Dokumen tersebut memberikan penjelasan mengenai prinsip dasar dan prosedur elektroforesis protein. Terdapat penjelasan mengenai komponen sistem elektroforesis, prinsip migrasi partikel bermuatan, faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dan resolusi, serta prosedur elektroforesis mulai dari persiapan sampai pembacaan hasil.

1. Tutor Kimia Klinik 15 Maret 2010 Elektroforesis Protein ResnaHermawati Dra. Soehartini B.S., MS, Apt

2. 2 Tutor kimia klinik

3. Elektroforesis protein 3 Tutor kimia klinik

4. PrinsipDasarElektroforesis A. Partikelbermuatanpada media penyanggaakanbermigrasimenujuelektrodadenganmuatan yang berlawanan. B. Molekulorganikbanyak yang bersifat amfoterik. Muatandanbesarnyamuatanpartikel dipengaruhipH.Misalnya protein akan bermuatannetralpada pH isoelektrik (pI) bermuatanbermuatan + pH < pI bermuatan - pH > pI Power supply /Wicks 4 Tutor kimia klinik

5. C. KecepatanMigrasiLanjutanprinsipdasar… 5 Tutor kimia klinik

6. D. ResolusiLanjutanprinsipdasar…kemampuanmemisahkanfragmen. Makin resolusinyajarakantarfragmen yang miripmakinlebar Resolusitergantungbeberapafaktor : 6 Tutor kimia klinik

7. E. KualitaselektroforesisLanjtanprinsipdasar… Voltase, arus,panas pH, kekuatan ion 7 Tutor kimia klinik

8. KOMPONEN SISTEM ELEKTROFORESIS Alatelektroforesis : Power supply Media Penyangga Sampel Wicks 8 Tutor kimia klinik

9. SAMPEL Tergantung Media penyangga diataskertas, dilubangi, well 9 Tutor kimia klinik

10. BUFER Fungsi 1. Menentukandanmenjaga pH konstan 2. Mengalirkanlistrik Syarat a. Tidakbereaksidengansampel b. pH optimal dantidakmendenaturasipartikel(protein pH 8-9 muatan - ) c. Kekuatan ion bufer(ionic strength) rendahmempercepatmigrasi tinggimemperlambatmigrasiresolusitinggi(panas- denaturasi protein) Seringdipakai : Bufer barbital, trisboric acid -EDTA 10 Tutor kimia klinik

11. Media Penyangga Tidakjernih, pita lebar Absorpsi protein Ukuranporitidakseragam Pita lebar, resolusirendah 11 Tutor kimia klinik

12. Lanjutan Media Penyangga… 12 Tutor kimia klinik

13. Lanjutan Media penyangga….. ENDOSMOSIS . 13 Tutor kimia klinik

14. Power Supply 0- 500 volts 0- 100 miliampere Voltaseatauaruskonstan Pemisahan < 30 menit : voltasekonstan Pemisahanlebih lama : aruskonstan ( minimalisasikenaikansuhu) 14 Tutor kimia klinik

15. Pewarna Merahterang, serapsinar 525 nm 15 Tutor kimia klinik

16. Pembacaanhasil .Pita dipotong .Dieluasikan .fotometer . Pita lgsdiukurdlmsistemoptik . Area dibawahpuncakkurva .Otomatis 16 Tutor kimia klinik

17. Lanjutanpembacaanhasil… Serum electrophoregram normal 17 Tutor kimia klinik

18. Lanjutanpembacaanhasil… Nilairujukan protein serum( A manual of laboratory and diagnostic test, 2000) 18 Tutor kimia klinik

19. Lanjutanpembacaanhasil… 19 Tutor kimia klinik

20. Gambaran abnormal elp Peningkatanα1 : inflamatory state (α1 antiprotease ), kehamilan. Peningkatanα2 : nephrotic syndrome, inflamatory state, terapi steroid, kontrasepsi oral, hipertiroidisme, hemolisis in vivo, penyakit liver. Peningkatan ß : hiperlipidemia, hemoglobinemia,anemiadefisiensibesi. Peningkatan Ƴ polyclonal gammopathies : penyakitliver,sirosis, infeksikronis, penyakitautoimun. Peningkatan Ƴ monoclonal gammopathies : multiple myeloma, waldenstormmacroglobulinemia, lymphoid malignancies. 20 Tutor kimia klinik

21. Lanjutangbranabn Penurunanα1 : defisiensiα1 antiprotease Penurunanα2: hemolisis in vivo, penyakit liver Penurunanß : hypo ßlipoproteinemia. Penurunan Ƴ : Defisiensiimun 21 Tutor kimia klinik

22. Lanjutangambaranabn… B 22 Tutor kimia klinik

23. Lanjutangambaranabn… 23 Tutor kimia klinik

24. ELEKTROFORESIS DI LAB PK Alat : SebiaHydragel Protein(E) K 20 K 20 electroporesis chamber Applicators applicators carriers 24 Tutor kimia klinik

25. Lanjutanalatelp PK… Media penyangga : Agarose gel (agarose 0,8 g/dl) & Tris barbital bufer pH : basa Filter paper thin 25 Tutor kimia klinik

26. Lanjutanalatelp PK… Bufer : Tris barbital bufer, pH 8,5 ± 0,3 A. Fixative solution etanol, as asetat, aquabidest B. Staining :Amidoblack C. Destaining as sitrat C C C B A 26 Tutor kimia klinik

27. Lanjutanalatelp PK… Power supply Incubator dryer IS 80 27 Tutor kimia klinik

28. Lanjutanalatelp PK… Scanner ג 570 nm atau filter kuning Komputer 28 Tutor kimia klinik

29. PROSEDUR 4 tahap : 29 Tutor kimia klinik

30. MIGRASI 30 Tutor kimia klinik

31. Lanjutanmigrasi… Terendam 1 cm Waktu 15`, 165 V, 7 ± 2 mA(set alat 60 mA) Volbufer 300 ml pH 8,5 ± 0,3 31 Tutor kimia klinik

32. FIKSASI Biarkandingin ± 1` 32 Tutor kimia klinik

33. Staining-destaining Gel menghadapkebawah, λ 570 nm 33 Tutor kimia klinik

34. Hasil scanning konsentrasirelatif (persentase). 34 Tutor kimia klinik

35. DaftarPustaka 1. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical chemistry: Principles, procedurs, correlations. 5th edition. Baltimore: Lippincott Williams&Wilkins; 2005. 105-07, 207-11. 2. Word KM, Lehmann CA, Leiken AM. Clinical laboratory instrumentation and automation : principles, application and selection. Philadelphia: WB Sunders Company; 1994. 158-70.I. 3. Merck E. Clinical laboratory. 11th edition. Germany; 1974. 145-60. 4. Henry JB. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th edition. Philadelphia : WB Saunders Company;2001. 249-61. 5. Sebia. Instruction manual. Sebia. 2002.

36. TERIMAKASIH

37. Quality control Komersial kit (assayed control serum, Sebia PN 4783). Membuatsendiridari 90 orangdewasasehat (priadanwanita) mencarinilaimean± 2 SD 37 Tutor kimia klinik

38. Tambahan Tris barbital buffer: pH 8,5 ± 0,3 0,92 % barbital 5,15 % Na barbital 0,10 % sodium azide 1 vial dilarutkandalam I liter aquadesttahanhingga 1 tahun, suhuruangan. Amidoblack stain, PH 2 Amidoblack0,4 g/dl danEthylene glycol 6,7 % Gantitiap staining 10 gel Larutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest. Working solution stabilhinggasetahun. 38 Tutor kimia klinik

39. Destaining solution 0,05 g/dl citric acid 1 ml stock solutiondalam 1 liter Working solution stabil 1 minggudalamsuhuruangan, padabotoltertutup Bilaterjadiperubahanwarnakontaminasibakteri + 5 uL/dl Proclin 300 Fixation solution 60 % etanol 10 % asamasetat 30 % aquadest Tutuprapatuntukmencegahevaporasi. Gantisetiap 3 bulan. Janganmencampur > 4 gel dalamfixation solution. 39 Tutor kimia klinik

40. Endosmosis ketika media penyanggabermuatannegatif Muatan - menarikmuatan + daribufer. Ketikadialirilistrik ion + kekatoda, berlawananarahdengangerakanmuatan - (misalnya protein) yang bergerakkearahanoda. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerakatauterdorongkearahkatoda. 40 Tutor kimia klinik

41. Wick flow Wick flow : 1.Gerakan keatasdarilarbufer melaluikeduatepimembran yang terendam 2.Menggantikan kelembaban yang hilangakibat pemanasan 3.Memperlambat gerakan partikelpada media penyangga 41 Tutor kimia klinik

42. Konsentrasi normal protein serum α1 globulin : 0,1 – 0,3 g/dl α1 Globulin : α1 antiprotease(90 %),α1 acid glycoprotein, α1 lipoprotein α2 globulin : 0,6-1,0 g/dl α2 globulin : α2macroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin. β globulin : 0,7-1,4 g/dl ß globulin : transfferin, hemopexin, complement C3, ß lipoprotein. γ globulin : 0,7-1,6 g/dl Ƴ globulin : immunoglobulin G, A, D, E, dan M 42 Tutor kimia klinik

43. TahapPersiapan Preparasireagenpada The Hydragel protein(E) K20 kits Agarose gels Siappakai Disimpanpadaposisi gel horizontal danmenghadapkeatas Bisadisimpanpadasuhu ruang/refrigeranated (2-8 ⁰C) Tris Barbital Buffer a. Setiap vial stock buffer solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest. b. Contoh 50 ml stock diencerkansampai 500 cc aquabidest c. Vial yang sudahdiencerkandapattahanselama 1 tahunpadasuhuruang 43 Tutor kimia klinik

44. d. Setelahpemakaian(di chamber), larutaninidisimpanpadatempat lain untukmenghindarikerusakanelektrodapada chamber. e. Ganti buffer pada chamber setelah 1 minggupemakaianatausetiap 1 kali migrasi( 1 full gel agarose) f. 0,05 M Na barbital 10,309 gram o,o1 M Barbital 1,842 gram Aqaudest 1 liter. Amidoblack Stain a. Setiap vial stock amidoblack stain(botolcoklat) ditambahkandengan staining solution diluents(60 cc) laludiencerkansampai 200 cc denganaquabidest. b. Stabilselama 1 bulan 44 Tutor kimia klinik

45. c. Menggantiamidoblack stain setiapbuka kit baru. Destaining solution a. Setiap vial sock destaining solutiondiencerkan sampai 100 L denganaquabidest b. Contohuntuk 1 ml stock solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest. c. Working reagenstabilsampai 1 minggubila disimpanpadasuhuruangdandisimpanpadabotol tertutup. e. Digantisetiapselesaidestaininguntuk 1 kali migrasi(chamber I) 45 Tutor kimia klinik

46. Applicators a. Siappakai b. Disimpanpadatempat yang keringpadasuhuruang Filters papers thin Siappakai Fixative solution a. Etanol 180 ml, acetic acid 30 ml, aquabidest 90 ml b. Disimpanpadasuhuruang, ganti 3 bulan/ setelah pemakaian 4-6 gel untuktiap 300 cc 46 Tutor kimia klinik

47. Migrasi TempatkanHydragel K-20 aplicatorcarierpadapermukaan yang datar Tambahkan 10 μl serum padasumuranaplicators, patahkanujungaplictor 47 Tutor kimia klinik

48. Buka pack hydragelagarose plate Serap buffer padaagarose gel dengan paper filter thin secukupnya(harus rata) janganterlalukering 48 Tutor kimia klinik

49. Tempatkanagarose gel padahydragel K-20 aplicatordenganposisikutub (+) beradadiatas Tempatkanaplicator yang telahberisi serum padaaplicator carrier diposisi 6 49 Tutor kimia klinik

50. Turunkanaplicatorsampaimenyentuhpermukaanagarose gel denganmemutar switch perlahan-lahan Setelah 40 detik, angkatperlahan-lahanaplicator 50 Tutor kimia klinik

51. Pindahkanagarose gel ke chamber denganposisikutub(+) kearahkutub(+) pada chamber. Agarose gel harusterendam 1 cm padamasing-masingujungnyadidalambufer 51 Tutor kimia klinik

52. Nyalakan power supply dengan setting sbb : Volume bufer per compartement 150 ml Total volume bufer 300 ml Waktumigrasi 15 menit Voltase 165 volt Arus 7 ± 2 mA ( set padaalat 60 mA) 52 Tutor kimia klinik

53. FIKSASI Setelahmigrasi, pindahkan gel untukdifiksasi Fiksasi gel dalamlarutanfiksasiselama 15 menit 53 Tutor kimia klinik

54. Keringkan gel dalaminkubator IS 80 padasuhu 80 selama 10 menit(sampaikering) Biarkandinginsekitar 1 menit 54 Tutor kimia klinik

55. Staining-destaining Lakukanpewarnaanpadalarutan staining selama 4 menit Lakukandestainingpadalardestainingdlm 3 kali rendamansampaibenar-benarbersih 55 Tutor kimia klinik

56. Keringkan pd IS 80 incubator dryer 56 Tutor kimia klinik

57. Scanning Lakukanpembacaanhasilpadascanner denganposisi gel menghadapkescanner(kebawah) dengan λ 570 nm atau filter kuning. 57 Tutor kimia klinik

58. 58 Tutor kimia klinik

59. Sampel : serum yang baru, bisadisimpansuhu 20 – 80 C segerasetelah sampling maksimalsatuminggu. Sampel plasma: fibrinogen memberigambaranmonoclonal gammopathydanmerubahpersentasedari zone ELP Fraksi beta 2 akanhilangsetelah 3 hari. Penyimpananbekustabilsampai 1 bulan (sodium azide0,02 g/dl). Sampel yang hemolisis me alpha 2 dan beta zones Sampel serum yang mengandungcryoglobulinataucryogelsangatkentalmengganguprosesdifusi. + fluidil 25 uLuntuk 75 ul serum. 59 Tutor kimia klinik

60. 60 Tutor kimia klinik

61. 61 ELP protein urine (Sebia K20) Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin Tutor kimia klinik

62. 62 Tabel 3. Interpretasi ELP protein urine Tutor kimia klinik

63. 63 Interpretasi……. Tutor kimia klinik

64. 64 Media Penyangga 1. Paper Terdiri dari serabut-serabut selulose,murah dan mudah, perlu waktu >16 jam, memisahkan fraksi protein serum menjadi 5 fraksi 2. Starch gel (tepung kanji) Perlu persiapan, harus dipurifikasi (pemurnian dulu), mempunyai pori-pori tertentu sehingga dapat memisahkan 20 fraksi, endosmosis flow besar Agarose gel Mengandung agarose dan agar opectin. Tidak mengandung asam sulfat dan carboxylic acid sehingga efek endosmosis kecil. Agarose Sebia K20 mengandung agarose 0,8 g/dl, 0,61 % barbital. Penyimpanan suhu ruangan atau 2 – 8 C. stabil hingga tanggal kadaluarsa. Jangan digunakan bila ada cristal, pertumbuhan bakteri, cairan eksudasi dari gel. Tutor kimia klinik

65. 65 3. Agar gel Perlu persiapan, lebih murni dari starch gel, endosmosis flow besar, waktu separasi protein ± 60 menit. 4. Polyacrylamide gel Inert, muatan netral sehingga endosmosis flow -, pori - pori yang bermacam – macam (25 fraksi protein), interpretasi sukar. 5. Cellulose acetat Banyak dipakai, tanpa persiapan khusus, sampel sedikit, waktu separasi 30 menit, pemisahan fraksi baik, dapat dibuat trasnparan, hasil dibaca dengan densitometer. Tutor kimia klinik

66. 66 b.Sellulosaasetathasilreaksiantaracellulosedanacetic anhydride. Keuntunganband lebihtajam, protein terpisahlebihcepat, dapatdisimpandalamwaktu lama. Kerugiannya hasilakhirburamharusditambahkancairan yang melarutkanseratcellulose asetatfraksi protein yang tercatdenganlatarbelakangtransparan. Tutor kimiaklinik

67. 67 c.Starch gel  amilosedanamilopectin. Kerugian hasilburamdanharusdirendamsemalamuntukhasil yang jernih ,kuantitasterkadangmasihtidakakurat. d.Poliacrylamide gel pemisahanalkalinphospataseisoenzim Keuntungan : stabilpadapemanasan,transparan, tidakbermuatanmenghilangkanefek endosmosis. Kerugiannyaacrylamideberpotensikarsinogenik. Tutor kimia klinik

68. 68 e. Agar gel agarosedanagaropectinbermuatannegatif. - Agarosefraksiimmobile. - Agaropectinberikatansecarareversibledengansebagianasam amino dan hemoglobin padapermukaanluar. Hemoglobin-agaropectinkompleksbermigrasikeanoda, hemoglobin yang tidakterikatbergerakkekatoda. Tutor kimia klinik

69. 69 f. Agarose gel lebihmurnidibanding agar gel karenatidakmengandungagaropectin. Keuntunganefek endosmosis kecil,resolusibaik ,hasilakhirjernih , waktulebihsingkat. Kerugiannya tidakdapatdisimpan lama. Tutor kimia klinik

70. 70 Tutor kimia klinik

71. 71 Tutor kimia klinik

72. 72 Endosmosis flow Endosmosis (electroendosmosis/wick flow) terjadiketika media penyanggabermuatannegatifakibatadsorbsi ion hidroksildari buffer. Muatan - menarikmuatan + dari buffer, ketikadialirilistrik ion + bergerakkekatoda yang berlawananarahdenganpergerakanmuatan -. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerak. Efekinidapatdikurangi : penambahansukrosaatausorbitol yang meningkatkanosmolalitasdan gel hampirbebasdari endosmosis (agarose gel). Tutor kimia klinik

73. 73 Teknik Elusi Tanpa dilakukan clearing, masing –masing band dipotong, masukkan tablet elusi (larutan Na2CO 3 0,5 %). Masing – masing larutan elusi baca dengan fotometer 590 nm, kolorimeter dengan filter oranye. OD (optical density) sesuai dengan konsentrasi protein. Kesalahan teknik ini besar: Pemotongan band, elusi yang tidak sempurna, pembacaan fotometer. Tutor kimia klinik

74. 74 Barbital buffer Tidak mengadakan interaksi dengan protein, tidak menyebabkan denaturasi dari protein 0,05 M Na barbital 10,309 gram o,o1 M Barbital 1,842 gram Aqaudest 1 liter. Tutor kimia klinik

75. 75 Staining solution Yang sering dipakai: Ponceau, Sudan Black, Coomasie, Brilliant blue. Ponceau S 0,5 gram Trichloracetic acid 5 gram Aquadest 100 ml Tutor kimia klinik

76. 76 Prosedur ELP cellulose acetat Alat dan reagensia : Cellulose acetat membran Kertas saring Applicator/mikropipet Beberapa kotak pengecatan Kotak kaca untuk clearing solution Obyek glass Oven/hair dyer 8. Power supply 9. Electrophoresis chamber. 10. Densitometer Tutor kimia klinik

78. Persiapan sampel, serum dengan sedikit bromphenol blue dengan applicator letakkan pada 1/3 tepi cell. Acetat membran

79. Letakkan pada supporting plate dalam electrophoresis chamber

80. Pengaturan power supply voltage 20 V (panjang strip), 0,8 mA (lebar strip) selama ± 20 menitTutor kimia klinik

81. 78 2. Staining phase. 1 2 3 4 5 6 7 Ponceauacetic acid dehydration clearing solution solution Prosedur…. Tutor kimia klinik

82. 79 Prosedur…. cell. Acetat membran direndam dalam staining solution 5 menit. Lakukan destaining (2,3,4 dan 5) untuk melarutkan sisa cat yang tidak terikat oleh protein Masukkan dalam dehydration solution (6) Tempelkan cell. Acetat membran pada obyek glass (hindari gelembung udara) Masukkan dalam clearing solution (7) sehingga menjadi trasparan 3. Pembacaan (kualitatif dan kuantitatif) Tutor kimia klinik

83. 80 Tris barbital buffer: PH 9,2 ± 0,3 0,92 % barbital 5,15 % Na barbital 0,10 % sodium azide 1 vial dilarutkan dalam I liter aquadest tahan hingga 1 tahun, suhu ruangan. Tutor kimia klinik

85. 82 Fixation solution 60 % etanol 10 % asam asetat 30 % aquadest Tutup rapat untuk mencegah evaporasi. Ganti setiap 3 bulan. Jangan mencapur > 4 gel dalam fixation solution. Tutor kimia klinik

86. 83 PROTEIN CONC.RANGE (g/L) M.WEIGHT ACTIONS CHARACTERISTIC OF MAJOR PLASMA PROTEINS Prealbumin Albumin 1-Antitrypsin 2-Macroglobulin Haptoglobin -Lipoprotein Transferrin C3 Fibrinogen IgA IgD IgE IgG IgM 0.15-0.36 39-51 2.0-4.0 1.5-3.5 0.4-2.9 2.7-7.4 2.0-4.0 0.6-1.4 1.0-4.0 0.4-3.5 0.1-0.4 50-600(g/L) 7-15 0.25-2.0 62,000 66,000 54,000 725,000 100,000 type1-1 380,000 80,000 185,000 340,000 160,000 180,000 180,000 150,000 850,000 Binds thyroxine: transport vit.A Oncotic pressure: amino acid reservoir: carries small molecules Protease inhibitor Protease inhibitor Binds hemoglobin Lipid transport Transport Iron Component of complement system Clot formation Surface immunity Binds to mast cell: hypersensitivity reactions Humoral immunity Humoral immunity primary response Tutor kimia klinik

87. 84 pendahuluan Hemoglobin merupakan konjugasi komplek protein yang mempunyai BM mendekati 64.500. Hemoglobin: - Heme : komplek dari fe (II) dan protoporphyrin. - Globin : 2 pasang rantai polipeptida dari asam amino. Tutor kimia klinik

88. 85 Tutor kimia klinik

89. 86 pendahuluan Kelainan Hemoglobin terdiri: 1. Kualitatif -> struktural, substitusi asam amino dari rantai polipeptida ( Hemoglobinopati ). Hb S -> α2β26 glutamic->valin Hb C -> α2 β26 glutamic -> lysin Tutor kimia klinik

90. 87 2. Kuantitatif : Penurunan sintesis dari 1 atau beberapa rantai globin. Talasemia α, kelainan pada rantai alfa. Talasemia β, kelainan pada rantai beta. Tutor kimia klinik

91. 88 Elektroforesis dalam suasana asam memakai media agar gel (Citrate agar electrophoresis pH 6,2 ) dapat memisahkan Hb S dari Hb D dan Hb G juga Hb C dari Hb E dan Hb O. Tutor kimia klinik

92. 89 ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN( Indikasi ) Anamnesis : mempunyai riwayat Anemi dan ikterik serta kelainan yang berhubungan dengan darah. Riwayat keluarga Pemeriksaan fisik didapati Hepatosplenomegali. Anemia,MCV↓, MCHC↓,MCH↓,RDW↑. Tutor kimia klinik

93. 90 prinsip Hemoglobin bersifat amfoter ( dapat bermuatan positif dan negatif ). Pada pH basa akan bermuatan negatif dan akan bergerak ke kutub positif ( anoda ). Pada PH asam akan bermuatan positif dan akan begerak ke kutub negatif ( katoda ). Tutor kimia klinik

94. 91 Macam – macam metode pemisahan hemoglobin Elektroforesis basa -> starch gel, polyacrylamide gel, cellulose asetat, agarose gel. Pada pH 8,6. Elektroforesis pada suasana asam -> agarose gel dan agar gel/ agar citrat. Pada pH 6,2. Tutor kimia klinik

95. 92 Macam – macam metode pemisahan hemoglobin Globin chain elektroforesis -> cellulose asetat, agar citrat. Pada pH basa dan asam. Isoelectric focusing ( IEF ) -> polyacrilamide gel dan agarose gel. Pada pH gradient. Tutor kimia klinik

96. 93 PROSEDUR KERJA 1. Pembuatan sampel 2. Fase migrasi 3. Fase fiksasi 4. Staining dan Destaining 5. Scanning Tutor kimia klinik

97. 94 SAMPEL Darah + antikoagulan ( EDTA, Citrat, Heparin ). Dibuat Hemolisat : 1. Sentrifuse sampel 5000 rpm, 5 menit. 2. Buang plasmanya. 3. Cuci eritrositnya 2 x dengan 10 volume saline, sentrifuse 5000 rpm, 5 menit. 4. Buat hemolisat 10 µl sel darah merah dengan 130 µl Hemolizing solution. 5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi 5 menit pada suhu ruangan. Tutor kimia klinik

98. 95 Elektroforesis Hemoglobin (Sebia K20) Sampel : darah + antikoagulan (EDTA, Citrat, atau heparin). Penyimpanan maksimal 5 hari 20 – 80 C. Persiapan hemolisat : 1. Sentrifus sampel 5000 rpm ,5 menit. 2. Buang bagian plasma. 3. Cuci eritrosit 3 X dengan 10 volume saline;sentrifus masing – masing 5000 rpm, 5 menit. 4. Buat hemolisat 10 uL sel darah merah dengan 130 uL Hemolizing solution.(1 : 13) 5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi suhu ruangan 5 menit. Tutor kimia klinik

99. 96 Prosedur ELP Hb (Sebia K20) 1. Tempatkan hydragel K20 applicator carrier pada permukaan datar. 2. + 120 uL aquabidest pada applicator carrier. 3. Tempatkan aplikator pada permukaan datar. 4. + 10 uL hemolisat pada masing sumuran pada aplikator, patahkan ujungnya 5. Buka bungkus hydragel agarose gel plate. 6.Serap buffer pada agarose gel dengan filter paper . 7. Tempatkan agarose gel pada hydragel K 20 applicator dengan posisi kutub + diatas Tutor kimia klinik

100. 97 Lanjutan……. 8. Tempatkan applicator pada applicator carrier diposisi no 4. 9. Turunkan applicator sampai menyentuh permukaan agarose gel dengan memutar switch perlahan –lahan, 10.Tunggu 1 menit, kemudian angkat perlahan – lahan. 11.Pindah agarose gel ke chamber dengan posisi kutub + kearah kutub + pada chamber. Posisi agarose gel menghadap kebawah. 12. Nyalakan power supply dengan kondisi: - volume buffer per compartement 150 ml - total volume buffer 300 ml Tutor kimia klinik

101. 98 Lanjutan…….. - waktu migrasi 5 menit - Voltage 165 Volt - Arus ampere 7 ± 2 mA 13. Pindah gel untuk difiksasi 15 menit. 14. Keringkan gel (inkubator IS 80),suhu 800 C, 10 menit. Biarkan dingin selama 1 menit. 15. Pewarnaan (staining) selama 5 menit. 16. Destaining 3 tahap . 17. Keringkan pada inkubator IS 80. 18. Pembacaan hasil (posisi menghadap kebawah) Tutor kimia klinik

102. 99 Hasil ELP Hb (Sebia K20) Gambar 14. Tutor kimia klinik

104. 101 Hasil ELP protein serum Tutor kimia klinik

105. 102 Tutor kimia klinik

106. 103 Tutor kimia klinik

107. 104 Tutor kimia klinik

108. 105 Tutor kimia klinik

109. 106 Tutor kimia klinik

110. 107 Quality Control Kontrol dari sampel patologis yang sudah diketahui. Kontrol komersial yang mengandung Hb A, Hb F, Hb C, Hb S. Tutor kimia klinik

111. Scanning Scan dengan densitometer/scanner pada 570 nm ataudengan filter kuning. QUALITY CONTROL Padasetiapserianalisisdianjurkanuntukmemakaidarahkontrolassayed (misalnyakontrolHb A2 normal, Sebia, PN 4778 ataukontrolHb A2 patologis, Sebia, PN 4779) atausampeldarahassayed yang mengandungHb A, F, S dan C (misalnyakontrolHb AFSC, Sebia, PN 4792). 108 Tutor kimia klinik

112. 109 Sampel bertahan 1-2 hari pada suhu 4ºC atau – 20 ºC selama 1 bln. Tutor kimia klinik

113. 110 Agarose gel dan agar gel Agar gel tediri dari: agarose dan agaropectin Agarose gel td : bentuk murni dari agar dimana agaropectinnya sudah tidak ada.. Untung agarose gel: mengurangi efek endosmosis ok agaropectinnya tidak ada. Tutor kimia klinik

114. 111 EL. Hb pada agar gel ph 6,2 Agar gel : agarose dan agaropectin. Agarose menjadi zat yang immobile,agaropectin akan berikatan dengan hemoglobin. Hb S terletak dipermukaan punya afinitas tinggi thdp agaropectin. Hb D,G terletak lebih dalam lagi punya afinitas rendah thdp agaropectin. Hb C punya afinitas yang tinggi thdp agaropectin, Hb E tidak. Tutor kimia klinik

115. 112 GLOBIN CHAIN ELEKTROFORESIS - Pemisahan rantai globin sangat berguna jika hasil antara cellulose asetat dan agar citrat mempunyai hasil yang sama ( Hb E dan O ). - Penggunaan mercaptoetanol dan urea dapat memisahkan heme dan globin, serta memisahkan rantai α dan non α. - Rantai globin mempunyai muatan yg beda dan migrasi yg beda antara asam dan basa. Tutor kimia klinik

116. 113 Metode IEF Mirip elektroforesis, kec pemisahan partikel partikel pada pH gradien dengan penambahan amfolites. Kutub anoda dilakukan pada cairan asam dan kutub katoda diletakkan pada cairan basa. Pada pH gradien Protein akan bergerak sesuai isoelektrik point. Tutor kimia klinik

117. 114 Teknik Elusi Tanpa clearing, masing-masing band dipotong, masukkan tablet elusi ( larutan Na2 CO3 0,5%) kedalam tabung. Masing- masing larutan dibaca denagn fotometer 590 nm, kolorimeter denag filter oranye. Kesalahan: pemotongan band, elusi tidak sempurna, baca fotometer. Tutor kimia klinik

118. 115 ELP protein urine (Sebia K20) Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuria Anderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, Ƴglobulin Tutor kimia klinik

119. 116 Interpretasi Tutor kimia klinik

120. 117 Interpretasi……. Tutor kimia klinik

121. ELP protein cerebrospinal fluid Bahan cerebrospinal fluid perlu disentrifus 400 – 500 rcf 5 menit Agarose gel : hidragel HR K20 Reference value: Protein 15 – 45 mg/dl Prealbumin 2- 7 % albumin : 56 – 76 % α1 globulin: 2 – 7 % α2 globulin : 4 – 12 % ß globulin: 8 – 18 % Ƴ globulin : 3 – 12 % 118 Tutor kimia klinik

122. 119 ELP protein synovial fluid Protein 1 – 3 g/dl albumin : 55 – 70 % α1 globulin: 6 – 8 % α2 globulin : 5 – 7 % ß globulin: 8 – 10 % Ƴ globulin : 10 – 14 % Tutor kimia klinik

123. 120 Hasil ELP protein urine Tutor kimia klinik

124. 121 Hasil ELP protein urine Tutor kimia klinik

125. Tutor kimia klinik 122 Sejarah Elektroforesis 1900 Michaelis - pergerakan ion dalammedanlistrik 1937 Tiselius – moving boundary, larutanbebas. 1946 Consden – silica gel. 1950an Starch gel, agar gel, celulose acetate, Polyacrylamide gel, immunoelectrophoresis.

126. Tutor kimia klinik 123 1960an Isoelectric focusing 1990an Capillary electrophoresis / teknikotomatis 2000 Electrophoresis microchip multichannel.

127. Tutor kimia klinik 124 Perkembangan Tehnis Baru Isoelectric Focusing High Resolution Protein Electrophoresis Capillary Electrophoresis

128. Tutor kimia klinik 125 Isoelectric focusing (IEF) Resolusisangattinggi. Prinsipkerja: molekulbermigrasimelaluigradienpH. Anode: larutanasam; padakatode: larutanbasa, ruangdiantaranyadiisiampholyte. AmpholytemenujupI. Media pilihan: polyacrylamide gel. Aplikasiklinis: isoenzymacid phosphatase, isoformcreatininekinasedan alkaline phosphatase, deteksi pita oligoclonalcairanserebrospinal.

129. Tutor kimia klinik 126 High Resolution Protein Electrophoresis (HRE) Agarose gelpadavoltasetinggi (> 250 volts), dalamsuatusistem water cooled. Dapatmendeteksi 15 pita ataulebih, tergantungkemurnian media, komponen buffer, macam cat, misalnya: amido black 10B mendeteksi protein > 30 – 50 mg/dL. Pengecatanperakmendeteksi protein 100μg/dLtanpakonsentrasisampel.

130. Tutor kimia klinik 127 Aplikasi klinis HRE elektroforesiscairanserebrospinalpadapenyakitdemyelinisasi, deteksi pita oligoklonalpada multiple sclerosis, deteksi monoclonal gammopathy, separasidankarakterisasi protein urindariglomerulusmaupundaritubulus.

131. Tutor kimia klinik 128 Capillary Electrophoresis (CE) Terdiridari: Sebuahkapilerfused silica, Duapenampung buffer elektrolit, Sumbertenagabertegangantinggi(10 – 30 kV) denganmedanlistriktinggi (100 – 1000 V/cm) Sebuahdetektor yang dihubungkandenganalatpengolah data.

132. Tutor kimia klinik 129 Gambar CE

133. Tutor kimia klinik 130 Sampelmasukkedalamkapilerdengancaraelectrokinetic injectionatauhydrostatic injection. Volume sampelhanyasedikitsekali (nanoliterataupicoliter). Sample dipisahkanolehpengaruhaliranelektrosomotik. Kelebihan CE : cepat, resolusitinggi, otomatisasi.

134. Tutor kimia klinik 131 Gambar elektroosmotik

135. Tutor kimia klinik 132

136. Tutor kimia klinik 133 Gambar cara sampel masuk (sample injection)

137. KESALAHAN DAN KETERBATASAN : Janganmenggunakansampel yang sudahlisis. Aplikasisampel : Hindariaplikasisampel yang berlebihan. Sampel yang berlebihandapatmenyebabkandistorsi pita yang terbentuk. Beberapaprosedurmembutuhkanjumlahsampel yang spesifik yang bisadidapatkandenganmenggunakanmikropipet. Cara lain denganmemakaiaplikator. Pemakaianaplikatorharusbersihdanlurusdanpastikanmemakaiukuran yang tepat. 134 Tutor kimia klinik

138. Bufer : Bufer yang terkontaminasiatausudah lama, akanmenghasilkanpolamigrasi yang pendek. Jikasedangtidakdigunakan, buferharusdidinginkanuntukmenghindaritumbuhnyamikroorganisme. Media penyangga : Perlakukan media penyanggadenganhati-hati. Hindarisidikjariataukontaminasilainnyasebelum media dibersihkandandikeringkan. Memasukkan media kedalambuferharusperlahansehinggatidakadagelembungudara yang terperangkap. Mengeringkan gel padakertas filter untukmengurangikelebihancairan, karenameletakkansampelpada gel yang terlalubasahakanmenghasilkan pita yang melebar. 135 Tutor kimia klinik

139. Pewarnaan : Sebagianbesarpewarnadapatdigunakanbeberapa kali. Sebagaipegangan, 100 mLstaining solutiondapatdigunakanuntuk total 387 cm2 (60 inchi2) cellulose acetateatauagarose gel. Keadaan-keadaan yang dapatterjadisaatproseselektroforesisdengan SEBIA: Tidakterjadimigrasibisadisebabkankarena power supply yang tidakterhubung, elektrodaterbalik, media tidakadadi buffer atau pH yang tidaksesuai. Jarakmigrasi yang pendekdapatdisebabkankarenavoltaseterlalulemahatauwaktuprosesterlalusingkatdan buffer sudah lama atauterkontaminasi. 136 Tutor kimia klinik

140. Jarakmigrasijauhdapatdisebabkankarenavoltaseterlalutinggi, waktuprosesterlalu lama dan buffer sudah lama atauterkontaminasi. Migrasilambatdapatdisebabkankarenaberatmolekultinggi, muatanrendah, kekuatan ion terlalutinggiatauvoltaseterlalulemah. Dapatdiatasidenganmenggunakanukuranpori-pori yang besar, mengganti pH danmengencerkan buffer. Pita-pita yang menyebardapatdisebabkankarena media terlalubasahketikasampeldiletakkan, waktuprosesterlalu lama, buffernyakurangtepat, teknik yang kurangpadasaatmeletakkansampel. 137 Tutor kimia klinik

141. Gambarmelengkungditepidapatdisebabkankarena media terlalupanasatauterlalukering. Diatasidenganmelembabkanruangandanmemeriksakekuatan ion buffer. Pita yang tipisdantajamdapatdisebabkankarenaberatmolekulsampelsangattinggiuntukukuranpori-pori media(kecil) 138 Tutor kimia klinik