Tugas mata kuliah Teknik Penelitian Biokimia membahas metode ELISA sandwich dan indirect untuk mengukur hemoglobin A2 dan mengidentifikasi pembawa beta talasemia. Metode tersebut melibatkan imobilisasi antigen di plate, inkubasi dengan antibodi primer dan sekunder terkonjugasi enzim, penambahan substrat, dan deteksi sinyal warna."

1. TUGAS MATA KULIAH
TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA
(BIK 504)
OLEH :
SOGANDI
G851130241
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014

2. Sandwich ELISA for Hemoglobin A2 Quantification and
Identification of β-Thalassemia Carriers
Surakit Kuntaruk, Thanusak Tatu, Tiemjan Keowkarnkash, Watchara Kasinrerk
© The Japanese Society of Hematology, 2010
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah uji yang berdasarkan
pada sebuah plate yang dirancang untuk mendeteksi dan mengukur zat seperti
peptida, protein, antibodi dan hormon. Nama lain, seperti enzyme immunoassay
(EIA), juga digunakan untuk menggambarkan teknologi yang sama. Dalam
ELISA, antigen harus bergerak ke permukaan padat dan kemudian kompleks
dengan antibodi yang terkait dengan enzim. Deteksi dilakukan dengan menilai
aktivitas enzim terkonjugasi melalui inkubasi dengan substrat untuk menghasilkan
produk terukur. Unsur yang paling penting dari strategi deteksi ini adalah interaksi
antigen-antibodi yang sangat spesifik.
ELISA biasanya dilakukan di 96-well (atau 384-well) plate polystyrene,
yang secara pasif akan mengikat antibodi dan protein. Hal ini akan mengikat dan
mengimobilisasi reagen yang membuat ELISA begitu mudah untuk dirancang dan
dilakukan. Reaktan dari ELISA bergerak ke permukaan plate yang memudahkan
untuk memisahkan ikatan dari bahan nonikatan selama pengujian tersebut.
Kemampuan untuk membersihkan bahan nonspesifik terikat membuat ELISA
sebagai alat yang ampuh untuk mengukur analit tertentu dalam sebuah preparat
kasar.
ELISA dapat dilakukan dengan sejumlah modifikasi pada prosedur
dasarnya. Langkah kuncinya adalah imobilisasi antigen, dapat dilakukan dengan
adsorpsi langsung ke pelat uji atau tidak langsung melalui antibodi capture yang
telah melekat pada plate. Antigen tersebut kemudian dideteksi baik secara
langsung (antibodi primer berlabel) maupun tidak langsung (antibodi sekunder
berlabel). Format uji ELISA yang paling kuat adalah uji sandwich. Jenis uji
capture disebut "sandwich" assay karena analit yang akan diukur terikat antara
dua antibodi primer yaitu antibodi yang mengikat dan antibodi deteksi.

3. Gambar 1. Gambaran umum teknik ELISA
Dalam uji tersebut, antigen yang menarik bergerak oleh adsorpsi langsung
ke pelat uji atau dengan terlebih dahulu melekatkan antibodi capture ke
permukaan plate. Deteksi antigen kemudian dapat dilakukan dengan
menggunakan antibodi enzim-terkonjugasi primer (deteksi langsung) atau
mencocokan satu set dari antibodi primer berlabel dan enzim-terkonjugasi
sekunder (deteksi tidak langsung).
Dalam penelitian ini peneliti menggunakan dua metode ELISA, yaitu
metode Indirect ELISA dan Sandwich ELISA.
Indirect ELISA
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA
yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi
dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan
suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik yang tertaut
enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel
yang diuji.
Gambar 2. Gambaran umum teknik indirect ELISA

4. Tahapan pada Indirect ELISA :
1. Coating plate ELISA
Coating dicapai melalui adsorpsi pasif antigen ke plate uji. Metode yang
paling umum untuk lapisan plate melibatkan penambahan 2-10 pg/ml dari
protein yang dilarutkan dalam buffer basa seperti phosphate-buffered saline
(pH 7,4) atau karbonat- buffer bikarbonat (pH 9,4). Pertama mikrotiter diisi
dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik
tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter selama
inkubasi dalam inkubator pada 370
C selama semalam. Dalam penelitian ini
peneliti menggunakan 10μg/mL Hbs sebagai antigennya dengan buffer
bikarbonat pH 9,6.
2. Langkah pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan
mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang
mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
3. Penambahan Buffer Blocked
Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial
untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas
assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-
to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang
diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking.
4. Penambahan Antibodi Primer
Langkah ini melibatkan penambahan pendeteksi antibodi (larutan sampel)
yang diarahkan terhadap couting antigen. Larutan sampel yang mengandung
antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter,
sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang
diinginkan. Antibodi biasanya diencerkan dalam buffer blocked untuk
mencegah penempelan protein nonspesifik, peneliti menggunakan larutan 2%
BSA-PBS. Kemudian diinkubasi pada suhu 370
C selama satu jam. Selanjutnya,
mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi

5. dengan antigen spesifik. Peneliti menggunakan 0,05% Tween-PBS sebanyak 4
kali.
Gambar 3. Proses pembilasan mikrotiter
5. Penambahan antibodi sekunder (konjugasi enzim antibodi)
Langkah selanjutnya adalah penambahan antibodi sekunder, yang
diencerkan dalam buffer block dan ditujukan terhadap antibodi primer. Diikuti
dengan inkubasi sampai terjadi pengikatan antibodi sekunder dengan enzim-
terkonjugasi. Pilihan antibodi enzim konjugasi ditentukan oleh tujuan dari
pengujian tersebut. Antibodi tersebut diproduksi terhadap imunoglobulin (Ig)
spesies di mana antibodi mendeteksi diproduksi dan disebut konjugasi anti-
spesies. Dengan demikian, jika mendeteksi antibodi yang diproduksi pada
kelinci, antibodi berlabel enzim akan menjadi anti-kelinci Ig di alam. Ini
memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dalam penggunaan konjugat anti-
spesies dalam kekhususan yang berbeda dari konjugasi dapat digunakan untuk
mendeteksi Ig tertentu yang mengikat dalam pengujian tersebut. Misalnya,
konjugat anti-spesies bisa menjadi anti-IgM, IgG1, IgG2 dan sebagainya.
Enzim dapat dihubungkan dengan protein seperti streptavidin jika antibodi
primer adalah berlabel biotin. Enzim yang paling umum digunakan (HRP) dan
alkaline phosphatase (AP). Enzim lain telah digunakan juga, tetapi mereka
belum diterima secara luas karena pilihan substrat terbatas. Ini termasuk β-
galaktosidase, acetylcholinesterase dan katalase. Dalam penelitian ini, peneliti

6. menggunakan immunoglobin anti-tikus horseradish peroxidase (HRP) sebagai
konjugat antispesiesnya.
6. Langkah pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder
tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik dengan
buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4
kali pembilasan.
7. Penambahan substrat
Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.
Pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik
yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan
penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.
Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui
katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA
dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)
merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish
peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-
Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak
beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan substrat
TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin) Pemilihan substrat tergantung pada
sensitivitas uji yang diperlukan dan instrumentasi tersedia untuk sinyal deteksi
(spektrofotometer, fluorometer atau luminometer).
8. Larutan penghenti reaksi
Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi
dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk
mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai
intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.
Misalnya untuk substrat TMB bereaksi dengan horseradish peroxidase (HRP)

7. antibodi sekunder terkonjugasi untuk menghasilkan warna biru. Pada penelitian
ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada pembacaan 450 nm.
Kuantifikasi
Spektrofotometer yang dirancang khusus untuk dapat melalui sumur
mikrotiter baik secara tunggal atau dalam baris. Beberapa pembaca plat ELISA
yang tersedia, dengan meningkatnya tingkat kecanggihan. Beberapa di
antaranya menyediakan pengukuran densitas optik sementara beberapa tabulasi
data menerapkan analisis statistik. Kompatibilitas dengan komputer kecil, dan
ketersediaan program yang sesuai untuk memproses hasil dan mengubah
pembacaan densitas optik ke konsentrasi protein adalah hal-hal tambahan yang
penting untuk dicari ketika memilih instrumen. Sebagian besar pembaca
ELISA dapat diatur untuk mengukur absorbansi warna yang dihasilkan oleh
reaksi enzim-antibodi terkonjugasi pada substrat masing-masing pembaca
lempeng yang bekerja dengan sebuah sinar jenis tertentu dari cahaya pada
masing-masing sampel dalam lempeng sumur mikro. Mode deteksi yang umum
untuk tes lempeng adalah absorbansi, intensitas fluoresensi, luminescence,
waktu diselesaikan fluoresensi dan fluoresensi polarisasi. Sebuah sumber
cahaya menerangi sampel menggunakan panjang gelombang tertentu (dipilih
oleh filter optik, atau monokromator), dan detektor cahaya yang terletak di sisi
lain dari langkah-langkah awal (100%) cahaya yang disebarkan melalui
sampel, jumlah cahaya yang ditransmisikan biasanya akan berhubungan
dengan konsentrasi molekul terikat, ini disebut deteksi penyerapan. Kisaran
aplikasi deteksi intensitas fluoresensi jauh lebih luas daripada saat
menggunakan deteksi absorbansi, tapi instrumentasi biasanya lebih mahal.
Kelemahan metode indirect ELISA
Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA
direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada
saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan
antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,
sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu

8. pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik
tertaut enzim signal.
Kelebihan metode indirect ELISA
1. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang dijual bebas.
2. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada
wadah berbeda.
3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder
Sandwich ELISA untuk Kuantifikasi HbA2
Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi
(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua
(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.
Gambar 4. Gambaran umum teknik Sandwich ELISA
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA
direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak
perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut
enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigen (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,

9. sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam
pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada
suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA
sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan
akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.
Gambar 5. Diagram skematik kompetitif immuno assay

10. Gambar 6. Format nonkompetitif immuno assay
Tahapan pada Sandwich ELISA :
1. Coating plate ELISA
Pada ELISA sandwich, pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang
mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat
menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter. Dalam penelitian ini
antibodi penangkapnya menggunakan anti-HbA2 mAb ThalA2-1 sebanyak 10
μg/ml yang dilarutkan dalam buffer karbonat/bikarbonat pH 9,6 pada suhu 40
C
dan didiamkan selama semalam.
2. Tahap pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang
tidak menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan
mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung
0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.

11. Gambar 7. Proses pencucian plate
3. Penambahan Buffer Blocking
Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial
untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas
assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-
to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang
diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking. Dalam
penelitian ini menggunakan BSA 2%.
4. Penambahan larutan antigen
Larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi
penangkap dengan antigen yang diinginkan. Dalam penelitian ini dengan
penambahan HbA2 yang telah dimurnikan dengan konsentrasi dari 3.125
sampai 100 μg/ml yang ada dalam hemolisat sampel. Kemudian diinkubasi
selama 1 jam pada suhu 370
C.
5. Tahap pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
berinteraksi dengan antibodi penangkap pada dinding lubang mikrotiter dengan
cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS)
yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.

12. 6. Penambahan Enzim Konjugat Antibodi
Lalu, kedalam lubang mikrotiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi
detektor, sehingga pada lubang mikrotiter tersebut terjadi interaksi antara
antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Dalam penelitian ini
menggunakan FITC-conjugated anti-HbA2 mAb ThalA2-2 dengan konsentrasi
10 μg/ml dan diinkubasi pada pada suhu 370
C selama satu jam untuk
membiarkan FITC-conjugated yang telah dilabel dengan antibodi berikatan
dengan molekul HbA2.
7. Tahapa pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor
yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik.
8. Penambahan substrat
Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.
Pada tahap akhir ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah
berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan
penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.
Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui
katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA
dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)
merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish
peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-
Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak
beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan HRP-
conjugated rabbit anti-FITC antibody yang telah ditambahkan kedalam plate
dan pewarnaan dengan TMB substrat (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin).
9. Penambahan larutan penghenti reaksi
Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi
dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk
mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai

13. intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.
Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada
pembacaan 450 nm.
Gambar 8. Plate ELISA yang sudah terbetuk warnanya
Jumlah HbA2 dalam sampel yang diuji diperoleh dengan menerjemahkan
OD 450 nm untuk unit konsentrasi (μg/ml) dengan menggunakan kurva standar
yang dikembangkan di plate yang sama. Jumlah relatif HbA2 sebagai persentase
dari total Hb (% HbA2) kemudian dihitung menggunakan persamaan berikut :
[kadar HbA2 dalam mg/ml] / [Hemoglobin total dalam mg/ml] x 100
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi
penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang mikrotiter dan Afinitas
dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen. Sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi
detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan,
yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat

14. multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi
antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
Interpretasi Kurva ELISA
Grafik diatas menunjukkan bahwa konsentrasi suatu sampel akan
berbanding terbalik dengan banyaknya jumlah antibodi yang terikat.

15. Hasil
Produksi dan karakterisasi mAbs menjadi HbA2
Untuk mengubah mAbs menjadi HbA2, dua tikus Balb/c diimunisasi
dengan HbA2 yang telah dimurnikan dengan interval 2 minggu. Setelah imunisasi
ketiga, respon antibodi poliklonal untuk HbA2 di kedua tikus itu cukup kuat (titer
[1:32,000). Seekor tikus dipilih untuk generasi hibridoma. Supernatan budaya
hyrbidomas yang dihasilkan diuji dengan indirect ELISA menggunakan berbagai
jenis Hbs sebagai antigen. Dua klon hibridoma menghasilkan antibodi yang dapat
mengenali HbA2 tapi tidak untuk Hbs. Kedua mAbs yang isotipe dengan IgG1.
Hasilnya menunjukkan bahwa mAbs ThalA2-1 dan ThalA2-2 khusus bereaksi
terhadap HbA2 dan dapat digunakan untuk membangun ELISA untuk kuantifikasi
HbA2.
Pengembangan sandwich ELISA untuk kuantisasi HbA2
Sebagai tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan ELISA
yang efektif untuk kuantifikasi HbA2, jenis ELISA terpilih menjadi sistem assay.
Dengan diproduksinya mAbs anti-HbA2, sandwich ELISA telah berhasil
dikembangkan. Anti-HbA2 mAb ThalA2-1 digunakan sebagai antibodi pertama
untuk lapisan plate sebagai penangkap molekul HbA2 dalam sampel. Yang kedua
anti-HbA2 mAb ThalA2-2 yang berlabel dengan FITC digunakan untuk
mendeteksi HbA2 yang terikat. HRP conjugate ditambahkan ke sistem untuk
mendeteksi pengikatan antibodi FITCl ke plate. Dengan sistem ini, kurva standar
mendeteksi HbA2 dalam kisaran 3,125-100 μg/ml mengikuti hukum Beer dengan
OD 450 nm berkisar 0,191-1,732 diperoleh gambar dibawah ini.
Kekhasan sandwich ELISA divalidasi menggunakan ELISA yang
dikembangkan untuk mengukur berbagai jenis Hbs. Hanya HbA2 yang dapat
dideteksi oleh ELISA.

16. Penilaian keandalan tingkat HbA2 ditentukan oleh sandwich dikembangkan
ELISA
ELISA yang dikembangkan telah digunakan untuk penentuan kadar HbA2
yang terdapat di hemolysates diperoleh dari berbagai penelitian. Analisis
hubungan jelas menunjukkan bahwa kadar HbA2 ditentukan oleh sandwich
ELISA berkorelasi sangat baik dengan yang ditentukan oleh metode HPLC.
Untuk memanfaatkan tingkat HbA2 untuk diagnosis thalassemia, cut-off poin dari
tingkat HbA2 dibuat dari nilai-nilai pada batas 2SD, yang berkisar masing-masing
2,5 dan 4,0% untuk sandwich ELISA dan HPLC. Sandwich ELISA yang
dikembangkan mampu mengukur kadar HbA2 dalam HbE-bearing (HbE sifat dan
homozigot HbE), yang tidak bisa dilakukan oleh HPLC konvensional.
ELISA yang dikembangkan kemudian diterapkan dalam penentuan tingkat
HbA2 di diketahui sampel darah rutin dan diagnosis yang diperoleh kemudian
dibandingkan dengan yang dihasilkan dengan metode HPLC. Analisis dari 112
sampel darah rutin menunjukkan bahwa teknik ELISA yang dikembangkan
memiliki kapasitas yang sebanding untuk mendeteksi heterozigot β-thalassemia
dengan teknik HPLC dengan sensitivitas 100%, 95% spesifisitas, akurasi 95%,
nilai prediksi 82,3% positif dan 100% nilai prediksi negatif .

17. Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah berhasil mengembangkan ELISA
sandwich untuk kuantifikasi HbA2. Teknik ini sederhana, cepat dan dapat
digunakan untuk mengidentifikasi operator β-thalassemia. Oleh karena itu dapat
diadaptasi untuk skrining skala besar untuk β -thalassemia di daerah endemik.
Dengan demikian, peneliti mendorong penggunaan strategi ini dalam penyaringan
untuk β -thalassemia di negara-negara yang memiliki keterbatasan sumber daya.
Referensi
Graphad Prism. 2003. Step-by-Step Examples Nonlinear Standard Curves: RIA
and ELISA. Graphad software. San Diego, CA.
Ibrahim A. Darwish. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in
Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances.
International journal of Biomedical science. vol. 2 no. 3 september 2006.
Kuntaruk, Surakit; Thanusak Tatu; Tiemjan Keowkarnkah et al. 2010. Sandwich
ELISA for hemoglobin A2 quantification and identification of β-
thalassemia carriers. Hematol journal. DOI 10.1007/s12185-009-0490-3.
SeraCare. 2013. Technical Guide for ELISA (Protocols & Troubleshooting). 800-
638-3167: www.kpl.com
Yang and Ma. 2009. Western Blotting and ELISA Techniques. Sciencepub journal.
1(2):67-86.