Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx

Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
Cần Thơ, 2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
NGUYỄN THỊ TRÚC GIANG
NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ
BỆNH CHÁY BÌA LÁ (Xanthomonas oryzae pv.oryzae)
TRÊN LÚA BẰNG THỰC KHUẨN THỂ
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
G
T
Cần Thơ, 2014
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ
BỆNH CHÁY BÌA LÁ (Xanthomonas oryzae pv.oryzae)
iáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
S. Nguyễn Thị Thu Nga Nguyễn Thị Trúc Giang
MSSV: 3103598
Lớp: BVTB K36

i
------    ------
Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật với đề tài
NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH
CHÁY BÌA LÁ (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trúc Giang
Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét.
Cần Thơ, ngày….. tháng…..năm 2013
Cán bộ hướng dẫn
TS. Nguyễn Thị Thu Nga

ii
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT
------   ------
Hội đồng khoa học chấm luận văn tốt nghiệp với đề tài:
NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH
CHÁY BÌA LÁ (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
Do sinh viên Nguyễn Thị Trúc Giang thực hiện và bảo vệ trước hội đồng.
Ý kiến hội đồng:
...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ……………
Cần Thơ, ngày……tháng… .. năm 2013
DUYỆT KHOA Chủ tịch Hội đồng

iii
LƯỢC SỬ CÁ NHÂN
LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Nguyễn Thị Trúc Giang Giới tính: Nữ
Ngày sinh: 06/09/1992 Dân tộc: Kinh
Nơi sinh: huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
Họ và tên cha: Nguyễn Trần Phong
Họ và tên mẹ: Quách Thị Tư
Chổ ở hiện nay: 306/5, ấp Mỹ Lợi, xã Mỹ Phú, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang.
E- mail: trucgiang.a2@gmail.com
QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1. Tiểu học (1998 – 2003), trường: A Mỹ Đức. Địa chỉ: xã Mỹ Đức, huyện Châu
Phú, tỉnh An Giang
2. Trung học Cơ sở (2003 – 2007), trường: Mỹ Đức. Địa chỉ: xã Mỹ Đức, huyện
Châu Phú, tỉnh An Giang
3. Trung học Phổ thông (2007 – 2010), trường: Châu Phú. Địa chỉ: xã Mỹ Đức,
huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
4. Đại học (2010 – 2014), Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại
học Cần Thơ, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, TP.Cần Thơ.
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật (khóa 36)

iv
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Trúc Giang

v
LỜI CẢM TẠ
Thành kính biết ơn!
Cha mẹ đã suốt đời tận tuỵ vì sự nghiệp và tương lai của các con.
Chân thành ghi ơn!
Cô Nguyễn Thị Thu Nga là giáo viên hướng dẫn luận văn đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như trong
quá trình học tập.
Thầy cố vấn học tập Lê Văn Vàng và toàn thể Quý thầy, cô khoa Nông nghiệp
& Sinh học Ứng dụng nói riêng, Quý thầy, cô trường Đại học Cần Thơ nói chung
đã dạy đỗ và truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt
quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn!
Chị Đoàn Thị Kiều Tiên đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt cho em những kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tất cả các anh, chị trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo điều kiện thuận lợi
cho em hoàn thành tốt đề tài này.
Các bạn Trần Hưng Minh, Trần Hoàng Anh và các bạn trong (ngoài) lớp Bảo
vệ thực vật K36 đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực
hiện luận văn tốt nghiệp.
Trân trọng!
Nguyễn Thị Trúc Giang

vi
MỤC LỤC
NỘI DUNG
LƯỢC SỬ CÁ NHÂN ................................................................................................iii
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... iv
LỜI CẢM TẠ...............................................................................................................v
MỤC LỤC................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. ix
DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................x
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. xi
TÓM LƯỢC................................................................................................................xii
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1
CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................................3
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY LÚA ...................................................................................3
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................3
1.1.2 Tình hình sản xuất..........................................................................................3
1.1.3 Một số dịch hại quan trọng trên lúa...............................................................3
1.2 BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA...............................................................................4
1.2.1 Sự xuất hiện và phân bố bệnh........................................................................4
1.2.2 Triệu chứng....................................................................................................4
1.2.3 Tác nhân gây bệnh.........................................................................................5
1.2.4 Sự xâm nhiễm lan truyền và lưu tồn..............................................................6
1.2.4.1 Xâm nhiễm, lan truyền ............................................................................6
1.2.4.2 Lưu tồn.....................................................................................................6
1.2.5 Đặc điểm phát sinh, phát triển bệnh ..............................................................7
1.2.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh................................................................8
1.2.7 Bệnh pháp quản lý bệnh ................................................................................9
1.2.7.1 Biện pháp canh tác...................................................................................9
1.2.7.2 Biện pháp hóa học ...................................................................................9
1.2.7.3 Biện pháp sinh học ..................................................................................9

vii
1.3 THỰC KHUẨN THỂ TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC .............................10
1.3.1 Khái niệm về phòng trừ sinh học bệnh cây .................................................10
1.3.2 Sơ lược về thực khuẩn thể (Bacteriophages)...............................................10
1.3.2.1 Khái niệm ...............................................................................................10
1.3.2.2 Lịch sử và sử dụng thực khuẩn thể ........................................................11
1.3.2.3 Thành phần hóa học của thực khuẩn thể................................................12
1.3.2.4 Cấu trúc của thực khuẩn thể...................................................................12
1.3.2.5 Kích thước và hình dạng của thực khuẩn thể ........................................14
1.3.2.6 Phân loại thực khuẩn thể........................................................................14
1.3.2.7 Cơ chế sinh sản của thực khuẩn thể.......................................................15
1.3.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến thực khuẩn thể.............................................16
1.3.3 Thực khuẩn thể trong phòng trừ sinh học bệnh cây.....................................18
1.3.3.1 Nghiện cứu và ứng dụng liệu pháp thực khuẩn.....................................18
1.3.3.2 Thuận lợi và bất lợi trong việc áp dụng liệu pháp thực khuẩn thể........19
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................22
2.1 Phương tiện.........................................................................................................22
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm ................................................22
2.1.2 Trang thiết bị và vật liệu trong phòng thí nghiệm .......................................22
2.2 Phương pháp.......................................................................................................23
2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng thực khuẩn phân bố ở các tỉnh Đồng Bằng
Sông Cửu Long...........................................................................................................23
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá phổ kí chủ của 10 dòng thực khuẩn thể trên vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm ..............24
2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. oryzae của thực khuẩn thể trong điều kiện phòng thí nghiệm.............................24
2.2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của một số dòng thực khuẩn thể triển vọng trong
điều kiện nhà lưới .......................................................................................................25
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................28
3.1 Kết quả phân lập các dòng thực khuẩn phân bố ở các tỉnh Đồng Bằng Sông
Cửu Long ....................................................................................................................28

viii
3.2 Kết quả phổ kí chủ của 10 dòng thực khuẩn thể trên vi khuẩn Xanthomonas
oryzae pv. oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm.................................................31
3.3 Khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 4 dòng thực
khuẩn thể 10, 12, 13 và 17..........................................................................................33
3.4 Hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae của một số dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới ...........36
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................43
4.1 Kết luận...............................................................................................................43
4.2 Đề nghị................................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................44
PHỤ BẢNG ............................................................................................................

ix
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
Xoo: Xamthomonas oryzae pv. oryzae
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
NSKLB: Ngày sau khi lây bệnh
NSKG: Ngày sau khi gieo
dsDNA: double-stranded DNA
ssDNA: single-stranded DNA
ssRNA: single-stranded RNA
Phage: Thực khuẩn thể
PFU: Plaque forming unit
cfu: colony forming unit
bp: base pairs

x
DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tựa Trang
3.1 Danh sách chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae và
thực khuẩn thể tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long
29
3.2 Đánh giá phổ kí chủ của 10 dòng thực khuẩn thể trên 26 chủng vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
32
3.3 Đường kính phân giải của 4 dòng thực khuẩn thể đối với vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm
35
3.4 Chiều dài vết bệnh cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)
của các nghiệm thức xử lý với 4 dòng thực khuẩn thể qua các thời
điểm khảo sát
37
3.5 Trung bình cấp bệnh của 4 dòng thực khuẩn thể đối với bệnh cháy
bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) qua các thời điểm khảo
sát
38

xi
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tựa Trang
1.1 Triệu chứng bệnh cháy bìa lá lúa 6
1.2 Vi khuẩn Xoo tuôn trào từ mạch nhựa 6
2.1a Cấu trúc của thực khuẩn thể T4 13
2.1b Thực khuẩn thể T4 dưới kính hiển vi điện tử 13
2.2 Chu trình phân giải và chu trình tải nạp DNA của phage ôn
hòa
16
3.1a Plaques của dòng thực khuẩn thể 12 29
3.1b Nhân mật số dòng thực khuẩn thể 12 29
3.2 Các dòng thực khuẩn thể 7, 10, 12, 13, 17 kí sinh trên chủng
vi khuẩn Xoo 44
33
3.3 Đường kính phân giải vi khuẩn Xoo của dòng thực khuẩn
thể 10 ở thời điểm 12 giờ (a) và 48 giờ (b)
35
3.4 Chiều dài vết bệnh cháy bìa lá lúa (Xanthomonas oryzae pv.
oryzae) ở thời điểm 14 NSKLB
42

xii
NGUYỄN THỊ TRÚC GIANG, 2014. “Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh
cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể”.
Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng
dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thu Nga
TÓM LƯỢC
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây và nhà lưới Bộ môn
Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần
Thơ từ tháng 03/2013 đến tháng 12/2013 nhằm tìm hiểu khả năng tiêu diệt vi khuẩn
và hiệu quả phòng trị bệnh của một số dòng thực khuẩn thể đối với bệnh cháy bìa lá
lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra.
Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng thực khuẩn thể phân bố ở các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Kết quả có 10 dòng thực khuẩn thể có khả năng kí sinh 26
chủng vi khuẩn Xoo khác nhau tại các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc
Liêu.
Thí nghiệm 2: Khảo sát phổ kí chủ của 10 dòng thực khuẩn thể đối với 26
chủng vi khuẩn Xoo trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả ghi nhận 10 dòng
thực khuẩn thể có khả năng kí sinh với số lượng chủng vi khuẩn Xoo khác nhau tùy
theo từng dòng. Trong đó, 4 dòng thực khuẩn 10, 12, 13 và 17 có khả năng kí sinh
cao với số lượng dòng vi khuẩn bị kí sinh lần lượt là 16, 18, 14 và 14. Bên cạnh đó,
chủng vi khuẩn Xoo 44 (Thới Lai - Cần Thơ) và Xoo 52 (Long Mỹ - Hậu Giang) bị
kí sinh nhiều nhất bởi các dòng thực khuẩn thể được phân lập từ các vị trí khác
nhau trong 26 chủng vi khuẩn Xoo khảo sát, với số lượng dòng thực khuẩn kí sinh
lần lượt là 8 và 7 dòng thực khuẩn thể.
Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn Xoo 44 của 4
dòng thực khuẩn thể 10, 12, 13, và 17. Kết quả ghi nhận bốn thời điểm khảo sát của
4 dòng thực khuẩn thể, thể hiện qua đường kính phân giải vi khuẩn đều có sự khác
biệt giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa thống kê 5%. Trong đó, dòng thực khuẩn
thể 12 có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo 44 cao hơn các dòng thực khuẩn thể 10,
13, 17.
Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của bốn dòng thực khuẩn (10, 12, 13 và 17) ở điều
kiện nhà lưới. Kết quả ghi nhận qua cả 4 dòng thực khuẩn thể qua hai biện pháp
phun trước hoặc sau khi chủng bệnh một ngày, đều thể hiện hiệu quả giảm bệnh.
Trong đó, biện pháp xử lí phun trước của dòng thực khuẩn thể 12 cho hiệu quả
phòng trị cao hơn và ổn định.

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa (Oryza sativa L.) là nguồn sản phẩm chủ yếu và là cây lương thực quan
trọng hàng đầu thế giới. Trong canh tác lúa người nông dân luôn đối mặt với nhiều
dịch bệnh nguy hại, khó kiểm soát. Đặc biệt là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf
blight) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra. Bệnh gây hại nặng trên
quy mô lớn và có thể gây thất thu năng suất từ 20 – 30% có khi lên đến 50% (Mew,
1992).
Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới như ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, bệnh
xảy ra trong cả mùa khô và ướt. Song song đó, quá trình thâm canh tăng vụ đã dẫn
đến nhiều bệnh dịch phát triển và gây hại, trong đó bệnh cháy bìa lá ngày trở nên
quan trọng. Hiện nay, hầu hết các giống lúa thương mại của Việt Nam đều rất mẫn
cảm với các Xanthomonas oryaze pv. oryzae (Hoang Dinh Dinh và ctv., 2008).
Biện pháp phòng trị bệnh chủ yếu hiện nay là sử dụng giống kháng và áp
dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên, số lượng giống kháng còn hạn chế, giống kháng
không bền do sự biến động quần thể mầm bệnh rất nhanh. Vì thế, áp dụng thuốc
hóa học vẫn là biện pháp phổ biến, nhưng mặt hạn chế của biện pháp này là gây ô
nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe của người sản
xuất và người tiêu dùng. Một số thuốc diệt khuẩn đã được phát triển và sử dụng để
kiểm soát bệnh này nhưng không có hiệu quả và giá trị kinh tế cao (Shim và ctv.,
2012). Vì vậy, biện pháp sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong chiến lược
quản lí bệnh, vì nó thân thiện với môi trường và mang tính bền vững.
Phòng trị sinh học đối với bệnh do tác nhân là vi khuẩn được ghi nhân thành
công như sử dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng, vi khuẩn đối
kháng, tác nhân kích kháng lưu dẫn (SAR) (Agrios, 2005). Theo Balogh (2010), từ
những năm 1990, thực khuẩn thể được tìm thấy có hiệu quả kiểm soát của một số vi
khuẩn gây bệnh bao gồm Xanthomonas spp. (Civerolo và Kiel, 1969; Flaherty và
ctv., 2000), Pseudomonas spp. (Munsch và Olivier, 1995), Erwinia spp.
(Ravensdale và ctv., 2007), Ralstonia solanacearum (Tanaka và ctv., 1990) và
Streptomyces sp. (McKenna và ctv., 2001). Hiện nay, thuốc trừ bệnh bằng thực
khuẩn thể đã được thương mại hóa để phòng trừ bệnh do vi khuẩn (Balogh và ctv.,
2010).
Ở nước ta, chưa có nghiên cứu về thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh cháy
bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra trên lúa, vì vậy đề tài
“Nghiên cứu phòng trị bệnh cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) trên lúa
bằng thực khuẩn thể” được thực hiện để tìm hiểu khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây
bệnh cháy bìa lá lúa trong trong điều kiện phòng thí nghiệm và hiệu quả phòng trị
bệnh của thực khuẩn đối với bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới từ đó tìm

2
ra dòng thực khuẩn thể và phương pháp áp dụng thực khuẩn thể mang lại hiệu quả
phòng trị cao trong quản lí bệnh.

3
CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY LÚA
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Sampath và Rao (1951) cho rằng sự hiện diện của nhiều loại lúa hoang ở Ấn
Độ và Đông Nam Á chứng tỏ rằng Ấn Độ, Miến Điện hay Đông Dương là nơi xuất
xứ của lúa trồng (trích dẫn Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), lúa là cây hằng niên có tổng số nhiễm sắc thể
2n = 24. Về mặt phân loại thực vật, cây lúa thuôc họ Gramineae (hòa thảo), tộc
Oryzeae, chi Oryza. Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm
của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và
một phần ở Úc Châu (Chang, 1976 theo De Datta, 1981). Trong đó, chỉ có 2 loài là
lúa trồng, còn lại là lúa hoang hằng niên và đa niên. Loài lúa trồng quan trọng nhất,
thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L.
(De Datta, 1981; trích dẫn Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
1.1.2 Tình hình sản xuất
Năm 2011, diện tích trồng lúa thế giới là 164,6 triệu ha, sản lượng lúa đạt
đến 721 triệu tấn và năng suất đạt 4,38 tấn/ha. Mặc dù năng suất lúa ở các nước
Châu Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lúa lớn nên Châu Á vẫn là nguồn
đóng góp rất quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới. Châu Á sản xuất 651 triệu
tấn lúa (435 triệu tấn gạo) (FAO, 2012). Riêng Việt Nam, sản lượng lúa đạt đến
42,31 triệu tấn, diện tích trồng là 7,65 triệu ha và năng suất đạt đến 5,53 tấn/ha
(Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2012).
Theo Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn (2013), sản lượng lúa cả năm
2013 ước tính đạt 44,1 triệu tấn, trong đó diện tích gieo trồng ước tính đạt 7,9 triệu
ha, năng suất đạt 5,8 tấn/ha.
1.1.3 Một số dịch hại quan trọng trên lúa
Một số sâu hại tấn công trên cây lúa như rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal),
rầy lưng trắng (Sogatella furcifera), sâu đục thân bướm hai chấm (Scirpophaga
incertulas Walker), sâu cuốn là nhỏ (Medinalis guenee), bọ xít hôi (Leptocorisa
oratorius), bù lạch (Baliothrips biformis), sâu phao (Nymphula depunstalis)…Dịch
bệnh xuất hiện quan trọng trên cây lúa như bệnh đạo ôn (cháy lá) do nấm
Pyricularia oryzae, bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae,
bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani, bệnh đốm nâu do nấm Bipolaris oryzae,
bệnh lúa von do nấm Fusarium moniliform, bệnh vàng lùn do virus (RGSV), bệnh

4
lùn xoắn lá do virus (RRSV), bệnh thối bẹ do nấm Sarocladium oryzae, bệnh đốm
nâu do nấm Bipolaris oryzae (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
1.2 BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA
1.2.1 Sự xuất hiện và phân bố bệnh
Theo Ou (1983), bệnh cháy bìa lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka,
Nhật Bản vào khoảng năm 1884. Bệnh xuất hiện ở các nước chuyên trồng lúa của
Châu Á (Sharma, 2006) như Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản, Bangladesh,
Campuchia, Cộng Hòa Dân Chủ Nhân Dân Triều Tiên, Hàn Quốc, Lào, Malaysia,
Myanmar, Nepal, Pakistan, Philippin, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam. Và
ở Châu Phi như Brukina Faso, Cameroon, Gabon, Mali, Niger, Senegal, Togo (John
và ctv., 1984), Madagascar (Buddenhagen, 1985). Ở Australia, một vài nước ở Mỹ
Latin và gần đây là ở Mỹ (Sharma, 2006).
Theo Singh và ctv. (1977) vào thời điểm lúc trời mưa bệnh gây thiệt hại
khoảng 74 – 81,3 %. Mức độ thiệt hại còn tùy thuộc vào giống và mùa vụ.
Ở Nhật Bản, trên các ruộng nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể thất thu 20 –
30%, có khi lên đến 50%. Ở Phillipin, Ấn Độ và Indonesia bệnh cũng xuất và gây
hại nặng với thất thu năng suất từ 6 – 60% (Sharma, 2006).
Ở Việt Nam, bệnh cháy bìa lá lúa được ghi nhận ở Hà Nam vào năm 1970.
Diện tích lúa mùa giống bệnh ở mức độ 60 – 100%, giảm năng xuất từ 30 – 60%
(Ou, 1983).
1.2.2 Triệu chứng
Theo Vũ Triệu Mân và ctv. (2007), bệnh cháy bìa lá lúa phá hoại suốt thời
kỳ mạ đến khi lúa chín và có triệu chứng điển hình vào thời kỳ lúa cấy trên ruộng từ
sau khi lúa đẻ - trổ - chín - sữa. Triệu chứng trên mạ không thể hiện đặc trưng như
trên lúa, vì thế dễ nhầm lẫn với hiện tượng khô đầu lá do sinh lý. Triệu chứng ban
đầu trên phiến lá với những đường kẻ dài không đều (Agrios, 2005) hoặc vết nhũn
nước ở gần chóp lá rồi chạy dọc theo một hoặc hai bên rìa lá (Sharma, 2006). Khi
ẩm độ cao vết bệnh sẽ lan dài ra với những vệt có màu vàng và phát triển dần tạo
thành màu vàng xám hoặc xám khô chạy theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá bị
quăn queo và sau đó lan ra khắp lá (Sharma, 2006).
Phạm Văn Kim (2000) cũng cho rằng trường hợp lá lúa mắc bệnh cháy bìa lá
do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae thường tiết ra bên dưới nội bì của vết
bệnh những giọt dịch màu vàng chứa rất nhiều vi khuẩn, có thể quan sát giọt dịch vi
khuẩn bằng mắt thường vào sáng sớm.

5
Theo Ou (1983), ở vùng nhiệt đới đã phát hiện thấy 2 kiểu hình triệu chứng
“Kresek” hay héo rụi của lá và toàn bộ cây con; và hiện tượng vàng nhợt của lá
trong giai đoạn sinh trưởng muộn.
Ở các nước nhiệt đới, khi cấy người ta thường xén đỉnh lá mạ, các lá mạ này
thường bị bệnh đầu tiên. Triệu chứng bệnh xuất hiện sớm nhất là vết dạng thấm
nước màu xanh ở ngay dưới bề mặt vết cắt, sau đó nhanh chóng chuyển màu xanh
xám nhạt. Toàn bộ lá bị cuốn lại và héo, tiếp đến bẹ lá cũng nhanh chóng bị héo. Vi
khuẩn truyền theo mạch xylem đến điểm sinh trưởng của cây non và nhiễm bệnh
cho các gốc lá khác, dẫn đến cây non bị chết toàn bộ. Trong các giai đoạn sớm, khi
chỉ có một vài lá già bị héo và trông như nổi trên mặt nước. Ở Java của Indonesia
người ta hoàn toàn gọi đó là bệnh “Kresek” (Ou, 1983).
Trên cây lúa bệnh, lá già vẫn còn xanh, nhưng các lá non hơn bị vàng nhợt
không đều, trên các lá này có các sọc rộng màu vàng hoặc vàng xám nhạt, đó là
biểu hiện của triệu chứng lá vàng nhợt (Ou, 1983).
1.2.3 Tác nhân gây bệnh
Bệnh cháy bìa lá lúa hay bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. oryzae (Xoo) gây ra (Swing và ctv., 1990). Theo Ou (1983), lúc đầu vi khuẩn có
tên là Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama), Xanthomonas oryzae (Uyeda và
Ishitama) Dowson, Bacillus oryzae (Hori và Bokura) (Bokura, 1911), Pseudomonas
oryzae (Uyed và Ishiyama) (Ishiyama, 1922), Bacterium oryzae (Uyeda và
Ishiyama) Nakata (1927). Xanthomonas campestris pv. oryzae hoặc Xanthomonas
oryzae pv. oryzae (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Vi khuẩn hình gậy ngắn, tròn ở hai đầu, có kích thước 1,0 – 2,0 x 0,8 – 1,0
µm với một chiên mao dài 6 – 8 µm × 30 nm ở một đầu để di động. Gram âm và
không hình hình thành nội bào tử (Ishiyama, 1922; trích dẫn Ou, 1983).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử đã xác định kích thước tế bào vi khuẩn
0,55 – 0,75 × 1,35 – 2,17 µm đối với khuẩn lạc trên môi trường và 0,45 – 0,60 ×
0,65 – 1,40 µm đối với vi khuẩn lấy từ mô cây chủ. Có chiên mao 8,75 µm × 30 nm
(Ou, 1983).
Trên môi trường nhân tạo, vi khuẩn tạo khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu
vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, không có khả năng khử NO3,
không lỏng hoá gelatin, không tạo NH3 và indol, có khả năng tạo H2S, tạo khí
nhưng không tạo axit trong môi trường có đường (Ou, 1983).
Vi khuẩn Xanthomona oryzae pv. oryzae có capsule và tập hợp thành khối
khá bền vững, không tan trong nước, bị kết tủa bởi aceton. Capsule có vai trò bảo

6
vệ vi khuẩn chống lại sự khô hạn và những yếu tố môi trường bất lợi khác (Võ
Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
Hình 1.1 Triệu chứng bệnh cháy bìa lá lúa Hình 1.2 Vi khuẩn Xoo tuôn trào từ mạch nhựa
1.2.4 Sự xâm nhiễm, lan truyền và lưu tồn
1.2.4.1 Xâm nhiễm, lan truyền
Vi khuẩn xâm nhập qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá, mép lá, đặc biệt
qua vết thương sây sát trên lá. Khi tiếp xúc với bề mặt có nước, vi khuẩn dễ dàng di
động xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương mà nhân mật số, theo
các bó mạch dẫn lan rộng đi. Trong điều kiện mưa ẩm thích hợp thuận lợi cho sự
phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn. Thông
qua sự va chạm giữa các lá lúa, nhờ mưa gió lan bệnh sang các lá khác để tiến hành
xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong thời kỳ sinh trưởng của cây lúa. Cho nên tuy là
một loại bệnh có cự li truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tùy thuộc mưa, gió,
giông bão xảy ra trong mùa vụ mùa mà bệnh có thể lan truyền với phạm vi không
gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, đó chính là một
trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa
gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa nước ta (Lê Lương Tề và Vũ Triệu
Mân, 1999).
1.2.4.2 Lưu tồn
Theo Wakimoto (1962), có hai hình thái vi khuẩn: sinh trưởng thông thường
và hình thái khô. Vi khuẩn dạng khô nhỏ hơn vi khuẩn thông thường và sống sót lâu
hơn dưới những điều kiện bất lợi (trích dẫn Ou, 1983).
Vi khuẩn gây bệnh có thể sống trên nhiều loại cỏ nếu không có cây lúa
(Reissig và ctv., 1985). Các ký chủ cỏ dại của Xanthomonas oryzae ở Nhật Bản
được phát hiện đầu tiên qua lây bệnh nhân tạo (Goto và ctv., 1953), về sau tìm thấy

7
cỏ bị bệnh trong tự nhiên. Trong đó, cỏ Leersia sayanuka Ohwi là quan trọng hơn
cả vì nó là một ký chủ qua đông phổ biến. Ở vùng nhiệt đới, người ta phát hiện thấy
cỏ đuôi phụng (Leptochloa chinensis (L.) Ness, L. filiformis và L. panaca) là những
ký chủ cỏ dại ở Phillipin, lây bệnh bằng kim châm gây được các vết bệnh lớn trên
các cây đó (IRRI, 1967) (trích dẫn Ou, 1983).
Rao và Srivastava (1973) đã dùng thực khuẩn thể để khảo sát sự tồn tại của
vi khuẩn trong hạt và đã phát hiện thấy hạt giống nhiễm khuẩn cả bên trong hạt
(trích dẫn Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Theo Ou (1983), Fang và ctv.
(1956) phát hiện thấy vi khuẩn không những có ở ngoài vỏ hạt, mà còn có cả ở
trong nội nhũ. Tuy nhiên nếu hạt phơi nắng khô thì vi khuẩn không sống qua 40
ngày và khi ngâm hạt vào nước sau 24 giờ thì mật số bị giảm 99%, hoàn toàn bị
chết hẳn sau 5 ngày ngâm (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
Theo Ou (1983), vi khuẩn có thể sống trong đất từ 1 - 3 tháng, phụ thuộc vào
ẩm độ đất và độ chua của đất. Vi khuẩn có thể sống sót dễ dàng trong rơm rạ, bên
trong hoặc bên ngoài cọng rơm, ở những nơi không có cỏ hoặc ít cỏ Leersia, đó có
thể là nguồn bệnh quan trọng (Isaka, 1962; trích dẫn Ou, 1983).
1.2.5 Đặc điểm phát sinh, phát triển bệnh
Bệnh cháy bìa lá lúa thường phát sinh và gây hại lớn trong vụ mùa. Bệnh có
thể phát sinh sớm vào tháng 8, khi lúa đẻ nhánh đến khi lúa làm đòng, trỗ đến chín.
Bệnh phát sinh phát triển mạnh và lan truyền nhanh trong điều kiện nhiệt độ từ
260
C - 300
C, ẩm độ cao từ 90% trở lên (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Các lỗ thủy khổng trên phiến lá, các vết nứt sinh trưởng do các rễ mới mọc
ra ở gốc bẹ lá và các vết thương đều là nhưng điểm xâm nhập của nguồn bệnh (Ou,
1983). Bệnh có phát triển được hay không còn tuỳ thuộc vào mật số vi khuẩn, tối
thiểu là 103
tế bào/ml (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
Theo Ou (1983), vi khuẩn xâm nhập vào thủy khổng phân bố dọc theo bề
mặt phía trên của lá, cạnh rìa lá và nhân lên trong biểu mô, nơi thông với các mạch
dẫn. Khi vi khuẩn đã nhân lên đủ nhiều trong biểu mô, một số vi khuẩn xâm nhập
vào hệ thống mạch dẫn, một số khác thoát ra ngoài qua thủy khổng (Tabei và Muko,
1960; trích dẫn Ou, 1983).
Vết thương ở rễ do bị đứt khi nhổ mạ hay vết cắt chóp lá khi cấy, cũng là
những của ngõ xâm nhiễm và vi khuẩn thường gây triệu chứng Kresek. Triệu chứng
Kresek lệ thuộc vào nhiều yếu tố: sự phù hợp giữa dòng độc và giống nhiễm, số
lượng vết thương còn mới, nhiệt độ cao (280
C – 340
C). Người ta thấy, nếu tiêm
chủng vi khuẩn vào lá, vi khuẩn sẽ tan hết đến các điểm tăng trưởng trong vòng 10
ngày và trong vòng 17 ngày thì các bó mạch trong mô phân sinh sẽ dày đặc vi

8
khuẩn và cây bắt đầu héo và người ta cho rằng là do mạch mộc bị nghẽn nước, bởi
sự tập trung nhiều polysaccharide (vỏ nhày) của vi khuẩn (Võ Thanh Hoàng và
Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
Khi thời tiết khô, các giọt dịch vi khuẩn dạng viên tròn nhỏ rơi xuống nước
tưới. Nước nhiếm khuẩn được chảy qua các ruộng hoặc làm ngập ruộng trong mùa
mưa khiến cho nguồn bệnh được lan truyền rộng (Ou, 1983).
1.2.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh
Nhiệt độ: Muko và ctv. (1957) cho thấy nhiệt độ cao (250
C – 300
C) thích
hợp hơn cho bệnh phát triển so với nhiệt độ thấp 210
C và ở nhiệt độ 170
C hầu như
bệnh không phát triển (trích dẫn Ou, 1983). Thời gian biểu hiện triệu chứng cũng
phụ thuộc vào nhiệt độ, ở điều kiện nhiệt độ trên 310
C, triệu chứng Kresek sẽ biểu
hiện dưới 20 ngày. Trong khi đó, ở điều kiện nhiệt độ 210
C, triệu chứng bệnh
Kresek sẽ biểu hiện ở 40 ngày hoặc hơn 40 ngày sau khi lây bệnh (Ou, 1983).
pH: Vi khuẩn có thể sống trong khoảng pH khá rộng từ 5,7 – 8,5 thích hợp
nhất là pH 6,8 – 7,2 (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Điều kiện canh tác và giống lúa: Sự phát triển và tác hại của bệnh phụ
thuộc vào điệu kiên thời tiết, đồng thời còn phụ thuộc theo giống lúa và đặc biệt là
kĩ thuật canh tác (như chế độ phân bón, chế đội nước) và giai đoạn sinh trưởng của
cây. Ngoài ra, điều kiện đất chua, úng, ngập nước hoặc mực nước sâu, đặc biệt lúa ở
vùng đất màu mở, nhiều mùn, thường có bóng râm bệnh sẽ phát triển sớm và mạnh
hơn. Mực nước ruộng ngập sâu, cây dễ bị nặng hơn khi giữ mực nước cạn (5 cm)
(Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Bón quá thừa phân đạm (nhất là dạng đạm hữu cơ); bón thúc muộn; thiếu lân
và kali, hoặc thừa silicat và magiê đều làm tăng bệnh. Ảnh hưởng của phân đạm đến
bệnh có thể chủ yếu do đạm thúc đẩy sinh trưởng dinh dưỡng của cây, làm gia tăng
ẩm độ và sự lây lan của bệnh (Ou, 1983).
Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm bệnh của cây
sớm hay muộn và mức độ bị nặng hay nhẹ. Nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ
nhánh thì mức độ bệnh về sau thường rất nặng có thể làm giảm 41% năng suất trở
lên, nếu bị bệnh bắt đầu từ thời kỳ đòng - trổ tác hại có thể vẫn còn cao hơn. Nhưng
nếu ở thời kỳ cuối (chín sữa – chắc) mới nhiễm bệnh thì mức độ tác hại ít hơn, tối
đa dưới 10% (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Trong dự báo bệnh cháy bìa lá lúa, các nhân tố khí hậu là những đối tượng
để phân tích. Người ta phát hiện thấy mức độ bệnh có tương quan với tổng lượng
mưa, các đợt mưa lớn, ngập lụt, gió mạnh và độ sâu nước tưới (Ou, 1983).
1.2.7 Biện pháp quản lý bệnh

9
1.2.7.1 Biện pháp canh tác
Biện pháp cơ bản nhất để phòng trừ bệnh bạc lá là dùng giống kháng bệnh,
xây dựng ruộng nhân giống không bệnh, và điều chỉnh sinh trưởng của lúa bằng các
biện pháp kỹ thuật canh tác, nhất là kỹ thuật bón phân và nước. Đồng thời làm tốt
khâu xử lí hạt giống và vệ sinh đồng tiêu diệt tàn dư lá bệnh trên đất ruộng, diệt các
loài cỏ dại là kí chủ phụ (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Điều khiển sự sinh trưởng của cây tránh giai đoạn làm đòng – trỗ trùng với
những điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển. Ruộng lúa cần điều chỉnh mực nước
thích hợp, nếu thấy bệnh chớm xuất hiện có thể rút nước, tháo nước để ruộng khô 2
– 3 ngày để hạn chế sự sinh trưởng của cây. Bón phân đúng kỹ thuật, đúng giai
đoạn, bón đạm nặng đầu nhẹ cuối, bón thúc sớm cân đối với kali theo tỉ lệ 1:1 (Vũ
Triệu Mân và ctv., 2007).
1.2.7.2 Biện pháp hóa học
Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm (1993) cho rằng có thể phun hỗn
hợp Bordeaux có trộn thêm đường để giảm ngộ độc cho cây. Các hợp chất đồng chủ
yếu là có tác dụng ngừa bệnh và hiệu quả không kéo dài nên phải phun thường kỳ
nhiều lần.
Các hợp chất thủy ngân đã được sử dụng đơn độc hoặc hỗn hợp với đồng.
Phun kháng sinh cloramphenicol và xenloxidin, cũng như các chất tổng hợp như
dithianon, dimethyl nickl cacbamat, fectiazon và phenazin được coi là ít độc hại
đồng thời lại có hiệu lực trung bình phòng trừ bạc lá vi khuẩn (Ou, 1983).
Có thể dùng một số thuốc hoá học để hạn chế bệnh như rắc vôi 60 – 80 kg/ha
lúc lúa mới bị chớm bệnh hoặc một số thuốc hoá học như Kasuran 0,1 – 0,2%,
Sankel 1/200…(Vũ Triệu Mân và ctv., 2007).
Để xác định thời gian dùng thuốc thích hợp phòng trừ bệnh có hiệu quả, có
thể dùng hệ thống dự báo. Ở Nhật, một số phương pháp dự báo bệnh cháy bìa lá vi
khuẩn như nhiễm bệnh tự nhiên, điều kiện khí hậu, quần thể vi sinh vật (Ou, 1983).
Để tăng hiệu quả phòng trị, cần phối hợp nhiều biện pháp như sử dụng giống
kháng, tránh ruộng bị ngập úng, diệt các nguồn bệnh lưu tồn, không bón thừa phân
đạm, kết hợp với phun ngừa bằng các loại thuốc hoá học.
1.2.7.3 Biện pháp sinh học
Theo Asai và Nakai (1998), xử lý hạt giống và phun lên lá lúa hóa chất
ethyleneimine và ethylmethanosulfonate, kích thích cây lúa có khả năng chống bệnh
cháy bì lá do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. oryzae gây ra.

10
Theo Trương Hồng Hạnh (2008), các hóa chất có khả năng kích kháng đối
với bệnh cháy bìa lá lúa (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) như CuCl2 0,05 mM,
oxalic acid 0,25 mM và Chitooligosac-charide 100 ppm.
Việc sử dụng một số tác nhân sinh học trong phòng trị bệnh cháy bìa lá đã
được nghiên cứu trong thời gian gần đây. Hai loài vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens và Brevibacillus brevis được đánh giá là cho hiệu quả cao để
kiểm soát bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong
nghiên cứu của Trần Thị Bích Trâm (2012). Pseudomonas aeruginosa 231-1 cho
hiệu quả kiểm soát bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Nguyễn Thị Tấm, 2013).
1.3 THỰC KHUẨN THỂ TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC
1.3.1 Khái niệm về phòng trừ sinh học bệnh cây
Theo Phạm Văn Kim (2000), “Biện pháp sinh học trong phòng trị bệnh cây
là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để
tạo nên một thể cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống
dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ,
không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế”. Biện pháp sinh học không có mục
đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh và cũng không có khả năng này.
Theo Agrios (2005), phòng trừ sinh học bệnh cây là kiểm soát bằng sinh học
một cách hoàn toàn hay một phần nhằm phá hủy mật số của mầm bệnh bằng những
vi sinh vật khác xuất hiện trong tự nhiên.
Eilenberg và ctv. (2006) đã định nghĩa: “Sử dụng các sinh vật sống để làm
giảm mật số hoặc ảnh hưởng của các loài dịch hại, làm chúng ít phong phú hoặc
giảm thiệt hại hơn so với các loài khác”.
1.3.2 Sơ lược về thực khuẩn thể (Bateriophages)
1.3.2.1 Khái niệm
Thực khuẩn thể là virus kí sinh vi khuẩn, theo nghĩa đen là “vật ăn vi khuẩn”
(Greek phagein = to eat) hay còn gọi tắt là phages (Singh và ctv., 2010).
Thực khuẩn thể nhỏ hơn ký chủ và có thể bị phân tách bằng cách xuyên qua
màng lọc với kích thước khe lọc là 0,45 µm. Chỉ có thể nhìn thấy qua kính hiển vi
điện tử (Walstra và ctv., 2006).
Thực khuẩn thể cấu tạo gồm có đầu hình đa diện ở trên của một trụ lõi nhỏ,
được bao bọc bởi lớp vỏ bọc bên ngoài. Ở chân đế của lõi là 6 sợi nhỏ giống như
“chân” nhện, nó là cái neo định vị của virus (Kingsley, 1982).

11
Thực khuẩn thể là thực thể sống đa dạng nhất về mật số, ước tính 1031
thực
khuẩn thể trong tự nhiên (Hendrix, 2003). Nước đại dương chứa hơn 1010
thực
khuẩn thể trên một lít nước biển (Bergh và ctv., 1989), và trầm tích trên hoặc nước
xung quanh trầm tích có thể chứa 107
- 109
thực khuẩn thể trên một lít (Danovaro
ctv., 2001; Hewson và ctv., 2001) (trích dẫn Shroyer, 2006).
1.3.2.2 Lịch sử và ứng dụng thực khuẩn thể
Hơn một trăm năm về trước, vào năm 1896, Hankin khám phá ra rằng nước
của sông Ganges và Jumma ở Ấn Độ có khả năng diệt khuẩn Vibrio cholera gây
bệnh dịch tả (Sharp, 2001). Hiện tượng này vẫn còn sau khi lọc nhưng biến mất khi
nước đun sôi. Ông suy đoán rằng nước sông để uống sẽ có tác động làm hạn chế sự
lây lan của bệnh dịch tả, nhưng không có ví dụ cụ thể về hiện tượng như trên nhiều
(trích dẫn Balogh, 2002).
Mãi đến hai thập kỷ sau, sự khám phá về thực khuẩn thể được biết đến. Một
nghiên cứu độc lập của Twort (1915) và d’Herelle (1917) đã báo cáo về tác nhân có
khả năng thâm nhập và phân giải vi khuẩn. Tuy nhiên, vấn đề này vẫn chưa được sự
đồng ý và còn nhiều tranh luận. Trong khi đó, Tworth cho rằng enzym của vi khuẩn
là nguyên nhân phân giải vi khuẩn, d’Herelle suy đoán rằng virus gây ra hiện tượng
đó. Mặc dù lý thuyết về thực khuẩn thể của d’Herelle không được chứng minh
thuyết phục khoảng trên 30 năm, ý tưởng về sử dụng thực khuẩn như một tác nhân
kiểm soát bệnh do vi khuẩn gây ra vẫn hoàn toàn là khái niệm của ông (trích dẫn
Balogh, 2002).
Thu hút sự quan tâm từ xã hội về lĩnh vực y tế với khả năng sử dụng thực
khuẩn như một công cụ chống lại nhiều bệnh vi khuẩn mà không có bất kì biện
pháp kiểm soát hiệu quả nào. Một thời gian ngắn sau đó khi d’Herelle khám phá,
Brunoghe và Maisin (1921) đã báo cáo về sự kiểm soát bệnh do vi khuẩn Bacillus
anthracis và Staphylococcus gây ra bằng thực khuẩn. Một năm sau đó, thực khuẩn
thể được ghi nhận kiểm soát bệnh thương hàn và lỵ trực trùng (Beckerich và
Hauduroy, 1922; Davison, 1922). Thực khuẩn thể cũng được sử dụng rộng rãi để
kiểm soát sự bùng phát dich tả ở Ấn Độ (Morrison, 1932). Trên 800 bài báo cáo
được công bố trong vòng 40 năm tiếp theo liên quan đến kiểm soát bệnh hoặc
phòng ngừa bằng thực khuẩn thể (trích dẫn Balogh, 2002).
Ngoài ra, vào năm 1924, Mallman và Hemstreet đã phân lập được vi sinh vật
bắp cải thối bằng cách lọc dịch trích từ bắp cải bị thối và dịch lọc của chất lỏng thu
được từ bắp cải bị thối có thể ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong
điều kiện phòng thí nghiệm. Kotila và Coons (1925) phân lập thực khuẩn từ các
mẫu đất được cho là có hoạt động chống lại các tác nhân gây bệnh thối đen gốc trên
khoai tây do Bacillus atrosepticus (Erwinia carotovora subsp. atroseptica). Họ đã

12
chứng minh thí nghiệm trong phòng ủ bệnh, khi kết hợp chủng vi khuẩn Bacillus
atrosepticus với thực khuẩn ức chế thành công các tác nhân gây bệnh và ngăn ngừa
thối củ (Kotila và Coons, 1925). Những thực khuẩn thể cũng được phân lập chống
lại vi khuẩn Bacillus carotovorus (Erwinia carotovora subsp. carotovora) và
Bacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) từ các nguồn khác nhau,
chẳng hạn như đất, cà rốt mục nát và nước sông (Coons và Kotila, 1925). Thomas
(1935) báo cáo hiệu quả kiểm soát bệnh héo Stewart ngô bằng vi sinh vật phân lập
từ thực vật bị bệnh có khả năng ức chế vi khuẩn Aplanobacter stewarti (Pantoea
stewarti) (trích dẫn Balogh, 2002).
Mặc dù sớm nhận được sự quan tâm nhưng thực khuẩn đã không trở thành
liệu pháp để kiểm soát bệnh do vi khuẩn, các liệu pháp thể thực khuẩn không chứng
minh được hiệu quả kiểm soát bệnh do hạn chế về kiến thức sinh học đối với hiện
tượng thực khuẩn và kỹ thuật nghiên cứu chưa phát triển (Kutter, 1997). Ngay cả
khi liệu pháp thực khuẩn thể có hiệu quả nhưng vẫn chưa được tin cậy do hạn chế
trong kiểm soát bệnh thực tế trên diện rộng. Cuối cùng, sau khi phát hiện thuốc
kháng sinh chứng minh là hiệu quả hơn nhiều thuốc diệt khuẩn, việc sử dụng thực
khuẩn là tác nhân kiểm soát sinh học phần lớn bị bỏ qua và các nhóm nghiên cứu
thực khuẩn thể bị thay đổi để tập trung nghiên cứu cơ bản (trích dẫn Balogh, 2002).
1.3.2.3 Thành phần hóa học của thực khuẩn thể
Các hạt thực khuẩn thể cấu tạo từ protein (khoảng 50 - 60%) và acid nucleic
(40 - 50%). Thực khuẩn thể cũng chứa đựng tỷ lệ nhỏ lipid ở dạng chất béo trung
hòa. Vách của phần đầu chứa khoảng 2000 đơn vị giống nhau của protein. Acid
nucleic của thực khuẩn thể có thể là dsDNA, hoặc ssDNA hoặc ssRNA (DNA và
RNA không bao giờ tồn tại cùng nhau). Ngoại trừ coliphage, Φ174 và một vài loại
khác thì hầu như thực khuẩn đều mang dsDNA. DNA thực khuẩn thể khác DNA vi
khuẩn về mặc hóa học. Trọng lượng phân tử DNA của thực khuẩn thể là 2500000
bp và tổng trọng lượng acid nucleic mỗi hạt thực khuẩn thể ước chừng 6×10-3
mg.
DNA là vật chất di truyền của hạt thực khuẩn; nó xâm nhiễm và làm cho tế bào tổng
hợp ra nhiều hạt thực khuẩn (Singh và ctv., 2010). DNA thực khuẩn thể hoặc
genome có ở bên trong đầu, và kích thước của nó thì đặc trưng cho từng loài thực
khuẩn thể, thay đổi từ 2 đến 13×104
bp (Walstra và ctv., 2006).
1.3.2.4 Cấu trúc của thực khuẩn thể
Theo Singh và ctv. (2010), thực khuẩn thể là hạt rất nhỏ và có thể xuyên qua
màng lọc vi khuẩn (có đường kính lổ lọc 0,2 – 0,45 µm). Cấu trúc cơ bản của thực
khuẩn được biết thông qua kính hiển vi điện tử là T4. T4 là thực khuẩn thể của vi
khuẩn E. coli có cấu tạo bởi ba bộ phận: đầu, cổ và đuôi. Đầu có cấu trúc 20 mặt

13
còn đuôi lại có cấu trúc đối xứng xoắn. Chính vì vậy mà người ta gọi là đối xứng
phức hợp.
1. Phần đầu dài 95 nm, rộng 65 nm, dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ
20 mặt. Vỏ có cấu tạo bởi 8 loại protein, lượng chứa protein chiếm tới 76 - 81%
trong thể thực khuẩn. Vỏ của T4 có cả 212 capsome, mỗi capsome có đường kính là
8 nm. Bên trong đầu có sợi ADN xoắn kép.
(a) (b)
Hình 2.1 (a) Cấu trúc của thực khuẩn thể T4
(b) Thực khuẩn thể T4 dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn Willey và ctv. (2008), The McGraw-Hill Companies. Inc, pp. 347)
2. Phần cổ nối phần đầu với phần đuôi. Đó là một đĩa hình lục giác tạo
thành, đường kính 37,5 nm, có 6 tua cổ (cảnh tu) mọc ra từ cổ.
3. Phần đuôi gồm có bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc, 6 mấu ghim và 6 sợi đuôi:
đuôi dài 95 nm, có 24 vòng xoắn cấu tạo bởi 144 capsome cấu tạo nên. Ống đuôi
dài 95 nm, đường kính 8 nm, ở giữa có lổ thủng đường kính 2,5 - 3,5 nm. Đây là
con đường để dẫn ADN trong đầu của thể thực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào vật
chủ.
- Ống đuôi cũng cấu tạo bởi 24 vòng xoắn, tương ứng với 24 vòng xoắn trên bao
đuôi.
- Đĩa gốc cũng tương tự như đĩa cổ, đó là một đĩa hình lục giác, rỗng ở giữa.
Đường kính đĩa gốc là 30,5 nm, trên đó mọc ra 6 sợi đuôi và 6 mấu ghim.

14
- Mấu ghim dài 20 nm có chức năng hấp phụ. Sợi đuôi dài 140 nm có thể gấp lại ở
chính giữa, đường kính 2 nm.
- Sợi đuôi cấu tạo bởi 2 loại phân tử protein khá lớn và 4 loại phân tử protein khá
nhỏ. Nó có tác dụng hấp thụ chuyên hóa vào vùng mẫn cảm của bề mặt tếbào vật
chủ. Sau khi sợi đuôi hấp thụ đĩa gốc sẽ bị kích thích, dẫn đến việc co rút bao đuôi
và làm cho ống đuôi đâm vào tế bào chủ (trích dẫn Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008).
1.3.2.5 Kích thước và hình dạng của thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể có kích thước và hình dạng khác nhau. Phổ biến nhất là thực
khuẩn thể có dsDNA là dạng hình cầu hoặc thon dài với cái đuôi để gắn vào vi
khuẩn và bơm genome vào vi khuẩn. Ba loài thực khuẩn thể phổ biến được nghiên
cứu thường có kích thước và hình dạng khác nhau, từ 45 × 54 nm dạng thon của
Φ29, đến 62 nm dạng cầu của λ, và 86 × 120 nm dạng thon của T4 (Fulle, 2008).
Có rất nhiều dạng trong cấu trúc cơ bản của thực khuẩn thể. Ví dụ, chiều dài
và chiều rộng của đầu có thể là như nhau hoặc chiều dài có thể hơn chiều rộng. Tuy
nhiên, đầu to và ngắn không được thấy. Đuôi có thể rất ngắn (thấy rõ ràng qua kính
hiển vi điện tử) hoặc có chiều dài gấp 4 lần chiều dài của đầu và nó có thể không
quá mềm hoặc quá cứng. Tấm đệm có cấu tạo phức tạp cũng có thể hiện diện trên
đuôi. Khi tồn tại, nó thường có từ 1 cho đến 6 sợi đuôi (Burton, 2012).
1.3.2.6 Phân loại thực khuẩn thể
Lịch sử phân loại của thực khuẩn thể dựa trên thành phần vật liệu di truyền
và sự khác nhau về đặc điểm kiểu hình. Đặc điểm vật lý bao gồm loài kí chủ, hình
dạng vỏ và kích thước, sự tồn tại của các đuôi, độ bền với dung môi hòa tan, và các
đặc điểm cấu trúc khác. Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (ICTV) (The
International Committee on the Taxonomy of Virus) yêu cầu hiển thị thực khuẩn
thể bằng kính hiển vi điện tử để phân loại (Murphy và ctv., 1995). Hệ thống phân
loại có 13 họ thực khuẩn thể, có khả năng xâm nhiễm cho hơn 140 chi vi khuẩn.
Thực khuẩn thể từ vài họ khác nhau có thể xâm nhiễm một loài của vi khuẩn
(Ackermann, 2001) (trích dẫn Shroyer, 2006).
Theo Lwoff (1953), thực khuẩn thể tồn tại ở 3 dạng: virion ngoại bào
(extracellular virion), phage ở dạng sinh trưởng (vegetative phage) và thể tiền phage
(prophage). Virion ngoại bào thì được hình thành bởi hạt thực khuẩn thể với nhân
acid nucleic và vỏ protein. Nó xâm nhiễm tế bào vi khuẩn. Ở trường hợp nội bào,
thực khuẩn thể ở dạng phage sinh trưởng và thể tiền phage, chỉ đặc trưng bởi acid
nucleic. Phage ở dạng sinh trưởng, acid nucleic có khả năng tự tái sản độc lập, trong
khi đó thể tiền phage không bao giờ nhân lên độc lập và được lồng vào DNA vi
khuẩn (ký chủ) và nhân lên cùng với DNA vi khuẩn. Vi khuẩn thể chứa thể tiền
phage gọi là lysogenic bacteria, các virus có nucleic acid có thể trở thành prophage

15
(hợp nhất với DNA vi khuẩn) thì được gọi là thực khuẩn thể ôn hòa, lysogenic
phages, temperate phages hoặc avirulent phages (F2, M12). Một nhóm thực khuẩn
thể khác luôn luôn nhân lên khi nó vào tế bào ký chủ gọi là thực khuẩn thể độc,
virulent phages hoặc lytic phages (T2, T4 phages) (trích dẫn Singh và ctv., 2010).
1.3.2.7 Cơ chế sinh sản của thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể giống như tất các loài virus, không được xem như sinh vật
sống bởi vì nó dựa vào hệ thống trao đổi chất của tế bào ký chủ và ribosome để tái
sinh. Tuy nhiên, chu kỳ sống của thực khuẩn thể thường được sử dụng để mô tả các
giai đoạn khác nhau của sự xâm nhiễm virus từ tiếp xúc ban đầu của virus với tế
bào ký chủ (Adsorption), đến giai đoạn xâm nhiễm (Penetration), giai đoạn tổng
hợp và trao đổi vật liệu với tế bào kí chủ, giai đoạn hình thành cấu trúc phages mới,
giai đoạn phóng thích (Hình 1.2) (Kutter và Sulakvelidze, 2005).
Dựa vào sự kí sinh của phage với tế bào ký chủ, phage được chia thành 2
nhóm: nhóm độc (virulent hoặc lytic phages) và nhóm ôn hòa hoặc không độc
(avirulent hoặc temperate phages) (Kutter và Sulakvelidze, 2005).
Đối với phage độc, khi kí sinh và xâm nhiểm tế bào kí chủ chỉ xảy ra chu
trình phân giải (lytic cycle) nghĩa là thực khuẩn thể sẽ chèn DNA của chúng vào tế
bào vi khuẩn điều khiển tế bào kí chủ tổng hợp nhanh thành nhiều thực khuẩn thể
mới sau đó chúng tiêu diệt tế bào kí chủ và thực khuẩn thể mới được phóng thích ra
môi trường. Quá trình này có thể xảy ra trong vài phút đến vài giờ (Hình 1.2 – chu
trình bên trái (lytic cycle)) (Kutter và Sulakvelidze, 2005).
Ngược lại đối với nhóm ôn hòa, quá trình kí sinh xảy ra hai giai đoạn phân
giải (lytic cycle) và giai đoạn tải nạp DNA (lysogenic cycle) trong chu kỳ sống của
chúng (Hình 1.2). Thỉnh thoảng khi xâm nhiễm kí chủ, phage sẽ khởi động chu
trình phân giải kết quả sẽ hình thành phage mới và giết tế bào kí chủ, hoặc chúng có
thể chuyển sang giai đoạn tải nạp DNA (lysogenic cycle) nghĩa là thay vì nhân bản
nên phage mới, DNA của thực khuẩn thể được chèn vào bộ gen của vi khuẩn, ở đây
bộ gen của thực khuẩn thể được sao chép thụ động khi bộ gen của tế bào kí chủ
sao bản, quá trình này không giết chết tế bào vi khuẩn mà chỉ gây ra sự biến đổi di
truyền của tế bào vi khuẩn, phage ở chu kỳ tải nạp ở trạng thái yên lặng nên được
gọi là thể tiền phage (prophage). Phage ôn hòa có thể giúp tế bào kí chủ khỏi sự tấn
công của phage khác đồng thời cũng làm thay đổi ý nghĩa những đặc tính của tế
bào kí chủ như tính kháng đối với kháng sinh hay sự mẫn cảm đối với môi trường.
Đôi khi prophage có thể làm thay đổi tính độc của tế bào vi khuẩn kí chủ (Kutter và
Sulakvelidze, 2005).

16
Hình 1.2 Chu trình phân giải và chu trình tải nạp DNA của phage ôn hòa
(Nguồn Willey và ctv. (2008), The McGraw-Hill Companies. Inc, pp. 349)
Đối với thực khuẩn thể T4 trên vi khuẩn E. coli, toàn bộ chu trình từ lúc
phage tiếp xúc bề mặt đến tiêu diệt tế bào kí chủ trong khoảng 20 - 30 phút ở
370
C. Trong thời gian đó lượng phage tăng lên hàng trăm lần, tuy nhiên lượng tế
bào vi khuẩn chỉ tăng gấp đôi (Phạm Thành Hổ, 2006).
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến thực khuẩn thể
pH: Thực khuẩn thể thường ổn định trong khoảng pH từ 5 đến 8. Ở phạm vi
nhiệt độ thấp có thể tồn tại từ pH 4 đến 9 hoặc 10. Thực khuẩn thể T2 có thể bị kết
tủa ở pH 4 mà không mất đi tính nhiễm (Herriott và Barlow, 1952; trích dẫn Mark
và ctv., 1959).
Urê và Urethane: Cả urê và urethane đều làm biến tính protein và bất hoạt
các enzyme, cũng như bất hoạt cả virus. Urê đã được sử dụng để ly trích nucleic
acid từ thực khuẩn thể T2 (Cohen, 1947). Ảnh hưởng của urethane đến sự khử hoạt
tính của coliphage T5 được nghiên cứu bởi Foster và ctv. (1949) (trích dẫn Mark và
ctv., 1959)
Chất tẩy rửa: Burnet và Lush (1940) thử nghiệm 3 loại chất tẩy rửa có hoạt
chất từ dodecyl sulfate natri, natri deoxycholate, và saponin trên một số virus động
vật và cũng như thực khuẩn CI 6, D6, D44, hai thực khuẩn thể Salmonella và hai
thực khuẩn thể tụ cầu. Tất cả các thực khuẩn thể đều có khả năng đề kháng với 3
chất tẩy rửa, trong khi đó nhiều virus động vật đã nhanh chóng bất hoạt (trích dẫn
Mark và ctv., 1959)

17
Chất tạo phức: Chất tạo phức là hợp chất phân tử kết hợp với các ion kim
loại. Lark và Mark (1953) phát hiện ra rằng citrate, ethylenediaminetetraacetate và
triphosphate tăng tốc tiến trình thoái hóa của thực khuẩn thể T5 ở nồng độ muối
thấp (trích dẫn Mark và ctv., 1959).
Khí Mustard: Khí mustard và mustard nitơ được chú ý trong sinh học vì
không chỉ làm bất hoạt các enzyme, diệt virus và vi sinh vật mà còn có tác động gây
đột biến. Các đối tượng đã được kiểm tra như là T2 coliphage và thực khuẩn thể tụ
cầu (trích dẫn Mark và ctv., 1959).
Acohol: Glycerine nguyên chất và ethanol là nguyên nhân làm ngừng hoạt
động của thực khuẩn thể (d'Herelle, 1926) (trích dẫn Mark và ctv., 1959).
Hóa chất khác: Cyanua và florua, không phá vỡ thực khuẩn thể ở nồng độ
có thể gây chết vi khuẩn. Cyanua đã được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển thực
khuẩn thể mà không làm bất hoạt các hạt phage vào các thời điểm mong muốn
trong giai đoạn tiềm tan (Doermann, 1952). Thymol và chloroform diệt khuẩn
nhưng không thể khử hoạt tính của thực khuẩn thể. Các chất này có thể được sử
dụng để bảo quản thực khuẩn thể (Wahl và Blum - Emerique, 1949; Fredericq,
1952; Sechaud và Kellenberger, 1956). Formaldehyde bất hoạt thực khuẩn thể,
nhưng Schultz và Gebhardt (1935) báo cáo rằng bất hoạt bằng formalin ở thực
khuẩn thể tụ cầu có thể được kích hoạt bằng cách pha loãng nồng độ. Có rất nhiều
nhận xét đối với ảnh hưởng của ion thủy ngân gây bất hoạt thực khuẩn thể. Krueger
và Baldwin (1934) cho thấy tỷ lệ ngừng hoạt động của thực khuẩn thể tụ cầu K
bằng HgCl2. Tác nhân oxy hóa như peroxide, halogen, ozone, và permanganat
nhanh chóng bất hoạt virus. Wahl và Blum - Emerique (1946) đề xuất việc bổ sung
các hydrosulfite để bảo vệ thực khuẩn thể bởi quá trình oxy hóa trong quá trình lưu
trữ (trích dẫn Mark và ctv., 1959).
Nhiệt bất hoạt: D'Herelle (1926) ghi nhận rằng một số thể thực khuẩn bị bất
hoạt khi nung nóng ở 750
C trong 30 phút. Trong khi đó, một số thực khuẩn thể tồn
tại và một số không, sau khi làm nóng ở 700
C (trích dẫn Mark và ctv., 1959).
Ánh sáng thường: Wahl và Guelin (1942) quan sát thấy rằng các thực khuẩn
thể SI 3 nhỏ đặc biệt nhạy cảm với ánh sáng đến mức bị bất hoạt và bị tiêu diệt bởi
bức xạ từ phần quang phổ có thể nhìn thấy với tỷ lệ nhiều hơn thể thực khuẩn CI 6
lớn. Wahl (1946) dùng bước sóng có bức xạ trong vùng lân cận của 450 nm, hoặc
trong vùng màu xanh. Ông cũng quan sát thấy rằng, phần lớn thực khuẩn thể như SI
3 nhỏ bị bất hoạt, trong khi đó các thể thực khuẩn coli 36 và liên cầu B563, như CI
6 lớn, chống lại sự bất hoạt bởi ánh sáng. Điều này được cho là do một số sự khác
biệt trong thành phần hóa học của các chủng thực khuẩn, trong đó chỉ có các loại

18
thể thực khuẩn nhạy sáng có chứa một số sắc tố hấp thụ ánh sáng màu xanh (trính
dẫn Mark và ctv., 1959).
Ánh sáng cực tím: trong tất cả các tác nhân có khả năng làm bất hoạt thực
khuẩn thể, tia cực tím được nghiên cứu rộng rãi nhất và đã cho thấy những tác động
đa dạng và thú vị. Ngoài ra việc làm bất hoạt các hạt thực khuẩn, tia cực tím còn có
tác động đến sinh lý và di truyền quan trọng, chẳng hạn như phát triển thực khuẩn
thể gây tan vi khuẩn, gây ra sự tăng trưởng chậm của các hạt thực khuẩn còn sống
sót sau chiếu xạ, kích thích sự tái tổ hợp di truyền, và gây biến đổi gen. Một số tác
dụng của tia cực tím, có thể đảo ngược trong điều kiện thích hợp. Ánh sáng tia cực
tím cũng được sử dụng để nghiên cứu quá trình phát triển thể thực khuẩn nội bào
(trích dẫn Mark và ctv., 1959).
1.3.4 Thực khuẩn thể trong phòng trừ sinh học bệnh cây
1.3.4.1 Nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể
Sử dụng thực khuẩn trong nông nghiệp như một tác nhân kiểm soát sinh học
ức chế các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trong thực tế được ghi nhận (Gill và Abedon,
2003). Áp dụng thực khuẩn thể có thể làm giảm việc sử dụng thuốc hóa học, kết quả
này dẫn đến sự quan tâm mạnh mẽ của các nhà môi trường học. Song song đó cũng
giảm việc sử dụng thuốc kháng sinh, do kháng sinh có thể chuyển vào con người
thông qua chuỗi thức ăn (Goodridge, 2004; trích dẫn Grath và Sinderen, 2007).
Civerolo và Keil (1969) xử lí cây đào với thực khuẩn thể Xanthomonas campestris
pv. pruni (Xcp) trước 1 giờ chủng vi khuẩn, tỷ lệ lá bị nhiễm bệnh là 22% so với
58% đối chứng. Tanaka và ctv. (1990) làm giảm héo xanh thuốc lá do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum gây ra bằng thực khuẩn thể (trích dẫn Yamada, 2012).
Saccardi và ctv. (1992, 1993) làm giảm tỷ lệ đốm trái trên đào với ứng dụng phun
thực khuẩn có hiệu quả chống lại Xcp hai tuần một lần (trích dẫn Jones và ctv.,
2007). Kuo và ctv. (1997) khám phá ra rằng thể thực khuẩn của X. oryzae được
phân bố rộng rãi trong nước của cánh đồng lúa. Khi thực khuẩn thể thuần được áp
dụng 1, 3, và 7 ngày trước X. oryzae được chủng bệnh, hiệu quả giảm vi khuẩn lần
lượt là 100%, 96%, và 86% (trích dẫn Jones và ctv., 2007). Schnabel và ctv. (1999)
sử dụng hỗn hợp của ba thể thực khuẩn để kiểm soát bệnh cháy bạc lá trên táo và tỉ
lệ bệnh giảm bệnh đáng kể (37%) (trích dẫn Jones và ctv., 2007). Flaherty và ctv.
(2000) kiểm soát có hiệu quả bệnh trong nhà kính và thử nghiệm hỗn hợp của bốn
thể thực khuẩn chống lại sự gây hại của hai chủng vi khuẩn X. campestris pv.
vesicatoria gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua (trích dẫn Jones và ctv., 2007). Gill
và ctv. (2003) phân lập 47 thực khuẩn thể có khả năng phân giải E. amylovora.
Balogh và ctv. (2003) tăng cường hiệu quả của điều trị của thực khuẩn thể bằng
công thức bảo vệ làm tăng độ bền của thực khuẩn thể trên lá cà chua. Obradovic và

19
ctv. (2004) sử dụng thực khuẩn thể được bảo vệ kết hợp với các tác nhân kiểm soát
sinh học khác và tác nhân kích kháng, như là một phần của phương pháp quản lý
dịch bệnh tổng hợp (trích dẫn Jones và ctv., 2007).
1.3.4.2 Thuận lợi và bất lợi trong việc áp dụng liệu pháp thực khuẩn thể
Thuận lợi
Reddy (2013) ghi nhận nhiều lợi ích từ việc sử dụng liệu pháp thực khuẩn
thể trong kiểm soát dịch bệnh như sau:
Thể thực khuẩn tự sao chép và tự giới hạn, chỉ sao chép được khi vi khuẩn kí
chủ có trong môi trường, nhưng nhanh chóng bị giảm sút khi kí chủ không còn
(Kutter 1997; trích dẫn Reddy, 2013).
Thực khuẩn là những thành phần tự nhiên của sinh quyển, nó có thể dễ dàng
phân lập từ khắp mọi nơi mà vi khuẩn được tìm thấy, bao gồm đất, nước, thực vật,
động vật (Mark, 1959; Goyal và ctv., 1987; Woods và ctv., 1981) và cơ thể con
người (Osawa và ctv., 1981) (trích dẫn Reddy, 2013).
Thực khuẩn thể tấn công vào vi khuẩn thông qua việc xác định thụ thể của vi
khuẩn gây bệnh, vì vậy sẽ giảm tính ổn định của các thể đột biến trong tính độc của
vi khuẩn (Kutter, 1997; trích dẫn Reddy, 2013).
Thực khuẩn thể không độc với tế bào nhân thật (Greer, 2005). Do đó, có thể
được sử dụng phòng trừ sinh học trong trường hợp mà các biện pháp khác không
được phép áp dụng do quy định của pháp luật, như xử lý cho trái đào trước thu
hoạch (Zaccardelli và ctv., 1992) hoặc để kiểm soát mầm bệnh của con người trên
sản phẩm tươi (Leverentz và ctv., 2001, 2003) (trích dẫn Reddy, 2013).
Thực khuẩn rất đặc thù và chuyên biệt cao, chỉ loại bỏ vi khuẩn là ký chủ mà
không gây tổn hại các thành phần khác của môi trường. Vì thế có thể sử dụng thực
khuẩn kết hợp cùng với ứng dụng của các vi khuẩn đối kháng để tăng hiệu quả
phòng trị đối với mầm bệnh (Tanaka và ctv., 1990), hoặc sử dụng các dòng thực
khuẩn thể có hiệu quả như mong muốn chống lại các tác nhân khác trong môi
trường (Basit và ctv., 1992) (trích dẫn Reddy, 2013).
Tạo ra thực khuẩn thể khá dễ và giá sản phẩm rẻ, có thể được trữ ở 40
C hoàn
toàn trong tối qua nhiều tháng mà hàm lượng giảm không đáng kể (Greer, 2005).
Thực khuẩn thể ít hoặc không bị hạn chế bởi phần lớn sản phẩm nông hóa học
(Zaccardeli và ctv., 1992; Balogh và ctv., 2004), các dòng thực khuẩn thể có thể
phối trộn mà không mất đi hàm lượng của thực khuẩn thể. Thuốc diệt khuẩn chứa
đồng không thể làm bất hoạt thực khuẩn thể (Alvarez và ctv., 1991; Balogh và ctv.,
2004), nhưng để đảm bảo hiệu quả thì thực khuẩn thể nên được áp dụng ít nhất 3
ngày sau khi đồng được sử dụng (Iriarte ctv., 2007) (trích dẫn Reddy, 2013).

20
Bất lợi
Ngoài những lợi ích mà thực khuẩn thể mang lại, việc áp dụng liệu pháp thực
khuẩn thể trong phòng trừ sinh học vẫn có một số mặt hạn chế như sau:
Giới hạn về loài ký chủ có thể là điều không thuận lợi, vì thường loại thực
khuẩn thể khác nhau trên các đối tượng vi khuẩn (Greer, 2005). Khắc phục tình
trạng nêu trên bằng cách sử dụng thực khuẩn thể có phổ kí chủ rộng (Saccardi và
ctv., 1993; Svircev và ctv., 2006), sử dụng thực khuẩn thể đột biến phổ kí chủ
(Flaherty và ctv., 2000, 2001; Obradovic và ctv., 2004), ứng dụng hỗn hợp thực
khuẩn thể (Flaherty và ctv., 2000) hoặc thậm chí là nuôi thực khuẩn thể (Hibma và
ctv., 1997) (trích dẫn Reddy, 2013).
Ngưỡng số lượng vi khuẩn cần thiết (104
- 106
cfu/ml) có thể giới hạn sự tác
động của thực khuẩn thể (Wiggins và Alexander, 1985). Hạn chế về số lượng hiện
diện của vi sinh vật kí chủ có thể làm giảm hiệu quả phòng trị. Vì vi khuẩn gây
bệnh thực vật thường không đồng nhất trong quần thể do sự khác nhau của
polysaccharides bao quanh, bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của thực khuẩn thể
(Okabe và Goto, 1963; Goto, 1992) hoặc chúng được bảo vệ nhờ vào sự định vị trên
bề mặt hoặc bên trong thực vật (Civerolo và ctv., 1972) (trích dẫn Reddy, 2013).
Sự xuất hiện của thể đột biến kháng thực khuẩn (phage - resistant mutants)
có thể làm cho liệu pháp thực khuẩn thể không còn hiệu quả. Tuy nhiên, sử dụng
hỗn hợp thể thực khuẩn có thể hạn chế hoặc xóa bỏ tính kháng (Tanji và ctv., 2004).
Thể kháng thực khuẩn được ghi nhận ở vài chi đối với vi khuẩn. Sự suy giảm tính
độc của thực khuẩn thể được ghi nhận về thể đột biến của Ralstonia solanacearum
(Hendrick và Sequeria, 1984), hay trên Xanthomonas campestris pv. pruni
(Randhawa và Civerolo, 1986) và Pantoea stewartii (Thomas, 1935) (trích dẫn
Reddy, 2013).
Ảnh hưởng của môi trường như nhiệt độ, pH và sinh lý của vi khuẩn có thể
cản trở hiệu quả của thực khuẩn thể. Civerolo và Geesteranus (1972) nhận ra rằng
thực khuẩn thể Xanthomonas phaseoli chống lại loài Xanthomonas và Pseudomonas
chỉ khi ở nhiệt độ trên 200
C. Leverentz và ctv. (2003) ghi nhận thực khuẩn thể làm
giảm đáng kể mật số Listeria monocytogenes trên dưa leo nhưng không giảm trên
táo, bởi vì thực khuẩn thể không ổn định trên lát táo, có thể do pH thấp (4,37 ở táo
và 5,77 ở dưa leo) (Leverentz và ctv., 2003) (trích dẫn Reddy, 2013).
Điều cần quan tâm đến là thực khuẩn thể có khả năng làm thay đổi đặc điểm
di truyền của kí chủ như là tác nhân mang độc tính vào vi khuẩn (Vidaver, 1976).
Thay đổi đặc điểm kiểu hình của vi khuẩn kí chủ bằng các thể tiền phage, cũng có
thể là do sự phát sinh thể kháng thực khuẩn thể, sản sinh chất độc hoặc thậm chí
tăng tính độc. Khi Xanthomonas axonopodis pv. citri chủng XCJ19 bị phân giải bởi

21
thực khuẩn thể ôn hòa PXC7, nó trở nên đối kháng với thực khuẩn thể CP2 (Wu,
1972). Ngoài ra, Goto (1992) báo cáo rằng chủng Xanthomonas campestris pv.
oryzae phân giải bởi thực khuẩn thể Xf hoặc Xf-2 trở nên mang nhiều độc tính trên
lúa (trích dẫn Reddy, 2013).
Nhận thức của người tiêu dùng thêm virus vào sản phẩm thức ăn cũng có thể
trở thành một vấn đề (Greer 2005; trích dẫn Reddy, 2013). Một trong những vấn đề
đó là tâm lý người tiêu dùng vẫn còn hoài nghi về hiệu quả liệu pháp thực khuẩn thể
và mặt khác bản chất của thực khuẩn thể là virus. Mặt dù vào năm 2006, Cục Quản
lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) đã phê duyệt một hỗn hợp thực khuẩn thể gọi
là "lytic cocktail", để giảm sự hiện diện của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong
thịt và nhiều sản phẩm thức ăn (United States Food and Drug Administration, 2006;
trích dẫn Ahmed và ctv., 2012). Tuy nhiên, ngành công nghiệp thịt lo ngại rằng
người tiêu dùng có thể thận trọng khi sử dụng sản phẩm được phun thực khuẩn thể
(virus) (Greger, 2012).
Điều đáng lo ngại là “sự tải nạp di truyền” thực khuẩn thể có thể dẫn đến
kích hoạt các gen của vi sinh vật nhân sơ khác bên trong tế bào thực vật và tế bào
động vật (Vidaver, 1976; trích dẫn Reddy, 2013). Do thực khuẩn thể có thể khả
năng truyền những đoạn DNA từ tế bào này sang tế bào khác tạo thành các thể tái tổ
hợp mới. Sự tải nạp làm lây lan các plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn gram dương
như enzyme penicilinase ở tụ cầu (Biền Văn Minh và ctv., 2008)
Mặc dù phổ ký chủ của thực khuẩn thể thường hẹp, tác dụng ức chế đối với
vi khuẩn có lợi là có khả năng. Ví dụ tác động tiêu cực của thực khuẩn thể trong
nông nghiệp như ảnh hưởng thực khuẩn thể lên vi khuẩn cộng sinh cố định đạm
giảm tăng trưởng và giảm hàm lượng đạm trong cây đậu đũa (Ahmad và Morgan,
1994) và khả năng kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens bị phá hủy bởi
sự phân hủy của thực khuẩn thể (Keel và ctv., 2002) (trích dẫn Reddy, 2013).
.

22
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa
Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian: tháng 03/2013 đến tháng 12/2013
2.1.2 Trang thiết bị và vật liệu trong thí nghiệm
Tủ cấy vi sinh có đèn cực tím, autoclave, micropipette, cân điện tử, máy đo
pH, Vortex,…
Các hóa chất cần thiết cho môi trường King’s B, Wakimoto cải tiến,
Chloroform.
Nguồn vi khuẩn: gây bệnh cháy bìa lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Xoo) được thu thập và phân lập trên cây lúa bệnh tại các tỉnh ĐBSCL.
Nguồn thực khuẩn: 10 dòng thực khuẩn thể được phân lập từ các mẫu lá lúa bị
bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Các môi trường sử dụng phòng thí nghiệm
Môi trường King’s B (Shurtleff và Averre, 1997)
Peptone 20 g
K2HPO4 khan 1,5 g
MgSO4.7H2O 1,5 g
Glycerol 15 ml
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 7,2 - 7,4
Môi trường Wakimoto cải tiến (Wakimoto, 1995)
Bactopepton 5 g
Ca(NO3)2.2H2O 0,5 g
Na2HPO3.12H2O 0,8 g
FeSO4.7H2O 0,05 g
Sucrose 15 g

23
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 6,8 - 7,0
2.2 PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng thực khuẩn thể phân bố ở các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long
Mục đích: Phân lập các dòng thực khuẩn thể phân giải vi khuẩn Xoo phân
bố ở các tỉnh ĐBSCL nhằm tạo ra nguồn thực khuẩn thể ban đầu có sự đa dạng sinh
học và thích ứng được điều kiện ĐBSCL.
Phương pháp thực hiện: Thu thập mẫu bệnh cháy bìa lá lúa ở các tỉnh
ĐBSCL, sau đó thực hiện việc phân lập thực khuẩn thể trong phòng thí nghiệm.
Phân lập vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae (Xoo) gây bệnh: mẩu lá bệnh được
thanh trùng bề mặt bằng cồn 70%, sau đó lá bệnh được cắt nhỏ ra trên bề mặt miếng
lam thanh trùng, rút vài giọt nước cất thanh trùng nhỏ lên mẫu bệnh sau khi cắt. Đợi
khoảng 1 phút cho vi khuẩn trong mô lá phân tán vào giọt nước. Dùng micropipette
rút 1 giọt huyền phù chuyển vào đĩa Petri chứa môi trường King’s B agar, và dùng
đũa vạch vi khuẩn phân tán giọt huyền phù vi khuẩn đều trên mặt đĩa. Đĩa được ủ ở
điều kiện phòng trong 2 - 3 ngày. Quan sát hình thái khuẩn lạc và thực hiện phương
pháp ròng để thu được vi khuẩn Xoo. Chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra khả
năng gây hại bằng cách chủng bệnh nhân tạo trên lúa. Chủng vi khuẩn gây bệnh
Xoo sẽ được dùng làm nguồn để phân lập thực khuẩn thể và các thí nghiệm sau.
Phân lập thực khuẩn thể: mẫu lá lúa bệnh được rửa sạch, lau khô, sau đó
được nghiền ra trong cối sứ. Phần tế bào thực vật sau khi nghiền được cho vào ống
Falcon vô trùng cộng thêm 5 ml nước cất vô trùng, sau đó thực hiện ly tâm ở vận
tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút. Tế bào thực vật lắng dưới đáy ống nghiệm, phần
dịch trong chứa thực khuẩn thể cộng thêm 50 µl Chloroform/ml, thu được phần
dung dịch trong chỉ chứa thực khuẩn thể. Rút lần lượt 50 µl; 100 µl; 250 µl; 500 µl
dung dịch trong cho vào ống nghiệm chứa môi trường King’s B agar đã nấu tan để
nguội 500
C phối hợp với 100 µl huyền phù vi khuẩn Xoo kí chủ được phân lập
trước đó trên cùng mẩu lá bệnh, hòa đều và đổ vào đĩa Petri vô trùng. Đĩa được ủ
trong điều kiện phòng và quan sát sự hình thành các vòng vô khuẩn (plaques), đó là
nơi vi khuẩn đã bị tiêu diện bởi thực khuẩn thể. Thực hiện phương pháp tách ròng
bằng cách chọn vòng vô khuẩn đơn lẽ và cấy truyền bằng tâm bông vô trùng sang
đĩa Petri mới chứa vi khuẩn kí chủ, sau 24 giờ thực khuẩn thể được thu hoạch bằng
cách thêm vào 2 – 3 ml nước cất vô trùng. Phần dung dịch trong chứa thực khuẩn

24
thể cộng thêm 50 µl Chloroform/ml, thu được phần dung dịch trong chỉ chứa thực
khuẩn thể và trữ nguồn trong điều kiện tối ở nhiệt độ 40
C.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá phổ kí chủ của 10 dòng thực khuẩn thể trong điều
kiện phòng thí nghiệm
Mục đích: Nhằm tìm ra dòng thực khuẩn thể có phổ kí chủ rộng để phục vụ
cho nghiên cứu tiếp theo (thí nghiệm 3 và 4).
Phương pháp thực hiện: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần lặp lại. Gồm 260 nghiệm thức (gồm 10 dòng thực khuẩn thể và 26 chủng vi
khuẩn Xoo được phân lập).
Các thực khuẩn thể được chọn từ thí nghiệm 1 được nuôi trong đĩa petri cho
nhân mật số trong 24 giờ. Thực hiện phương pháp pha loãng và đổ đĩa để thu đơn
plaque từng dòng thực khuẩn thể.
Cách tiến hành: Dùng tăm bông vô trùng vạch vào đĩa petri chứa các plaque
đơn tương ứng từng dòng, sau đó tiếp tục vạch đường Ziczac vào đĩa petri chứa 250
µl huyền phù vi khuẩn Xoo (109
cfu/ml) (xác định mật số vi khuẩn trong huyền phù
bằng phương pháp đo độ quang truyền ở bước sóng 600nm, sau đó dựa vào đường
chuẩn để quy ra mật số, từ đó thực hiện pha loãng để tạo ra huyền phù vi khuẩn
Xoo) trong 10 ml môi trường King’s B agar đã nấu tan để nguội ở 500
C, hòa đều và
đổ ra đĩa Petri thanh trùng, mỗi đĩa Petri vạch 5 dòng thực khuẩn thể khác nhau và
mỗi đĩa là một lần lặp lại. Đĩa được đặt ở điều kiện phòng.
Chỉ tiêu ghi nhận: Xác định sự phân giải của các dòng thực khuẩn thể trên
các kí chủ khác nhau hình thành trên đĩa Petri sau 24 giờ.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo của thực khuẩn thể
trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích: tìm ra dòng thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo
hiệu quả cao trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Gồm 4 nghiệm thức là số dòng thực khuẩn thể có phổ kí chủ rộng và 1 chủng vi
khuẩn bị kí sinh nhiều nhất bởi các dòng thực khuẩn thể từ thí nghiệm 2.2.2
Các thực khuẩn thể được chọn từ thí nghiệm 2 được nuôi trong đĩa petri cho
nhân mật số trong 24 giờ. Thực hiện đếm mật số thực khuẩn thể có trong huyền phù
bằng phương pháp pha loãng và đổ đĩa. Dựa vào mật số xác định sau 48 giờ, thực
hiện phương pháp pha loãng để tạo các huyền phù của các dòng thực khuẩn thể
khác nhau với mật số 103
plaques/ml.

25
Rút 100 µl huyền phù thực khuẩn thể (103
plaques/ml) của mỗi dòng + 250
µl huyền phù vi khuẩn Xoo (109
cfu/ml) cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi
trường King B agar đã nấu tan để nguội ở 500
C, hòa đều và đổ ra đĩa Petri thanh
trùng, mỗi đĩa Petri là một lần lặp lại. Đĩa được đặt ở điều kiện phòng
Chỉ tiêu ghi nhận: quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn (plaque)
mà từng dòng thực khuẩn thể phân giải trên đĩa Petri vào các ngày sau khi nuôi cấy
bằng cách đo 20 vòng vô khuẩn ngẫu nhiên trên đĩa và lấy trung bình.
Xử lý số liệu: số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MstatC qua
phép thử Duncan, từ đó chọn ra các chủng có bán kính vòng tiêu diệt vi khuẩn cao
đồng thời khả năng nhân mật số cao để đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh trong điều
kiện nhà lưới.
2.2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae của một số dòng thực khuẩn thể triển vọng
trong điều kiện nhà lưới
Mục đích: tìm ra dòng thực khuẩn thể cũng như mật số thực khuẩn xử lý cho
hiệu quả phòng trị bệnh cao nhất ở điều kiện nhà lưới.
Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với
5 lần lặp lại và 9 nghiệm thức trong đó gồm: 4 dòng thực khuẩn thể (được chọn từ
thí nghiệm 2.2.3) ở mật số 108
plaques/ml với hai biện pháp xử lý thực khuẩn thể
khác nhau (trước hoặc sau khi chủng bệnh 1 ngày), và một nghiệm thức đối chứng
chủng bệnh không xử lý thực khuẩn thể.
Chuẩn bị cây lúa: Chuẩn bị chậu trồng lúa bằng nhựa có kích thước 17,5 x
12 cm, cho vào mỗi chậu 1kg đất. Cho nước vào ngâm và xả phèn trong 2 tuần. Hạt
giống lúa Jasmine 85 được xử lý 2 sôi 3 lạnh trong 30 phút, sau đó đem ủ với nhiệt
độ 37o
C trong 48 giờ cho hạt nảy mầm. Đem hạt gieo vào chậu, mỗi chậu gieo 20
hạt, 10 hạt/hàng. Sau khi gieo được 7 ngày thì tỉa lại còn 5 hạt/hàng. Lúa được
chăm sóc, tưới nước, bón phân đảm bảo cho lúa phát triển tốt. Lượng phân bón
được quy ra diện tích chậu nhựa từ công thức phân bón của Nguyễn Ngọc Đệ
(1998) với công thức 120 N - 40 P2O5 - 30 K2O và chia ra thành 5 lần bón như sau:
Bón lót: 100% P2O5
Bón thúc lần 1 (7 ngày sau khi gieo): ¼ N + 100% K2O
Bón thúc lần 2 (15 ngày sau khi gieo): ¼ N

26
Phân bón được hòa tan vào 2750 ml H2O, tưới 50 ml/chậu và sử dụng phân
đơn dạng hạt.
Liều lượng sử dụng cho mỗi lần bón: urê: 0,55 g/chậu; super lân: 0,56
g/chậu; KCl: 0,105 g/chậu. Phân urê và KCl được hòa tan vào nước và tưới đều cho
mỗi chậu. Mực nước trong chậu khoảng 2cm, chăm sóc và bảo vệ cây lúa không bị
sâu bệnh tấn công.
Chuẩn bị nguồn thực khuẩn thể: thực khuẩn thể được nuôi trong đĩa Petri sau
24 giờ thu hoạch huyền phù và xác định mật số và đưa về mật số như nhau là 108
plaques/ml.
Chuẩn bị nguồn vi khuẩn gây bệnh Xoo: Chủng vi khuẩn Xoo bị nhiều thực
khuẩn thể kí sinh nhất được nuôi trên đĩa Petri chứa môi trường Wakimoto trong 4
ngày, sau đó cho 10 ml nước muối sinh lý vô trùng 0,9% vào, thu hoạch huyền phù
vi khuẩn. Xác định mật số vi khuẩn trong huyền phù bằng phương pháp đo độ
quang truyền ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa vào đường chuẩn để quy ra mật số,
từ đó thực hiện pha loãng để tạo ra huyền phù vi khuẩn Xoo mật số (2,5x1011
cfu/ml).
Phương pháp chủng bệnh: khi lúa được 45 NSKG, thực hiện chủng bệnh
nhân tạo bằng kéo nhún vào huyền phù vi khuẩn Xoo sau đó cắt các chóp lá lúa
(khoảng 2 cm tử chóp vào), mỗi lần nhún kéo vào huyền phù sẽ thực hiện cắt 1 lá.
Các lá có chủng bệnh sẽ được đánh dấu để ghi nhận chỉ tiêu.
Phương pháp xử lý thực khuẩn thể: thực hiện phun thực khuẩn thể trước
hoặc sau khi chủng bệnh với huyền phù thực khuẩn thể ở mật số 108
plaques/ml,
phun đều khắp bề mặt lá lúa tương ứng từng nghiệm thức và áp dụng phun vào buổi
chiều. Cây lúa sau khi chủng bệnh và xử lý thực khuẩn thể được đặt trong điều kiện
nhà lưới có phun sương định kỳ 2 giờ lần.
Chỉ tiêu ghi nhận:
Đo chiều dài vết bệnh của từng lá trên cây, lấy giá trị trung bình.
Cấp bệnh được ghi nhận và đánh giá theo thang đánh giá của Kaufman và
ctv., (1973) phân ra 5 cấp bệnh như sau:
Cấp 1: Không có vết bệnh
Cấp 3: Vết bệnh <1/4 chiều dài lá
Cấp 5: Vết bệnh từ 1/4 -1/2 chiều dài lá
Cấp 7: Vết bệnh >1/2 chiều dài lá
Cấp 9: Vết bệnh lan ra toàn lá

27
Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm MsStatC qua phép thử
Duncan.

28
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập các dòng thực khuẩn thể phân bố ở các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long
Bằng phương pháp phân lập thực khuẩn thể Xoo trên 26 chủng vi khuẩn Xoo
khác nhau tại các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu. Kết quả ghi nhận
được 10 dòng thực khuẩn thể (Bảng 3.1) có khả năng phân giải vi khuẩn Xoo tương
ứng từng kí chủ chúng.
Kết quả trên cho thấy rằng có thể phân lập thực khuẩn thể từ môi trường trên
không (tán lá cây). Theo một số nghiên cứu về thực khuẩn thể của Erwinia
amylovora đã ghi nhận rằng, thực khuẩn thể ít được phân lập từ các phần trên
không (aerial portions) của cây, thậm chí trong suốt thời gian hoạt động xâm nhiễm
của vi khuẩn lên kí chủ (Erskine, 1973; trích dẫn Gill và Abedon, 2003). Ngược lại,
hầu hết thực khuẩn thể luôn được phân lập từ đất xung quanh cây bị nhiễm bệnh.
Điều này cho thấy rằng, nơi chứa thực khuẩn thể nằm trong đất, có thực khuẩn thể
kí sinh bên trong vi khuẩn rơi từ cây xuống mặt đất. Một nghiên cứu khác về thực
khuẩn thể trên cùng một vi khuẩn kí chủ như trên, đã tìm thấy thực khuẩn thể E.
amylovora phong phú trong môi trường tán lá cây bị nhiễm bệnh (Ritchie và Klos,
1977; trích dẫn Gill và Abedon, 2003). Lời giải thích có thể là do thực khuẩn thể
xâm nhập vào tán lá cây khi cây nảy mầm và là một phần của hệ thực vật của cây
bình thường. Ngoài ra, thực khuẩn thể có thể di chuyển từ cây này sang cây trồng
trong môi trường tán lá, còn đất là nơi chứa thực khuẩn thể của môi trường tán lá
cây chứ không phải là môi trường sống (Gill và Abedon, 2003).
Mặt khác, kết quả trên cũng nói lên rằng, thực khuẩn thể có khả năng tấn
công vi khuẩn kí chủ, khi thực khuẩn bắt đầu xâm nhiễm lên tế bào ký chủ, sự phân
giải hoặc ức chế sự tăng trưởng vi khuẩn có thể xảy ra. Dẫn đến một khu vực trong
suốt trên lớp tế bào ký chủ phát triển, vùng trong suốt gọi là plaque, và nó được cho
rằng mỗi plaque được hình thành từ việc sao chép của virion. Thực vậy, Micheal và
ctv. (1997) cũng đã chứng minh phương pháp plaque có thể dùng để định lượng,
đồng thời cũng cho phép phân lập dòng thực khuẩn thể thuần khiết bởi vì plaque
phát sinh từ đơn virion, tất cả virion trong plaque hầu như đông nhất về mặt di
truyền (Hình 3.1a).
Để có thể xâm nhiễm thành công, thực khuẩn thể phải vượt qua các rào cản
đó là vách tế bào chủ. Một số trường hợp được biết đến là thực khuẩn thể chứa các
enzyme lytic có khả năng mở các vị trí vào bên trong thành tế bào vi khuẩn (như
thành phần Murein sacculus hình thành từ peptidoglycan polymer liên kết ngang,
đảm bảo sự ổn định về cơ cấu và thành tế bào vi khuẩn) (Rydman và Bamford
2002; trích dẫn Tan và ctv., 2009).

29
Các enzym của thực khuẩn thể được sử dụng, khai thác như công cụ sinh học
phân tử bao gồm DNA polymerase, RNA polymerase, DNA ligase, RNA ligase and
polynucleotide kinase (Promega Life Science Catalogue, 1999; Invitrogen Product
Catalogue Invitrogen, 1999; trích dẫn Marks và Sharp, 2000).
Hình 3.1a Plaques dòng thực khuẩn thể 12 Hình 3.1b Nhân mật số thực khuẩn thể
bằng đơn plaque
Một khi đã xâm chiếm các tế bào vi khuẩn, thực khuẩn thể sẽ bắt đầu sản
sinh thế hệ con bằng cách kết hợp DNA của nó vào DNA vi khuẩn và chuyển đổi
thành "nhà máy sản xuất thực khuẩn". Sau khi quá trình hoàn tất, thực khuẩn thể sẽ
tiết ra enzyme lytic để thủy phân vách tế bào vi khuẩn và giải phóng thực khuẩn
mới (Tan và ctv., 2009).
Từ kết quả của thí nghiệm 1, sử dụng 10 dòng thực khuẩn phân lập từ 26
chủng vi khuẩn để tiến hành thí nghiệm 2.
Bảng 3.1 Danh sách chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae và thực khuẩn
thể tại các tỉnh Đồng Bằng sông Cửu Long
STT Mã số Vị trí phân lập vi khuẩn Xoo trên lúa Thực khuẩn thể
1 7 Phong Điền - Cần Thơ +
2 9 Châu Thành A - Hậu Giang +
5 13 Phong Điền - Cần Thơ +

Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx

Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx

Similar to Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu biện pháp phòng trị Bệnh cháy bìa lá (xanthomonas oryzae pv.oryzae) trên lúa bằng thực khuẩn thể.docx