Western Blot SebagaiTesKonfirmasi HIV <br />Diah Puspita Rini<br />Siswanto Darmadi<br />
PENDAHULUAN<br />
AIDS<br />Disebabkan oleh HIV<br />HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983<br />HIV-2, tahun 1984 yang diisola...
STRUKTUR HIV<br />
PEMERIKSAAN LAB HIV<br />Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA, mempunyai sensitivitas 93-98...
Tes diagnostik untuk infeksi HIV<br />Skrening<br />Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 	Aglutinasi latek untu...
Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV<br />Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology<br />
Prinsip Pemeriksaan <br />WESTERN BLOT<br />
WESTERN BLOT<br />Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis<br />Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan sp...
PRINSIP PEMERIKSAAN<br />Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida<br />Fraksi protein dipinda...
PRINSIP PEMERIKSAAN<br />4.   Membran direaksikan dengan antibodi primer<br />5.   Membran direaksikan dengan antibodi sek...
PROSEDUR    		 		    PEMERIKSAAN<br />
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <br />Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electr...
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN<br />3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadapkatode. Pastik...
PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN<br />   Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M T...
BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI<br />Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan a...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Memblok  membran<br />larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non-...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuciuntuk membuang antibodi primer <b...
Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Cuci membran dengan TBS  menghilangkan Tween<br />Inkubasi dengan substrat selam...
INTERPRETASI<br />		WESTERN BLOT<br />
INTERPRETASI WESTERN BLOT<br />     Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC) <br />NEGATIF : tidak terb...
RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)<br />Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzy...
RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)<br />Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah  terda...
PRINSIP REAKSI RIBA<br />
INTERPRETASI HASIL<br />
PERBEDAAN WB dan RIBA<br />WESTERN BLOT<br />Inti : p17,p24,p55<br />Polimerase : p21, p51, 		   p66<br />Envelope : gp41,...
Thank You !<br />FOR YOUR ATTENTION<br />
RIBA TEST INSTRUCTION<br />1. Antigen-antibody reaction (row A)<br />2. First wash (row B)<br />3. Binding of conjugate (r...
HASIL NEGATIF PALSU<br />Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi ...
Serokonversi
Agammaglobulinemia
Atypical host response
Strain N atau O atau HIV-2</li></li></ul><li>
INDETERMINATE<br />Penyebab :<br />Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi<br />Infeksi HIV stadium lanjut<br />Reak...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Ti10

649 views

Published on

Published in: Health & Medicine
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
649
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
55
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Ti10

  1. 1. Western Blot SebagaiTesKonfirmasi HIV <br />Diah Puspita Rini<br />Siswanto Darmadi<br />
  2. 2. PENDAHULUAN<br />
  3. 3. AIDS<br />Disebabkan oleh HIV<br />HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983<br />HIV-2, tahun 1984 yang diisolasi dari pasien di Afrika Barat<br />HIV : famili retrovirus, termasuk virus RNA BM 9,7 kb<br />Khas : enzim reverse transkriptase<br />
  4. 4. STRUKTUR HIV<br />
  5. 5. PEMERIKSAAN LAB HIV<br />Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA, mempunyai sensitivitas 93-98% dan spesifisitas 98-99%.<br />Pemeriksaan serologi HIV sebaiknya dilakukan dengan 3 metode berbeda. Dapat dilanjutkan dengan pemeriksaan yang lebih spesifik Western Blot. <br />
  6. 6. Tes diagnostik untuk infeksi HIV<br />Skrening<br />Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 Aglutinasi latek untuk HIV-1<br />Konfirmasi<br />Western Blot (WB) , HIV-1 dan HIV-2<br />Indirect immunofluorescence antibody assay (IFA),HIV-1<br />Radioimmunoprecipitation antibody assay (RIPA),HIV-1<br />Lain-lain<br /> ELISA untuk HIV-1 p24 antigen<br />Polymerase chain reaction (PCR), HIV-1<br />
  7. 7. Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV<br />Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology<br />
  8. 8. Prinsip Pemeriksaan <br />WESTERN BLOT<br />
  9. 9. WESTERN BLOT<br />Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis<br />Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas immunoassay<br />
  10. 10. PRINSIP PEMERIKSAAN<br />Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida<br />Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-fraksi protein<br />Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik<br />
  11. 11. PRINSIP PEMERIKSAAN<br />4. Membran direaksikan dengan antibodi primer<br />5. Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim<br />6. Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang akan menghasilkan produk berwarna<br />
  12. 12. PROSEDUR PEMERIKSAAN<br />
  13. 13. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN <br />Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis), setelah selesai dicuci dengan buffer 25mM Tris-Cl pH 8.3/20% methanol(atau pH 7.0 - 8.8) <br />Membran nitoselulosa dipotong dan direndam dalam larutan buffer selama 15 menit<br />
  14. 14. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN<br />3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadapkatode. Pastikan tidak ada gelembung, elektrotransfer dilakukan dengan menjalankan unit selama 1 jam dengan voltase 500mA<br />
  15. 15. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN<br /> Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH 7,5)<br />
  16. 16. BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI<br />Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik<br />Digunakan antibodi primer dan sekunder untuk mendeteksi protein spesifik yang dicari<br />
  17. 17. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Memblok membran<br />larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non- fat milk powder dan 0.05% Tween-2030-60 menit pada suhu 370C atau 2 hari pada suhu kamar<br />Cuci membran 2 x 5 menit<br />larutan pencuci 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl pH 7.4 (atau saline) yang mengandung 0,05% Tween-20 (TTBS)<br />Membran diinkubasi dengan antibodi primer <br />selama 1-2 jam pada suhu kamar<br />
  18. 18. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuciuntuk membuang antibodi primer <br />Membran diinkubasi pada antibodi sekunder konjugasi alkali fosfatase,1-2 jam suhu kamar<br />Cuci membran 2 x 5 menit dengan TTBS<br />
  19. 19. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi<br />Cuci membran dengan TBS menghilangkan Tween<br />Inkubasi dengan substrat selama 1 jam, cuci dengan air<br />Inkubasi membran 20 menit dengan TBS mengandung 0,3 % Tween 20, cuci dengan air 5 menit<br />Masukkan membran ke dalam zat warna emas koloid/ Amido Black/ India ink/ Ponceau S selama 4 jam. <br />
  20. 20. INTERPRETASI<br /> WESTERN BLOT<br />
  21. 21. INTERPRETASI WESTERN BLOT<br /> Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC) <br />NEGATIF : tidak terbentuk pita<br />POSITIF: terdeteksi dua pita dari gp 120/160 dan gp41 atau gp 24<br />INDETERMINATE : terdapat satu pita saja yang positif yaitu p24, gp41, gp120/160, p66, p55, p51, p31 atau p17<br />
  22. 22.
  23. 23. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)<br />Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzyme immunoassay (EIA).<br />Fase solidnya adalah kartu dengan 12 tonjolan (“gigi” ). Masing-masing kartu memiliki enam pasang gigi, dengan enam titik antigen (3 titik pada masing-masing gigi). <br />
  24. 24. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay)<br />Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah terdapat internal control, dan dua protein marker p24 (gag) dan p 31 (pol). Pada bagian kanan terdapat tiga protein dari bagian env virus yaitu gp41, gp 120 dan gp 36. <br />
  25. 25. PRINSIP REAKSI RIBA<br />
  26. 26. INTERPRETASI HASIL<br />
  27. 27. PERBEDAAN WB dan RIBA<br />WESTERN BLOT<br />Inti : p17,p24,p55<br />Polimerase : p21, p51, p66<br />Envelope : gp41, gp120, gp 160<br />RIBA<br />Inti : p24<br />Polimerase : p31<br />Envelope : gp 120<br /> gp 41<br />
  28. 28. Thank You !<br />FOR YOUR ATTENTION<br />
  29. 29. RIBA TEST INSTRUCTION<br />1. Antigen-antibody reaction (row A)<br />2. First wash (row B)<br />3. Binding of conjugate (row C)<br />4. Second wash (row D)<br />5. Third wash (row E)<br />6. Color reaction / chromogenic substrate containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) (row F)<br />7. Stop reaction (row E)<br />
  30. 30. HASIL NEGATIF PALSU<br />Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi prevalensi rendah<br />Penyebab:<br /><ul><li>Window period
  31. 31. Serokonversi
  32. 32. Agammaglobulinemia
  33. 33. Atypical host response
  34. 34. Strain N atau O atau HIV-2</li></li></ul><li>
  35. 35. INDETERMINATE<br />Penyebab :<br />Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi<br />Infeksi HIV stadium lanjut<br />Reaksi silang antibodi nonspesifik, multiple skelosis, psx vaskular-kolagen, limfoma, penyakit liver<br />HIV vaccine recipients<br />
  36. 36. HIV-1 adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis (strain) HIV-1 yang berbeda-beda. Jenis ini digolongkan menurut golongan (group) dan subtipe (subtype). Ada dua golongan, yaitu golongan M dan golongan O.<br />Pada September 1998, peneliti dari Perancis mengumumkan penemuan jenis HIV baru pada seorang wanita dari Kamerun di Afrika Barat. Jenis ini tidak termasuk dalam golongan M atau pun golongan O, dan hanya ditemukan pada tiga orang lainnya, semua di Kamerun.<br />Saat ini dalam golongan M sedikitnya diketahui adasepuluh subtipe HIV-1 yang secara genetis berbeda. Subtipe ini terdiri dari A sampai J. Tambahan pula, golongan O terdiri dari beberapa golongan yang berbeda dari virus yang sangat beraneka ragam. Subtipe di golongan M dapat berbeda antar subtipe sebanyak perbedaan golongan M dengan golongan O.<br />
  37. 37. SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN<br /> Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh, subtipe B kebanyakan ditemukan di sekitar Amerika (utara dan selatan), Jepang, Australia, Karibia, dan Eropa; subtipe A dan D adalah yang paling sering ditemukan di Afrika sub-Sahara; subtipe C di Afrika Selatan dan India; dan subtipe E di Republik Afrika Tengah, Thailand, dan negara lainnya di Asia Tenggara. Subtipe F (Brazil dan Rumania),G dan H (Rusia dan Afrika Tengah),I (Siprus), dan golongan O (Kamerun) mempunyai prevalensi sangat rendah. Di Afrika, sebagian besar subtipe ditemukan, walaupun subtipe B kurang umum.<br />
  38. 38. subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya, subtipe B dengan hubungan homoseksual dan penggunaan narkotik secara suntikan (pada intinya, melalui darah) dan subtipe E dan C, melalui hubungan heteroseksual (melalui jalur mukosal).<br />Penelitian di laboratorium yang dilakukan oleh Dr. Max Essex dari Harvard School of Public Health di Boston, AS, menunjukkan subtipe C dan E menularkan dan menggandakan diri lebih efisien dibandingkan dengan subtipe B pada sel Langerhans yang ada dalam mukosa vagina, leher rahim, dan kulup penis, tetapi tidak pada dinding dubur. Data memperlihatkan HIV subtipe E dan C lebih mudah menyebar secara heteroseksual dibandingkan dengan subtipe B.<br />

×