Dokumen ini membahas prosedur elektroforesis kapiler yang digunakan untuk memisahkan dan menganalisis makromolekul seperti protein dan hemoglobin. Proses melibatkan langkah-langkah persiapan sampel, pemisahan molekul melalui medan listrik, dan deteksi menggunakan panjang gelombang tertentu. Terdapat juga bagian mengenai kontrol kualitas dan penyimpanan sampel yang diperlukan untuk memastikan hasil yang akurat.

1. TUTOR IMUNOLOGIMINICAPCapillary ElectrophoresisSiswantoDarmadi, dr, SpPK(K) /RantiPermatasari, dr1

2. PENDAHULUAN2ELEKTROFORESIS :carapemisahandanpengukurandarimakromolekul, seperti protein, lipoprotein, isoenzim, dan hemoglobin dalamberbagaimacamcairantubuhCapillary electrophoresis (CE) : elektroforesiskinerjatinggi yang dikerjakandalamtabungkapiler diameter 20-200 μm, denganatautanpapelapis, denganmenggunakanmedanlistrik.

3. KOMPONEN ALAT3Reagent CompartementAnalysis UnitRotating Sampler (carousel)

4. 4ROTATING SAMPLER

5. 5ANALYSIS UNIT

6. Reagent CompartmentReagent cupsholderBuffer 1Buffer 2H2OWashLoaded reagent cupsDiscarded reagent cupscontainerWastebottle6

7. PRINSIP KERJA7MINICAP menggunakansistem CE yang memisahkanmolekulberdasarkankecepatanelektroforesisnyadalambufer alkali dengan pH tertentudalamtabungkapilerdengan diameter 100 μm, yang dipengaruhioleh pH elektrolitdanelectroosmotic flow.

8. STEP 1Back wash to clean capillaryPOpened chamberClosed ChamberAnodeCathodeWash solution8

9. STEP 2Back wash to fill capillary with bufferPOpened chamberClosed ChamberAnodeCathodeBuffer solution9

10. STEP 3Diluted sample injection:Vacuum (P) during a fixed period of time (t)PSample micro cupClosed ChamberAnodeDilution SegmentCathodeBuffer10

11. STEP 4Migration and Detection:High voltage applied (V) and Detection at 200 nmDetectorVOpened Chamber-+AnodeBufferCathodeBuffer11

12. STEP 4Migration and Detection:High voltage applied (V) and Detection at 200 nmDetectorV-+AnodeBufferCathodeBuffer12

13. KEGUNAAN MINICAP13

14. ELEKTROFORESIS PROTEINReagendanperlengkapan yang dibutuhkan :14

15. Sampel yang disarankanuntukelektroforesis protein yaitu serum. Hindari serum yang hemolisisatau serum yang sudah lama atautidakdisimpandenganbaik. 15Penyimpanansampel: Suhu 2-8 ⁰ C : 10 hari

16. Frozen : 1 bulanPROSEDUR16

17. LANGKAHOTOMATISPembacaan barcode padatabung (jikaada)Pengenceransampeldenganbuferdanpencucianprobe.PencuciankapilerSampel yang telahdiencerkandimasukkankedalamkapilerProsesmigrasiberlangsungdengantegangan yang konstanselama 4 menitProtein dibacalangsungpadapanajnggelombang 200 nm danhasilnyamunculpadalayar LCD.17

18. QUALITY CONTROL18Serum kontroldiperolehdari pool serum manusiadandikemasdalambentukliofilisasi. Serum kontroldapatdigunakanuntuk quality control elektroforesis protein, lipoprotein, kolesteroldanapolipoprotein

19. 19

20. 20

21. ELEKTROFORESIS HEMOGLOBINReagendanperlengkapan yang dibutuhkan :21

22. 22

23. Sampel yang digunakanuntukelektroforesisHbyaitudarahantikoagulan. Antikoagulan yang dapatdigunakanyaitu EDTA, sitratatau heparin. Darahantikoagulandisentrifusdengankecepatan 5000rpm selama 5 menitkemudianbuangplasmanyadan vortex selama 5 detik.23

24. PROSEDUR24

25. 25

26. LANGKAH OTOMATISPembacaan barcode padatabung (jikaada)Pengenceransampeldenganbuferdanpencucianprobe.PencuciankapilerSampel yang telahdiencerkandimasukkankedalamkapilerProsesmigrasiberlangsungdengantegangan yang konstanselama 8 menitProtein dibacalangsungpadapanjanggelombang 415 nm danhasilnyamunculpadalayar LCD.26

27. QUALITY CONTROL27Kontrol normal HbA2 diperolehdari pool darahmanusiadandikemasdalambentukliofilisasi. Kontrol normal HbA2 dirancanguntukdapatdigunakanuntuk quality kontroljumlahdanposisi hemoglobin A2

28. 28

29. IMMUNOTYPINGReagendanperlengkapan yang dibutuhkan :29

30. 30

31. 31Sampel yang disarankanuntukimmunotypingyaitu serum. Hindari serum yang hemolisisatau serum yang sudah lama atautidakdisimpandenganbaik. Penyimpanansampel: Suhu 2-8 ⁰ C : 10 hari

32. Frozen : 1 bulanPROSEDURPilih menu immunotypingkemudianpilih program dilution sesuaidengankadar total Ig.Hypergamma: total kadarIg >2 g/dlHypogamma: total kadarIg <0.8 g/dlStandard: total kadarigantara 0.8 – 2 g/dl32

33. Hemoglobin Capillary electrophoresisProtein Capillary electrophoresis33

34. Perbandinganhasilelektroforesis protein hydrageldgnminicap (%)34

35. Normal serum35

36. Double Alpha 1->Heterozygousphenotype of alpha 1 antitrypsin36

37. 37Hb AHb A=93.4% Hb F=1.1% HbA2=5.5%Hb A2Hb F ß-thalassemia- minor

38. 38Hb AHb A2Hb FHbBart’sHb HHb H and Bart’s - Alpha-thalassemia

39. NILAI NORMALElektroforesis ProteinAlbumin : 53-65% α1- globulin : 2.5-5%α2 - globulin: 7-13%β - globulin : 8-14% γ - globulin : 12-22% (BISHOP 2005)Elektroforesis HemoglobinDewasaHb A : 97%Hb A2:: 2-3.3%Hb F : 0.2-1%(DACIE and LEWIS 2006)39

40. 40ΤεЃιΜαΚαςιΗ

41. 41

42. 42

43. Hb identification for Capillarys/MinicapZ 15 : Hb HZ 14 : //Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-BaltimoreZ 12 : Hb Bart’s, Hb J-Providence, Hb J-Mexico, Hb J-baltimore….Z 11 : DenaturatedHb A, HbKaoshiungZ 10 : Hb Hope, Hb M-IwateZ 9 : Hb A,HbCamperdown, Hb Phnom Penh……Z 8 : Acetylated Hb F, HbAltanta, Hb Athens-GAZ 7:Hb F,denaturatedHb S, Hb Porto-Alegre…….. Z 6 : Hb D-Punjab, denaturatedHb E, HbKorle-Bu, HbLepore, Hb Köln….Z 5 : Hb S, HbHasharon, HbHandsworth, denaturatedHb O-Arab.Z 4 : Hb E, denaturatedHb C, Hb Köln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variantsZ 3 : Hb A2, Hb O-ArabZ 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variantZ 1 : HbdA2 HbaA2, HasharonHb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant……43

44. Kriteriadx MMMayor:BM-plasmacytosis >30%HistologidxplasmacytomaSerum paraproteinIgG>3,5g/dl atauIgA>2,0 g/dlMinor:BM-plasmacytosis 10-30%Serum paraprotein < dr mayorOsteoliticlessionHipogammaglobulinemiaWaldenstormmacrogabulinemia : Tumor infiltrasiCirculating IgMTissue IgM44

45. Hemoglobin normal padadewasaHb A (α2β2) 97%Hb F (α2γ2) 3-5%Hb A2 (α2β2) 1.5 – 3.5%45