]. Protein thuộc nhóm serine- protease nên có khả
năng thủy phân cơ chất là casein tạo sản phẩm là các tyrosine tự do.
Tiến hành:
Ống thí nghiệm: 250 μl dung dịch 1% casein pha trong 50 mM đệm
potassium phosphate pH 7,4 được cho vào ống nghiệm, bổ sung 125 μl dịch
enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 370
C trong 30 phút. Sau đó, bổ sung
625 μl dung dịch 5% TCA, đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, và
ly tâm 1000 vòng/phút trong 3 phút. Thu 250 μl dịch trong, bổ sung 1 ml dung
dịch 6% Na2CO3, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, thêm 250 μl dung
dịch 0,2 N Folin. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và so màu ở
bước sóng 750 nm.
Ống đối chứng: 125 μl dịch enzyme được bổ sung 625 μl dung dịch 5%
TCA, ủ nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó, bổ sung 250 μl dung dịch 1% casein

34
pha trong 50 mM đệm potassium phosphate pH 7,4. Hỗn hợp được đảo đều và
ủ ở 370
C trong 30 phút. Các bước sau tiến hành tương tự với ống thí nghiệm.
Xây dựng đường chuẩn tyrosine:
Dưới xúc tác của enzyme LK, casein bị thủy phân tạo sản phẩm là các
đơn phân tyrosine. Lượng tyrosine tạo ra từ phản ứng được tính toán nhờ sử
dụng L- tyrosine tinh khiết của hãng (Merck) làm chất chuẩn.
Quy trình xây dựng đường chuẩn tyrosine tiến hành tương tự như quy
trình ủ phản ứng enzyme với casein ở trên. Đường chuẩn có phương trình: y=
0,904x+0,017. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 750 nm (OD750nm) và
x là nồng độ tyrosine (µmol).
Nồng độ tyrosine (µmol)
Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine
2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide
Nguyên lý: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein với
nồng độ 12,5% polyacrylamide theo phương pháp điện di biến tính của
Leammli và cs (1970) [58]. Theo đó, các phân tử protein trong môi trường có
SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong
điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
Tiến hành:
Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách
mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên,

35
cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn
toàn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.6.
Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%
STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô (ml)
1 H20 khử trùng 1,94 1,18
2 Dung dịch A 1,5
3 Dung dịch B 0,5
4 Dung dịch C 2,5 0,3
5 Dung dịch D 0,06 0,02
6 APS 0,024 0,01
7 TEDMED 0,007 0,005
Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với
tỷ lệ mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95o
C, 10 phút.
Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ
dòng điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút.
Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie
Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy. Sau khi tẩy màu
kiểm tra kết quả bằng mắt thường.
2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn
Tất cả các chỉ tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn được thực hiện theo
phương pháp trong Dược điển Việt Nam 5 [51].
2.2.7.1. Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm
Xử lý mẫu: Cân khoảng 10 g chế phẩm, thêm dung dịch đệm phosphat
pH 7,2 để thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1
(hỗn hợp X). Tiếp tục pha
loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến độ pha loãng 10-2
,10-3
, 10-4
.
Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm
có độ pha loãng 10-2
,10-3
, 10-4
vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha
loãng tiến hành trên 2 đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml môi trường thạch
casein đậu tương, trộn đều, để môi trường đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa.
Ủ đĩa ở 30-350
C trong vòng 3-5 ngày.

36
Đếm tổng số vi nấm: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm có độ pha loãng
10-2
,10-3
, 10-4
vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha loãng tiến hành trên 2
đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml thạch Sabouraud, trộn đều, để môi trường
đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa. Ủ đĩa ở 20-250
C trong vòng 5-7 ngày.
Tính kết quả: Sau thời gian ủ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa.
Chọn 1 nồng độ pha loãng tại đó số lượng khuẩn lạc là lớn nhất và đĩa có số
lượng khuẩn lạc không quá 250 khuẩn lạc đối với vi khuẩn và không quá 50
khuẩn lạc đối với vi nấm. Số lượng vi sinh vật trong 1 g chế phẩm được tính
theo công thức:
NTB = (N1 + N2) /2 *d
Trong đó, N1, N2: Số khuẩn lạc trong đĩa 1 và đĩa 2
d: Độ pha loãng
2.2.7.2. Xác định tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật
Chuẩn bị mẫu như đã được mô tả trong mục 2.2.7.1 nhưng thay thế
dung dịch đệm phosphat pH 7, 2 bằng môi trường lỏng casein đậu tương thu
được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1
(hỗn hợp A) và ủ ở 20-250
C trong 2-5 h.
Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm
Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm Số lượng vi khuẩn Gram âm dung
0,1 g 0,01 g 0,001 g nạp mật có trong 1 g chế phẩm
+ + + Lớn hơn 103
+ + - Nhỏ hơn 103
và lớn hơn 102
+ - - Nhỏ hơn 102
và lớn hơn 101
- - - Nhỏ hơn 101
Lấy từng thể tích hỗn hợp A tương ứng với 0,1 g; 0,01 g; 0,001 g chế
phẩm cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường lỏng Enterobacteria
Mossel, lắc đều, ủ ở 30-350
C/24-48 h.
Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng
Enterobacteria Mossel, tiếp tục thử nghiệm như sau: với mỗi ống môi trường
Enterobacteria Mossel lỏng cấy một quai cấy lên bề mặt một đĩa môi trường
muối mật Violet-Red, ủ ở ủ ở 30-350
C/18-24 h. Nếu trên đĩa môi trường muối
mật Violet-Red có các khuẩn lạc màu đỏ chứng tỏ kết quả dương tính.

37
2.2.7.3.Phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh
Cấy 10,0 ml hỗn hợp X đã thu được trong mục 2.2.7.1 vào 100 ml môi
trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30-350
C/24-48 h. Sau thời gian nuôi cấy
nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng casein đậu tương,
tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng casein đậu tương
sang các môi trường đặc hiệu cho từng vi khuẩn.
a. Xác định Escherichia coli
Lắc đều bình môi trường lỏng casein đậu tương, lấy 1 ml hỗn dịch canh
thang chủng này cấy vào bình chứa 100 ml môi trường lỏng MacConkey, ủ ở
42°C - 44°C/24 - 48 hh. Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng
MacConkey sang bề mặt đĩa môi trường thạch MacConkey ủ ở 30 -35 °C
trong 18 - 72 h. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật
phát triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc
trưng chứng tỏ không có E. coli trong chế phẩm.
Nếu trên bề mặt đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc màu đỏ gạch, có
thể có vòng mật kết tủa bao quanh thì lấy khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm
soi theo phương pháp nhuộm Gram.
Quan sát hình thái vi sinh vật ở vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần,
nếu thấy vi sinh vật là trực khuẩn Gram âm thì cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ
sang bề mặt đĩa môi trường thạch Levine Eosin xanh methylen. Nếu có nhiều
khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc
đã lựa chọn, ủ các đĩa ở 30 - 35°C/24 - 48 giờ. Trên môi trường này nếu
không thấy có vi sinh vật phát triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng
không có dạng khuẩn lạc đặc trưng chứng tỏ không có E. coli trong chế
phẩm. Nếu trên môi trường thấy khuẩn lạc có ánh kim dưới ánh sáng phản xạ
hoặc khuẩn lạc xanh đen dưới ánh sáng truyền qua thì thì tiếp tục định danh vi
khuẩn bằng kit API 20E.
b. Xác định Staphylococcus aureus
Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng Casein đậu tương
sang bề mặt đĩa môi trường thạch muối manitol và ủ ở 30 – 35 °C trong 18 –
72 h. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật phát triển

38
hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc trưng chứng
tỏ không có Staphylococcus aureus trong chế phẩm.
Nếu trên bề mặt đĩa môi trường xuất hiện các khuẩn lạc màu vàng cùng
với một vùng vàng xung quanh thì lấy khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm
soi theo phương pháp nhuộm Gram.
Quan sát hình thái vi sinh vật ở vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần
nếu thấy vi sinh vật là cầu khuẩn Gram dương, tụ lại thành từng đám như
chùm nho thì tiếp tục làm phản ứng coagulase.
Phản ứng coagulase (đông huyết tương):
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ bề mặt đĩa môi
trường thạch muối manitol vào ống nghiệm đã có sẵn 0,5 ml huyết tương thỏ
hoặc ngựa (hoặc huyết tương của loài động vật có vú) ủ ở 37o
C/24 giờ, 3 giờ
theo dõi 1 lần. Đồng thời làm ống chứng âm tính và dương tính.
Ống chứng âm tính là ống chỉ có 0,5 ml huyết tương.
Ống chứng dương tính là ống có 0,5 ml huyết tương có cấy một quai
cấy canh chủng Staphylococcus aureus ATCC 6538 đã được nuôi cấy trên
môi trường thạch casein đậu tương.
Nếu thấy có sự đông huyết tương ở bất kì mức độ nào chứng tỏ có
Staphylococcus aureus.
Các thử nghiệm trên đều dương tính chứng tỏ có thể có Staphylococcus
aureus trong chế phẩm. Khẳng định kết quả bằng kit API Staph.
c. Xác định Salmonella
Lấy 10 g mẫu vào bình chứa 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương,
ủ ở 30 – 35 o
C trong 18 đến 24 h. Cấy 0,1 ml môi trường lỏng casein đậu
tương vào ống chứa 10 ml môi trường lỏng Rappaport Vasiliadis Salmonella,
ủ ở 30 – 35o
C/18 - 24 giờ. Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng
này sang đĩa môi trường thạch Xylose Lysin Deoxycholat, ủ ở 30 – 35o
C/18 -
48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật phát
triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc trưng
chứng tỏ không có Salmonella trong chế phẩm. Trên môi trường này nếu

Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc

Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc

Similar to Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ Giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng Và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật Trong quá trình bảo quản sản phẩm.doc