1. TUTOR IMUNOLOGI PEMERIKSAAN HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN EstiRohani, dr / SitiRochmatoen, dr, SpPK(K) Jumat, 1 Oktober 2010 1

3. 5-10% menjadikronis

4. 1/3 populasiduniapernahterinfeksi HBV

5. Prevalensidi Indonesia 3-17%Hepatitis marker: HBsAg, anti HBs, HBeAg, anti HBeAg, dll Kegunaanpemeriksaan marker: skrining, diagnosis, prognosis, danpemantauanterapi. 2

6. HBsAg Ditemukanth 1963 olehdr.Blumberg Disebutaustralian antigen (AU Ag) krnditemukanpadapendudukasliaustralia. Au Ag berhubungandengan hepatitis B virus marker serologikpertama yang tampakselamamasaprodromalinfeksi hepatitis B akut. 3

7. HBV Surface protein Pre-core protein Core protein DNA surface antigen dan HBV DNA merupakan marker yang pertama kali terdeteksipadasaatinfeksiakut, munculsebelumtimbulgejalaataupeningkatan ALT. HBe antigen yang berasaldari pre-core protein merupakan marker HBV untukreplikasidaninfeksisitas. HBV core antigen tidakdapatterdeteksidalam serum, tetapiberupaantiboditerhadapnya. 4

8. Perubahan marker hepatitis padainfeksi virus akut 5

9. Infeksi hepatitis B kronikdenganHBeAgpositif 6

10. infeksi hepatitis B kronikdenganHBeAg negative 7

11. PemeriksaanHBsAg Paling pentingpada hepatitis B Bahanpemeriksaan: serum, semen, saliva, urine dancairantubuhlainnya. Metodepemeriksaan: - generasi 1: imunodifusi - generasi 2: CIEP, CF - generasi 3: RPHA,RIA, ELISA, dll 8

12. Metodeimunodifusi Agar cair dibekukan Sumuran-sumurandiberi Ag dan AB Terjadigarispresipitasi Agar AgAb Garispresipitasi AgAb 9

13. Metodefiksasikomplemen Prinsip: Serum + Ab + Complemen kompleks Ag-Ab-C + SDM tersensitisasi (hemolisin)  - Lisis (negatif) - tidaklisis (pos) Keuntungan : murah Kekurangan : kurangsensitifuntukskriningrutin sangatrumitdanbanyakmakan waktu. tidakspesifik, seringbereaksi silangdengan HZV dan VZV. 10

14. Metode Reverse passive hemagglutination assay (RPHA) Prinsip : eritrosit (carrier) disensitisasidenganAbditambah serum  terjadiaglutinasi Ada 2 tahap : Tespenyaring : serum dimasukkankesumuranmicrotiterbentuk v atau u laludireaksikan dg eritrositygtelahdilapisi anti HBs. Positif (kemungkinanmengandungHBsAg) bilaterjadiaglutinasi . Teskonfirmasi: serum reaktif yang mengandungHBsAgakanterjadinetralisasidenganpemberianantibodi yang spesifik (anti HBs)  penghambatanreaksiaglutinasi. 11

15. Hasiltespenyaring Positif : terjadiaglutinasi Negatif : terjadiendapandidasartabung Interpretasihasil 12

17. Bandingkanaglutinasi yang terjadiantara yang diberi anti HBs dan yang tidak (selkontrol). 13

18. Interpretasihasilteskonfirmasi Interpretasiinconclusiveharusdiujiulangdenganmetode lain 14

19. Metode Elisa Metode yang paling banyakdipakaidilaboratorium Sensitivitas & spesifitastinggi, sederhana,murah. Antibodidilekatkanpadafasepadat. Ditambahkan serum pasien Setelahdicuciditambahkanantibodiygdilabelenzim kompleksAb-Ag-Ab 15

20. ELISA DOUBLE SANDWICH 16

22. bahan: serum, plasma

23. Reagen : hepalisaHBsAg

24. Sensitifitas 100%, spesifitas 97,7%17

25. Alatdanbahan Microwell : dilapisi anti HBs monoclonal tikus Peroksidase solution: anti HBs marmot dankonjugatperoksidase. kontrolpositif : serum manusia yang mengandungHBsAgpositif yang tidakaktif, konsentrasi 8 ng/ml kontrolnegatif : serum yang non reaktifterhadap HBV TMB substrate solution A : 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine TMB substrate solution B : buffer asamsitrat yang berisi 0.03% H2O2. Buffer pencuci : larutanpenyanggafosfat yang berisi tween-20. Stop solution : 2N H2SO4 Mikropipet 50 dan 100 µl Inkubatordengantemperatur 370C Alatpencuci plate ELISA reader : λ 450/650 nm. 18

26. Prinsipreaksi Serum pasien Anti HBs.HRPO KompleksAb-Ag-Ab.HRPO Anti HBs Lar.substrat TMB KompleksAb-Ag-Ab.HRPO 2N H₂SO₄ Baca padaλ 450 atau 650 nm 19

27. Cara kerja 50 µl kontrol (3xNC, 2xPC), + masing2 dg 50 µl spesimen. Sediakan 2 sumuranuntukblanko serum inkubasi 20-30⁰C selama 30’ Reagen atau Tambahkan 50 µl lar.peroksidasedalam masing2 sumuran, kecuali 2 blanko. Inkubasi plate pada 37+ 1⁰C, 80’ Cuci plate Tambahkan 50 µl TMB A + 50 µl TMB B kedlmsumuran, campursecara hati2. Buatcampuran dg volume samaantaralar. TMB A&B, tambahkan 100 µl kedlmsumuran Inkubasipadasuhuruangan 30’ Tambahkan 100 µl stop solution Tentukanabsorbanpadaλ 450 nm atau 650 nm 20

28. Perhitungan Rerataabsorban control negatif (NCx) harus< 0,1 Rerataabsorbankontrolpositif (PCx) harus> 0,6 Nilai P-N : PCx – NCx , harus> 0,5 Nilai cut off : NCx + 0,025 21

29. interpretasi Nilaiabsorbanspesimenpasien < cut off = non-reaktifHBsAgnegatif Nilaiabsorbanspesimenpasien> cut off = reaktifawalujiulang. BilahasilnyareaktifHBsAgpositif. 22

30. TERIMA KASIH Terimakasih 23